JPS6125052A - 酵素濃度の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は酵素の活性個体群又は酵素含有個体群、例えば
バクテリア、酵母菌などの濃度を定量する方法及び装置
に関する。

伝統的に、このような個体群は顕微鏡法で、又は更に複
雑な方法、例えば個体群を含有する液体の光学的濁り度
を測定する方法で数えられていた。

本発明者が共同発明者に々っているアメリカ特許第３，
５０６，５４４号に、酵素触媒反応のある成分の濃度を
電気化学的に可逆的なレドックス・カップル（ｒｅｃｌ
ｏｘ　ｃｏｕｐｌｅ　）を用いて測定する方法が述べら
れている。この方法においては、酵素、レドックス・カ
ップル、例えばメチレンブルー、基質、例えばグルコー
ス及び相溶性の導電性媒体、例えば緩衝水溶液が電解槽
中で混合され、その電らできていた。酵素の活性は酸化
されたレドックス・カップルを酵素の濃度に対応する割
合で還元させた。還元されたレドックス・カップルは電
解槽の陽極で再酸化を受け、かくして還元形のレドック
ス・カップル濃度に比例するセル電流がもたらされた。

電流の増加率はかくして溶液中の酵素濃度に比例するこ
とが示された。

酵素又はバクテリア個体群を測定する各種の従来法はあ
る種の欠陥を避けられなかった。それらのあるものは非
常に低い濃度を検出するには十分な感度を持たないとか
、非常に遅いとか、あるいはそれらによる定量を効率的
に行うには必要とされはステップが多過ぎるとかの欠点
を持っていた。

ある方法、特に貴金属又は同様の金属の電極を用いる方
法はまた極めて高価であった。１だ、ときには特定標本
の分析で説明不能の誤差が生ずることも見い出された。

従来装置によるもう１つの問題は、同じ装置を多数の標
本について連続して使用するとき表面化した。すなわち
、１つの標本セルからもう１つのセルえの電極の移動は
第二のセル又は標本を酵素又は電極によって吸収された
他の成分で汚染させることが判明した。また、電解液に
浸漬される電極の表面積を一定に保つのを保証するため
に、セルを校正するのに用いられる深さと同一の非常に
正確に測定された深さまでセルを確実に満すには多大の
注意を払う必要があった。この点で多大の注意を払って
も、しかしながら、測定において説明不能の誤差が発生
した。

従来法で遭遇した更に他の問題は、テストを行う前に溶
液を脱泡する必要があることから来ていた。ある種の状
況下では、予測できない量の好気性バクテリアが脱泡ス
テップにより失活せしめられることがあることが判明し
た。他方、溶液が脱泡されないと、残っている酸素が測
定の基礎となる陽極での反応に寄与するため測定精度が
阻害された。

従来法のこれらの、及び他の問題は本発明によシ著しく
軽減又は取り除くことができる。

発明の要約 本発明は、カウンター電極と低多孔度の細長い円筒状の
高密度黒鉛電極との間に電流が流される溶液中の酵素濃
度を測定する方法及びその手段を意図するものである。

こ＼で、黒鉛電極は溶液中でその長軸の廻りに回転せら
れ、その溶液はまたレドックス・カップルと基質を含有
し、酵素剤はそれらレドックス・カップルと基質に触媒
作用を及ぼしてそれらを反応させ、そのレドックス・カ
ップルを１つの酸化状態からもう１つの酸化状態に変化
させる。酸化状態の変化は回転している電極を流れる電
流に変化をもたらす。この場合、その変化はレドックス
・カップルの酸化状態の変化に関係し、従ってまた酵素
剤の濃度に関係する。

黒鉛電極の液面下の部分は端面を除きその全表面を非導
電性で不活性な、そして溶液の各成分を透過させない保
護絶縁層、例えばエポキシ樹脂で被覆されている。これ
は測定について高い精度と再現性を可能にし、また連続
する測定間で電極の露出端面部分を単に取り除くことに
よって同じ電極を用いて色々な溶液中の酵素剤濃度の一
連の連Ｃ９） 続測定を行うのが可能になる。

本発明の方法はまた電流を測定する前に酸素を除去する
ために溶液な脱泡することを意図するものである。好気
性バクテリアのようなある種の酵素剤には、脱泡ステッ
プの前に溶液にレドックス・カップルと基質を導入すれ
ば精度が著しく向上することが判明した。

