NL8500845A - Werkwijze en inrichting voor het meten van enzymconcentraties. - Google Patents

Description

Λ * - I -

Werkwijze en inrichting voor het meten van enzymconcentraties.

De uitvinding heeft betrekking op werkwijzen en inrichtingen voor het bepalen van concentraties van aktieve 5 populaties van enzymen of enzymbevattende populaties» zoals bacteriën, gisten en dergelijke.

Traditioneel worden dergelijke populaties geteld door microscopische technieken of door meer gekunstelde methodes, zoals de meting van optische troebeling van vloeistoffen, die 10 de populaties bevatten. In het Amerikaanse octrooischrift 3.506.544 wordt een methode beschreven voor het meten van de concentratie van bepaalde componenten van door enzym gekatalyseerde reakties onder toepassing van een elektrochemisch omkeerbaar redoxkoppel. Het enzym, een redoxkoppel zoals methyleen-15 blauw, een substraat zoals glucose, en een verenigbaar geleidend medium zoals een gebufferde wateroplossing, worden gemengd in een elektrolytische cel, waardoorheen een stroom wordt gevoerd door het drukken van een voltage over een paar elektroden.

De elektroden zijn typisch gemaakt van edelmetaal. De aktivi-20 teit van het enzym reduceert het geoxydeerde redoxkoppel met een snelheid overeenkomend met de concentratie van het enzym.

Het gereduceerde redoxkoppel wordt onderworpen aan heroxydatie aan de anode van de cel, waardoor een celstroom wordt geproduceerd, die evenredig is met de concentratie van het geredu-25 ceerde redoxkoppel. De toenamesnelheid van de stroom blijkt dus evenredig te zijn met de enzymconcentratie in de oplossing.

De verschillende tot nog toe bekende methodes voor het meten van enzymen of bacterienpopulaties leden aan bepaalde gebreken. Sommige waren niet voldoende gevoelig 30 om zeer lage concentraties te ontdekken, of waren zeer langzaam, of vereisten te veel trappen om de bepalingen efficient te maken. Sommigen waren ook erg duur, in het bijzonder die waarbij edelmetaal of dergelijke elektrodes werden gebruikt. Ook werd gevonden dat soms onverklaarbare fouten optraden bij de analyse 35 van een bepaalde soort.

8500845

* I

- 2 -

Een ander probleem bij de tot nog toe bekende inrichtingen kwam aan de oppervlakte toen hetzelfde apparaat achtereenvolgens werd gebruikt voor meervoudige monsters. Gevonden werd, dat het overbrengen van de elektrodes van de ene 5 monstercel naar de andere de tweede cel of monster verontreinigde met enzymen, of andere componenten die geabsorbeerd waren door de elektroden. Ook was grote zorg vereist om ervoor te zorgen, dat de cel gevuld was tot zeer nauwkeurig gemeten dieptes, identiek aan die gebruik om haar te calibreren, opdat 10 de elektrodeoppervlakte ondergedompeld in het elektrolyt constant bleef. Zelfs bij grote zorg in dit opzicht traden echter onverklaarbare fouten in de metingen op.

Nog een ander probleem bij de bekende stand van de techniek werd ontmoet vanwege de noodzaak om de oplossing 15 voor het laten lopen van de proef te ontluchten. Gevonden werd dat onder sommige omstandigheden onvoorstelbare hoeveelheden aerobe bacteriën konden worden gedesaktiveerd vanwege de ont-luchtingstrap. Wanneer daarentegen de oplossing niet ontlucht werd, verstoorde de resterende zuurstof de juistheid van de 20 meting, daar deze bijdroeg tot de reaktie aan de anode, waarop de meting was gebaseerd.

Deze en andere problemen bij de bekende stand van de techniek konden in hoge mate worden opgeheven of voorkomen volgens de uitvinding.

25 De uitvinding voorziet nu in een werkwijze en een inrichting voor het meten van de concentratie van een enzymatisch middel in een oplossing, waardoorheen een elektrische stroom wordt gevoerd tussen een contraelektrode en een langgerekte cilindrische grafietelektrode met lage porositeit en 30 hoge dichtheid. De grafietelektrode wordt rond zijn lengteas gedraaid in de oplossing, die ook een redoxkoppel bevat en substraat, die gekatalyseerd worden door het enzymatische middel onder reaktie en verandering van het redoxkoppel van de ene oxydatietoestand naar de andere. De verandering in oxydatie-35 toestand bewerkstelligt een verandering in stroom door de rote- 8500345 « * - 3 - rende elektrode, welke verandering verband houdt met de snelheid van veranderen van de oxydatietoestand van het redoxkoppel, dat op zijn beurt verband houdt met de concentratie van het enzymatische middel.

