DE19930433A1

DE19930433A1 - Tetramere Antikörper-Konstrukte

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Publication number: DE19930433A1
Application number: DE1999130433
Authority: DE
Inventors: Melvyn Little; Gall Fabrice Le; Sergey M Kipriyanov; Gerd Moldenhauer
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 1999-07-01
Filing date: 1999-07-01
Publication date: 2001-01-11

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft tetramere F v -Antikörper-Konstrukte, bei denen die V H - und V L -Domänen der einzelnen Monomere jeweils über eine Aminosäure miteinander verbunden sind, Monomere der F v -Antikörper-Konstrukte und sie kodierende DNAs sowie ein Verfahren zur Herstellung der F v -Antikörper-Konstrukte und ihre Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft tetramere F_V-Antikörper- Konstrukte, ihre Monomere und sie kodierende DNAs sowie ein Verfahren zur Herstellung der F_V-Antikörper-Konstrukte und ihre Verwendung.

Natürliche Antikörper sind Dimere und werden daher als bivalent bezeichnet. Sie weisen vier variable Domänen, nämlich zwei V_H- und zwei V_L-Domänen, auf. Die variablen Domänen dienen als Bindungsstellen für ein Antigen, wobei eine Bindungsstelle aus einer V_H- und einer V_L-Domäne ausgebildet ist. Natürliche Antikörper erkennen jeweils ein Antigen, wodurch sie auch als monospezifisch bezeichnet werden. Ferner weisen sie auch kon stante Domänen auf. Diese tragen zur Stabilität der natürli chen Antikörper bei. Andererseits sind sie auch für uner wünschte Immunreaktionen mitverantwortlich, die entstehen, wenn natürliche Antikörper verschiedener Tierarten wechsel seitig verabreicht werden.

Zur Vermeidung solcher Immunreaktionen werden Antikörper konstruiert, denen die konstanten Domänen fehlen. Insbesondere sind dies Antikörper, die nur noch die variablen Domänen aufweisen. Solche Antikörper werden mit F_V-Antikörper- Konstrukten bezeichnet.

Es hat sich allerdings gezeigt, daß F_V-Antikörper-Konstrukte oft nur eine geringe Affinität zu ihrem Antigen aufweisen. Ihre Verwendbarkeit für therapeutische Zwecke ist daher stark eingeschränkt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Antikörper bereitzustellen, mit dem unerwünschte Immunreaktionen vermieden werden können. Ferner soll er eine Affinität zu seinem Antigen aufweisen, die ihn für therapeutische Zwecke einsetzbar macht.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß ein F_V-Antikörper-Konstrukt eine für therapeutische Zwecke geeignete Affinität zu seinem Antigen aufweist, wenn das F_V-Antikörper-Konstrukt tetramer ist und die V_H- und V_L-Domänen der einzelnen Monomere jeweils über eine Aminosäure miteinander verbunden sind. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß ein solches F_V-Antikörper-Konstrukt eine erhöhte Verweilzeit bei seinem Antigen und im Körper aufweist, was weitere Vorteile hinsichtlich seiner Verwendbarkeit für therapeutische Zwecke darstellt. Beispielhaft wird dies nachstehend an einem F_V-Antikörper-Konstrukt gegen das humane B Zell-Antigen CD19 gezeigt. Desweiteren hat der Anmelder erkannt, daß ein vorstehendes F_V-Antikörper-Konstrukt leicht herstellbar ist. Insbesondere hat er gefunden, daß sich dieses selbst ausbildet, wenn ein nachstehend mit scF_V-1 bezeichnetes einzelkettiges F_V-Antikörper-Konstrukt exprimiert wird, wobei sich vier Monomere von scF_V-1 zu einem F_V-Antikörper-Konstrukt zusammenlagern. Darüber hinaus hat er gefunden, daß das F_V- Antikörper-Konstrukt ein- oder bispezifisch sein kann, d. h. ein oder mehrere Antigene gleichzeitig erkennen und binden kann.

Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein tetrameres F_V-Antikörper-Konstrukt bereitzustellen, bei dem die V_H- und die V_L-Domänen der einzelnen Monomere jeweils über eine Aminosäure miteinander verbunden sind.

Der Ausdruck "F_V-Antikörper-Konstrukt" weist auf einen Antikörper hin, der variable Domänen, nicht aber konstante Domänen aufweist.

