LU85890A1 - Verfahren und vorrichtung zur messung von enzymkonzentrationen - Google Patents

Description

-1- ff ff « * 1 Beschreibung <* _ __ ______ -. _—

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur 5 Bestimmung der Konzentrationen von aktiven Populationen von Enzymen oder enzymhaltigen Populationen, wie z.B. Bakterien, Hefen oder dgl.

Üblicherweise werden derartige Populationen durch mikro-10 skopische Verfahren oder durch kompliziertere Verfahren, wie z.B. die Messung der optischen Trübung von die Populationen enthaltenden Flüssigkeiten, bestimmt. In der USPS 3 506 544 ist ein Verfahren zur Messung der Konzentration bestimmter Partner von Enzym-katalysierten Reaktionen 15 unter Verwendung eines elektrochemisch-reversiblen Redox-

Paares beschrieben. Das Enzym, ein Redox-Paar, wie Methylenblau, ein Substrat, wie Glucose, und ein kompatibles leitfähiges Medium, wie z.B. eine gepufferte Wasserlösung, * werden in einer Elektrolysezelle gemischt, durch die ein 20 Strom geschickt wird durch Anlegen einer Spannung an ein Elektrodenpaar. Die Elektroden wurden bisher in der Regel aus einem Edelmetall gefertigt. Unter der Einwirkung des Enzyms wird das oxidierte Redox-Paar in einer der Konzentration des Enzyms entsprechenden Rate bzw.

25 Geschwindigkeit reduziert. Das reduzierte Redox-Paar wird an der Anode der Zelle einer Rückoxidation unter- -worfen, wodurch ein Zellenstrom entsteht, der proportional zur Konzentration des reduzierten Redox-Paares ist. Es wurde gezeigt, daß die Rate bzw. Geschwindigkeit 30 der Zunahme des Stromes proportional zur Konzentration des Enzyms in der Lösung ist.

Die verschiedenen bekannten Verfahren zur Messung von - Enzymen oder Bakterienpopulationen weisen bestimmte 35 Nachteile auf. Einige sind für die Bestimmung sehr niedriger Konzentrationen nicht empfindlich genug oder arbeiten sehr langsam oder erfordern zu viele Stufen ^ 5 i ! rv < 5 -2- Λ «-♦ < 1 zur wirksamen Durchführung der Bestimmungen (Messungen).

Einige sind auch sehr teuer, insbesondere diejenigen, in denen Edelmetall- oder ähnliche Elektroden verwendet werden. Es wurde auch gefunden, daß bei der Analyse einer 5 speziellen Probe gelegentlich unerklärliche Fehler auf-treten.

Ein anderes Problem tritt bei den bekannten Vorrichtungen auf, wenn die gleiche Apparatur nacheinander zur Messung 10 mehrerer Proben verwendet wird. Es wurde gefunden, daß durch den Transport der Elektroden von einer Proben-Zelle in eine andere Proben-Zelle die zweite Zelle oder Probe durch Enzyme oder andere Komponenten, die von den Elektroden absorbiert worden sind, kontaminiert wird.

15 Auch ist große Vorsicht erforderlich, um sicherzustellen, daß die Zelle in sehr genau gemessenen Füllhöhen gefüllt , wird, die identisch sind mit denjenigen, die zum Eichen derselben verwendet werden, um sicherzustellen, daß die Λ in den Elektrolyten eingetauchten Flächen der Elektroden- 20 Oberfläche· konstant bleiben. Selbst bei Anwendung großer Vorsicht in dieser Beziehung treten jedoch bei den Messungen unerklärliche Fehler auf.

Ein weiteres Problem des Standes der Technik ist zurückzu-25 führen auf die Notwendigkeit, die Lösung vor Durchführung des Tests zu entlüften. Es wurde gefunden, daß unter j bestimmten Umständen un vorhersehbare Mengen an aeroben | Bakterien desaktiviert werden können durch die Entlüf- 1 tungsstufe. Wenn andererseits die Lösung nicht entlüftet 1 30 wirä' stört der zurückbleibende Sauerstoff die Präzision | der Messung, da er zur Reaktion an der Anode, auf der die I Messung basiert, beiträgt.