5 Het ondergedompelde gedeelte van de grafietelek- trode is over zijn gehele oppervlak, uitgezonderd het eind-oppervlak, bedekt met een beschermende isolatielaag, zoals een epoxyhars, die niet geleidend, inert en ondoordringbaar voor de componenten van de oplossing is. Dit stelt in staat tot een 10 hoge precisie en reproduceerbaarheid van de metingen, en maakt het ook mogelijk dezelfde elektroden te gebruiken voor een reeks van opeenvolgende metingen van concentraties van enzymatische middelen in verschillende oplossingen eenvoudig door een gedeelte van het blootgestelde einde van de elektroden 15 tussen opeenvolgende metingen te verwijderen.

Bij de onderhavige methode wordt ook de ontluchting van de oplossing overwogen om zuurstof te verwijderen alvorens de stroom te meten. Voor bepaalde enzymatische middelen, zoals aerobe bacteriën, werd gevonden dat de precisie sterk wordt 20 verbeterd door het redoxkoppel en het substraat in de oplossing te brengen alvorens te ontluchten.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm wordt overwogen dinatrium EDTA te gebruiken om de precisie van de analyse aanzienlijk te verbeteren.

25 Figuur 1 toont een inrichting voor het meten van enzymatisch middelconcentratie volgens de uitvinding,

Figuur 2 toont grafisch een voorbeeld van de stroom door het aanvoelcircuit uitgezet tegen de tijd,

Figuur 3 toont grafisch het verband tussen de 30 reaktiesnelheid en de bacterieconcentratie gedurende de oplos-singbeproeving en

Figuur 4 is een dwarsdoorsnede van de grafiet-elektrode langs de lijn 4-4 van figuur 1.

Figuur 1 toont een actinische glazen houder 10, 35 die een oplossing 12 bevat, waarvan de concentratie aan enzyma- £ c Π Π D 4 * • · - 4 - tisch middel moet worden beproefd. Het enzymatische middel kan zelf een enzym zijn of een gist; het nut van de uitvinding wordt echter speciaal overwogen voor oplossingen, die bacteriën bevatten.

5 Oplossing 12 bevat water , dat gebufferd wordt met geschikte bufferingsmiddelen, zoals kaliumdihydrogeenfosfaat (KH2P0^) en dikaliumhydrogeenfosfaat (K^HPO^) tot een pH van 7,0. De optimale pH hangt af van het bepaalde enzymatische middel, dat men beproeft, maar typisch is een neutrale pH van 10 7,0 voldoende. Men voegt dinatriumzout van ethyleendiamine- tetraazijnzuur (dinatriumedetaat of dinatrium EDTA) toe in een hoeveelheid voldoende om de concentratie ervan ongeveer 0,01 molair te doen zijn in de oplossing 12. Het is gebleken dat hierdoor de verstoring wordt gereduceerd van metaalionen, 15 die aanwezig kunnen zijn in de oplossing als onzuiverheden, en die anders de neiging zouden hebben de enzymatische akti-viteit of de stroom door oplossing 12 ongunstig te beïnvloeden en foutieve resultaten op te leveren. Gemeend wordt dat het dinatrium EDTA complexen vormt met de metaalionen onder voor-20 koming van het neerslaan ervan bij de procesomstandigheden (welk neerslaan anders de bacteriën of ander te analyseren enzymatisch middel zou occluderen). De effektieve en optimale hoeveelheden van dinatrium EDTA zullen dus afhangen van de aanwezige metaalionen en kunnen worden bepaald door routine-25 experimentering.

Men voegt een substraat en een redoxkoppel toe aan de oplossing. Het gekozen substraat en redoxkoppel moeten van een type zijn, dat zich laat onderwerpen aan katalytische werking door het te beproeven bepaalde enzymatische middel.

30 Typisch worden voor de meeste bacteriën uitstekende resultaten bereikt met een oplossing 12, die ongeveer 0,01 molair concentratie aan glucose en ongeveer 0,0001 molair concentratie aan methyleenblauw (methylthioninechloride) bevat.

