TW202327566A - 包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途及包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼之組合物及包含其的醫藥品 - Google Patents

包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途及包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼之組合物及包含其的醫藥品 Download PDF

Info

Publication number
TW202327566A
TW202327566A TW111100630A TW111100630A TW202327566A TW 202327566 A TW202327566 A TW 202327566A TW 111100630 A TW111100630 A TW 111100630A TW 111100630 A TW111100630 A TW 111100630A TW 202327566 A TW202327566 A TW 202327566A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
fucoidan
kidney disease
chronic kidney
fucoxanthin
small molecule
Prior art date
Application number
TW111100630A
Other languages
English (en)
Inventor
陳正憲
Original Assignee
中華海洋生技股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中華海洋生技股份有限公司 filed Critical 中華海洋生技股份有限公司
Priority to TW111100630A priority Critical patent/TW202327566A/zh
Publication of TW202327566A publication Critical patent/TW202327566A/zh

Links

Abstract

本發明提供一種包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途，其中所述醫藥品含有有效劑量之該包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物以及藥學上可接受的載劑。本發明證實包含小分子褐藻醣膠及藻褐素之組合物可促進腎功能、促進腎小管細胞存活，因此能有效治療或減緩慢性腎病。本發明更提供一種組合物，其包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼。

Description

包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途及包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼之組合物
本發明涉及包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物的醫藥用途，特別是用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途；本發明另外涉及一種組合物，其包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼。
全球慢性腎病患者的數量正在增加。此一趨勢與人口老齡化、糖尿病和高血壓患病率增加、腎臟疾病的早期發現以及患者的早期轉診都有相關。許多潛在的機制會引發腎損傷，包括與年齡相關的腎小管細胞凋亡、腎纖維化、氧化壓力以及慢性炎症。目前的研究集中在如何預防和阻止慢性腎病進展為終末期腎臟病。因此，迫切需要開發更安全、更有效的治療方法來預防慢性腎病。
為達上述目的，本發明提供一種包含藻褐素(Fucoxanthin，Fx)及小分子褐藻醣膠(oligo-fucoidan，Fc)之組合物用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途，其中，所述醫藥品含有有效劑量之該包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物以及藥學上可接受的載劑。將包含小分子褐藻醣膠及藻褐素之組合物投予慢性腎病小鼠後，可以降低血清肌酸酐、血中尿素氮，以促進腎功能，降低腎小管間質膠原蛋白的積累、降低了正常和擴張腎小管中纖維接合素(fibronectin)的表現，進而抑制腎纖維化，並能使小鼠體重回升至與正常小鼠相同，且不會有肝損傷。更能減少腎小管細胞中的活性氧物質、減少細胞凋亡，而促進細胞存活。