! ] * Diese und weitere Probleme der bekannten Verfahren können | 35 durch die vorliegende Erfindung stark gemildert oder j eliminiert werden.

i f I 4 : Π » a \ v e -3- I-·- « » % 1 Die vorliegende Erfindung-betrifft ein Verfahren und eine - > *

Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines enzymatischen Agens in einer Lösung, in der ein elektrischer Strom zwischen einer.Gegenelektrode und einer länglichen, 5 zylindrischen Graphitelektrode mit hoher Dichte und niedriger Porosität fließt. Die Graphitelektrode wird um ihre Längsachse gedreht in der Lösung, die auch ein Redox-Paar und ein Substrat enthält, die durch das enzymatische Agens katalysiert werden, so daß sie reagieren 10 und das Redox-Paar von einem Oxidationszustand in einen anderen überführt wird. Die Änderung des Oxidationszustandes bewirkt eine Änderung des die sich drehende Elektrode durchfließenden Stromes, die in Beziehung steht zur Rate bzw. Geschwindigkeit der Änderung des Oxidationszustandes 15 des Redox-Paares, die ihrerseits in Beziehung steht zur Konzentration des enzymatischen Agens.

Der eingetauchte Abschnitt der Graphitelektrode ist auf s, seiner gesamten Oberfläche mit Ausnahme der Stirnfläche 20 (Endoberfläche) mit einer schützenden Isolierschicht, beispielsweise aus einem Epoxyharz, die nicht-leitend, inert und für die Bestandteile der Lösung undurchlässig ist, überzogen. Dies erlaubt die Durchführung hochpräziser und reproduzierbarer Messungen und ermöglicht auch 25 die Verwendung der gleichen Elektrode für eine Reihe von aufeinanderfolgenden Messungen der Konzentrationen von enzymatischen Agentien in verschiedenen Lösungen durch einfaches Entfernen eines Teils des freiliegenden Endes der Elektrode zwischen aufeinanderfolgenden Messungen.

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Das hier beschriebene Verfahren umfaßt auch die Entlüftung der Lösung zur Entfernung von Sauerstoff vor Messung des Stromflusses. Für bestimmte enzymatische Agen-i tien, wie z.B. aerobe Bakterien, wird, wie gefunden 35 wurde, die Präzision stark erhöht durch Einführen des Redox-Paares und des Substrats in die Lösung vor Durchführung der Entlüftungsstufe. j r\ * 1 ^ -4- * ψ * • * 1 Gemäß bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die Erfindung » * die Verwendung von Dinatrium-EDTA, um die Präzision der Analyse wesentlich zu verbessern.

5 Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine Vorrichtung zur Messung der Konzentrationen eines enzymatischen Agens gemäß der vorliegenden 10 Erfindung;

Fig. 2 in graphischer Form ein Beispiel des Stromflusses durch den Meßkreis, aufgetragen gegen die Zeit; 15

Fig. 3 in graphischer Form die Beziehung zwischen der

Reaktionsgeschwindigkeit bzw. -rate und der Bakterienkonzentration während des Lösungstests; und 20 Fig. 4 eine Querschnittsansicht der Graphitelektrode entlang der Linien 4-4 der Fig. 1.

Die Fig. 1 zeigt einen aktinischen Glasbehälter 10, der eine Lösung 12 enthält, deren Konzentration an enzymati-25 schem Agens getestet bzw. bestimmt werden soll. Das enzymatische Agens kann umfassen oder enthalten ein Enzym ~ selbst oder eine Hefe; die vorliegende Erfindung ist jedoch insbesondere brauchbar für Bakterien enthaltende Lösungen.

