LU86533A1 - Compositions pharmaceutiques antivirales et antitumorales - Google Patents

Description

Μ «.

"Compositions pharmaceutiques antivirales et antitumo-rales"___________________________________

La présente invention est relative à de nouvelles compositions convenant pour combattre les - virus et les tumeurs, c'est-à-dire pour l'élimination, l'amélioration, la palliation ou l'allègement des virus et des tumeurs, ainsi que des états qui en résultent, par exemple des affflictions, des infections ou des maladies, ces compositions contenant, en plus d'un compo-' 10 sé de xanthate actif connu, qui est antiviral et anti tumoral, un adjuvant ionique comportant à la fois un groupe lipophile et un groupe hydrophile, améliorant ou accroissant leur action antivirale et antitumorale.

Dans la demande de brevet allemand 15 publiée no.3.146.772, ainsi que dans le brevet britannique no.2.091.244, dans les brevets canadiens nos.-1.174.978 et 1.175.047. et dans le brevet des Etats-Unis d’Amérique no.4.602.037 délivré le 22 juillet 1986. on a décrit des xanthates qui ont des pro-20 priétés pharmacologiques intéressantes, en particulier une activité ou un effet antiviral et antitumoral.

On a maintenant constaté que certains adjuvants, qui par eux-mêmes ne montrent pas d’activité antivirale ou antitumorale, améliorent l'action des 25 xanthates antiviraux et antitumoraux, spécialement ceux décrits dans la demande de brevet allemand publiée no.3.146.772 du 2 septembre 1982, dans le brevet britannique no.2.091.244 publié le 28 juillet 1982 et ^ ί \ * 2 délivré le 6 février 1985, dans les brevets canadiens nos.1.174.978 et 1.175.047 tous deux du 25 septembre 1984, et dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique mentionné ci-dessus.

5 La présente invention est en consé quence relative à des compositions antivirales et antitumorales, qui sont intéressantes pour le soulagement des états viraux et tumoraux et qui contiennent, à titre de substance active, un composé de xanthate antivi-ral et antitumoral connu, en particulier un composé de xanthate répondant â la formule I suivante: R1-0-C^^ (I) ^ S-R2 15 dans laquelle R1 représente un groupe norbornyle, tri- c cyclodécyle (notamment adamantyle). benzyle, alkyle en C0-C0q à chaîne droite ou ramifiée, cycloalkyle en C^-CO0> furyle, pyridyle ou quinuclidinyle, ou bien le groupe alkyle en C.^-C90 à chaîne droite ou ramifiée, mentionné ci-dessus et substitué par le radical hydro- xyle ou un groupe alcoxv en C.-C·,, ou par un halogene, 1 ^ ou bien le groupe cycloalkyle en C0-C00 mentionné ci-dessus et éventuellement substitué par un radical hy-droxyle, alcoxy en C -C^, alkyle en C^-C^ ou par un 25 halogène, R2 représente un atome de métal monovalent ou multivalent, un groupe alkyle en C^-C^ à chaîne droite ou ramifiée, qui peut éventuellement être substitué par un radical hydroxyle, alcoxy en C^-C^, amino, alkylami-no en C.-C., (alkvle en G' -C. )„-amino, (alkyle en 14 1 4 Δ 30 C1-C9)^-amino ou un halogène, ou bien un groupe 2,3-di-hydroxypropyle ou «J-hydroxy-(alcoxy en C^-C )-méthyle, ces compositions étant caractérisées en ce qu'elles comportent au moins un composé adjuvant ionique comportant â la fois un groupe lipophile et un groupe • 3 h>Irophile.

Les deux ingrédiens sont essentiels suivant l'invention et, en conséquence, les compositions de celle-ci comprennent ces deux ingrédients ou 5 consistent essentiellement en ces deux ingrédients.

Le composé ionique adjuvant ou "accroissant l'action", comportant à la fois un groupe lipophile et un groupe hydrophile, est de préférence un composé dont le groupe lipophile est un groupe alipha-10 tique à chaîne droite ou ramifiée de 6 à 18 atomes de carbone inclusivement, tandis que le groupe hydrophile comprend de préférence un ou deux radicaux carboxyle et/un ou deux groupes sulfate, sulfonate ou phosphate. Le composé est avantageusement un acide aliphatique 15 monocarboxylique ou dicarboxylique de 6 â 18 atomes de 1«- carbone inclusivement, ou bien un composé mono- ou disulfate, mono- ou disulfonate ou mono- ou diphospha-te, comprenant le même nombre d'atomes de carbone et qui peut en outre comprendre un ou deux groupes éther 20 et/ou amide. Peuvent aussi convenir des acides aliphatiques monocarboxyliques de 9 à 13 atomes de carbone inclusivement, ainsi que des sulfates d'alcools gras, des éthers-sulfates d'alcools gras, des phosphates d'alcools gras, des éthers-phosphates d'alcools gras, 25 des sulfonates d'alcane, des sulfonates oléfiniques, des esters d'acides sulfocarboxyliques et des sulfates de glycérides, comportant dans chaque cas de 8 à 18 atomes de carbone inclusivement. On peut avantageusement utiliser des acides stéroïdaux, tels que l’acide 30 désoxycholique, de préférence sous la forme d'un sel de métal alcalin, par exemple le sel de sodium ou de potassium. Sont particulièrement avantageux des sulfates d'alcools gras ou les acides gras naturels, comportant de 8 à 18 atomes de carbone, en particulier de 8 à 14, % l 4 et plus particulièrement de 10 à 12. Un nombre de 11 • atomes de carbone semble être le nombre optimal dans cette série. D'une manière général, le composé adjuvant peut avantageusement contenir environ 8 à environ 24 5 atomes de carbone inclusivement, de préférence de 8 à 14, il est de préférence anionique et il est avantageusement utilisé sous la forme d’un sel acceptable en pharmacie, par exemple sous la forme d'un sel de métal alcalin, tel que le sel de sodium ou de potassium.

La description suivante de l'invention se référera aux dessins annexés.

La Figure 1 est un graphique illustrant la fixation d’uridine radioactive dans des cellules de fibroblastes d’embryons de souris, transformées 15 et non transformées (normales), avec diverses combinaisons d'ingrédient actif (D609) et d’adjuvant, combinaisons dans lesquelles la quantité de l'ingrédient actif est fixée à 20 μ/ml et la quantité d'adjuvant varie entre 10 et 100 μ/ml.

20 La Figure 2 est un graphique montrant la sensibilité de tumeurs de la peau provoquées, au traitement par voie intraveineuse (IV) avec des compositions de l’invention et avec leurs composants individuels a des concentrations pouvant être mises en corré-25 lation (10 mg/kg).

La Figure 3 est un graphique illustrant l'influence de la longueur de chaîne des acides monocarboxyliques sur l'activité antivirale et la cytotoxicité en combinaison avec du D609 à la fois sur 30 des cellules non infectées et sur des cellules Rita infectées par HSV-i.

La Figure 4 est un graphique illustrant l'inhibition de la croissance d'un virus herpes par diverses concentrations de D609 en combinaison avec « 5 » ( de l'acide undécanoïque dans diverses proportions.

5 La Figure 5 montre un diagramme d’é lectrophorèse en gel, mettant en évidence 1’inhibition totale d'une réplication du virus HTLVIII.

5 La Figure 6 est un diagramme montrant les résultats du traitement d'une tumeur Meth-A immédiatement après transplantation en utilisant une combinaison de D609 et d'acide undécanoïque.

La Figure 7 est un diagramme montrant 10 les résultats du traitement d'une tumeur Meth-A nettement après transplantation en utilisant une combinaison de D609 et d'acide undécanoïque.

La Figure 8 est un graphique montrant la sensibilité de lymphocytes normaux du sang et 15 de lymphomes de cellules T et de cellules B à une combinaison de D609 et d'acide undécanoïque.

Les buts de la presente invention sont de prévoir: une composition antivirale et antitumorale comprenant un composé de xanthate actif connu, 20 antiviral et antitumoral, et une quantité, renforçant l'activité, d'un compose adjuvant ionique comportant à la fois un fragment hydrophile et un fragment lipophi-le, cet adjuvant étendant egalement l'effet du xanthate antiviral et antitumoral sur une plus large gamme de 25 pH, notamment la gamme de pH physiologiques; un procédé pour la préparation d’une composition de ce genre; l'utilisation d'une telle composition en thérapeutique antivirale ou antitumorale; et un procédé pour combattre un virus ou une tumeur, ce procédé comprenant 1'ad-30 ministration concourante à un sujet ou à un site affligé d’un virus ou d'une tumeur, d'une quantité d’un xanthate antiviral et antitumoral, en même temps que d'une quantité, renforçant l’activité, d'un adjuvant ionique contenant à la fois un groupe lipophile et un groupe • 6 hydrophile, ces quantités combinées étant efficaces pour une telle action antivirale ou antitumorale, en étant utilisées soit individuellement, soit sous la forme d'une composition unitaire les contenant. D'au-5 très buts de 1'invention apparaîtront de la description suivante, tandis que d’autres buts encore seront évidents pour les spécialistes en ce domaine.