較佳的，上述小分子褐藻醣膠之分子量約400道爾頓至10,000道爾頓；更佳的，上述小分子褐藻醣膠之分子量約400道爾頓至500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、5,000或10,000道爾頓，小分子褐藻醣膠之平均分子量約400道爾頓至2,000道爾頓，較佳者為500道爾頓至600、700、800、900或1,000道爾頓；在一實施例中，小分子褐藻醣膠具有之單元結構式如下： (式I )。
較佳的，上述小分子褐藻醣膠係選自由褐藻綱( Phaeophyceae)之藻類所組成之群組經萃取而得，小分子褐藻醣膠可由商業上獲得，其可由多種褐藻萃取而得，包括但不限於，海帶、裙帶菜、馬尾菜、昆布、墨角藻等常見之食用藻類。
依據本發明，藻褐素之分子式為C 42H 58O 6，結構類似β-胡蘿蔔素或維他命A，屬於類胡蘿蔔素之一種，屬褐藻綱之葉綠體中之常見色素，可由商業上獲得或自上述褐藻萃取而得，較佳者為海洋生技股份有限公司販售之高穩定藻褐素。
本發明所述之「藥學上可接受之載劑」包含，但不限於還原劑(reducing agent)、溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、表面活性劑(surfactant)，及其他類似或適用本發明之載劑。
更佳的，上述之醫藥品為經腸道或非經腸道的劑型，其中，該經腸道的劑型係口服劑型，其口服劑型係溶液、懸浮液、錠劑或膠囊；該非經腸道的劑型係針劑。
較佳的，該包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物的投予對象為哺乳類動物，更佳的，該包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物的投予對象可為人類、小鼠、犬或貓等。
較佳的，前述包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物中之藻褐素對於小鼠的投予劑量為50毫克/千克/天(mg/kg/d)至400 mg/kg/d；而前述包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物中之小分子褐藻醣膠對於小鼠的投予劑量為1 mg/kg/d至20 mg/kg/d。
較佳的，前述包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物進一步包含左旋肉鹼(L-carnitine，Lc)。
較佳的，前述包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物中之左旋肉鹼對於小鼠的投予劑量為20 mg/kg/d至150 mg/kg/d。更佳的，該包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物中之左旋肉鹼對於小鼠的投予劑量為20 mg/kg/d至80 mg/kg/d。
較佳的，該包含小分子褐藻醣膠及藻褐素之組合物中之左旋肉鹼對於人類之投予劑量為1.6 mg/kg/d至12 mg/kg/d。更佳的，該包含小分子褐藻醣膠及藻褐素之組合物中之左旋肉鹼對於人類之投予劑量為1.6 mg/kg/d至7 mg/kg/d。以上劑量是根據2005年美國食品藥物管理局所公告之實驗初期估算方法(Estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers)計算而得。
較佳的，前述包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物中之藻褐素對於人類之投予劑量為4 mg/kg/d至33 mg/kg/d。前述包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物中之小分子褐藻醣膠對於人類之投予劑量為0.08 mg/kg/d至1.6 mg/kg/d。
本發明所述之「有效劑量」係指在劑量上及對於所需要之時間段而言對達成所要治療或減慢性腎病的有效之量；依據本發明，投予本發明之組合物能夠降低血清肌酸酐、血中尿素氮，促進腎功能；降低腎小管間質膠原蛋白的積累、降低了正常和擴張腎小管中纖維接合素的表現，而抑制腎纖維化。更能減少腎小管細胞中的活性氧物質、減少細胞凋亡增加抗凋亡蛋白 Bcl-x L的表現、降低促凋亡蛋白裂解的 caspase-3表現、增加生存訊號蛋白磷酸化 Akt 的表現，而促進細胞存活。因此本發明組合物可有效治療或改善慢性腎病。
為達上述目的本發明另外提供一種用於治療或改善慢性腎病之組合物，其包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼，其可有效改善慢性腎病。
為達上述目的，本發明另外提供一種醫藥品，其包含前述本發明組合物及藥學上可接受的載劑。
為達上述目的，本發明另外提供一種保健食品，其包含前述本發明組合物。
本發明之優點在於投予包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物或本發明組合物可以有效治療或改善慢性腎病，並能使小鼠體重回升至與正常小鼠相同，且不會有肝損傷。
製備例1 製備藻褐素