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Die Lösung 12 enthält Wasser, das unter Verwendung ge-v eigneter Puffer, wie z.B. Kaliumdihydrogenphosphat (K^PO^) und Dikaliumhydrogenphosphat (K2HP04) auf einen a pH-Wert von 7,0 abgepuffert ist. Der optimale pH-Wert 35 hängt von dem speziellen getesteten enzymatischen Agens ab, in der Regel ist jedoch ein neutraler pH-Wert von 0 7,0 zufriedenstellend. Das Dinatriumsalz der Ethylendi- [ ΓΜ 1 * * # - ΞΙ amintetraessigsäure (Dinatriumedetat oder Dinatrium- ' 4 EDTA) wird in einer Menge zugegeben, die ausreicht, um seine Konzentration etwa 0,01 molar in der Lösung 12 zu machen. Es wurde gefunden, daß dadurch die Störung 5 von Metallionen, die in der Lösung als Verunreinigungen vorhanden sein können, herabgesetzt wird, die sonst die enzymatische Aktivität oder den Stromfluß durch die Lösung 12 beeinflussen und fehlerhafte Ergebnisse liefern würden. Es wird angenommen, daß das Dinatrium-EDTA mit 10 den Metallionen Komplexe bildet, um ihre Ausfüllung unter Verfahrensbedingungen zu verhindern (die sonst Bakterien oder andere enzymatische -Agentien, die analysiert werden sollen, einschließen könnte). Die wirksamen und optimalen Mengen an Dinatrium-EDTA hängen von den vorhandenen Metall-15 ionen ab und können durch Routineversuche ermittelt werden.

^ Der Lösung werden ein Substrat und ein Redox-Paar zugesetzt.

Das ausgewählte Substrat und das ausgewählte Redox-Paar ä sollten von einem Typ sein, der einer katalytischen Wir- 20 kung durch das getestete spezielle enzymatische Agens unterliegt. In der Regel werden für die meisten Bakterien ausgezeichnete Ergebnisse erzielt bei Verwendung einer Lösung 12, die Glucose in einer etwa 0,01-molaren Konzentration und Methylenblau (Methylthioninchlorid) in einer 25 etwa 0,0001-molaren Konzentration enthält.

Das Innere des Behälters 10 ist durch die Hälse 14, 16, 18 und 20 zugänglich. Nachdem alle Komponenten eingeführt worden sind, wird ein inertes Gas, wie z.B. Argon, 30 durch die Leitung 30 und das Verteilerrohr 32 eingeleitet, so daß es durch die Öffnungen 34 nach oben durch die * 'Lösung 12 hindurchperlt. Dieses Verfahren wird in der

Regel etwa 5 min lang durchgeführt, um den größten Teil -- des freien Sauerstoffs aus der Lösung 12 zu entfernen.

35 Das hindurchperlende Argon und irgendwelche flüchtigen Materialien, wie z.B. Sauerstoff, strömen nach oben durch den Dampfraum 35 und werden mittels der Auslaßleitung 36 aus dem Behälter 10 entfernt. Sowohl die Einlaßleitung 30 j i ΛΪ J - * ! i I * ·.

i 1 . - 6- 1 als auch die Auslaßleitung 36 sind mittels eines Zwei-Loch- i Stopfens 38 innerhalb des Einführungshalses 14 dicht einge- j b ; paßt.

j I 5 Ein getrennter Glasbehälter 11, der eine Lösung 13 enthält, wird mit dem System in dem Behälter 10 mittels einer ' ✓ *

Salzbrücke 100, die aus Agar und Kaliumchlorid besteht, elektrolytisch verbunden. Die Lösung 13 enthält einen geeigneten Elektrolyten, in der Regel eine 0,1-molare 10 Eisen(III)-EDTA-Lösung oder alternativ eine wäßrige Kaliumchloridlösung.

Der Zugang zum Innern des Behälters 11 wird erhalten durch die Hälse 15, 17 und 19. Die Lösung13 kann gewünschtenfalls 15 ebenfalls entlüftet werden durch Einleiten eines inerten Gases, wie Argon, durch die Einlaßleitung 31 und das s Verteilerrohr 33, und durch Herausperlenlassen durch die Öffnung-37 und nach oben durch die Lösung 13. Das hindurch-i perlende Argon und der Sauerstoff und irgendwelche anderen 20 flüchtigen Materialien strömen nach oben durch den Dampfraum 39 und werden mittels der Auslaßleitung 41 aus dem Behälter 11 entfernt. Die Einlaßleitung 31 und die Auslaßleitung 41 sind beide durch einen Zwei-Loch-Stopfen 43 innerhalb des Zuführungshalses 15 dicht eingepaßt.