Ce que la demanderesse considère notamment comme constituant l'invention est constitué 10 par: une composition antivirale et antitumorale comprenant (a) un xanthate antiviral et antitumoral et (b) un compose adjuvant ionique contenant à la fois un groupe lipophile et un groupe hydrophile; - une composition dans laquelle le xanthate (a) répond " a la formule I: i^-O-C^^ (I) ^S-R2 20 dans laquelle R1 représente un groupe norbornyle, tricyclodécyle, benzyle, alkyle en C3-C20, cycloal-kyle en C3-C2Q, furyle, pyridyle, quinuclidinyle, un groupe cycloalkyle en C0-C9Q substitué par un radical hydroxyle, alcoxy en C^-C ou Par un halogène, 25 ou bien un groupe cycloalkyle en C3-CO0 substitué par un radical hydroxyle, alcoxy en C..-C,, alkyle en 2 i 4 C,-C, ou un halogène, et R représente un atome de 1 4 métal monovalent ou multivalent, un groupe alkyle en C -C,. , un groupe alkyle en C-C,. substitué par un 16 16 30 radical hydroxyle, alcoxy en C.-C,, amino, alkyla- mino en C -C,, (alkvle en C.-C,)--amino, (alkyle en 1 4 * 14 2 C,—C )_-amino, ou par un halogène, ou bien un groupe 1 4 3 2,3-dihydroxypropyle ou t^-hydroxy-(alcoxy en C -C )-méthyle; ' , 7 « t une composition dans laquelle le composé adjuvant est un composé dans lequel le groupe lipophile comprend un groupe aliphatique de 6 à 18 atomes de carbone inclusivement, et le groupe hydrophile comprend 5 un ou deux groupes carboxyle, sulfate, sulfonate ou phosphate, ou un sel acceptable en pharmacie d'un tel composé; une composition dans laquelle le composé adjuvant est un acide aliphatique monocarboxylique ou dicar-10 boxylique, ou un tel acide qui est fluoré, ou bien un mono- ou disulfate, un mono- ou disulfonate, ou un mono- ou diphosphate aromatique, dans chaque cas avec de 6 a 18 atomes de carbone inclusivement, ou bien un tel composé comportant un ou deux groupes 15 éther ou amide. ou un sel acceptable en pharmacie d'un tel composé; une composition dans laquelle le composé adjuvant est un acide monocarboxylique aliphatique comportant de 9 à 12 atomes de carbone inclusivement, ou bien 20 un tel acide qui est fluoré, ou un sel acceptable en pharmacie d'un tel composé, ou bien un sulfate d’alcool gras, un phosphate d'alcool gras, un éther-phosphate d'alcool gras, un éther-sulfate d'alcool gras, un sulfonate d’alcane, un sulfonate défini -25 que, un ester d'acide suifocarboxylique ou un sul fate de glycéride, comportant dans chaque cas de 8 à 18 atomes de carbone inclusivement, ou bien un sel acceptable en pharmacie d'un tel composé; une composition dans laquelle le composé adjuvant 30 est un sulfate d'alcool gras ou un acide gras natu rel , comportant environ 8 à 18 atomes de carbone inclusivement, ou un sel acceptable en pharmacie d'un tel composé; une composition dans laquelle le composé adjuvant 8

* V

est anionique et comporte environ 8 à 24 atomes de carbone inclusivement, de préférence de 8 à 14; - une composition dans laquelle le xanthate est un

composé répondant à la formule I dans laquelle R

5 représente un groupe bensyle, cyclodécyle, tricyclo- hexyle, 1-norbornyle, cyclododécyle, n-dodécyle ou 2 4-isobornylcyclohexyle, et dans laquelle R représente le sodium ou le potassium ou un groupe alkyle en C-C,, cette composition comportant, comme compo-1 4 l'-1 sé adjuvant, un acide gras naturel ou un sulfate d'alcool gras de 8 à 14 atomes de carbone inclusivement, ou un sel de métal alcalin d'un tel composé; une composition dans laquelle le xanthate est l'un des xanthates suivants : Ί·-' benzylxanthate de sodium ou de potassium cyclohexylxanthate de sodium ou de potassium 1-adamantylxanthate de sodium ou de potassium ** r) 0 ee^-tricyclo-tS^.l.O-’ ]-décylxanthate de sodium ou de potassium 20 2-endo ou exo-bicyclo [2.2.11 ’14]-heptylxanthate de sodium ou de potassium cyclododécylxanthate de sodium ou de potassium n-dodécylxanthate de sodium ou de potassium ou 4-isorbornyl-cyclohexylxanthate de sodium ou de po-25 tassium et dans laquelle le composé adjuvant est un acide monocarboxylique aliphatique comportant de 9 à 13 atomes de carbone inclusivement, ou un sel de sodium ou de potassium d'un tel acide, ou un éther-sulfate, 30 un phosphate ou un phosphonate d’alcool gras de 8 à 18 atomes de carbone inclusivement, ou le sel de potassium ou de sodium d'un tel acide, ou un désoxy-cholate de métal alcalin; une composition dans laquelle le composé adjuvant . ' 9 * *· / est le sel de sodium ou de potassium d'acide déca-noïque, d'acide undécanoïque, d'acide dodécanoïque, d'acide désoxycholique, le sulfate de dodécyle ou l'acide dodécylphosphonique; 5 _ une composition dans laquelle le rapport molaire en tre le xanthate et le composé adjuvant est de l'ordre de 1/6 à 1/0,25, de préférence de 1/3 à 1/0,5, et plus spécialement de 1/1 à 1/2; une composition sous une forme d'application par 10 voie topique, orale ou parentérale, spécialement sous la forme d'un onguent, d'un gel ou d'un pulvérisation, ou bien sous la forme d'un comprimé, d'une gelule, d'un suppositoire ou d'une solution pour perfusion ou injection; 15 - un procédé de production d'une composition antivira le et antitumorale, présentant une activité antivirale et antitumorale améliorée, ce procédé comprenant le mélange, sous la forme d'une composition pharmaceutique, d'un composé de xanthate antiviral 20 et antitumoral connu et d'une quantité, renforçant l'activité, d'un composé adjuvant ionique comportant à la fois un groupe hydrophile et un groupe lipophi-le; un procédé dans lequel le rapport molaire entre le 25 xanthate et le composé adjuvant est de l’ordre de 1/6 à 1/0,25, de préférence de 1/3 à 1/0,5, et plus particulièrement de 1/1 à 1/2; un procédé dans lequel l'adjuvant est anionique et la composition produite est sous une forme d'appli-30 cation topique, orale ou parentérale, en particulier sous la forme d'un onguent, d'un gel ou d'une pulvérisation, ou sous la forme d'un comprimé, d'une gel-lule, d'un suppositoire ou d'une solution pour perfusion ou injection; #. fr 10 l'utilisation d'une telle cou,position à titre d'agent antiviral ou antitumoral; - un procédé pour combattre un virus ou une tumeur, qui consiste à administrer à un sujet ou à un site 5 affligé d'un virus ou d'une tumeur, susceptible d'un traitement par un agent chimiothérapeutique, d'une quantité d'un xanthate antiviral et antitumoral en même temps que d'une quantité, améliorant l’activité, d'un composé adjuvant ionique contenant à la 10 fois un groupe lipophile et un groupe hydrophile, ces quantités combinées étant efficaces pour une telle action antivirale ou antitumorale; et un procédé pour combattre un virus ou une tumeur, qui consiste à administrer à un sujet ou à un site 15 affligé d’un virus ou d'une tumeur, susceptible d’un traitement par une telle composition, d'une composition de xanthate antivirale et antitumorale, comprenant un adjuvant anionique, en une quantité efficace pour soulager l'état susdit.

20 Suivant l'invention, il est avanta geux que le groupe hydrophile, à savoir le groupe car-boxyle, sulfate, sulfonate ou phosphate, du composé adjuvant soit localisé à une extrémité de la partie aliphatique de préférence allongée qui constitue le groupe 25 lipophile, en formant ainsi une molécule polaire comportant une "tête" hydrophile et un "corps" lipophile. Les acides carboxyliques de ce type, que l'on préfère particulièrement, sont l'acide décanoïque, l'acide un-décanoïque et l'acide dodécanoïque. Les composés adju-30 vants sont par conséquent de préférence des composés comportant un groupe hydrophile anionique, que l'on préfère spécialement sous la forme de sels comptabiles en pharmacie, en particulier un sel de métal alcalin et spécialement un sel de sodium ou de potassium, bien que », n 11 de nombreux composés cationiques, tels que les sels d'ammonium quaternaire, soient disponibles en pratique et puissent également être employés avantageusement dans certains cas, pourvu qu'ils répondent aux autres 5 critères mentionnés précédemment, par exemple les fragments lipophile et hydrophile, et ce comme cela sera démontré plus complètement encore par la suite.

L'acide carboxylique peut également être fluoré ou perfluoré, ce qui signifie que, dans de 10 tels acides carboxyliques, certains, de nombreux ou tous les atomes H des liaisons CH peuvent être remplacés par des atomes de fluor.