藻褐素是萃取自海帶，購自中華海洋生技股份有限公司。其主要係根據Chen, Yen-Cheng, et al. "Alleviative effect of fucoxanthin-containing extract from brown seaweed Laminaria japonica on renal tubular cell apoptosis through upregulating Na+/H+ exchanger NHE1 in chronic kidney disease mice." Journal of ethnopharmacology224 (2018): 391-399所述利用乙醇萃取製備藻褐素。簡而言之，將100 公克(g)乾燥的海帶( Laminaria japonica)在2公升95%乙醇中於70°C下振盪6小時。將乙醇萃取物離心，然後在40°C下減壓蒸發，得到海帶萃取物，而該海帶萃取物中含有 10.0 ± 2.3% 的藻褐素，並將之包覆褐藻醣膠之多醣膜以延長其保質期和穩定性。含藻褐素的萃取物中的褐藻醣膠含量小於1%。
製備例2 製備小分子褐藻醣膠
小分子褐藻醣膠是萃取自海帶，購自中華海洋生技股份有限公司。主要是根據Chen, Cheng-Hsien, et al. "Oligo-fucoidan prevents renal tubulointerstitial fibrosis by inhibiting the CD44 signal pathway." Scientific reports7.1 (2017): 1-13.所述，利用酵素水解原始褐藻醣膠而製備的小分子褐藻醣膠粉末。簡而言之，將 5 g來自海帶的褐藻醣膠懸浮在 125 ml 蒸餾水中，溫度為 55°C，攪拌速度為 700 rpm，然後加入濃度為 1 mg/g 褐藻醣膠的糖解酵素作用6 小時。離心後，上清液通過30 kDa 分子量截留膜(ProStream™ PP，TangenX Technology Co. 波士頓，麻州，美國)，濾液再進一步通過 1 kDa 截留分子量膜，得到平均分子量為800 Da，純度為95%的小分子褐藻醣膠。
實施例1 小鼠動物模型及藥物處理
根據文獻Chen, Cheng-Hsien, et al. "Oligo-fucoidan prevents renal tubulointerstitial fibrosis by inhibiting the CD44 signal pathway." Scientific reports7.1 (2017): 1-13.建立慢性腎病模型，具體步驟如下：對 9 週齡 129S1/SvImJ 小鼠(樂斯科科技，台北，台灣)進行右腎切除，並對左側腎臟缺血再灌注造成損傷(30 分鐘)以建立。假手術組(sham)小鼠接受剖腹手術和人工操作腎臟。
為了評估小分子褐藻醣膠和藻褐素的聯合作用，手術後6週的實驗小鼠通過口服管飼法餵食前述兩種化合物6週。實驗小鼠分為10組，每組有6隻實驗小鼠(n=6)：(a1) 假手術組(未餵食褐藻醣膠及/或藻褐素的對照組)；(a2) 假手術組餵食藻褐素(300毫克/千克/天(mg/kg/d))；(a3) 假手術組餵食小分子褐藻醣膠(10 mg/kg/d)；(a4) 假手術組餵食藻褐素(300 mg/kg/d)和小分子褐藻醣膠(10mg/kg/d)；(a5)慢性腎病組(未餵食褐藻醣膠及/或藻褐素的對照組)；(a6)慢性腎病組餵食藻褐素(300 mg/kg/d)；(a7)慢性腎病組餵食小分子褐藻醣膠(10 mg/kg/d)； (a8)慢性腎病組餵食藻褐素(300 mg/kg/d)和小分子褐藻醣膠 (10mg/kg/d)；(a9)慢性腎病組餵食藻褐素(150 mg/kg/d)和小分子褐藻醣膠 (10 mg/kg/d)；(a10)慢性腎病組餵食藻褐素 (75 mg/kg/d) 和小分子褐藻醣膠 (10 mg/kg/d)。
為了評估前述兩種化合物和左旋肉鹼的聯合作用，手術後6週的另一組實驗小鼠通過口服管飼法餵食褐藻醣膠、藻褐素和左旋肉鹼(Sigma-Aldrich)6週。實驗小鼠分為10組，每組有6隻實驗小鼠(n=6)：(b1) 假手術組(未餵食褐藻醣膠、藻褐素及/或左旋肉鹼的對照組)；(b2) 假手術組餵食左旋肉鹼(100 mg/kg/d)；(b3) 慢性腎病組(未餵食褐藻醣膠、藻褐素及/或左旋肉鹼的對照組)；(b4) 慢性腎病組餵食左旋肉鹼 (100 mg/kg/d)；(b5) 慢性腎病組餵食左旋肉鹼(50mg/kg/d)；(b6) 慢性腎病組餵食藻褐素 (300 mg/kg/d)和小分子褐藻醣膠(10mg/kg/d)；(b7) 慢性腎病組餵食藻褐素 (300 mg/kg/d)和左旋肉鹼(50mg/kg/d)；(b8)慢性腎病組餵食小分子褐藻醣膠 (10 mg/kg/d)和左旋肉鹼(50mg/kg/d)；(b9)慢性腎病組餵食藻褐素(300mg/kg/d)、小分子褐藻醣膠(10mg/kg/d)和左旋肉鹼 (100mg/kg/d)；(b10) 慢性腎病組餵食藻褐素 (300mg/kg/d)、小分子褐藻醣膠(10mg/kg/d)和左旋肉鹼(50mg/kg/d)。
為了評估聯合治療隨時間推移對慢性腎病小鼠的影響，進一步對慢性腎病小鼠餵食藻褐素(300 mg/kg/d)、小分子褐藻醣膠(10 mg/kg/d)和左旋肉鹼的混合物(50 mg/kg/d)，即本發明組合物(FFL)，為時8週，然後在第4週和第8週測量血清肌酸酐和血中尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)數值。實驗小鼠分為4組，每組有6隻實驗小鼠(n=6)：(c1) 假手術組(未餵食本發明組合物的對照組)；(c2) 假手術組餵食本發明組合物；(c3) 慢性腎病組(未餵食本發明組合物的對照組)；(c4) 慢性腎病組餵食本發明組合物。