好ましい態様において、本発明は分析精度を実質的に改
善するためにＥＤＴＡシナ）　ＩＪウムを使用すること
を意図する。

発明の詳細な記述 第１図は化学ガラス（ａｃｔｉｎｉｃ　ｇｌａｓｓ　）
製容器１０を示し、その中には酵素剤濃度が測定される
溶液１２が入っている。酵素剤は酵素自体又は酵母菌か
ら成ることができる。しかし、本発明の利用は特にバク
テリアを含有する溶液について意図されている。

溶液１２は適当な緩衝剤、例えばリン酸二水素カリウム
（ＫＨ２ＰＯ４）とリン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ
４）を用いてｐＨ７に調整されている水を含有している
。最適ｐＨはテストされる特定の酵素剤に依存するが、
典形的には中性のｐＨ７で十分である。エチレンジアミ
ンテトラ酢酸のジナトリウム塩〔ニブテート（ｅｄ、ｅ
ｔａｔｅ　）　　ジナトリウム、すなわちＥＤＴＡジナ
トリウム〕はその溶液１２中濃度を約０．０１モルにす
るのに十分な量で添加する。これは、溶液中に不純物と
して存在することがあり、またもしそのＥＤＴＡ塩が存
在しないと酵素活性又は溶液１２を流れる電流に影響し
、不正確な結果をもたらす傾向のある金属イオンの妨害
を減少させるのが見い出された。これは、ＥＤＴＡジナ
トリウムが金属イオンとコンプレックスを形成してプロ
セス条件でそれらの沈澱を妨げると信じられている（そ
の沈澱はさもなければ分析されるバクテリア又は他の酵
素剤を吸蔵する）。かくして、ＥＤＴＡジナトリウムの
有効量又は最適量は存在する金属イオンに左右される。

しかし、それは日常的な実験で決めることができる。　
　　　　　。

溶液には基質とレドックス・カップルが添加さく１１） れる。選択される基質とレドックス・カップルはテスト
される特定の酵素剤に由来する触媒作用を受けるタイプ
のものでなければならない。典形的には、はとんどのバ
クテリアに対しては、約０．０１モル濃度のゲルコール
と約０．０００１モル濃度のメチレンブルー（塩化メチ
ルチオニン）を含有する溶液を用いると優れた結果が達
成される。

容器１０の内部への接近はネック１４．．１６゜１８及
び２０で達成される。内容物を適所に全て入れた後、不
活性ガス、例えばアルゴンをライン３０から注入し、チ
ューブ３２で分配し、開口３４から吹き出させ、溶液１
２にバブリングさせる。この操作を典形的には約５分間
続け、溶液１２からほとんどの遊離酸素を追い出す。バ
ブリングしているアルゴン及び任意の揮発性物質、例え
ば酸素は蒸気空間３５を通って上方に進み、排出ライン
３６で容器１０から取り除かれる。導入ライン３０及び
排出ライン３６は両方共接近ネック１４内の２孔ストツ
パー３８に密封嵌入されている。

溶液１３が入っている別のガラス容器１１は、寒天と塩
化カリウムより成る塩ブリッジ１００によって容器１０
の系と電気分解的に接続されている。溶液１３は適切な
電解液、典形的にはＥＤＴＡ第二鉄の０．１モル溶液を
、あるいはまた塩化カリウム水溶液を含有している。

容器１１の内部への接近はネック１５．１７及び１９で
達成される。溶液１３もまた所望によって、不活性ガス
、例えばアルゴンを導入ライン３１から注入し、チュー
ブ３３で分配し、開口３７から吹き出し、溶液１３を通
してバブリングさせることによって脱泡することができ
る。バブリングしているアルゴン及び酸素、及び他の任
意の揮発性物質は蒸気空間３９を通って上方に進み、排
出ライン４１によって容器１１から取り除かれる。導入
ライン３１及び排出ライン４１は両方共接近ネック１５
内の２孔ストツパー４３に密封嵌入されている。

バッテリー又はＤＣ電力供給源４０はポテンショメータ
ー４２を備え、ポテンショメーター４２はポテンショメ
ータースライダー４４及び抵抗手段４６を有している。

スライダー４４は導線５０によってカウンター電極５２
に接続されている。

カウンター電極５２は任意の都合のよい電極材料から作
ることができる。はとんどの使用には、鉄電極が満足で
きることが判明している。カウンター電極５２は接近ネ
ック１７内にストッパー５４で密封嵌入されている。