D’autres exemples de composés adjuvants de ce type sont les sulfates d'alcools gras (es-ters d'acide sulfurique et d'alcools gras), tels que, par exemple, le dodécyl sulfate de sodium (SDS), le lauryl sulfate d'ammonium, les éthers-sulfates d'alcools gras (éthers-sulfates d'alkyle), par exemple R{0-CH„-CHo)0-0S0oNa, alkylsulfo-acétates de sodium 20 R-0-CO-CH0-SQ0Na, un suifocolaurate, un sel de potassium d'un ester d'acide laurique 0Ho- ( CH0 ) Λ -C00-CHoCH._,-NH-C0-CH„,-Sü„K , des sulfates

o i 1U — ^ J

d'alkvlol amide (alkylolamides d'acides gras sulfatés) R-CONH-R1-OSO^,Na (R1. = CHr, par exemple), les sulfonates -5 d'alcane (et les sulfonates d'hydroxyalcane), les sulfonates oléfiniques, les esters d'acides gras α-sulfo, les alkyl (par exemple dodécyl)-benzène sulfonates, les suifosuccinates, par exemple: monoester diester 30 SQ„Na SO„Na I 3 | -

HC—- COOR HC — COOR

I I

H C — COONa H„C —- COOR, < JLa

·, B

12 notant ent le dioctyl-sulfosuccinate de sodium p- Γ2»5 HC- COO— CH-—· CH —— ( Ch'2 /-,-CH, H2C— COO —CH2— CH—(CH2)j-CH^ C2H5 des produits de condensation d'acides gras, par exem- 10 pie, les isothionates d’acides gras R-COO-CH,.-CH.--S0_ Na , les méthyltaurides d'acides gras Λ Λ

R .........- CO

\ N-CH2-CH„-S0oNa 15 / h3c

les sarcosides d'acides gras H-C

Λ N-CH.-COONa /

R-CO

les produits de condensation de protéines et d'acides 25 gras (produits de condensation de polypeptides et d'acides gras) tels que:

R

R-CO-NH-R-(CO-NH-CH-)n-COOM 30

R R

i i par exemple, H C -CO-NH-CH-(CO-NH-CH)n-COOK,

«L X

les éthers-phosphates d'alcools gras (esters d'acide 13 *0 ί phosphobique et d'alcools gras), tels que 0

II

R-0-(CH2-CH2-Q)n-P-ONa ONa par exemple le phosphate d'éther oléylique éthoxylé, les sulfates de monoglycérides, tels que:

HoC-0-C0-R

10 I

HC-ÖH

HoC-0-S0,,Na le sulforicinoléate (huile de ricin sulfonée) et 15 Na-SO^-O-C.^H^-COONa.

Les radicaux R dans les formules mentionnées précédemment sont des groupes alkyle, dont la longueur est prévue de manière à assurer que le nombre total d'atomes de carbone de chaque composé se situe 20 dans l'intervalle d'environ 6 à 18.

Sont spécialement avantageuses, les substances actives de la formule I, dans laquelle R^ représente un groupe bensyle, cyclohexyle, 1-adamanty-le, tricyclodecvle, 1-norbornyle, cyclododécyle, n-do--5 décyle, ou 4-isobornyl-cyclohexyle et R2 représente un ion sodium ou potassium ou un groupe alkyle en C^-C^.

Des exemples de substances actives antivirales et antitumorales avantageuses sont les xan-thates de sodium ou de potassium suivants: benzylxanthate, cyclohexylxanthate, adamantylxanthate (D424), 8(9)-tricyclo-[5.2.1.0^,fa]-décylxanthate (D6Q9), 1 4 2-endo ou exo-bicyclo [2.2.1 ’ ]-heptylxanthate (D611), N ^ 14 cyclododécylxanthate (D435), n-dodécylxanthate et 4-isobornyl-cyclohexylxanthate (D622).

Le xanthate actif et l'adjuvant aug-5 mentant 1’activité suivant 1'invention se trouvent avantageusement dans un rapport molaire de 1/6 à 1/0,25, de préférence dans un rapport molaire de 1/3 à 1/0,5, et plus particulièrement dans un rapport molaire de 1/1 à 1/2 (xanthate actif/composé adjuvant). Les compositions suivant l'invention peuvent s'appliquer par voie topique, orale ou parentérale. Des formes appropriées d'application par voie orale ou parentérale sont les comprimés, les gelules, les suppositoires et les solutions de perfusion ou d'injection. Ces formes d'application se préparent avec les adjuvants, les ex-" cipients et les diluants habituels, compatibles du point de vue pharmaceutique.

La dose à utiliser dépend principalement de la forme d'application particulière et du but 2(-' de l'application, c'est-à-dire du but de la thérapeutique ou de la prophylaxie. L'importance de la dose individuelle, ainsi que le régime d'application peuvent être déterminés de la façon la plus commode grâce à une estimation individuelle du cas particulier. Habituelle-25 ment, la quantité active du point de vue thérapeutique de la combinaison suivant l'invention, que l'on utilise pour une injection, se situe dans une gamme de doses d'environ 0,005 à environ 10mg par kg de poids corporel, de préférence dans la gamme d'environ 0,01 à envi-30 ron 0,1 mg par kg de poids corporel. En plus de la combinaison suivant l’invention, ces formes d'application orales ou parentérales contiennent habituellement un tampon qui maintient la valeur du pH entre environ 7 et 8, en particulier environ 7,4, et en outre du chlorure 15 de sodium, du manitol ou du sorbitol pour 1’ajustement isotonique. Les compositions suivant l'invention peuvent également se préparer sous une forme lyophilisée ou solidifiée. Evidemment, lorsque l'objet est de tuer ^ un virus extérieur au corps d'un être vivant, la combinaison peut s'employer sans considérations thérapeutiques ou pharmaceutiques.

Une préparation appropriée pour une application topique peut se faire en solution aqueuse, 1^ par exemple en dissolvant la combinaison suivant l'invention dans une solution de tampon aqueuse et en ajoutant ensuite un agent épaississant polymère, par exemple de la polyvinyl pyrrolidone.

Une forme d'application oléagineuse 15 appropriée pour une application topique peut s'obtenir, par exemple, en mettant en suspension la combinaison suivant l'invention dans une huile, en ajoutant ensuite un agent gonflant, tel que du stéarate d’aluminium et/ou un agent actif végétal, dont la valeur EHL {équi-2u libre hydrophile-lipophile) se situe de façon convenable en dessous d'environ 10, par exemple un monoester d'acide gras d'un polyalcool, tel que le monostéarate de glycérine ou le monooléate de sorbitan.

On peut préparer un onguent gras ap-25 proprié, par exemple en mettant en suspension les deux substances actives suivant 1'invention dans une base d'onguent, et en ajoutant ensuite un agent tensio-actif d'une valeur EHL inférieure à 10. On peut obtenir un onguent en émulsion d'une manière silimaire, par exem-u0 pie en mélangeant une solution aqueuse des deux substances actives suivant l’invention dans une base d'onguent molle et en ajoutant un agent tensio-actif d'une valeur EHL inférieur à environ 10. Toutes ces formes d'applications topiques peuvent également contenir des ' 16

•y I

agents de conservation. La concentration des deux substances actives dans le mélange total est d’environ 0,05 à 5 mg, de préférence de 0,25 à 1 mg pour environ 100 mg de la composition totale, les limites les plus 5 larges allant jusqu’à 10 mg par 100 mg de composition totale.

Les xanthates de la formule générale I sont connus et peuvent se préparer, par exemple, par la réaction d’un alcoolate de la formule R^-O-Me, dans 10 laquelle R. a la définition donnée précédemment et Me représente un atome de métal alcalin, avec du disulfure de carbone, ou par la réaction d’un alcool, qui correspond à 1’alcoolate mentionné ci-dessus, avec du disulfure de carbone en presence d’une base alcaline forte, 15 et ce d’une manière connue en soi. Une telle préparation a été décrite dans la demande de brevet allemand publiée no.3.146.772 et dans les autres brevets cités précédemment. Sous ce rapport, une référence expresse est faite à ces documents publiés.

2° Le second composant de la composition suivant l’invention, à savoir le composant adjuvant ionique comportant à la fois un fragment lipophile et un fragment hydrophile, peut, à titre d’exemple, être choisi parmi les acides monocarboxyliques et dicarboxy-liques disponibles sur le marché, les composés mono- et disulfate, les composés mono- et disulfonate et les composés mono- et diphosphate, comportant un groupe aliphatique saturé ou non, à chaîne droite ou ramifiée, comportant par exemple environ 6a 18 atomes de car-bone. Des composés de ce type peuvent avantageusement être transformés en les sels correspondants, d’une manière connue en soi, en utilisant une base qui fournit un sel compatible du point de vue pharmaceutique.

Des résultats obtenus à la suite *> 1 17 d'examens pharmacologiques sont présentés ci-après.

1. Cytotoxicité.

Sustances testées : o £ 8(9)-tricyclo-[5.2.1.0 ’ ]-décylxanthate de potassium 5 (D609) abrévation: "DEXA", en combinaison avec diffé rents acides carboxyliques à longue chaîne, qui sont identifies dans le tableau suivant.

Cultures de cellules employées : fibroblastes d’embryons de hamster normaux (HEF); fibroblastes d'embryons de hamster transformés par le virus du papillome bovin (HEF-BPV).

Milieu : milieu basique de Eagle avec des sels de Earle (BME), complétés par 10% de sérum de foetus de veau (FBS). 1% de pénicilline, de la streptomycine; pH = 15 7,4.

Méthode : les types indiqués de cellules sont incubés in vitro dans le milieu mentionné. A chaque échantillon, on ajoute une combinaison constituée par 20 ul de la substance active DEXA mentionnée précédemment et par des quantités graduellement croissantes d'un acide gras (mentionné dans le Tableau suivant). Après trois jours, les cultures sont examinées au microscope, pour déterminer ainsi la concentration toxique minimale. Les résultats sont résumés dans le Tableau suivant.