動物犧牲後，使用馬森三色染色試劑盒(Masson’s trichrome staining kit，Sigma-Aldrich) 和免疫組織化學染色 (immunohistochemistry staining，IHC) 在福馬林固定的 2 μm 厚石蠟切片中檢查腎臟形態的變化。前述所有動物實驗均經台北醫學大學實驗動物護理和使用委員會批准(批准號 LAC-2018-0475)，並按照相關指南和規定進行。
實施例1-1 血清肌酸酐和血中尿素氮的測定
收集每隻實施例1之實驗小鼠於治療前後的血漿樣品用於代謝研究。使用 AU5810 臨床化學分析儀(Beckman Coulter，Brea，加州，美國)分別通過 Jaffe 法和雙乙醯反應分析血清肌酸酐和血中尿素氮，以評估對小鼠腎功能的影響。
實驗結果如圖1A至圖1C所示。其中圖1A至1B是以血清肌酸酐之測定結果評估藻褐素和小分子褐藻醣膠對腎功能的綜合影響。其中，如圖1A所示，由於急性腎損傷，慢性腎病模型手術後小鼠的血清肌酸酐在第 3 天和第 7 天顯著增加。雖然術後 6 週(42天)血清肌酸酐略有下降，但從圖1B看來，其於手術後/治療前的血清肌酸酐仍明顯高於假手術組。而如圖1B所示，藻褐素(Fx)(300 mg/kg/d)和小分子褐藻醣膠(Fc)(10 mg/kg/d)都降低了慢性腎病小鼠的血清肌酸酐數值，藻褐素和小分子褐藻醣膠的聯合使用進一步顯著降低了血清肌酸酐。相較之下，儘管小分子褐藻醣膠以及藻褐素和小分子褐藻醣膠的組合降低了小鼠的血清肌酸酐，但與假手術組相比，結果並不顯著。而圖1C則顯示左旋肉鹼(Lc)、小分子褐藻醣膠(Fc)和藻褐素(Fx)對腎功能的影響。左旋肉鹼以100 mg/kg/d或50 mg/kg/d的劑量處理6週顯著降低了慢性腎病小鼠的血清肌酸酐。左旋肉鹼50 mg/kg/d 與藻褐素(300 mg/kg/d) 或小分子褐藻醣膠 (10 mg/kg/d) 組合(本發明組合物)進一步降低慢性腎病小鼠的血清肌酸酐，甚至低於正常小鼠的血清肌酸酐含量。該結果表明本發明組合物有效地促進了小鼠的腎功能。然而，將本發明組合物中左旋肉鹼的含量增加到 100 mg/kg/d 會減少其對血清肌酸酐降低的影響。
請參照圖2A至2B，係以血中尿素氮之測定結果評估藻褐素和小分子褐藻醣膠對腎功能的綜合影響。其結果如圖2A所示，與前述肌酸酐的結果相同，藻褐素(Fx)和小分子褐藻醣膠(Fc)的聯合使用顯著降低了血中尿素氮。而如圖2B所示，以左旋肉鹼(Lc)、藻褐素(Fx)和小分子褐藻醣膠(Fc)聯合治療能進一步降低慢性腎病小鼠的血中尿素氮。前述結果顯示，藻褐素和小分子褐藻醣膠的組合比單獨使用每種成分更能改善慢性腎病小鼠的腎功能，而左旋肉鹼進一步促進了藻褐素和小分子褐藻醣膠的腎臟保護作用。
實施例1-2 染色及組織形態學分析
動物犧牲後，取出小鼠腎組織，用 4% 緩衝多聚甲醛固定，石蠟包埋，製備 2 μm 厚的切片。根據製造商的說明，利用馬森三色染色試劑盒和免疫組織化學染色在福爾馬林固定的 2 μm 石蠟切片中檢查腎臟形態的變化。在實施例1的所有小鼠中，選用餵食300 mg/kg/d藻褐素(Fx)、10 mg/kg/d小分子褐藻醣膠(Fc)及/或50 mg/kg/d左旋肉鹼(Lc)6週的慢性腎病小鼠進行組織切片製作。其中，免疫組織化學染色是將切片與抗纖維接合素抗體(ab2413，Abcam，劍橋，英國)雜交，並用 UltraVision Quanto 檢測系統 HRP DAB 試劑盒(Thermo Scientific，Fremont，加州，美國)染色。在經馬森三色染色和免疫組織化學染色後，自每隻小鼠各收集10張放大200倍的腎臟細胞染色圖像。使用定量軟體Image-Pro Plus 6 (Media Cybernetics，Rockville，馬里蘭，美國)檢查整個皮質小管間質中的馬森三色染色強度和免疫組織化學染色的陽性染色。
馬森三色染色的結果請同時參看圖3A及圖3B，在慢性腎病小鼠的腎小管間質空間中有明顯的藍色染色，顯示出膠原蛋白的積累。使用藻褐素和小分子褐藻醣膠聯合治療6週後，慢性腎病小鼠腎小管間質空間中的膠原蛋白積累明顯減少。儘管左旋肉鹼降低了慢性腎病小鼠的血清肌酸酐，但單獨使用左旋肉鹼治療 6 週後對腎小管間質膠原蛋白的積累沒有顯著影響。相較之下，左旋肉鹼與藻褐素和小分子褐藻醣膠的搭配使用減少了慢性腎病小鼠腎小管間質膠原蛋白的積累，這與藻褐素和小分子褐藻醣膠的搭配使用之效果相同。
此外，纖維接合素表現增加是腎纖維化的重要標誌。免疫組織化學染色結果請同時參看圖4A及圖4B，染色結果顯示纖維接合素在慢性腎病小鼠的腎小管細胞中有顯著表現，尤其是在擴張的腎小管中更為明顯。藻褐素和小分子褐藻醣膠的組合顯著降低了慢性腎病小鼠正常和擴張腎小管中纖維接合素的表現。左旋肉鹼不影響慢性腎病小鼠腎臟中纖維接合素的大量表現，也不影響藻褐素和小分子褐藻醣膠對腎纖維化的抑制作用。這些結果表明，藻褐素和小分子褐藻醣膠的搭配使用即可抑制慢性腎病小鼠的腎纖維化。
實施例1-3 聯合治療的時間效應