容器１０の接近ネック２０内には高密度で低多孔度の黒
鉛電極５６がストッパー５７で嵌入され、導線５８によ
シミ流計６０及び導線６２を経由してバッテリー４０の
陽極側に接続されている。

参照電極７０、例えば飽和カロメル電極が容器１０の接
近ネック１８にストッパー７２で嵌入すれ、導線７４及
び７６で電圧計７８を経由して黒鉛電極からの導線５８
に接続されている。

装置を運転下に置くには、黒鉛電極５６を回転させて電
極を溶液１２の成分と確実、十分に接触させ、消費され
るレドックス・カップルを電極表面において置換するこ
とが重要である。この回転は第１図に模式図的に図示さ
れる１駆動手段８０とギヤ機構８２を用いて達成される
。色々な回転速度が満足に用いることができるが、本発
明では約１００〜２，０００　ｒｐｍ　の速度で電極を
回転させるのが好ましい。もつと遅い速度も使用できる
。

しかし、速度が遅過ぎると、電極が外部振動に対して一
層鋭敏になり、低濃度のバクテリアを検出することに対
して感度が小さくなる。

テスト操作を開始するために、ポテンショメータースラ
イダー４４を抵抗手段４６に沿って電圧計７８の示度が
本質的に０．０で読み取れるようになるまで調整する。

溶液１２中の溶存酸素をアルゴンと共にパージした後、
又はパージと同時に、残っている痕跡量の酸素を、例え
ば電流計６０を通って流れる電流の測定値を本質的にゼ
ロに減少させるのに十分なＥＤＴＡ第一鉄を添加するこ
とによって除去するのが好ましい。

電流計６０で測定されるテスト回路（すなわち、黒鉛電
極５６とカウンター電極５２との間の回路）を通って流
れる電流を第２図に示されるようにプロットする。典形
的には、電流の時間に対する変化は初めは直線ではない
が、短時間の後に直線関係が確立される。線の直線部分
（第２図に接線で示される）の傾斜は酵素剤の触媒作用
による電極５６におけるレドックス・カップルの反応速
度に比例する。その反応速度とグルコースとメチレンブ
ルーで飽和された溶液中のバクテリア濃度（バクテリア
の有効量に対する）との間の典形的関係を第３図に示す
。

この実施例はＥＤＴＡシナ）　ＩＪウムの形で０．００
１モルの溶液を調製するために０．１１２ｇのＥＤＴＡ
ジナトリウムを含む容器１０中の３００−の血液水試料
を用いて行った。この溶液に１．６３３９のＫ　Ｈ２Ｐ
　Ｏ４と３．１３６ｇのＫ　２　ＨＰ　０４を加えてホ
スフェートの形で０．１モルの溶液を調製した。

０．５規定のＮａＯＨを用いてｐＨ７に調整し、そして
この溶液に０．５ｇのグルコース（０，ＯＩＭ）及び１
５ｆｎｌの０．０１Ｍメチレンブルー（５Ｘ１０−’Ｍ
）を加えた。この溶液を次に電極と接触させて置いた。

回転用電極は細かいサンドペーパーで研磨することによ
って前取って清浄にされており、次いでガラス板上で研
磨した。この炭素電極は０．３０Ｃｒｌの露出下面を有
し、１．、　ＯＯＯｒｐｍ　で回転させた。

電圧は回転用電極が飽和カロメル電極に対して０．００
ボルトとなるように設定した。電流は時間の関数として
測定した。電流の時間に対する変化の傾斜が一定になっ
たとき、その傾斜を測定し、校正カーブに基づいてバク
テリア数を計算した。

この実施例において、第２図の接線の傾斜から求めた反
応速度を第３図に破線で示すように用いて、反応速度が
約６．２５Ｘ１０　　であるときバクテリアの濃度は溶
液１ミリリッター当り細胞１０６個乃至１０　個である
ことを確立した。

標準テスト条件におけるバクテリア又は他の酵素剤の標
準濃度を用いて第３図と同様のグラフを作ることができ
る。この校正カーブを作ると、これを同じ、又は同様の
バクテリア又は酵素剤を含有する溶液の色々な試料に対
するテストについて繰り返し使用することができる。