Toegang tot het inwendige van houder 10 wordt 35 verkregen door halzen 14, 16, 18 en 20. Wanneer de inhouden 8500845 « * - 5 - alle op hun plaats zijn, wordt een inert gas, zoals argon, geinjekteerd door leiding 30 en verspreidingsbuis 32, en borrelt daarbij door openingen 34 omhoog in oplossing 12. Deze procedure wordt typisch gevolgd gedurende ongeveer 5 minuten om de 5 meeste vrije zuurstof uit de oplossing 12 te spuien. Het borrelende argon en eventuele vluchtige materialen zoals zuurstof, gaan omhoog door dampruimte 35 en worden verwijderd uit houder 10 door middel van uitlaat 36. Zowel de inlaat 30 als de uitlaat 36 zijn afsluitend gestoken door een stop 38 met twee gaten in 10 toevoerhals 14.

Een afzonderlijk glazen vat 1I, dat een oplossing 13 bevat, is elektrolytisch verbonden met het systeem in vat 10 door middel van zoutbrug 100, bestaande uit agar en kalium-chloride. De oplossing 13 bevat een geschikt elektrolyt, typisch 15 een 0,1 molaire ferri EDTA oplossing, of anders een waterige kaliumchlorideoplossing.

Toegang tot het inwendige van vat 11 wordt verkregen door halzen 15, 17 en 19. Oplossing 13 kan desgewenst ook worden ontlucht door.injektie van een inert gas, zoals 20 argon,door toevoerleiding 31 en afvoerleiding 33, waarbij het door openingen 37 in oplossing 13 omhoogborrelt. Het borrelende argon en de zuurstof, en eventueel andere vluchtige materialen, gaan omhoog door dampruimte 39 en worden verwijderd uit vat 11 door middel van afvoerleiding 41. Toevoerleiding 31 en afvoer-25 leiding 41 zijn beide afsluitend gestoken door een stop 43 met twee gaten in toevoerhals 15.

Een batterij of gelijkspanningsbron 40 is voorzien van een potentiometer 42, bestaande uit een weerstand 46 met een schuifcontact 44 erop. Het schuifcontact 44 is door middel 30 van geleider 50 verbonden aan contraelektrode 52. De contra-elektrode 52 kan gemaakt zijn van elk geschikt elektrode-materiaal. Voor de meeste doeleinden blijkt een ijzeren elektrode voldoende te zijn. De contraelektrode 52 is afdichtend bevestigd in toevoerhals 17 door middel van stop 54.

35 Een grafietelektrode 56 met hoge dichtheid en

p η n f’ p £ K

C v V W ^ « t - 6 - lage porositeit is bevestigd in toevoerhals 20 van vat 10 door middel van stop 57 en is verbonden door geleidingsdraad 58 via amperemeter 60 en leiding 62 met de positieve kant van de accu.

Een. referentieelektrode 70, zoals een verzadigde 5 calomelelektrode, is door stop 42 gestoken in toevoerhals 18 van vat 10 en verbonden door leidingen 74 en 76 via voltmeter 78 met leiding 58 van de grafietelektrode.

Bij het in werking stellen van de inrichting is het van belang de grafietelektrode 56 te draaien om repre-10 sentatief contact van de elektrode met de componenten van oplossing 12 te verzekeren om het redoxkoppel te vervangen, dat gebruikt wordt aan het oppervlak van de elektrode. Dit wordt bereikt met een aandrijforgaan 80 en een tandwielmechanisme 82, schematisch getoond in figuur 1. Men kan met succes een 15 reeks van rotatiesnelheden gebruiken. Het verdient echter de voorkeur de elektroden hierbij te laten draaien met snelheden van ongeveer 100-2000 omw/min. Men kan lagere snelheden gebruiken, maar bij te lage snelheden kan de elektrode gevoeliger worden voor uitwendige vibraties en minder gevoelig voor het 20 opsporen van lage concentraties van bacteriën.

Bij het begin van een proef schuift men het schuifcontact 44 langs weerstand 46 totdat voltmeter 78 nagenoeg op 0,0 staat. Na of gelijktijdig met het spuien van de opgeloste zuurstof in oplossing 12 met argon, worden eventueel 25 resterende sporen zuurstof bij voorkeur verwijderd door toevoegen van bijvoorbeeld genoeg ferro EDTA om de gemeten stroom door amperemeter 60 te doen afnemen tot nagenoeg 0.

De stroom door het proefcircuit (dat wil zeggen tussen grafietelektrode 56 en contraelektrode 52) zoals gemeten 30 door amperemeter 60, wordt afgezet als getoond in. figuur 2.

Typisch is de stroombehandeling met de tijd aanvankelijk niet lineair, maar na een korte duur stelt zich een lineair verband in. De helling van het lineaire gedeelte van de lijn (aangeduid door de raaklijn in figuur 2) is evenredig met de reaktie-35 snelheid van het redoxkoppel aan elektrode 56, vanwege de kata- 8500845 ♦ · lytische werking van het enzymatische middel. Een typisch verband tussen de reaktiesnelheid en de concentratie aan bacteriën in een oplossing verzadigd met glucose en methyleen- blauw (met betrekking tot de hoeveelheid beschikbare bacteriën) 5 wordt getoond in figuur 3.