25 30 18 TABLEAU 1

Combinaison Culture HEF Culture HEF-BPV

testée Concentration toxique minimale 5 de 20 ug/ml DEXA + adjuvant.

DEXA + adjuvant adjuvant, adjuvant,

Ug/ml Ug/ml DEXA + acide decanoïque 100 10 10 DEXA + acide undécanoïque 100 10 DEXA + acide dodécanoïque 40 10 DEXA + acide myristique 30 10

Le Tableau 1 montre que la combinai-15 son de la substance active DEXA et d'un acide gras est nettement plus toxique pour la culture de cellules transformées que pour la culture de cellules qui n'a pas été transformée. Ceci s'applique particulièrement à la combinaison avec l'acide decanoïque et à la combine naison avec l'acide undécanoïque, ces combinaisons étant dix fois plus toxiques pour la culture de cellules transformées que pour la culture de cellules normales .

Dans un autre essai de cytotoxicité, -5 on a vérifié différentes combinaisons suivant l'invention, pour ce qui concerne leur toxicité, dans des cultures de cellules de fibroblastes d'embryons de souris (MEF) et dans des cultures de cellules de fibroblastes d'embryons de souris transformés (MEF-K1). Ces cultures 30 de cellules sont incubées dans le milieu suivant: BME, 5% de plasma de veau, pénicilline, streptomycine, pH = 7,4. Les essais ont été réalisés de façon analogue aux indications mentionnées précédemment, mais a la différence que l’estimation microscopique a été faite après +, k 19 24 heures. Les résultats sont résumés dans le Tableau 2. suivant.

!ABLEAU_2 5 Combinaison Culture MEF Culture MEF-K1 testée Concentration toxique minimale de 20 ug/ml DEXA + adjuvant. DEXA + adjuvant adjuvant, adjuvant, pg/ml Ug/ml 10 DEXA + décanoate de K S0 10 DEXA + acide déconoique — 40 DEXA + acide undecanoique 80 10 DEXA + undécanoate de K 80 10 15 DEXA + acide docécanoïque 60 20 DEXA + acidfe tridécanoïque 60 10 DEXA + acide têtradécanoique 80 10-20

Le Tableau 2 montre que les combinai-20 sons essayées sont de loin plus toxiques pour les cultures de cellules transformées que pour les cultures de cellules normales.

La sélectivité de l'action toxique du DEXA en combinaison avec de l'acide undécanoïque vis-à-25 vis de cultures de cellules transformées est encore plus évidente dans l'essai suivant qui est basé sur l’introduction d’uridine marquée au tritium (~'H uridi-ne) .

Des fibroblastes d'embryons de souris 30 normaux (MEF) et des fibroblastes d’embyrons de souris transformés par le virus du papillome des bovins (MEF-BPV) ont été ensemencés sur des plaques de Linbro 5 (2 x 10 cellules par trou) et traités avec une combinaison de 20ug/ml de DEXA et de quantités croissantes

*. I

20 (10, 20, 40, 60 et 80 ug/ml d'acide undécanoïque. Comme milieu, on a utilisé le milieu basal de Eagle avec le sel de Earle, complétés par 5% de plasma de veau, pH de 7,5 dans une atmosphère à 5% de CO„. Après deux jours, 5 on a ajouté un nouveau milieu contenant lpcCi/ml de 3 H-uridine mais ne contenant pas la substance active mentionnée précédemment. Deux heures plus tard, la quantité de 3H-uridine, qui peut avoir précipité avec l'acide, est déterminée dans chaque culture. Avant de 10 réaliser le comptage total, les composants de bas poids O, moléculaire, notamment la “H-uridine qui n'a pas été incorporée, sont éliminés par lavage. Ensuite, les comptages sont faits sur la culture sèche. Les valeurs moyennes de la radioactivité, mesurées dans les deux 15 cultures, sont présentées par la Figure 1.

Le diagramme de la Figure 1 montre que les cultures de cellules transformées sont détruites ou inactivées de façon sélective par la combinaison suivant l'invention, du fait que la radioactivité, — 7·* 20 c'est-à-dire la “'H-uridine, ne se retrouve que dans la culture de cellules normales, mais non pas dans la culture de cellules transformées.

2. Action antivirale.

L'action inhibitrice de la substance 25 active DEXA, de la combinaison de DEXA et d'acide déca-noïque en différentes concentrations, et d'acide déca-noïque seul a été vérifiée dans différentes cultures in vitro. inoculées par le virus herpes simplex 1 (culture de HSV1). Le milieu avait un pH de 7,4. Après deux 30 jours d'incubation, la production de virus a été déterminée et les unités de formation de plaque (ufp) que l'on donne en pourcentage, ont été calculées par rapport a une culture correspondante sans additifs inhibiteurs, et ce comme illustré par le Tableau suivant.

'· ί 21 TAPLEAU 3

Composés inhibiteurs % ufp, par rapport à une essayés culture de virus, sans 5 inhibiteurs DEXA (20ug/ml 22,6 DEXA (10ug/ml) + acide décanoïque lOug/ml 8,7 10 20pg/ml 0 40ug/ml 0,3 acide décanoïque lOpg/ml 1S,9 20ug/ml 24 40(ig/ml 35

Ce Tableau 3 montre que la combinaison de DEXA et d'acide decanoïque développe une action inhibitrice nettement plus puissante que les composants 20 individuels de la combinaison.

Une combinaison de DEXA et de dodé-cylsulfate de sodium (SDS) a de même inhibé fortement la reproduction de HSV1.

Cellules: Rita P 0/37.

25 Milieu: BME, 5% de FBS, 1% de pénicilline + streptomycine, pH de 7,4, atmosphère à 5% de CO^.

Inhibiteurs: lOug/ml de DEXA + 10, 20, 40, 80 pg/ml de dodécylsulfate (SDS).

Infection des cellules Rita par MOI: 0,05 ufp/cellule 20 Addition d’inhibiteurs: une heure après l'infection (2 cultures dans chaque cas)

Nouvelle récolte des descendants de virus: 24 heures après infection 6

Titre témoin: 7,7 x 10 ufp/ml.

22

Combinaison de subs- Titre Facteur d'inhi- tances actives upf/ml bition.

5 10ug/ml DEXA + lOug/ml SDS 2,5 x 10" 3 x 104 lOug/ml DEXA + 20ug/ml SDS 25 3 x 105 10ug/ml DEXA + 40ug/ml SDS 25 3 x 105 lOug/ml DEXA + 80ug/ml SDS 2,5 3 x 10^ 10 Remarque: la croissance des cellules Rita non infectées n'a pratiquement pas été inhibée par la même combinaison de substances actives.

On a obtenu des résultats analogues avec une combinaison de cyclododécylxanthate (D435) et d'acide undécanoïque. Cette combinaison a également été essayée, par exemple sur des cellules confluentes d'embryons de poumons humains, en employant du HSV-1, avec des résultats inhibiteurs très efficaces. Le même effet 20 a été obtenu en utilisant du D424. du D611 ou du D622 au lieu de D509.

On a également constaté que le virus ARN (virus monocordé), tel que par exemple, le virus de la stomatite vésiculeuse, est inhibé par la combinaison 25 de substances actives, telle que décrite ci-dessus.

Dans un autre essai réalisé sur des cobayes présentant des lésions infestées de HSV, l'effet curatif de la combinaison suivant l'invention et de l'adjuvant seul a été essayé. Les substances identi-20 fiées dans le Tableau 4 ont été mélangées dans un onguent de vaseline aux concentrations mentionnées, et on a ensuite appliqué l'onguent aux lésions provoquées par HSV sur la peau des cobayes (deux fois par jour}.

Les résultats sont tels qu'illustrés 23 dans le Tableau 4 suivant.

TABLEAU„4.

Nombre de lésions % de gué- 5 au début du après 36 heures rison traitement de traitement (96h après inoculation

Agent de trai-10 tement

Vaseline avec 8 8 10% d'acide 10 10 0 décanoïque 9 9 15 -------------------------------------------------------

Vaseline avec 6 4 5% de DEXA et 23 14 10% d'acide 16 5 42 décanoïque 11 8 20 S 6

Le Tableau 4 montre que les résultats curatifs les meilleurs sont de loin ceux obtenus avec une combinaison suivant l'invention.

25 Dans un autre essai concernant 1'ac tion antivirale de la combinaison, on a inoculé six cobayes par du HSV-1 de la famille Wal. Dix heures plus tard, on a amorcé le traitement (deux fois par jour) avec un onguent à la vaseline contenant 5% de DEXA et 30 5% d'acide décanoïque. Après deux jours de traitement (72 heures après l'inoculation), les animaux ont été sacrifiés et la peau infectée a été enlevée. La peau a été congelée par de 1'asote liquide et ensuite pulvérisée dans un mélangeur-agitateur "Mikro Dismembrator" 24 (marque déposée) (deux échantillons par animal), puis elle a été recueillie à nouveau par la suite dans une quantité décuple (en poids/volume) de milieu de culture de tissu. Après une courte centrifugation (une minute, 5 centrifugeuse du type Eppendorf), on a procédé au titrage en virus de la couche supérieure.

Résultat: pas de virus décelable. Le titrage d'un milieu d'essai témoin était de 1 x 105 ufp/g de tissu.