（Ｉ７） 第４図は第１図に示される高密度、低多孔度の黒鉛電極
５６の線４−４に沿って取った断面を示す。電極５６は
直径が約０．１ｃｒ／Ｌ乃至約１０ｃｒＩＬ１好る黒鉛
芯体９６から成る。黒鉛は多孔度が約１０係以下でなけ
れば々らない。これは、テストされる後の試料に持ち込
まれるかもしれ々い溶液の吸収を最少限に抑えるのに重
要である。また、電極の孔隙への吸収はいかなるもので
も電極の表面を増加させるのと同様の電気的効果を持つ
。すなわち、それはレドックス・カップルの酸化速度を
増力口させ、特に低電極回転速度において誤った読みを
もたらすことがあり得る。

円筒状ロッド９６の外表面の廻りの被覆９８は任意の都
合のより不透過性材料から成ることができる。好ましく
は、高分子材料（例えば、エポキシ樹脂、ポリウレタン
又は同様の高分子材料）が用いられる。それは、黒鉛ロ
ッドがそのような高分子材料に浸漬でき、その接着被覆
は比較的短時間で硬化して強靭で緻密な保護層を形成す
るからである。この層は、液体を透過させず、そして黒
鉛の導電率に関して実質的な電流に対する絶縁体として
作用する限り、極端に厚くする必要はない。

一般に、厚さ約１罷のエポキシ被覆が許容できることが
証明された。

被覆を適用した後、その端部を取り除いて電極端に非被
覆表面１１０（第１図を参照）を露出させる。表面１１
０はかくして黒鉛と溶液１２との間の唯一の接触領域を
構成する。このとき、保護被覆９８は少々くとも容器の
蒸気空間３５−１で適用され、そして好ましくは電極の
全黒鉛部分を覆っている。

端面１１０は、例えば非常に細かいサンドペーパーで研
磨して掻ききすをなくシ、平らな表面を与えるようにし
なければならない。次に、硬い平らな面、例えばガラス
板の上に置いた平滑な硬い紙を用いて金属光沢が全表面
１１０を覆うまで磨くのが好ましい。電極を次に使用直
前にメタノールと蒸留水で洗浄して油又は他の汚染物を
除去する。

極めて平滑な、光沢のある不透過性表面１１０を与える
ことによって、黒鉛電極につｈて正確な露出表面積を有
する高度に再現性のある電気回路が得られるので、相互
に関連する連続測定において高精度を得ることができる
。

本発明の被覆黒鉛電極の特に魅力的な特徴は溶液１２の
色々な標本又は試料について連続テストを行う場合のそ
の使用である。例えば、この溶液は変えることができ、
あるいは電極を接近ネック２０から引き抜き、別の溶液
が入っている別の容器１０に入れて用いることができる
。この場合、黒鉛電極５６を新しい溶液に入れる前にそ
の下端部を、前のテストに由来するどんな少量の吸収溶
液も確実に除去するために取り除く（例えば一部を削り
取ることによって）。電極の底端を約１４“又はそれ以
上削り取り、次いで底面にサンドペーパーを掛け、研磨
することによって、電極は使用に適したものになり、新
しい電極と区別できない結果をもたらすことが判明した
。更に、従来の、例えば貴金属を用いた電極と違って、
電極の外面被覆９８の付着物又は汚染はテストの精度に
影響しないことが判明した。かくして、電極外表面が腐
食され、又は外来試剤で被覆されていってもその電極を
捨てる必要はない。