Dit voorbeeld wordt uitgevoerd met een 300 ml

monster vloedwater in houder 10 met 0,112 g dinatrium EDTA

om de oplossing 0,001 molair te maken aan dinatrium EDTA. Aan deze oplossing voegt men 1,633 g K^PO^ en 3,136 g K^HPO^ 10 toe om de oplossing 0,1 molair aan fosfaat te maken. Men stelt de pH in op 7 onder toepassing van 0,5 N NaOH en 0,5 g glucose -4

(0,01 M) en voegt 15 ml 0,01 M methyleenblauw (5x10 M) aan toe\ J

de oplossing /Men brengt de oplossing dan in contact met de elektrodes, waarbij men de roterende elektrode tevoren heeft 15 schoongemaakt door polijsten met fijn zandpapier en daarna polijsten op een glasplaat. De koolelektrode heeft een bloot-gesteld onderoppervlak van 0,30 cm en draait met 1000 omw/min.

De voltage wordt zodanig ingesteld, dat de roterende elektrode op 0,00 volt is ten opzichte van de verza-20 digde calomelelektrode. Men meet de stroom als funktie van de tijd. Wanneer de helling van de verandering in stroom met de tijd constant wordt, bepaalt men de helling en berekent het aantal bacteriën op basis van de calibreringskromme. In dit voorbeeld gebruikt men de reaktiesnelheden bepaald uit de 25 helling van de raaklijn in figuur 2, zoals getoond door de stippellijnen in figuur 3, om vast te stellen dat de bacterie- concentratie tussen 10 en 10^ cellen ligt oer ml oplossing, . -9 wanneer de reaktiesnelheid ongeveer 6,25 x 10 is.

Men kan grafieken maken zoals in figuur 3 30 waarbij men standaardconcentraties van bacteriën of andere enzymatische middelen gebruikt onder standaard proefomstandigheden. Nadat deze calibreringscurve is bepaald, kan deze herhaaldelijk gebruikt worden voor proeven op verschillende monsters van oplossing, die dezelfde of dergelijke bacteriën of enzy-35 matische middelen bevatten.

3500845 - 8 -

Figuur 4 toont een dwarsdoorsnede langs lijn 4-4 van de grafietelektrode 56 met hoge dichtheid en lage porosi-tiet, getoond in figuur 1. De elektrode 56 bestaat uit een grafietkern 96, die typisch bestaat uit een ondoordringbaar 5 cilindrisch element met zeer hoge zuiverheid en met een diameter van ongeveer 0,1-10 bij voorkeur 0,3-1,0 cm. Het grafiet moet een porositeit hebben van minder dan ongeveer 10 %. Dit is belangrijk om absorptie van oplossing te miniseren, dat anders zou kunnen worden overgedragen naar een volgend te 10 beproeven monster. Ook heeft elke absorptie in tussenruimtes van poriën van een elektrode een elektrisch effekt analoog aan het vergroten van het oppervlak van de elektrode, dat wil zeggen hierdoor neemt de oxydatiesnelheid van het redoxkoppel toe en er kunnen foutieve aflezingen worden verkregen, in het bijzonder 15 bij lage elektrodedraaisnelheden.

De bekleding 98 rond het buitenoppervlak van de cilindrische staaf 96 kan van elk geschikt ondoordringbaar materiaal zijn. Bij voorkeur gebruikt men een polymeer materiaal (zoals epoxyhars, polyurethan en dergelijke), daar de grafiet-20 staven in dergelijke materialen kunnen worden gedoopt en de aanhechtende bekleding kan worden gehard in een betrekkelijk korte duur onder vorming van een taaie dichte beschermingslaag. De laag behoeft niet buitengewoon dik te zijn, mits zij ondoordringbaar is voor de vloeistof en werkt als een isolator 25 tegen aanzienlijke stroom met betrekking tot de geleidbaarheid van het grafiet. In het algemeen zijn epoxybekledingen van ongeveer 1 mm dik aanvaardbaar gebleken.

Nadat de bekleding 98 is aangebracht, verwijdert men het eindgedeelte om een onbekleed grafietoppervlak 110 30 (zie figuur 1) aan het eind van de elektrode bloot te leggen. Oppervlak 110 vormt dus het enige contactgebied tussen het grafiet en de oplossing 12, waarbij de beschermingsbekleding 98 tot tenminste de dampruimte 35 van vat 10 loopt en bij voorkeur het gehele grafietgedeelte van de elektrode bedekt.