L'influence de la longueur de chaîne 10 des acides monocarboxyliques sur l’activité antivirale et la cystotoxicité, en combinaison avec du D609, est illustrée par la Figure 3. Des cellules Rita non infectées (ß) et des cellules Rita infectées par HSV-1 (B) ont été traitées avec lOpg/ml de D609 et 40ug/ml de 15 chaque acide monocarboxylique (au pH de 7,4).

La production de virus dans les deux cultures a été examinée individuellement par une détermination sur lamelles en double. Les barres d’erreur indiquent l'écart-type. Les densités de cellules des 20 cultures de cellules Rita non traitées et traitées à l’état non infecté (en double) ont été déterminées après coloration au bleu de trypane par comptage en utilisant un hématocytomètre.

3. Activité antitumorale.

25 Traitement de la leucémie lymphatique chez la souris.

Des souris DBA-2 de six semaines ont été inoculées par voie intraveineuse par 1 x 105 cellules de tumeur (NCI-oeuf-leucémie). Dix huit-heures plus tard, on a formé trois groupes de dix animaux chacun. 30 un groupe n'a pas reçu de traitement quelconque et représentait le groupe témoin. Le second groupe a été traité seulement par du DEXA (4 x 15 mg/kg, puis 6x11 mg/kg). Le troisième groupe a été traité par une combinaison suivant l'invention, à savoir du DEXA et de 25 **r l'acide undécanoïque (traitement par le DEXA tel que réalisé pour le groupe 2, avec en outre de l'acide undécanoïque, 4 x 7,5 mg/kg, puis 6 x 5,5 mg/kg).

Toutes les applications ont été fai-5 tes par voie intraveineuse. Les injections ont été faites sur des périodes d'une heure. Le jour suivant (deux jours après l'inoculation par les cellules tumorales), on a prélevé des échantillons de sang de chaque animal et on a déterminé la concentration de lymphocytes. Les 10 résultats sont résumés dans le Tableau 5 suivant.

TABLEAU_5.

Nombre de lymphocytes x 10-b/ml 15 Pas de traitement DEXA DEXA + acide undécanoïque 13.8 17,9 8,6 11,1 15,0 11,7 15.8 24,1 12,0 20 17,3 13,0 9,8 12 18.6 12,8 15.7 15,6 18,4 23 10,7 11,6 18.3 14,6 12,4 25 20,2 13,7 8,4

Valeur moyenne x 10 b/ml 30 16,3 15,9 11,7 p significatif <0,01

Ce Tableau 5 montre que la combinaison suivant 1'invention provoque une réduction 26 importante du nombre des lymphocytes.

Régression des tumeurs de peau autochtones chez la souris, par traitement de l'organisme avec une combinaison suivant l'invention, comprenant du 5 DEXA et de l'acide undécanoique.

On provoqué des tumeurs de peau d'une manière connue en soi sur des souris femelles de sept semaines de la race NMRI. Ceci a impliqué un traitement topique par une seule dose de 25,6 mg de DMBA dissous 10 dans 0,1 ml d'acétone, et sept jours plus tard, avec 6,16 mg de TPA dissous dans 0,1 ml d'acétone, ce dernier milieu étant appliqué deux fois par semaine durant 23 semaines.

Trois semaines après la fin du trai-15 tement favorisant les tumeurs, on a amorcé la chimiothérapie par une injection intraveineuse de 10 mg/kg du composé essayé (1 mg/ml), préalablement dissous dans une solution â 0,9% de NaCl d'un pH de 7,4. Le pH a été ajusté par l'addition de NaOH 0,15 M. On a sélectionné 20 quarante animaux comportant des tumeurs, en formant quatre groupes arbitraires. Onze animaux n’ont pas été traités, dix animaux ont été traités avec du DEXA, dix animaux ont été traités avec de 1'acide undécanoique et neuf animaux ont été traités avec une combinaison de 25 DEXA et d'acide undécanoique (1 mg par ml, 10 mg par kg de chaque substance).

Sur la Figure 2 illustrative, les durées d'injection ont été indiquées par de petits rectangles sur l’axe (abscisse) des temps. La taille de 30 toutes les tumeurs (trois dimensions) a été déterminée au pied à coulisse. On a déterminé de la sorte la taille de 35 tumeurs d'animaux non traités, de 40 tumeurs d'animaux traités par de l'acide undécanoique, de 37 tumeurs d'animaux traités par du DEXA, et de 35

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27 tumeurs d'animaux traités par la combinaison suivant l’invention. La taille initiale des tumeurs variait entre 2 et 400 mm3. La taille de chaque tumeur particulière a été observée durant l'essai. L'accroissement ou 5 la régression a été exprimé en pourcentage de la taille initiale. Les valeurs moyennes de chaque groupe sont présentées par la Figure 2. Le caractère significatif de la régression des tumeurs traitées par la combinaison suivant 1'invention a été déterminé en suivant 10 l'essai T de Student. Après deux jours de traitement, la taille des tumeurs dans le groupe traité différait considérablement de la taille des tumeurs du groupe non traité, en étant de p<10 ^ et en se situant à p<10 7 après 5 jours de traitement.

15 Traitement sous-cutané de tumeurs de peau autochtones.

; 20 animaux d'essai (du type décrit) comportant des tumeurs de peau provoquées par voie chimique, de la façon décrite, ont été subdivisés arbi-traitement en quatre groupes. Le traitement a été réa--0 lise par une injection sous-cutanée au voisinage immédiat des tumeurs, en injectant trois portions de 0,5 ml chacune pendant deux heures durant deux jours. Le troisième jour, on a injecté une seule dose. La solution d'injection contenait 5 mg/ml de DEXA et 5 mg/ml d'aci-25 de undécanoïque. Six jours après le début du traitement, on a procédé à un examen photographique et à un examen visuel.

Résultat: toutes les tumeurs avaient régressé de façon considérable, beaucoup avaient disparu totalement, et 30 toutes les tumeurs étaient réduites d'au moins 50% par rapport à leur taille initiale.

Régression de tumeurs de peau autochtones chez la souris par traitement de l'organisme avec une combinaison suivant l’invention, comprenant du DEXA et de l’acide ο « 28 r»t undécanoplaue.

Des tumeurs de peau ont été produites sur des souris NMRI de la façon décrite précédemment. Deux jours après la dernière application de ΤΡΔ, on a 5 amorcé la chimiothérapie. L'agent de traitement a été administré aux animaux par une injection intraveineuse trois fois par jour. Chaque injection contenait 10 mg/kg de DEXA et 10 mg/kg d'acide undécanoïque (1 mg/ml de chaque composé, en dissolution dans du NaCl 10 à 0,9%). Le pH de la solution a été ajusté à une valeur de 7,4 par du NaOH, 0,15 M. Les animaux ont été photographiés au début et à la fin du traitement, en déterminant le nombre de tumeurs de chaque animal. Quatre semaines après la fin de la thérapie, les tumeurs ont 15 été estimées à nouveau. Aucune récidive (récurrence) n'était visible aux endroits où les tumeurs avaient disparu. Les résultats sont résumés dans le Tableau 6 suivant.

20 25 30 •Λ 29 TABLEAU_6.

> —·—— — — — — —·——“----—

Animal d'essai Nombre de tumeurs Agent de avant traite- après traite- traite-5 ment ment ment 13 3 3 5 3 4 14 4 5 11 8 10 6 5 3 DEXA + 7 5 0 acide un- 8 15 10 décanoï- 9 13 0 que i.v.

10 14 4 116 2 total 91 37 = 59% de régression .

9Q 1 11 10 2 4 3 3 8 7 4 4 2 6 4 0 Témoin 7 7 7 8 5 5 9 10 8 25 10 4 1 11 7 5 total 64 48 = 25% de régression .

30 30

Le Tableau 6 lontre qu'une combinaison suivant l'invention, contenant du DEXA et de l'acide undécanoïque, produit une régression des tumeurs de peau à raison de 59%, tandis que la régression chez les 5 animaux non traités n'était que de 25%.

D'autres résultats d'essai concernant les compositions antivirales et antitumorales suivant l'invention sont données ci-après.

(A) Activité antivirale de D609/acide undécanoïque.

10 On a montré que des composés de xan- thate montrent une’activité antivirale contre divers virus ADN et ARN sous des conditions de pH acide (Sauer, G., Amtmann, E., Melber, K., Knapp, A., Müller, FC., Hummel, K., et Scherm, A.: DNA & RNA virus species 15 are inhibited by xanthates, a dass of antiviral com- pounds with unique properties. Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 81, 3263 - 3267 (1984)). Il est maintenant possible d'utiliser de façon plus efficace le large spectre antiviral remarquable de ces composés sous des condi-20 tions de pH plus élevé et physiologique (pH de 7,4) par l'administration simultanée ou combinée de certains adjuvants ioniques comportant à la fois un fragment hydrophile et un fragment lipophile. C'est ainsi que du tricyclodécan-9-ylxanthate (D609), en combinaison avec 25 les adjuvants formés par les désoxycholates de sodium, le dodécylsulfate de sodium et certains acides gras, qui n'ont pas par eux-mêmes une activité antivirale, empêche la réplication de divers virus ADN et ARN (tels que l'herpes simplex, la stomatite vesiculeuse et le 30 virus Coxsackie B 4 in vitro) au pH de 7,4 (Tableau 7).