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Eine Batterie oder Gleichstromquelle 40 ist mit einem Potentiometer 42 mit einem PotentiometerSchieber 44 und einem Widerstand 46 ausgestattet. Der Schieber 44 steht durch den Leiter 50 mit der Gegenelektrode 52 in Ver-30 bindung. Die Gegenelektrode 52 kann aus irgendeinem geeigneten Elektrodenmaterial gefertigt sein. Für die * meisten Verwendungszwecke ist, wie gefunden wurde, eine

Eisenelektrode zufriedenstellend. Die Gegenelektrode 52 ist innerhalb des Einführungshalses 17 mittels des Stopfens 35 54 dicht eingepaßt.

Eine Graphitelektrode 56 mit hoher Dichte und niedriger j fN* \ ‘ # - 7 - % 1 Porosität ist innerhalb des Einführungshalses 20 des Be- ** * hälters 10 mittels des Stopfens 57 dicht eingepaßt ' und steht durch den Leiterdraht 58 über das Ampereme ter 60 und den Leiter 62 mit der positiven Seite der 5 Batterie 40 in Verbindung. Eine Bezugselektrode 70, wie z.B. eine gesättigte Kalomelelektrode, ist durch den Stopfen 72 in den Einführungshals 18 des Behälters 10 eingesetzt und steht mittels der Leiter 74 und 76 über das Voltmeter 78 mit dem Leiter 58 aus der Graphitelektro-10 de in Verbindung.

Um die Apparatur in Betrieb zu setzen, ist es wichtig, die Graphitelektrode 56 zu drehen, um einen repräsentativen Kontakt der Elektrode mit den Bestandteilen der 15 Lösung 12 zu gewährleisten, um das an der Oberfläche der Elektrode verbrauchte Redox-Paar zu ersetzen. Dies wird erzielt durch Verwendung einer Antriebseinrichtung 80 und eines Getriebemechanismus 82, wie in Fig. 1 schematisch dargestellt. Es kann ein Bereich von Drehgeschwindigkeiten 20 mit Erfolg angewendet werden; es' ist jedoch bevorzugt, die Elektroden erfindungsgemäß mit Geschwindigkeiten von etwa 100 bis etwa 2000 Umdrehungen pro Minute (UpM) zu drehen. Es können auch niedrigere Geschwindigkeiten angewendet werden, bei zu niedrigen Geschwindigkeiten wird 25 die Elektrode jedoch empfindlicher gegen äußere Vibrationen und weniger empfindlich für die Messung (Bestimmung) von niedrigen Bakterienkonzentrationen.

Um ein Testverfahren zu starten, wird der Potentiometer-30 Schieber 44 entlang der Widerstandseinrichtung 46 so eingestellt, bis die Ablesung auf dem Voltmeter 78 im wesentlichen 0,0 beträgt. Nach oder gleichzeitig mit dem Herausspülen des gelösten Sauerstoffs in der Lösung 12 mit Argon werden eventuelle verbleibende Spuren an 35 Sauerstoff vorzugsweise entfernt durch Zugabe von beispielsweise genügend Eisen(II)-EDTA, um den gemessenen Stromfluß durch das Amperemeter 60 auf im wesentlichen j 0 herabzusetzen.

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- 8- t, 4 * % » - 1 Der Stromfluß durch den Testkreis (d.h. zwischen der »*

Graphitelektrode 56 und der Gegenelektrode 52)', gemessen s mittels des Amperemeters 60, wird, wie in der Fig. 2 darge- stellt graphisch( gegen die Zeit aufgetragen. In der 5 Regel ist die Änderung des Stromes mit der Zeit zu Be- . ginn nicht-linear, nach einer kurzen' Zeitspanne entsteht jedoch eine lineare Beziehung. Die Steigung des linearen Abschnittes der Linie (angezeigt durch die Tangentenlinie in der Fig. 2) ist proportional zur Reaktionsgeschwin-10 digkeit bzw. -rate des Redox-Paares an der Elektrode 56 als Folge der katalytischen Wirkung des enzymatischen "·· Reagens. Eine typische Beziehung zwischen der Reaktions rate bzw. -geschwindigkeit und der Bakterienkonzentration in einer mit Glucose und Methylenblau gesättigten Lösung 15 (relativ zur Menge der verfügbaren Bakterien) ist in der Fig. 3 dargestellt.