根據前述實驗結果得知藻褐素、小分子褐藻醣膠和左旋肉鹼聯合治療 6 週可改善慢性腎病小鼠的腎功能。為了評估聯合療法在慢性腎病小鼠中隨時間推移的效果，使用本發明組合物(FFL)，即包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼之組合物，餵養慢性腎病小鼠 8 週，然後在第 4 週和第 8 週測量小鼠之血清肌酸酐和血中尿素氮數值。其中本發明組合物包含：300 mg/kg/d藻褐素、10 mg/kg/d小分子褐藻醣膠及50 mg/kg/d左旋肉鹼，簡稱為FFL。
結果如圖5A所示，本發明組合物(FFL)在第 4 週的慢性腎病小鼠中顯著降低了血清肌酸酐，但在對照組小鼠中則沒有影響。在第 8 週，本發明組合物(FFL)進一步降低了慢性腎病小鼠的血清肌酸酐，甚至降低了對照組小鼠的血清肌酸酐數值。如圖5B所示，本發明組合物(FFL)對於降低慢性腎病小鼠血中尿素氮值之影響在第 8 週時顯著，但在第 4 週時不顯著。
實施例1-4 聯合治療對小鼠體重之影響
小鼠的體重與其健康密切相關。利用本發明組合物餵養慢性腎病小鼠 8 週並監測它們的體重。而本發明組合物中包含：300 mg/kg/d藻褐素、10 mg/kg/d小分子褐藻醣膠及50 mg/kg/d左旋肉鹼，簡稱為FFL。
其結果如圖6所示，在8週的實驗期間，慢性腎病小鼠的體重顯著低於對照小鼠。用本發明組合物(FFL)餵養的慢性腎病小鼠的體重在 3 週內即可回升至與對照組小鼠相似之體重。
實施例1-5 聯合治療對血清天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙胺酸轉胺酶(alanine transaminase，ALT)的影響
血清中 AST 和 ALT 的水平通常用於診斷肝損傷，因此為了評估聯合治療對肝臟的影響，對慢性腎病小鼠餵食本發明組合物，即包含藻褐素、小分子褐藻醣膠和左旋肉鹼之組合物，為期8週。並在第 8 週按照製造商的說明，測量血清中 AST 和 ALT值。具體而言，分別使用 ALT 活性比色測定試劑盒（K752，BioVision，Milpitas，加州，美國）和 AST 活性比色測定試劑盒（K753，BioVision，Milpitas，加州，美國）測定血清 ALT 和 AST 的數值。其中，本發明組合物中包含：300 mg/kg/d藻褐素、10 mg/kg/d小分子褐藻醣膠及50 mg/kg/d左旋肉鹼，簡稱為FFL。
結果如圖 7A及7B 所示，本發明組合物確實不會使對照組或慢性腎病小鼠的血清 AST 和 ALT之值升高。該結果證實本發明組合物(FFL)對肝臟並未造成可檢測的影響。
實施例2 細胞培養
大鼠近端腎小管細胞(NRK-52 E)購自生物資源保存及研究中心(台灣)。 NRK-52 E 細胞在補充有抗生素/抗真菌溶液和 10% 胎牛血清的 DMEM 培養基中於溫度為 37℃，濕度為 95%的二氧化碳培養箱中培養。實驗前，我們將細胞的培養基更換為無血清之培養基，並培養細胞過夜。然後將細胞分別用150 μg/mL、300 μg/Ml或600 μg/mL藻褐素；50 μg/mL、100 μg/mL或200 μg/mL小分子褐藻醣膠；5 mM、10 mM或20 mM左旋肉鹼或本發明組合物(300 μg/mL藻褐素、100 μg/mL小分子褐藻醣膠、10 mM左旋肉鹼)預處理 30 分鐘，再用 1 mM過氧化氫(H 2O 2)處理過夜。
實施例2-1細胞內活性氧物質 (reactive oxygen species，ROS)測定
當實施例2之NRK-52細胞以 1 mM過氧化氫處理30分鐘後，將 DCF-DA (10 μM)添加到 NRK-52 E 細胞中，以檢測室溫下黑暗中 H 2O 2誘發產生活性氧物質的情況，然後使用冰冷的PBS沖洗細胞兩次。再以100 μl PBS懸浮細胞，並置入到 96 孔盤中，以光度計(Victor 3，PerkinElmer，Waltham，麻州)進行檢測，其中激發和發射波長分別為 485 nm 和 535 nm。測定活性氧物質對細胞之影響以評估藻褐素、小分子褐藻醣膠、左旋肉鹼或本發明組合物對腎小管細胞的保護作用。
結果如圖8A所示，利用DCF-DA 染色可發現經過氧化氫處理後的NRK-52 E 細胞中之活性氧物質顯著增加。而以藻褐素、小分子褐藻醣膠、左旋肉鹼、或本發明組合物處理的細胞，由H 2O 2誘導的細胞內活性氧物質增加量均顯著降低，且呈現劑量依賴(dose dependent)關係。此結果顯示，藻褐素、小分子褐藻醣膠、左旋肉鹼和本發明組合物都可以減少過氧化氫在腎小管細胞中誘發的活性氧物質含量。
實施例2-2 細胞凋亡檢測
收集實施例2之處理過的 NRK-52 E 細胞，並根據製造商的說明使用流式細胞儀進行分析，具體步驟如下：使用異硫氰酸螢光素-膜聯蛋白 V (annexin V-FITC)/碘化丙啶 (PI) 雙染色試劑盒(BD Biosciences-Pharmingen，聖地牙哥，加州，美國)檢測如實施例2之經 1 mM 過氧化氫誘導的細胞的細胞凋亡情形。
其結果如圖8B及8C所示，過氧化氫處理會誘導 NRK-52 E 細胞凋亡，然而藻褐素、小分子褐藻醣膠、左旋肉鹼和本發明組合物均可抑制細胞凋亡的發生。
實施例2-3 西方墨點法