Der Ausdruck "tetrameres F_V-Antikörper-Konstrukt" weist auf ein F_V-Antikörper-Konstrukt hin, das vier Monomere von scF_V-1 umfaßt. scF_V-1 weist eine V_H- und eine V_L-Domäne auf, die über eine Aminosäure miteinander verbunden sind. In einem erfindungsgemäßen F_V-Antikörper-Konstrukt können die vier Monomere von scF_V-1 identisch sein. Günstig kann es auch sein, wenn jeweils zwei der vier scF_V-1 Monomere identisch sind. Ein erfindungsgemäßes F_V-Antikörper-Konstrukt kann daher mono- oder bispezifisch sein, d. h. ein oder zwei Antigene gleichzeitig erkennen und binden.

Der Ausdruck "Aminosäure" umfaßt jegliche natürliche und künstliche Aminosäure, wobei letztere z. B. eine derivatisierte Form einer natürlichen Aminosäure ist. Insbesondere ist die Aminosäure ein Serin (S), ein Glycin (G) oder ein Prolin (P).

In bevorzugter Ausführungsform ist ein vorstehendes F_V- Antikörper-Konstrukt gegen das humane B Zell-Antigen CD19 gerichtet. Ganz besonders bevorzugt wird ein F_V-Antikörper- Konstrukt, das scF_V-1 von Fig. 1 als Monomer umfaßt.

Ein erfindungsgemäßes F_V-Antikörper-Konstrukt kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Günstig ist ein Verfahren, bei dem eine DNA, die für eine V_H- und eine V_L-Domäne kodiert, wobei die Domänen über eine Aminosäure miteinander verbunden sind, in ein Expressionsplasmid inseriert und über dieses in Zellen, z. B. E. coli, exprimiert wird. Aus den Zellen bzw. dem Zellüberstand kann dann das erfindungsgemäße F_V- Antikörper-Konstrukt isoliert und gereinigt werden. Es wird auf die nachstehenden Beispiele verwiesen. Hinsichtlich der Ausdrücke "F_V-Antikörper Konstrukt" und "Aminosäure" wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen. Ergänzend wird auf Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982, verwiesen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Monomer des vorstehenden F_V-Antikörper-Konstruktes, d. h. scF_V- 1, insbesondere scF_V-1 von Fig. 1. Desweiteren ist eine scF_V-1, insbesondere scF_V-1 von Fig. 1, kodierende DNA ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Desweiteren ist ein Expressionsplasmid, das eine vorstehende DNA enthält, ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ein bevorzugtes Expressionsplasmid, das für scF_V-1 von Fig. 1 kodiert, ist pHOG-tetra 19. Dieses wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellen) am 25. Juni 1999 unter DSM 12 889 hinterlegt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, umfassend:

a) ein erfindungsgemäßes F_V-Antikörper-Konstrukt,
b) ein erfindungsgemäßes scF_V-1, und/oder
c) eine erfindungsgemäße DNA, insbesondere ein erfindungsgemäßes Expressionsplasmid, sowie
d) übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Lösungsmittel und Kontrollen.

Von den einzelnen Komponenten können ein oder mehrere Vertreter vorliegen.

Die vorliegende Erfindung stellt ein tetrameres F_V-Antikörper- Konstrukt bereit, bei dem die V_H- und V_L-Domänen der einzelnen Monomere jeweils über eine Aminosäure miteinander verbunden sind. Ein solches Antikörper-Konstrukt zeichnet sich dadurch aus, daß es keine Teile enthält, die zu unerwünschten Immunreaktionen führen können. Ferner weist es eine große Affinität zu seinem Antigen auf. Des weiteren weist es eine lange Verweilzeit bei seinem Antigen und im Körper auf. Darüber hinaus ermöglicht es ein oder zwei Antigene gleichzei tig zu erkennen und zu binden. Das erfindungsgemäße F_V- Antikörper-Konstrukt eignet sich daher bestens nicht nur für diagnostische, sondern auch für therapeutische Zwecke verwendet zu werden. Solche Zwecke können hinsichtlich jeder Erkrankung, insbesondere einer viralen, bakteriellen oder Tumor-Erkrankung, z. B. B Zell-Tumor, gesehen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die genetische Organisation eines erfindungsgemäßen Monomers scF_V-1, und von Vergleichskonstrukten. Bei scF_V-0 liegt keine Aminosäure zwischen der V_H- und der V_L-Domäne vor, während bei scF_V-10 10 und bei scF_V-18 18 Aminosäuren vorliegen. Das Vergleichskonstrukt am Fuß von Fig. 1 ist ein CD3 × CD19 "diabody". Ferner sind die Lokalisisierungen einer Ribosomenbindungsstelle (rbs), von pelβ Leader (pelb), c-myc Epitop (c-myc), Hexahistidin-Tag (his₆) und Stopcodon (Stop) angegeben.

Fig. 2 zeigt eine Größenausschluß-FPLC mit einem erfindungsgemäßen F_V-Antikörper-Konstrukt, das scF_V-1 von Fig. 1 als Monomer enthält, und Vergleichskonstrukten, die als Monomer scF_V-0, scF_V- 10 bzw. scF_V-18 von Fig. 1 enthalten.