Dieses Beispiel wurde durchgeführt unter Verwendung einer 300 ml-Flutwasserprobe in dem Behälter 10 mit 0,112 g » — 20 Dinatrium-EDTA, um die Lösung 0,001-molar an Dinatrium-EDTA zu machen. Zu dieser Lösung wurden 1,633 g K^PO^ und 3,136 g K^HPO^ zugegeben, um die Lösung 0,1-molar an Phosphat zu machen. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von 0,5 n NaOH auf 7 eingestellt und es wurden 0,5 g -4 25 (0,01 M) Glucose und 15 ml 0,01 M Methylenblau (5 x 10 M) zu der Lösung zugegeben. Dann wurde die Lösung mit den . Elektroden in Kontakt gebracht, wobei die sich drehende Elektrode vorher durch Polieren mit feinem Sandpapier und anschließendes Polieren auf einer Glasplatte gerei-30 nigt worden war. Die Kohlelektrode wies eine freiliegende untere Oberfläche von 0,30 cm2 auf und wurde mit 1000 UpM gedreht.

c Die Spannung wurde so eingestellt, daß die sich drehende 35 Elektrode bei 0,00 Volt gegen die gesättigte Kalomel-elektrode lag. Der Strom wurde als Funktion der Zeit gemessen. Als die Steigung der Änderung des Stromes mit dem r

Ablauf der Zeit konstant wurde, wurde die Steigung be- j i ”4 f 9 ♦ - 9- - 1 stimmt und die Anzahl der Bakterien errechnet auf der

Basis der Eichkurve. In diesem Beispiel wurden die Rëak- - tionsgeschwindigkeiten bzw. -raten, ermittelt aus der Steigung der Tangentenlinie in Fig. 2,dazu verwendet, 5 wie durch die unterbrochenen Linien in Fig. 3 dargestellt, zu ermitteln, daß die Bakterienkonzentration 6 7 ' zwischen 10 und 10 Zellen pro ml Lösung lag, wenn die -9

Reaktionsgeschwindigkeit bzw. -rate etwa 6,25 x 10 betrug.

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Graphische Darstellungen ähnlich der Fig. 3 können hergestellt werden unter Verwendung vpn Standard-Konzentrationen von Bakterien oder anderen enzymatischen Agentien bei Standard-Testbedingungen. Nachdem diese Eichkurve 15 hergestellt worden ist, kann sie wiederholt für Tests mit unterschiedlichen Proben von Lösungen, welche die gleichen oder ähnliche Bakterien oder enzymatische Agentien enthalten, verwendet werden.

20 Die Fi9* 4 zeigt einen Querschnitt entlang den Linien 4-4 der in Fig. 1 dargestellten Graphitelektrode 56 mit hoher Dichte und niedriger Porosität. Die Elektorde 56 besteht aus einem Graphitkern 96, der in der Regel aus einem sehr hochreinen, undurchlässigen zylindrischen 25 Element mit einem Durchmesser innerhalb des Bereiches von etwa 0,1 bis etwa 10 cm, vorzugsweise von etwa 0,3 bis etwa 1,0 cm, besteht. Der Graphit sollte eine Porosität von weniger als etwa 10 % besitzen. Dies ist wichtig, um die Absorption von Lösung, die dann in eine an-30 schließend getestete Probe eingeschleppt werden könnte, minimal zu halten. Auch hat irgendeine Absorption in die Zwischenräume der Poren einer Elektrode einen elek- xr trischen Effekt analog zur Vergrößerung der Oberfläche der Elektrode, d.h. sie erhöht die Rate bzw. Geschwin-35 digkeit der Oxidation des Redox-Paares und kann zu fehlerhaften Ablesungen, insbesondere bei niedrigen Elektrodenumdrehungsgeschwindigkeiten, führen.