Parmi les acides gras saturés de différentes longueurs de chaîne, il y a une différence nette en ce sens que l'efficacité de l'acide undécanoïque (11 atomes de carbone) est de trois ordres de grandeur supérieure à 31 celle d'acides monocarboxyl.ques plus courts (8 atomes de carbone) ou plus longs (13 atomes de carbone). La cinétique de la sensibilité à la dose a montré qu'une dose qui empêchait la réplication du virus herpes d'un 5 facteur de 1000 permettait encore une activité mitotique dans des cultures de croissance témoins non infectées. Un mélange de D609-acide undécanoïque suivant un rapport de 1/1 s'est avéré être le plus avantageux comme on peut le voir de la Figure 4 (cercles pleins). 10 On a aussi obtenu des états similai res dans le cas du virus HTLVIII, qui pouvait être inhibé dans des cultures de tissu par 10pg de D609 combi-; nés avec 10pg d’acide undécanoïque/ml après des pério des d'application de 3 et de 5 jours (Figure 5). Le 15 traitement avec la combinaison laisse non affectée l'activité mitotique de limphocytes du sang humain périphérique, stimulés par mitogène, à des concentrations qui sont capables de détruire les lymphomes des cellules B et T (Section B, Figure 6). Ceci amené la combi-20 naison de D609/acide undécanoïque à convenir potentiellement pour la chimiothérapie du SIDA.

TABLEAU_2.

Effet antiviral de la combinaison de D609/acide undécanoïque sur des virus ARN au pH de 7,4.

25 Espèce de D609 Acide undéca- Production de virus (Ug/ml) noïque (ug/ml) virus0 (ufp/ml) VSVb 0 0 (4,3+1) x 106 5 0 (5,6 + 0,05) X 106 30 0 40 (4,3 + 0,3) X 106 5 40 (1,3 + 0,2) X 104

Coxsackie E4 0 0 (1,15 + 0,2) x 10b 10 40 (7,7 + 0,25) X 10* 32 ab-les valeurs ont été obtenues par des détermina· ions sur cultures en double, et les productions résultantes de virus ont été déterminées en double. La progéniture de VSV a été récoltée 10 heures avec l'infection, et 5 celle de Coxsackie B4 après 24 heures.

Figure 4: Inhibition de la croissance du virus herpes par diverses concentrations de D609 et d'acide undéca-noïque.

La concentration des deux composants 10 est indiquée en abscisse. Le D609 et l'acide undécanoï-que ont été mélangés dans les rapports suivants: ·: 1/1 ; 0:1/2; ·: 1/3 ; 0: 0/1 (acide undécanoïque).

Les concentrations donnant une inhi-bition d'un facteur supérieur à 10“ étaient accompa-15 gnées par des effets cytotoxiques. Par contre, de plus s faibles concentrations ne provoquaient pas de cytotoxi cité décelable dans les cellules témoins non infectées.

On a constaté qu'une concentration de 1/1 (D609/acide undécanoïque,· } est la plus efficace 20 en ce qui concerne la concentration de l’un et l’autre composé et pour ce qui est de leur effet antiviral combiné. De ce fait, on a suggéré d’appliquer les composés dans un rapport de 1/1.

Figure 5: de l’acide nucléique spécifique HTLVIII (ADN 25 en superhélice comme intermédiaire de réplication) a été isolé et visualisé après une électrophorèse en gel et une hybridation avec du ADN HTLVIII marqué par voie radioactive, authentique, cloné. Après traitement pendant trois jours (bande a) et pendant 5 jours (bande 30 c), le signal qui est typique pour le ADN HTLVIII est totalement suprimé, tandis que, dans des cultures infectées non traitées (lymphome T K37) (bandes b et d), le ADN spécifique HTLVIII peut se voir (à la fois la forme en superhélice I et la forme circulaire relâchée 33 II de ADN). Après segmentation avec une endonucléase de restriction â simple coupure, les formes I et II sont converties à la forme linéaire III (bandes f et h). Ces résultats montrent qu'après un tel traitement, la ré-5 plication du HTLVIII peut être totalement inhibée.

(B) Activité antitumorale du D609/acide undécanoïque.

Des composés de xanthate ayant des propriétés antivirales exercent, en combinaison avec des acides monocarboxyliques d'une taille raisonnable 10 (de préférence une longueur de chaîne de 11 ou 12 ato mes de carbone), une activité antitumorale prononcée in vitro.

Le tricyclodécane-9-yl-xanthogénate (D609) ou le cyclododécylxanthogénate (D435), lorsqu'on 15 les administre en même temps que 1'acide undécanoïque 1 ou que l'acide dodécanoïque â diverses cellules trans formées (montrant généralement une faible exigence en sérum), peuvent provoquer une destruction des cellules. Lors d’une application à la même concentration à des 20 cellules normales dont les dérivés transformés déri vent, un tel effet est ou bien non apparent ou bien beaucoup moins sévère.

Ceci est confirme par les résultats du Tableau 8, dans lequel on compare les effets de la 25 combinaison de D609/acide undécanoïque sur des cellules normales et sur leurs dérivés transformés. La destruction sélective des cellules de tumeur (et des cellules transformées par voie chimique ou virale) est évidente en considérant les différences dans les taux de survie 30 allant jusqu'à un facteur de 10- , ce qui est la limite de la possibilité de détection dans les systèmes expérimentaux de détermination. Bien que les cellules normales restent presque non affectées par le traitement, leurs dérivés transformés (montrant une faible exigence 34 en sérum) ne survivent pas au même traitement.

La tumeur Meth-A (fibrosarcome) peut être inhibée avec succès par une application dans le péritoine de la combinaison de D609/acide undécanoïque 5 (Figure 6). Même à des stades plus avancés (5 jours après inoculation), un effet thérapeutique peut être démontré (Figure 7). Un traitement dans l'un ou l'autre cas avec du D609 en l'absence d'acide undécanoïque n'a pratiquement pas d'effet antitumoral démontrable.

10 De plus, la destruction sélective de divers lymphomes de cellules B et T (comparativement à des lymphocytes de sang humain périphérique (pBL), qui résistent au traitement) est illustrée par la Figure 8.

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36 » ·

Tableau 8.

Sensibilité au traitement par xanthate/acide monocarbo-xyligue et caractéristiques de croissance de divers types de cellules.

5 Des cellules ont été ensemencées à une densité de 3,8 x 10 /cm2 dans des ballons en matière plastique ou des boîtes de Petri. Un nouveau milieu de culture de tissu (milieu basal de Eagle complété par 2,2 g de NaHCû^, 1% de pénicilline et de strep-10 tomycine (BME) et 5% de sérum de foetus bovin (FBS) avec 10ug/ml de D609 et 40ug/ml d'acide undécanoïque ou sans cette combinaison a été ajouté 4 heures après l'ensemencement des cellules et les cultures ont été incubées dans une atmosphère à 5% de CO., {= pH 7,4 + 15 0,05) à 37°C (témoins et cultures traitées en double ; dans chaque cas). Après 24 heures, le milieu de culture de tissu a été recomplété, en utilisant du BME complété par 10% de FBS.

§ : les cellules ont été trypsinées 24 heures après sé- 20 paration du D609/acide undécanoïque et le nombre de cellules viables a été déterminé dans un hématocy-tomètre de Neubauer après coloration au bleu de trypane. Le taux de survie est le rapport entre le nombre de cellules dans les cultures non traitées 25 et le nombre dans les cultures traitées.

§§: après 10 jours d'incubation à 37°C, les ballons sont fixés pendant deux minutes dans du formaldéhyde à 2% et colorés pendant une minute avec du Crys-tal violet à 0,5%. Le nombre de cellules qui ont 30 été ensemencées dans les boîtes avant le traitement indique le taux de survie maximal. En aucun cas, il n'est possible de déceler les cellules survivantes.

*: dans des boîtes de Petri de 6cm, on a ensemencé 5 4 x 10 cellules et on les a incubées avec du BME, 37 5% de FBS, dans une atmosphère à 5% de CO^. Après un et deux jours, le nombre des cellules a été déterminé dans deux boîtes pour chaque ligne de cellules . Le temps de dédoublement a été extrapolé en 5 partant des courbes de croissance établies.

**: en partant de chaque type de cellule, on a ensemen- q cé 10“ cellules dans des boîtes de Petri de 6cm et on les a incubées pendant deux semaines dans un milieu contenant 1%, 2%, 5% ou 10% de FBS. Les colo-nies ont été visualisées par coloration au Crystal violet après fixation dans du formaldéhyde à 1%. Figyre_6: Traitement d'une tumeur Meth-A immédiatement après transplantation. Des souris mâles Balb-c (S à 10 semaines, 20g) ont été inoculées par 1 x 10 cellules 15 de tumeur dans le péritoine. Une heure après la transplantation des cellules de tumeur, le traitement des animaux a été amorcé. Dix animaux ont été traités une fois par jour sur une période de cinq jours avec 50 mg/kg de D609 et 50 mg/kg d'acide undécanoïque de K 20 et 25 unîtes d’insuline/kg dans du glucose isotonique.

Les substances ont été inoculées dans le péritoine à raison de 1 ml/20 g de poids d'animal. Dix animaux ont été traités seulement avec de 1'insuline dans du glucose isotonique. Huit animaux du groupe traité par le 25 D609/acide undécanoïque ont survécu pendant plus de 90 jours.