Fig. 3 zeigt Analysen der Bindungseigenschaften eines erfindungsgemäßen F_V-Antikörper-Konstruktes, das scF_V-1 von Fig. 1 als Monomer enthält, und von Vergleichskonstrukten, die als Monomer scF_V-0, scF_V- 10 bzw. scF_V-18 von Fig. 1 enthalten bzw. ein CD3 × CD19 "diabody" sind. (a) betrifft die direkte Bindung an CD19⁺-JOK-1 Zellen, bestimmt mittels Durchflußzytometrie, (b) betrifft die Bindungsinhibition von FITC-markiertem monoklonalen Antikörper HD37 an JOK-1 Zellen und (c) betrifft die Zelloberflächen-Retension in vitro bei 37°C.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 Konstruktion eines Expressionsplasmids pHOG tetra 19 zur Expression eines tetrameren F_V- Antikörper-Konstruktes in Bakterien

Das Expressionsplasmid pHOG21-αCDl9, das für ein scF_V-Konstrukt codiert, welches für das humane B Zell-Antigen CD19 (Kipriyanov et al., 1996, J. Immunol. Meth. 196, 51-62) spezifisch ist, wurde zur Konstruktion des Expressionsplasmids pHOG-tetra 19 verwendet. PCR-Fragmente der V_H-Domäne von Anti- CD19 wurden unter Verwendung der Primer DP1, 5'-TCA- CACAGAATTCTTAGATCTATTAAAGAGGAGAAATTAACC, und V_HISS, 5'- GAGCAAGATATCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCC, erzeugt. DIE PCR- Fragmente wurden mit NcoI und EcoRV gespalten und in das mit NcoRI/EcoRV linearisierte Expressionsplasmid pHOG-αCD19 inseriert, wodurch das Expressionsplasmid pHOG-tetra 19 erhalten wurde.

Beispiel 2 Expression und Reinigung eines tetrameren F_V- Antikörper-Konstruktes in Bakterien

E. coli-XL1-Blue-Bakterien (Stratagene, La Jolla, CA), wurden mit dem Expressionsplasmid pHOG-tetra19 transformiert. Die Bakterien wurden in 2xYT-Medium mit 0,1 g/l Ampicillin und 100 mM Glucose bei 37°C kultiviert. IPTG-Induktion und Isolierung von periplasmatischen Extrakten wurden durchgeführt, wie in Kipriyanov, S. M et al., J. Immunol. Methods 200, (1997), 69-77 und Kipriyanov, S. M. et al. Protein Eng. 10, (1997), 445-453, beschrieben. Der Kulturüberstand und der lösliche periplasmatische Extrakt wurden kombiniert und unter Verwendung von Amicon YM10 Membranen mit einem 10 kDa- Ausschluß (Amicon, Witten), gefolgt von einer Dialyse gegen an 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 7,0, ankonzentriert. Eine Reinigung wurde durch eine immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) unter Verwendung einer mit Cu²⁺ beladenen Säule an chelatierender Sepharose (Pharmacia) durchgeführt, wie in Kipriyanov " S. M. et al. Protein Eng., vorstehend beschrieben. Ferner wurde eine Ionenaustausch-Chromatographie an einer MonoQ HR5/5-Säule (Pharmacia) in 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 mit einem linearen O-I M NaCl-Gradienten durchgeführt.

Beispiel 3 Charakterisierung eines tetrameren F_V- Antikörper-Konstruktes (A) SDS-PAGE und Größenausschlußchromatographie

Eine SDS-PAGE wurde gemäß Laemmli unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt. Ferner wurde eine analytische Gelfiltration der F_V-Antikörper-Konstrukte in PBSI (15 mM Na- Phosphat, 0,15 M NaCl, 50 mM Imidazol, pH 7,0) unter Ver wendung einer Superdex-200-HR10/30-Säule (Pharmacia) durchgeführt. Das Probenvolumen und die Fließgeschwindigkeit betrugen 50 µl bzw. 0,5 ml/min.