t i % -10- - 1 Der Überzug-98 um die äußere Oberfläche des zylindri schen Stabes 96 herum kann aus irgendeinem geeigneten undurchlässigen Material bestehen. Vorzugsweise wird ein polymeres Material (beispielsweise ein Epoxyharz, Poly-5 urethan oder dgl.) verwendet, da die Graphitstäbe in diese Materialien eingetaucht werden können und der daran haftende Überzug innerhalb einer verhältnismäßig kurzen Zeitspanne gehärtet werden kann unter Ausbildung einer zähen, dichten Schutzschicht. Die Schicht braucht 10 nicht übermäßig dick zu sein, vorausgesetzt, daß sie für die Flüssigkeit undurchlässig ist und als Isolator gegenüber dem beträchtlichen Stromfluß relativ zur elektrischen Leitfähigkeit des Graphits fungiert. Im allgemeinen haben sich Epoxyüberzüge einer Dicke von etwa 1 mm als 15 akzeptabel erwiesen.

Nachdem der Überzug 98 aufgebracht ist, wird der Endabschnitt entfernt, um eine unbeschichtete Graphitober-. fläche 110 am Ende der Elektrode freizulegen (vgl. Fig.

! 20 1) . Die Oberfläche 110 stellt somit die einzige Kontakt- j fläche zwischen dem Graphit und der Lösung 12 dar, wobei ! der Schutzüberzug 98 mindestens bis zu dem Dampfraum 35 des

Behälters 10 verläuft und vorzugsweise den gesamten Graphitabschnitt der Elektrode bedeckt.

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Die Stirnfläche (Endoberfläche) 110 sollte geschliffen oder geschmirgelt werden, beispielsweise mit sehr feinem Sandpapier, um irgendwelche Kratzer zu entfernen und eine ebene Oberfläche zu erzeugen. Vorzugsweise wird 30 sie dann poliërt unter Verwendung von glattem hartem Papier auf einer harten ebenen Oberfläche, wie z.B. einer Glasplatte, bis ein metallischer Glanz die gesamte Oberfläche 110 bedeckt. Dann wird die Elektrode unmit-c telbar vor der Verwendung mit Methanol und destillier- 35 tem Wasser gespült, um irgendwelche Öle oder sonstige Verunreinigungsmittel zu entfernen.

4 J

Γ,

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v -11- ! ψ m 1 Durch Herstellung einer sehr glatten, glänzenden, undurchlässigen Oberfläche 110 kann eine hohe Präzision in Korrelation zu den nachfolgenden Messungen erzielt werden, da sehr gut reproduzierbare elektrische 5 Meßkreise mit genauen freiliegenden Oberflächengrößen der Graphitelektrode hergestellt werden können.

Ein besonders attraktives Merkmal der erfindungsgemäßen beschichteten Graphitelektrode ist ihre Verwendbarkeit 10 zur Durchführung aufeinanderfolgenden Tests mit verschiedenen Mustern oder Proben der Lösung 12. So kann beispielsweise die Lösung geändert werden oder die Elektrode kann aus dem Einführungshals 20 herausgezogen und in einem anderen Behälter 10 mit einer anderen 15 Lösung verwendet werden. Vor dem Einführen der Graphitelektrode 56 in eine neue Lösung wird der untere Endabschnitt entfernt (beispielsweise durch Abschleifen ii& eines Teils), um sicherzustellen, daß auch geringfügigen Mengen an absorbierter Lösung aus dem vorherge-20 henden Test entfernt worden sind. Es wurde gefunden, daß durch Abschleifen von etwa 0,64 cm (1/4 inch) oder mehr des Bodens der Elektrode und anschließendes Schmirgeln und Polieren der Bodenoberfläche die Elektrode für die Wiederverwendung geeignet ist unter Erzielung 25 von Ergebnissen, die von denjenigen einer neuen Elektrode nicht zu unterscheiden sind. Darüber hinaus wurde im Gegensatz zu den bekannten Elektroden, in denen beispielsweise Edelmetalle verwendet werden, gefunden, daß irgendwelche Ablagerungen oder eine Verunreinigung des 30 äußeren Überzugs 98 der Elektrode die Genauigkeit des Tests nicht beeinflussen (beeinflußt). Es ist somit nicht erforderlich, die Elektrode wegzuwerfen, wenn ihre äußere Oberfläche mit von außen einwirkenden Agentien korrodiert oder beschichtet ist.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme r auf spezifische bevorzugte Ausführungsformen näher j Ύ 35 -12- h * * ί ' 1 erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständ- * lieh, daß sie darauf nicht beschränkt ist, sondern auch viele andere Verwendungen und Abänderungen umfaßt, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung 5 verlassen wird.