Figure 7: Traitement de la tumeur Meth-A tardivement après transplantation, par du D609/acide undécanoïque. Des souris femelles Balb-c (10 à 12 semaines, 20 g) ont 30 été inoculées dans le péritoine par 1 x 106 cellule de tumeur Meth-A. Cinq jours après transplantation, dix animaux ont été traités avec 50 mg/kg de D609 et 50 mg/kg d'acide undécanoïque de K + 25 unités d'in suline/kg dans du glucose isotonique, deux fois par 38 jour. Les substances ont été dissoutes à raison de 1 mg/20 g de poids d’animal. Le traitement a été arrêté après 25 inoculations. Dix animaux restaient sans traitement à tire d'animaux témoins. Deux animaux du groupe 5 traité (cercles ouverts) ont survécu pendant plus de 55 jours.

L'insuline a été ajoutée dans les essais précédents pour apporter un facteur de croissance nécessaire au corps de l'animal en vue d'augmenter la 10 production de glucose et de renforcer la croissance, la production et la stabilité des cellules.

Figure_8: Sensibilité des lymphocytes normaux du sang et des lymphomes de cellules T et B à une combinaison de D509 et d'acide undécanoïque. Des lymphocytes de 15 sang périphérique (pBL) ont été isolés par centrifuga-1 tion sur des gradients de lympho-préparation. Les cel lules ont été incubées dans un milieu RPMI 1640 complété par 10% de sérum de foetus de veau et 5ug/ml de PHA (phytémaglutinine). Après un jour, les cellules ont été 20 récoltées par centrifugation et transférées sur des 5 plaques de microtitrage (2 x 10 cellule par trou) et un nouveau milieu sans PHA mais complété par 10% de IL-2 (Interleukine-2) a été ajouté. Du D609 et des concentrations croissantes d’acide undécanoïque ont été 25 ajoutés comme montré sur la Figure. Parallèlement, deux lymphomes de cellules T (Jurkat et K37) et deux lymphomes de cellules B (Raji et P3HR1) ont été traités de la même manière. Après quatre jours d’incubation, le nombre de cellules vivantes a été déterminé dans chaque 30 trou, en utilisant la méthode d'exclusion de colorant (bleu de trypane). Dans les cultures de Jurkat, de Raji et de K37, qui ont été traitées avec 5pg de D609 et 40ug/ml d'acide undécanoïque, on n’a pu déceler aucune cellule vivante. Les lymphocytes traités de sang •· ’ή 39 périphérique humain (pBL) étaient cependant encore capables de subir des divisions mitotiques en dépit de ce même traitement.

Comparaison de l'activité antivirale des combinaisons 5 de D609/acide undécanoïque et de D609/bromure de dodé-cyltriméthylammonium au pH de 7,4.

Composé Açtiyité_antivirale_--- Cytotoxicité“--

Acide undé- canoïque (C11) 5,8 x 10“ 1,6 10 Bromure de do- décyltriméthy- lammonium (TNCB} 15 1,6 (a) Des cellules Rita infectées par HSV-1 (MOI = 0,01 15 ufp/cellule) en double ont été traitées pendant 23 - heures après la période d'absorption par 10ug/ml de D609 et ou bien 4Qug/ml de ou bien 20pg/ml de TNCB dans du BME, 5% de FBS, 1% de pénicilline et de streptomycine, pH de 7.4. La progéniture virale 20 a été déterminée dans des déterminations sur la melle et comparée avec la production obtenue de cultures non traitées. L'activité antivirale est indiquée par le facteur d'inhibition de la détermination virale (valeurs moyennes pour deux cultu-•i-’ res ) .

(b) Des cellules Rita non infectees ont été traitées de la façon décrite sous (a) et le nombre de cellules a été déterminé par comptage dans une chambre de comptage de Neubauer. Le rapport entre les cultures 30 non traitées et les cultures traitées est indiqué (valeur moyenne provenant de deux cultures) dans le Tableau.

Résultat: l'adjuvant cationique (TNCB) montre une activité d'ajudvant antivirale spécifique nettement réduite

'V

40 comparativement à l’acide undécanoïque (C^).

Bien que les xanthates antiviraux et ' antitumoraux actifs de l'invention, spécialement le D609, lorsqu'on les utilise seuls, semblent exercer 5 leur activité antivirale de façon plus efficace à un pH acide de 6,8 qu’à un pH légèrement plus élevé de 7,25-7,8, leurs combinaisons avec un adjuvant ionique suivant l'invention constituent des inhibiteurs efficaces de la croissance virale à un pH physiologique d’en-1U viron 7,4. De ce fait, au cours d’autres investiga tions, on a traité des cultures de cellules Rita pendant un jour après infection par du HSV-1, avec du D609 et, en même temps avec l'un des adjuvants énumérés dans le Tableau 9 (un rapport D609/ajuvant de 1,4 a été 15 choisi sur la base d'expériences préliminaires). La s production de progéniture virale a été déterminée par des déterminations sur lamelles et comparée avec la production provenant de cultures infectees non traitées. Un traitement combiné avec du D609 et l'un quel-20 conque des trois premiers adjuvants cités dans le Ta bleau 9 a mené à une inhibition marquée de la croissance de HSV-1 au pH de 7,4. L'effet antiviral amélioré peut être attribué à une cytotoxicité accrue, puisque de 62,5 à 83% des cellules témoins non infectées, sou-25 mises au même traitement que les cultures infectées, étaient encore capables de subir une division mitotique (Tableau 9). Les trois derniers adjuvants du Tableau montraient un effet antiviral minimum comparativement aux trois premiers adjuvants de ce même Tableau.

30

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Autre preuve de 1'inhibition du virus HTLV.II par une combinaison de DEXA-acide undécanoïgue.

Des cellules K37 (lymphome de cellules T humaines) ont été utilisées pour la reproduction 5 du virus HTLVIII. Les cellules K37 infectées de HTLVIII ont été traitées sur une période de trois ou cinq jours après l'infection, avec 10pg de DEXA et lüpg d'acide décanoïque/ml. Les cellules K37 croissent encore sous ces conditions comme mis en évidence par des comptages 10 de cellules (après coloration) avant le début et à la fin (cinq jours) du traitement. De plus, la même quantité de ARN cellulaire (Northern Blot) a été trouvée dans les cellules traitées et dans les cellules non traitées. En même temps, le ADN a été isolé des cellu-15 les traitées susdites et egalement des cultures de K37 infectées non traitées, et on a procédé à une hybridation avec du ADN-HTLVIII authentique cloné, qui a été 32 marqué par du P, et le résultat a été présenté par voie autoradiographique. Un intermediaire de duplica-20 tion du virus HTLVIII est le ADN à superhélice comme c’est le cas pour tous les retrovirus. Ce ADN à superhélice (forme I) et également la forme relâchée II peuvent se voir dans les cultures infectées non traitées après trois jours ainsi qu'après cinq jours sous la 25 forme de taches noires dans l'autoradiogramme (Figures 5b et 5d). Après coupage avec un enzyme de restriction à coupure simple, qui ouvre le ADN annulaire pour donner un ADN linéaire de longueur unitaire, les signaux typiques (Figures 5f et h) sont obtenus à nouveau res-30 pectivement après trois jours et après cinq jours. Il n’était pas possible de déceler, dans la culture traitée après trois ou après cinq jours soit le ADN à super-hélice (Figures 5a et c) soit, après coupure, le ADN linéaire (Figures 5e et f). Ces résultats montrent * t « 43 que le traitement avec le DEXA/acidé undécanoïq le inhibe totalement la réplication du HTLVIII.

Cette inhibition s'effectue dans les cellules K37 à une concentration qui n'endommage pas du 5 point de vue toxique les cellules K37 non infectées.

Seule une augmentation de la concentration mène à une destruction sélective, non seulement des cellules de lymphome T K37 mais également d'autres lymphomes T et B humains, comme on peut le voir sur la Figure 8. La com-10 binaison de DEXA/acide undécanoïque laisse cependant les lymphocytes de sang périphérique humain, stimulés par mitogène (pBL) non endommagés à des concentrations qui sont sélectivement lethale pour les cellules de tumeur .

15 A cet effet, on a isole des lymphocy- - tes de sang périphérique par centrifugation sur des gradients de lymphopréparation. Les cellules ont été incubées dans un milieu RMPI 1640, auquel on a ajouté 10% de sérum de foetus bovin et 5pg/ml de phythémagglu-20 tine (PHA). Après un jour, les cellules ont été transformées en pastilles par centrifugation et transférées sur des lamelles de microtitrage (2 x 10^ cellules par cavité) dans un nouveau milieu sans PHA, contenant toutefois 10% d'interleukine-2. On a ajouté du DEXA et des 25 concentrations croissantes d'acide undécanoïque comme illustré sur la Figure 8. Parallèlement à cela, des lymphomes de cellules T (Jurkat et K37), ainsi que des lymphomes de cellules B (Raji et P3HR1) ont été traités de la même manière. Après une incubation pendant quatre 30 jours, le nombre de cellules vivantes a été déterminé .par des processus d'exclusion en couleur (bleu de try-pane). Dans les cultures Jurkat, Raji et K37, qui ont été traitées avec 5pg de DEXA et 40pg/ml d'acide undécanoïque, on n'a trouvé aucune cellule vivante. Les * ' ( « . 44 lymphocytes de sang périphérique humain traités étaient cependant capables d'assurer une division mitotique même sous de telles conditions. L’inhibition spécifique de la réplication de HTLVIII, ainsi que la cytotoxicité 5 sélective par rapport aux cellules de tumeur de lymphomes T et B, font que la combinaison de DEXA et d'acide undécanoïque constitue un agent efficace pour la chimiothérapie du SIDA.