本発明の他の多くの用途及び変更は当業者には明白であ
ろう。また、本発明について特定の実施態様を説明した
が、これらは単に説明のためのものである。しかして、
本発明の範囲は前記特許請求の範囲によってのみ限定さ
れるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により酵素剤濃度を測定する装置を示し
、第２図は感知回路を通って流れる電流を時間に対して
プロットした例をグラフとして示し、第３図は溶液のテ
スト中の反応速度とバクテリア濃度との間の関係をグラ
フとして示すものであり、そして第４図は第１図の線４
−４に沿って取った本発明による黒鉛電極の断面図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）第一の溶液に第一の電極が少なくとも一部浸漬さ
   れており、該第一溶液と電解関係で連絡されている第二
   の溶液に第二の電極が少なくとも一部浸漬されており、
   第一電極と第二電極とを横切って電位が印加され、これ
   ら電極間に生じた電流は第一溶液中の酵素剤の濃度に関
   係するようになっている酵素剤の第一溶液中濃度の測定
   法において、第一電極として溶液表面より約１／４イン
   チ以上下の溶液の有意の吸収を妨げるように十分に低い
   多孔度を有する黒鉛導体を用いることを特徴とする酵素
   剤濃度の測定法。 （２）黒鉛導体が１０％以下の多孔度を有する特許請求
   の範囲第（１）項記載の方法。 （３）黒鉛導体が円筒状で、かつその長軸の廻りに第一
   溶液の成分と確実、十分に接触させるのに十分な速度で
   回転せしめる特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 （４）回転速度が１００ｒｐｍ乃至２，０００ｒｐｍの
   範囲である特許請求の範囲第（３）項記載の方法。 （５）円筒状導体の浸漬部分がその浸漬端面を除いて全
   表面にわたって第一溶液を透過させない電気絶縁層で被
   覆されている特許請求の範囲第（４）項記載の方法。 （６）円筒状導体が直径０．１センチメーター乃至１０
   センチメーターである特許請求の範囲第（５）項記載の
   方法。 （７）円筒状導体が直径０．３センチメーター乃至１．
   ０センチメーターである特許請求の範囲第（６）項記載
   の方法。 （８）第一溶液が酵素剤、レドックス・カップル及び基
   質を含有する水溶液から成り、そして第一溶液に十分な
   量のＥＤＴＡジナトリウムを添加してその酵素剤の濃度
   測定の精度を実質的に改善するステップを更に含む特許
   請求の範囲第（１）項記載の方法。 （９）直径が０．１センチメーターから１０センチメー
   ターの範囲で、かつ多孔度が１０パーセント以下である
   円筒状の黒鉛導体を用意し、その円筒状導体の側面を溶
   液を透過させない高分子材料で被覆し、そしてその円筒
   状導体の端面を平坦にし、平滑にし、そして金属光沢が
   出るまで研磨することを特徴とする溶液中に少なくとも
   一部は浸漬され、そして溶液を通って流れる電流の測定
   を正確にする電極の製造方法。 （１０）特許請求の範囲第（９）項記載の方法により製
   造した電極。 （１１）酵素と酸素を溶解含有する水溶液の試料を容器
   に入れ；その溶液のｐＨを調節して実質的に中性に保ち
   ；その溶液に基質とレドックス・カップルを加えてそれ
   ら基質及びレドックス・カップルを酵素からの触媒作用
   で１つの酸化状態からもう１つの酸化状態にシフトさせ
   ；基質及びレドックス・カップルを加えた後その水溶液
   から溶存酸素を除去し；別個に含有せしめられた電解質
   の溶液を用意し；前記水溶液とその電解液を電気的に接
   続し；電解液にカウンター電極を少なくとも一部浸漬し
   ；水溶液に０．１センチメーターから１０センチメータ
   ーの範囲の直径と１０パーセント以下の多孔度を有し、
   かつ側面を覆って前記水溶液を透過させない絶縁被覆を
   有するが、端面はそのような被覆を持たづ、平坦、平滑
   にされ、かつ金属光沢が出るまで研磨されている円筒状
   の黒鉛導体から構成される黒鉛電極を少なくとも一部浸
   漬し；その黒鉛電極をその長軸の廻りに１００ｒｐｍか
   ら２，０００ｒｐｍの範囲の速度で回転させ、かつこの
   黒鉛電極と前記カウンター電極の間に電位を印加し；そ
   れらカウンター電極及び黒鉛電極間に流れる電流を測定
   し；そしてその電流の変化率から前記水溶液中の酵素濃
   度を定量することを特徴とする酵素と酸素を溶解含有す
   る水溶液中の酵素濃度を測定する方法。 （１２）カウンター電極が鉄から構成されている特許請
   求の範囲第（１１）項記載の方法。 （１３）酵素がバクテリアから成り、また基質とレドッ
   クス・カップルがグルコースとメチレンブルーから成る
   特許請求の範囲第（１１）項に記載の方法。 （１４）水溶液中に金属イオンが不純物として存在し、
   そしてその水溶液に十分な量のＥＤＴＡジナトリウムを
   加えてその金属イオンが酵素の測定精度を阻害するのを
   最少限に抑えるステップを更に含む特許請求の範囲第（
   １３）項記載の方法。 （１５）電流を測定してから黒鉛電極の浸漬端を少なく
   とも１／４インチ取り除き；得られた新露出端面を平坦
   、平滑にし、そして金属光沢が出るまで研磨し；その黒
   鉛電極を再使用する各ステップを更に含む特許請求の範
   囲第 （１４）項記載の方法。 （１６）水溶液を通して酸素を含まない不活性ガスをバ
   ブリングさせることによって溶存酸素をその水溶液から
   除去する特許請求の範囲第（１１）項記載の方法。