10 15 ** 2° * 25 30

V

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Claims (15)

1. 5 Patentansprüche M
2. 1. Verfahren zur Messung der Konzentration eines enzyma-' tischen Agens in einer ersten Lösung, in die eine erste
3. 10 Elektrode mindestens teilweise eingetaucht ist, wobei eine zweite Elektrode mindestens teilweise in eine zweite Lösung · ' eingetaucht ist, die mit der ersten Lösung in elektrolytischer Verbindung steht, und wobei an die erste Elektrode und die zweite Elektrode ein elektrisches Potential angelegt 15 wird, und der resultierende fließende Strom zwischen den Elektroden in Relation zur Konzentration des enzymatischen Agens in der ersten Lösung steht, dadurch g e k e η n zeichnet , daß als erste Elektrode ein Graphit-'Leiter mit einer Porosität verwendet wird, die ausreichend 20 niedrig ist, um eine signifikante Absorption von mehr Lösung als etwa 0,6 cm (1/4 inch) unterhalb ihrer Ober- * fläche zu verhindern. * 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 25 daß ein Graphit-Leiter mit einer Porosität von weniger \ * * 0 « Ί \ - 14- ** 1 als etwa 10 % verwendet wird. ·* 3. 'Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Leiter zylindrisch ist und um seine
4. 5 Längsachse mit einer .Geschwindigkeit gedreht wird, die ausreicht, um einen repräsentativen Kontakt desselben mit den Bestandteilen der ersten Lösung zu gewährleisten.
5. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, 10 daß die Geschwindigkeit innerhalb des Bereiches von etwa 100 bis etwa 2000 Umdrehungen pro Minute (UpM) liegt.
6. 5- Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, 15 daß der eingetauchte Abschnitt des zylindrischen Leiters auf seiner gesamten Oberfläche mit Ausnahme der eingetauchten Stirnfläche mit einer elektrisch isolieren-den Schicht überzogen ist, die für die erste Lösung un-. durchlässig ist. 20
7. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der zylindrische Leiter einen Durchmesser zwischen etwa 0,1 und etwa 10 cm hat.
8. 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Leiter einen Durchmesser zwischen etwa 0,3 und etwa 1,0 cm hat.
9. 8· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, 30 daß die erste Lösung enthält oder besteht aus einer wäßrigen Lösung, die das enzymatische Agens, ein Redox-Paar und das Substrat enthält, und daß es außerdem die Stufe der Zugabe einer ausreichenden Menge Dinatrium-s EDTA zu der ersten Lösung umfaßt, um dadurch die Präzi- 35 sion der Messung der Konzentration des enzymatischen Agens wesentlich zu verbessern. » ψ f * r 4 Λ ; -15- * lg. Verfahren zur Herstellung einer Elektrode zum min destens teilweisen Eintauchen in eine Lösung und zur Durchführung von Präzisionsmessungen des hindurchfließenden Stromes, dadurch.gekennzeichnet, daß 5 ein zylindrischer Graphit-Leiter mit einem Durchmesser innerhalb des Bereiches von etwa 0,1 bis etwa 10 cm und *· · einer Porosität von weniger als etwa 10 % hergestellt wird, die Oberflächen der Seiten des zylindrischen Leiters mit-einem polymeren Material überzogen werden, das für 10 die Lösung undurchlässig ist, und die Stirnfläche des zylindrischen Leiters abgeplattet, , geglättet und poliert wird zur Erzielung eines metalli schen Glanzes.
10. 10. Elektrode, wie sie in dem Verfahren gemäß Anspruch 9 erhalten wird. i 1