En conclusion de ce qui précède, il 10 est évident que la présente invention apporte une composition antivirale et antitumorale nouvelle, comprenant un xanthate antiviral et antitumoral connu avec en plus un adjuvant renforçant l’activité, qui est un composé ionique comportant à la fois un fragment lipophile 15 et un fragment hydrophile, l’invention prévoyant égale-» ment un procédé de préparation d'une telle composition nouvelle, et une méthode d'utilisation de cette composition pour combattre les virus et les tumeurs, le tout suivant les caractéristiques mentionnées précédemment 20 et avec les avantages cités.

Il sera entendu que l'invention n'est pas limitée aux détails exacts de fonctionnement ou aux compositions, procédés ou formes de réalisation exacts décrits ou illustrés, car des modifications et des 25 équivalents évidents apparaîtront aux spécialistes en ce domaine.

30

Claims (19)

1. Composition antivirale et antitu-morale, caractérisée en ce qu'elle comprend (a) un xanthate antiviral et antitumoral, et (b) un composé 5 adjuvant ionique contenant à la fois un groupe lipho-phile et un groupe hydrophile.

2. Composition suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le xanthate (a) répond à la formule I :

10 S R1(I) ^ S-R“ dans laquelle R1 représente un groupe norbornyle, tri-cyclodécyle, bensyle, alkvle en C^-C0^, cycloalkyle en 15 C._,-C furyle, pyridyle, quinuclinidyle, un groupe •J >uU * alkyle en co-C20 substitué par un radical hydroxyle, alcoxy en C^-C^ ou par un halogène, ou bien un groupe cycloalkyle en C^-C2Q, substitué par un radical hydroxyle, alcoxy en C -C , alkyle en C -C, ou par un halo- ry J. ‘H X <4 20 gène, et R" représente un atome de métal monovalent ou multivalent, un groupe alkvle en C -C,., un groupe al- 1 t? kyle en C -C substitué par un radical hydroxyle, 1 o alcoxv en C„-C,, amino, alkylamino en C -C , (alkyle en 1 it 14 C.-C.)-amino, (alkyle en C-C.)„-amino ou un halogène, 14 2 1 4 J 25 ou bien un groupe 2,3-dihydroxypropyle ou -hydroxy-(alcoxy en C -C,)-méthyle.

3. Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que le composé adjuvant est un composé dans lequel le groupe lipophile comprend un 30 groupe aliphatique de 6 à 18 atomes de carbone inclusivement et le groupe hydrophile comprend un ou deux groupes carboxyle, sulfate, sulfonate ou phosphate, ou un sel acceptable en pharmacie d’un tel composé.

4. Composition suivant la 46 revendication 2, caractérisée en ce que le composé adjuvant est un acide mono- ou dicarboxylique aliphatique, ou un tel acide qui est fluoré, ou bien un mono-ou disulfate aliphatique, un mono- ou disulfonate ali-5 phatique, ou un mono- ou diphosphate aliphatique, comportant dans chaque cas de 6 à 18 atomes de carbone inclusivement, ou un tel composé comportant un ou deux groupes éther ou amide, ou un sel acceptable en pharmacie d'un tel composé.

5. Composition suivant la revendica tion 2, caractérisée en ce que le composé adjuvant est un acide monocarboxylique aliphatique de 9 à 12 atomes de carbone inclusivement, ou un tel acide qui est fluoré, ou bien un sel acceptable en pharmacie d'un tel 15 composé, ou bien un sulfate d'alcool gras, un phosphate „ d'alcool gras, un éther-phosphate d'alcool gras, un éther-sulfate d'alcool gras, un sulphonate d'alcane, un sulphonate oléfinique, un ester d'acide suifocarboxy-lique ou un sulfate de glycéride, comportant dans cha- 20 que cas de 8 à 18 atomes de carbone inclusivement, ou un sel acceptable en pharmacie d’un tel composé.

6. Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que le composé adjuvant est un acide gras naturel ou un sulfate d'alcool gras d'en- 25 viron 8 à 18 atomes de carbone inclusivement, ou un sel acceptable en pharmacie d'un tel composé.

7. Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que le composé adjuvant est anionique et comporte environ 8 à 24 atomes de carbone 30 inclusivement, de préférence 8 à 14.

8. Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que le xanthate est un com- posé de la formule I, dans laquelle R représente un groupe benzyle, cyclohexyle, tricyclodécyle, 47 1-norbornyle, c/clododécyle, n-dodécyle ou 4-isobornyl- 2 cyclohexyle, et dans laquelle R représente le sodium ou le potassium ou un groupe alkyle en C -C^, et en ce qu'elle comprend, à titre de composé adjuvant, un acide 5 gras naturel ou un sulfate d'alcool gras de 8 à 14 atomes de carbone inclusivement, ou un sel de métal alcalin d'un tel composé.

9. Composition suivant la revendication 2, caractérisée en ce que le xanthate est l'un des 10 xanthates suivants: benzylxanthate de sodium ou de potassium cyclohexylxanthate de sodium ou de potassium 1-adamantylxanthate de sodium ou de potassium 8(9)-tricyclo-[5-2.1.0^’ ]-décylxanthate de sodium ou 15 de potassium 1 4 « 2-endo ou exo-bicyclo[2.2.1 ’ ]-heptylxanthate de so dium ou de potassium cyclododécylxanthate de sodium ou de potassium n-dodécylxanthate de sodium ou de potassium ou 20 4-isorbornyl-cyclohexylxanthate de sodium ou de potas sium et en ce que le composé adjuvant est un acide monocar-boxylique aliphatique de 9 à 13 atomes de carbone inclusivement, ou un sel de potassium ou de sodium de 25 celui-ci, ou un éther-sulfate d’alcool gras, un phos phate ou un phosphonate de 8 à 18 atomes de carbone inclusivement. ou le sel de sodium ou de potassium d'un tel composé, ou un désoxycholate de métal alcalin.

10. Composition suivant la revendica- 30 tion 9, caractérisée en ce que le composé adjuvant est un sel de sodium ou de potassium d'acide décanoïque, d'acide undécanoïque, d'acide dodécanoïque, d'acide désoxycholique, de dodécylsulfate ou d'acide dodéc-yl-phosphonique. ·«" 48 t ’ , 11. Composition suivant l'une quel conque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le rapport molaire entre le xanthate et le composé adjuvant est de l'ordre de 1/6 à 1/0,25, de préfé-S rence de 1/3 à 1/0,5, plus particulièrement de 1/1 à 1/2.

12. Composition suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu’elle est prévue sous une forme d'application to- 10 pique, orale ou parentérale, en particulier sous la forme d'un onguent, d'un gel ou d'üne pulvérisation, ou sous la forme d'un comprimé, d'une gelule, d'un suppositoire ou d'une solution de perfusion ou d'infusion.

13. Procédé de production d'une com-15 position antivirale et antitumorale présentant une activité antivirale et antitumorale améliorée, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange, sous la forme d'une composition pharmaceutique, d'un composé de xanthate antiviral et antitumoral connu, et d’une quantité, ren- 20 forçant l'activité, d'un composé adjuvant ionique comportant a la fois un groupe hydrophile et un groupe lipophile.

14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce que le rapport molaire entre le 25 xanthate et le composé adjuvant est de l'ordre de 1/6 à 1/0,25, de préférence de 1/3 à 1/0,5, plus particulièrement de 1/1 à 1/2.

15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que l’adjuvant est anionique et 30 la composition produite est sous une forme d’application topique, orale ou parentérale, spécialement sous la forme d'un onguet, d'un gel ou d'une pulvérisation, ou sous la forme d'un comprimé, d’une gelule, d’un suppositoire ou d'une solution de perfusion ou d'in- V 49 • ί* jection.

16. Composition suivant l'une quelconque des revendications 1, 2, 7 ou 9, caractérisée en ce qu'elle est utilisée à titre d'agent antiviral ou 5 antitumoral.

17. Procédé pour combattre un virus ou une tumeur, caractérisé en ce qu'il consiste à administrer à un sujet ou à un site affligé d'un virus ou d'une tumeur, susceptible d'un traitement par un agent 10 chimiothérapeutique, d’une quantité d'un xanthate anti viral et antitumoral, ainsi que d'une quantité, renforçant l'activité, d'un composé adjuvant ionique contenant à la fois un groupe lipophile et un groupe hydrophile, les quantités combinées de ces composés étant 15 efficaces pour assurer une activité antivirale ou antitumorale.

18. Procédé suivant la revendication 17 destiné à combattre un virus ou une tumeur, caractérisé en ce qu'il comprend l'administration, à un sujet 20 ou à un site affligé d’un virus ou d'une tumeur, susceptible d'un traitement par une telle composition, d'une composition de xanthate anvirirale et antitumorale, comprenant un adjuvant anionique, et ce en une quantité efficace pour soulager l'état traité.

19. Composition pharmaceutique ou procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, que l'on utilise pour le traitement du SIDA.