(B) Durchflußzytometrie und Affinitätsbestimmung

Die humane CD19⁺- B-Zellinie JOK-1 wurde für die Durchflußzytometrie verwendet, wie in Kipriyanov, S. M. et al., Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772 beschrieben. Die Affinitätsbestimmung erfolgte durch einen Kompetitions- Inhibitions-Test (Kipriyanov, S. M. et al., Int. J. Cancer 77, vorstehend). Zunehmende Konzentrationen des F_V-Antikörper- Konstruktes wurden einer "subsaturating" Konzentration des FITC-markierten monoklonalen Antikörpers HD37 (anti-CD19) zugegeben und das Gemisch wurde mit den JOK-1 Zellen inkubiert. Fluoreszenz-Intensitäten der gefärbten Zellen wurden mittels eines FACScan-Durchflußzytometers (Becton Dickinson) bestimmt. Bindungsaffinitäten wurden ermittelt gemäß der Formel K_D(I) = IC₅₀/(1+[FITC-mAb]K_D(mAb), worin I der unmarkierte Inhibitor [FITC-mAb] die Konzentration von FITC- markiertem mAb HD37, K_D(mAb) die Bindungsaffinität von mAb und IC₅₀ die Konzentration des Inhibitors, die zu einer 50% Bindungsinhibition führt, ist. Eine Affinitätskonstante (K_D) von 0,4 nM wurde für mAb HD 37 bestimmt.

(C) Zelloberflächen-Retensionstest

In vitro Zelloberflächen-Retensionstests wurden bei 37°C durchgeführt, wie in Adams, G. P. et al., Br. J. Cancer 77, (1998), 1405-1412 beschrieben, außer daß der Nachweis des zurückgehaltenen F_V-Antikörper-Konstruktes unter Verwendung des monoklonalen anti-c-myc-Antikörpers 9E10 (IC Chemikalien, Deutschland), gefolgt von FITC-markiertem anti-Maus IgG erfolgte. Kinetische Dissoziationskonstanten (K_off) wurden berechnet unter Verwendung einer Gleichung F_t = F_oxe^-kt, wobei F_t Fluoreszenz am Zeitpunkt t, F_o Fluoreszenz am Zeitpunkt 0 und k k_off ist. Die Assoziations-Halbwertszeit (t_1/2) für das F_V- Antikörper-Konstrukt wurde mittels der Gleichung t_1/2 = Ln 2/ k_off berechnet.

Es wurden die in Tabelle 1 angegebenen Daten erhalten. Tabelle 1 zeigt auch Daten, die mit Vergleichskonstrukten erhalten wurden. Aus der Tabelle 1 geht hervor, daß ein erfindungsgemäßes F_V-Antikörper-Konstrukt, das als Monomer scF_V-1 von Fig. 1 enthält, eine starke Affinität zu seinem Antigen, d. h. etwa 2,5-fach stärker als z. B. ein Vergleichskonstrukt, das als Monomer scF_V-10 von Fig. 1 umfaßt, hat. Ferner hat das erfindungsgemäße F_V-Antikörper-Konstrukt eine lange Verweilzeit an seinem Antigen, d. h. 26,6 min gegenüber 13,3 min bzw. 6,7 min von Vergleichskonstrukten.

Somit wird deutlich, daß ein erfindungsgemäßes F_V-Antikörper- Konstrukt bestens für diagnostische und therapeutische Maßnahmen geeignet ist.

Tabelle 1

Claims

1. Tetrameres F_V-Antikörper-Konstrukt, bei dem die V_H- und V_L-Domänen der einzelnen Monomere jeweils über eine Aminosäure miteinander verbunden sind.

2. F_V-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure ein Serin, ein Glycin oder ein Prolin ist.

3. F_V-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei das F_V-Antikörper-Konstrukt monospezifisch ist.

4. F_V-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei das F_V-Antikörper-Konstrukt bispezifisch ist.

5. F_V-Antikörper-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-3, wobei das F_V-Antikörper-Konstrukt gegen das humane B-Zell Antigen CD19 gerichtet ist.

6. F_V-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 5, wobei als Monomer scF_V-1 von Fig. 1 vorliegt.

7. Monomer (scF_V-1), das sich zur Ausbildung des F_V- Antikörper-Konstruktes nach Anspruch 1 eignet.

8. Monomer (scF_V-1) nach Anspruch 7, wobei scF_V-1 jenes von Fig. 1 ist.

9. DNA, kodierend für das Monomer nach Anspruch 7 oder 8.

10. Expressionsplasmid, enthaltend die DNA nach Anspruch 9.

11. Expressionsplasmid nach Anspruch 10, wobei die DNA für scF_V-1 von Fig. 1 kodiert.

12. Verfahren zur Herstellung des F_V-Antikörper-Konstruktes nach Anspruch 1, bei dem eine DNA, die für eine V_H- und eine V_L-Domäne kodiert, wobei die Domänen über eine Aminosäure miteinander verbunden sind, in ein Expressionsplasmid inseriert und über dieses in Zellen exprimiert wird.

13. Verwendung des F_V-Antikörper-Konstruktes nach einem der Ansprüche 1-6 zur Diagnose und/oder Therapie von Erkrankungen.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Erkrankungen virale, bakterielle oder Tumor-Erkrankungen, z. B. B-Zell Tumoren, umfassen.