以實施例2之處理過的 NRK-52 E 細胞進行觀察，但挑選分別經過300 μg/mL藻褐素、100 μg/mL小分子褐藻醣膠或10 mM左旋肉鹼預處理30分鐘的組別，在以過氧化氫處理2小時後即檢測其pAkt蛋白之表現，其餘蛋白質表現量之檢測則仍在過氧化氫處理24小時候進行。萃取處理後之NRK-52 E細胞中之蛋白，並將總共 20 μg 的蛋白加入於每個電泳槽的泳道。使用購自 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)之抗 Bcl-x L(產品編號2762)、裂解的 caspase-3 (產品編號9664)、p-Akt (產品編號12178) 和 Akt (產品編號4691) 的抗體，並根據製造商的說明，使用化學冷光套組(Thermo Fisher Scientific Inc. Waltham，麻州，美國)檢測抗體的條帶訊號。以測定藻褐素、小分子褐藻醣膠、左旋肉鹼等化合物對細胞凋亡訊號傳遞的影響。
結果如圖 8D 所示，經過氧化氫處理 24 小時後，抗凋亡蛋白 Bcl-x L的表現降低。而用藻褐素、小分子褐藻醣膠和左旋肉鹼或本發明組合物預處理會增加過氧化氫處理細胞中的 Bcl-x L。又，過氧化氫處理的細胞中促凋亡蛋白即裂解的 caspase-3 明顯升高，然裂解的 caspase-3蛋白表現量被藻褐素、小分子褐藻醣膠和左旋肉鹼和本發明組合物所抑制。此外，過氧化氫處理 2 小時降低了生存訊號蛋白磷酸化 Akt (pAkt)的表現，而使用藻褐素、小分子褐藻醣膠、左旋肉鹼或本發明組合物預處理也會增加過氧化氫處理細胞中磷酸化 Akt的含量。此結果顯示，藻褐素、小分子褐藻醣膠、左旋肉鹼和本發明組合物都可以減少過氧化氫在腎小管細胞中誘發的活性氧物質和細胞凋亡，並促進細胞存活。
綜上，包含小分子褐藻醣膠及藻褐素之組合物投予慢性腎病小鼠後，可以降低血清肌酸酐、血中尿素氮，以促進腎功能，降低腎小管間質膠原蛋白的積累、降低了正常和擴張腎小管中纖維接合素的表現，而抑制腎纖維化，並能使小鼠體重回升至與正常小鼠相同，且不會有肝損傷。更能減少腎小管細胞中的活性氧物質、減少細胞凋亡，而促進細胞存活。
而將本發明組合物投予慢性腎病小鼠後，亦可降低血清肌酸酐、血中尿素氮、以促進腎功能，降低腎小管間質膠原蛋白的積累、降低了正常和擴張腎小管中纖維接合素的表現，而抑制腎纖維化，並能使小鼠體重回升至與正常小鼠相同，且不會有肝損傷。更能減少腎小管細胞中的活性氧物質、減少細胞凋亡，而促進細胞存活。因此本發明組合物可有效治療或改善慢性腎病。
無
圖1A為手術後至治療前的慢性腎病小鼠之血清肌酸酐數值，*表示與手術前相比 p＜0.05； 圖1B為慢性腎病小鼠餵食藻褐素(Fx)及小分子褐藻醣膠(Fc)6週之血清肌酸酐數值； 圖1C為慢性腎病小鼠餵食藻褐素(Fx)、小分子褐藻醣膠(Fc)及/或左旋肉鹼(Lc)6週之血清肌酸酐數值； 圖2A為慢性腎病小鼠餵食藻褐素(Fx)及小分子褐藻醣膠(Fc)6週之血中尿素氮數值； 圖2B為慢性腎病小鼠餵食藻褐素(Fx)、小分子褐藻醣膠(Fc)及/或左旋肉鹼(Lc)6週之血中尿素氮數值； 圖3A為慢性腎病小鼠餵食300 mg/kg/d藻褐素(Fx)/10 mg/kg/d小分子褐藻醣膠(Fc)及/或50 mg/kg/d左旋肉鹼(Lc)6週之馬森三色染色腎臟切片，其中比例尺為60 μm； 圖3B為慢性腎病小鼠餵食300 mg/kg/d藻褐素(Fx)/10 mg/kg/d小分子褐藻醣膠(Fc)及/或50 mg/kg/d左旋肉鹼(Lc)6週之馬森三色染色腎臟切片中染上藍色部分之面積百分比； 圖4A為慢性腎病小鼠餵食300 mg/kg/d藻褐素(Fx)/10 mg/kg/d小分子褐藻醣膠(Fc)及/或50 mg/kg/d左旋肉鹼(Lc)6週之免疫組織化學染色腎臟切片，其中比例尺為60 μm； 圖4B為慢性腎病小鼠餵食300 mg/kg/d藻褐素(Fx)/10 mg/kg/d小分子褐藻醣膠(Fc)及/或50 mg/kg/d左旋肉鹼(Lc)6週之免疫組織化學染色腎臟切片中的陽性染色面積百分比； 圖5A為慢性腎病小鼠餵食本發明組合物(FFL)4週及8週對血清肌酸酐數值之影響； 圖5B為慢性腎病小鼠餵食本發明組合物(FFL)4週及8週對血中尿素氮數值之影響； 圖6為慢性腎病小鼠餵食本發明組合物(FFL)8週之慢性腎病小鼠體重變化，*表示與慢性腎病小鼠第三週之體重相比 p＜0.01； 圖7A為慢性腎病小鼠餵食本發明組合物(FFL)8週後血清天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase，AST)之變化； 圖7B為慢性腎病小鼠餵食本發明組合物(FFL)8週後丙胺酸轉胺酶(alanine transaminase，ALT)之變化； 圖8A為不同劑量的藻褐素(Fx)、小分子褐藻醣膠(Fc) 及/或左旋肉鹼(Lc)對過氧化氫誘導的活性氧物質之影響； 圖8B是以流式細胞術呈現處理藻褐素(Fx)、小分子褐藻醣膠(Fc)及/或左旋肉鹼(Lc)對過氧化氫誘導的細胞凋亡之影響； 圖8C為不同劑量的藻褐素(Fx)、小分子褐藻醣膠(Fc)及/或左旋肉鹼(Lc)處理後之過氧化氫誘導的細胞凋亡比例； 圖8D為藻褐素(Fx)、小分子褐藻醣膠(Fc)及/或左旋肉鹼(Lc)對Bcl-x L、裂解的 caspase-3及磷酸化Akt(pAkt)蛋白表現量的影響。
無