11. 11. Verfahren zur Messung der Enzymkonzentration in ,, einer ein Enzym und gelösten Sauerstoff enthaltenden 20 wäßrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß eine Probe der Lösung in einen Behälter eingeführt wird, die Lösung auf einen im wesentlichen neutralen pH-Wert abgepuffert wird, | ein Substrat und ein Redox-Paar der Lösung zugegeben 25 werden, wobei das Substrat und das Redox-Paar durch die katalytische Wirkung des Enzyms von einem Oxidationszustand in einen anderen überführt werden, der gelöste Sauerstoff aus der wäßrigen Lösung entfernt [ wird, nachdem das Substrat und das Redox-Paar der Lösung ! ' ; 30 zugesetzt worden sind, | eine elektrolytische Lösung in einem getrennten Behälter 4 bereitgestellt wird, die wäßrige Lösung und die elektrolytische Lösung elektro-= lytisch miteinander verbunden werden, ; 35 eine Gegenelektrode mindestens teilweise in die elektroly- ' tische Lösung eingetaucht wird, ! I S./ » J > t -16 *L 1 eine Graphitelektrode mindestens teilweise in die wäßrige Lösung eingetaucht wird, wobei die Graphitelektrode aus einem zylindrischen Graphit-Leiter mit einem Durchmesser innerhalb des Bereiches von etwa 0,1 bis etwa 10 cm 5 und einer Porosität von weniger als etwa 10 % besteht, der auf den Oberflächen seiner Seiten einen isolierenden Überzug aufweist, der für die wäßrige Lösung undurchlässig ist, während die Stirnfläche des zylindrischen Leiters frei von dem Überzug ist und abgeplattet, glatt und 10 poliert ist zur Erzielung eines metallischen Glanzes, die Graphitelektrode mit einer Geschwindigkeit innerhalb des Bereiches von etwa 100 bis etwa 2000 Umdrehungen pro Minute (UpM) um ihre Längsachse gedreht wird und zwischen der Graphitelektrode und der Gegenelektrode ein elektrisches 15 Potential angelegt wird, der zwischen der Gegenelektrode und der Graphitelektrode fließende Strom gemessen wird, und die Enzymkonzentration in der wäßrigen Lösung aus der Geschwindigkeit bzw. Rate der Änderung des fließenden 20 Stromes bestimmt wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,. [ daß die Gegenelektrode aus Eisen besteht. [ [ | 25 13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, i daß das Enzym Bakterien enthält bzw. umfaßt und daß das i ! Substrat und das Redox-Paar Glucose und Methylenblau ? enthalten bzw. umfassen. i .
13. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekenn zeichnet, daß in der wäßrigen Lösung Metallionen als Verunreini-* gungen vorhanden sind und daß es außerdem die Stufe der Zugabe von genügend Dinatrium-EDTA zu der Lösung umfaßt, um eine Wechselwirkung (Störung) zwischen den Metallionen 35 und der Präzision der Messungen des Enzyms minimal zu halten. v : ! * ï* - ν’ ί - * -17-
14. 15. Verfahren nach einem der’Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem umfaßt die Entfernung von mindestens etwa- v 0,6 cm (1/4 inch) des untergetauchten Endes der Graphitelektrode nach Messung des hindurchfließenden Stromes, 5 das .Abplatten, Glätten und Polieren der resultierenden neu freigelegten Stirnfläche desselben bis zur Erzielung eines metallischen Glanzes und die Wiederverwendung der Graphitelektrode.
15. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der gelöste Sauerstoff aus der wäßrigen Lösung entfernt wird durch Hindurchperlenlassen eines sauerstofffreien inerten Gases. 15. o ----------- : Γ 20 25 30 35