Claims (10)

  1. 一種包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途，其中，所述醫藥品含有有效劑量之該包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物以及藥學上可接受的載劑。
  2. 如請求項1所述之用途，其中，該醫藥品係投予哺乳類動物。
  3. 如請求項2所述之用途，其中，該哺乳類動物為人類。
  4. 如請求項3所述之用途，其中，該包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物中之藻褐素對於人類之投予劑量為4 毫克/千克/天至33 毫克/千克/天。
  5. 如請求項3所述之用途，其中，該包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物中之小分子褐藻醣膠對於人類之投予劑量為0.08 毫克/千克/天至1.7 毫克/千克/天。
  6. 如請求項1至5任一項所述之用途，其中，該包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物進一步包含左旋肉鹼。
  7. 如請求項6之用途，其中，該包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物中之左旋肉鹼對於人類之投予劑量為1.6 毫克/千克/天至12 毫克/千克/天。
  8. 如請求項7之用途，其中，該慢性腎病包含腎纖維化。
  9. 一種用於治療或改善慢性腎病之組合物，其包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼。
  10. 一種醫藥品，其包含如請求項9所述之用於治療或改善慢性腎病之組合物及藥學上可接受的載劑。
TW111100630A 2022-01-06 2022-01-06 包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途及包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼之組合物及包含其的醫藥品 TW202327566A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW111100630A TW202327566A (zh) 2022-01-06 2022-01-06 包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途及包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼之組合物及包含其的醫藥品

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW111100630A TW202327566A (zh) 2022-01-06 2022-01-06 包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途及包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼之組合物及包含其的醫藥品

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202327566A true TW202327566A (zh) 2023-07-16

Family

ID=88147823

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111100630A TW202327566A (zh) 2022-01-06 2022-01-06 包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途及包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼之組合物及包含其的醫藥品

Country Status (1)

Country Link
TW (1) TW202327566A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cao et al. Curcumin ameliorates oxidative stress-induced intestinal barrier injury and mitochondrial damage by promoting Parkin dependent mitophagy through AMPK-TFEB signal pathway
Wang et al. Resveratrol protects oxidative stress-induced intestinal epithelial barrier dysfunction by upregulating heme oxygenase-1 expression
Dong et al. Juglanin suppresses fibrosis and inflammation response caused by LPS in acute lung injury
Huang et al. Downregulation of microRNA‐155 stimulates sevoflurane‐mediated cardioprotection against myocardial ischemia/reperfusion injury by binding to SIRT1 in mice
Gan et al. Propofol attenuates small intestinal ischemia reperfusion injury through inhibiting NADPH oxidase mediated mast cell activation
JP6638092B2 (ja) ピロロキノリンキノン、その誘導体及び／又は塩の乾燥症候群における使用ならびに医薬組成物
Li et al. Agnuside alleviates synovitis and fibrosis in knee osteoarthritis through the inhibition of HIF-1α and NLRP3 inflammasome
Turdiyev et al. CHOLERETIC ACTIVITY OF RUTANA AT THERAPEUTIC APPLICATION IN RATS WITH HELIOTRIN HEPATITIS
Ahmed et al. Combinatory effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and indomethacin on adjuvant-induced arthritis in Wistar rats: roles of IL-1β, IL-4, Nrf-2, and oxidative stress
Wu et al. Recombinant adiponectin peptide promotes neuronal survival after intracerebral haemorrhage by suppressing mitochondrial and ATF4‐CHOP apoptosis pathways in diabetic mice via Smad3 signalling inhibition
Bo et al. The roles of FGF21 and ALCAT1 in aerobic exercise-induced cardioprotection of postmyocardial infarction mice
Chang et al. Apelin enhances IL-1β expression in human synovial fibroblasts by inhibiting miR-144-3p through the PI3K and ERK pathways
Qu et al. Theaflavin promotes mitochondrial abundance and glucose absorption in myotubes by activating the CaMKK2-AMPK signal axis via calcium-ion influx
Shi et al. Schisandra chinensis polysaccharides prevent cardiac hypertrophy by dissociating thioredoxin-interacting protein/thioredoxin-1 complex and inhibiting oxidative stress
Chen et al. Combined protective effects of oligo-fucoidan, fucoxanthin, and L-carnitine on the kidneys of chronic kidney disease mice
Du et al. Metformin coordinates with mesenchymal cells to promote VEGF-mediated angiogenesis in diabetic wound healing through Akt/mTOR activation
Xue et al. Ginsenoside Rc alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury by reducing mitochondrial oxidative stress and apoptosis: Role of SIRT1 activation
Li et al. Metformin ameliorates senescence of adipose-derived mesenchymal stem cells and attenuates osteoarthritis progression via the AMPK-dependent autophagy pathway
Fang et al. Soluble epoxide hydrolase inhibition protected against diabetic cardiomyopathy through inducing autophagy and reducing apoptosis relying on Nrf2 upregulation and transcription activation
Wang et al. The roles of the mitophagy inducer Danqi pill in heart failure: a new therapeutic target to preserve energy metabolism
Li et al. Mechanism of N-acetylcysteine in alleviating diabetic myocardial ischemia reperfusion injury by regulating PTEN/Akt pathway through promoting DJ-1
Shen et al. Sacubitril valsartan enhances cardiac function and alleviates myocardial infarction in rats through a SUV39H1/SPP1 axis
TW202327566A (zh) 包含藻褐素及小分子褐藻醣膠之組合物用於製備治療或改善慢性腎病之醫藥品的用途及包含藻褐素、小分子褐藻醣膠及左旋肉鹼之組合物及包含其的醫藥品
Liu et al. 1, 8-Cineole ameliorates diabetic retinopathy by inhibiting retinal pigment epithelium ferroptosis via PPAR-γ/TXNIP pathways
WO2020077030A1 (en) Aggf1 and aggf1-primed cells for treating diseases and conditions