35 Het eindoppervlak 110 moet worden geslepen of 8500845 - 9 - geschuurd bijvoorbeeld met zeer fijn zandpapier om eventuele krassen te verwijderen en te voorzien in een mat oppervlak.

Het wordt dan bij voorkeur gepolijst onder toepassing van glad hard papier op een glad plat oppervlak, zoals een glazen 5 plaat, totdat een metallieke glans het totale oppervlak 110 bedekt. Men spoelt de elektrode dan met methanol en gedestilleerd water om eventuele oliën of andere verontreinigingen vlak voor het gebruik te verwijderen.

Door te voorzien in een zeer glad glanzend on-10 doordringbaar oppervlak 110, kan een zeer hoge precisie worden bereikt bij het correleren van opeenvolgende metingen, daar kan worden voorzien in zeer reproduceerbare elektrische circuits met precieze blootgestelde oppervlaktegebieden van de grafietelektrode.

15 Een bijzonder aantrekkelijk kenmerk van de beklede grafietelektrode volgens de uitvinding is het nut ervan voor het uitvoeren van opeenvolgende proeven op verschillende soorten of monsters van oplossing 12. Men kan bijvoorbeeld de oplossing verwisselen of de elektrode kan uit de toevoer-20 hals 20 worden getrokken en gebruikt in een ander vat 10 met een andere oplossing. Alvorens de grafietelektrode 56 in een nieuwe oplossing te steken, verwijdert men het onderste eindgedeelte (bijvoorbeeld door een gedeelte weg te slijpen) om er zeker van te zijn dat zelfs geringe hoeveelheden geab-25 sorbeerde oplossing uit de vorige proef zijn verwijderd.

Gevonden werd dat door wegslijpen van ongeveer 6,25 mm of meer van de bodem van de elektrode, en daarna zanden en polijsten van het bodemoppervlak, de elektrode geschikt is voor gebruik met resultaten, die niet te onderscheiden zijn van een nieuwe 30 elektrode. Bovendien werd gevonden, dat in tegenstelling met tot nog toe bekende elektrodes waarbij men bijvoorbeeld edelmetalen gebruikt, eventuele afzettingen of verontreinigingen van de buitenbekleding 98 van de elektrode niet de precisie van de proef aantasten. Het is dus niet nodig de elektrode weg 35 te gooien wanneer het buitenoppervlak ervan gecorrodeerd wordt p £ Λ * 3 4 * -10- of bekleed met vreemde stoffen.

8500345

Claims (16)

1. Werkwijze voor het meten van de concentratie van een enzymatisch middel in een eerste oplossing, waarin een eerste elektrode tenminste gedeeltelijk is ondergedompeld, een tweede elektrode tenminste gedeeltelijk is ondergedompeld in 5 een tweede oplossing, die in elektrolytische verbinding staat met de eerste oplossing, een elektrische potentiaal drukt over de eerste en tweede elektrode, en de verkregen stroom tussen genoemde elektrodes verband houdt met de concentratie van genoemd enzymatisch middel in genoemde eerste oplossing, 10 met het kenmerk, dat men als genoemde eerste elektrode een grafietgeleider gebruikt met een porositeit voldoende laag om aanzienlijke absorptie van oplossing van meer dan ongeveer 6,25 mm beneden het oppervlak ervan te voorkomen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 15 dat men een grafietgeleider gebruikt met een porositeit van minder dan ongeveer 10 %.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een cilindrische geleider gebruikt, die men om zijn lengteas draait met een snelheid voldoende om representatief 20 contact ervan met de componenten van genoemde eerste oplossing te verzekeren.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat men een draaisnelheid toepast van 100-2000 oraw/min.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, 25 dat men een cilindrische geleider toepast, waarin het ondergedompelde gedeelte over het gehele oppervlak ervan bekleed is, uitgezonderd het ondergedompelde eindoppervlak, met een elektrisch isolerende laag, die ondoordringbaar is voor genoemde eerste oplossing.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men een cilindrische geleider toepast met een diameter van 8 5 0 G s '· 5 -12- 0,1-10 cm.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men een geleider toepast met een diameter van 0,3-1,0 cm.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 5 dat men als genoemde eerste oplossing een waterige oplossing gebruikt, die enzymatisch middel, een redoxkoppel en substraat bevat, en die verder de trap omvat van het toevoegen van een voldoende hoeveelheid dinatrium EDTA eraan om de precisie van de meting van de concentratie van genoemd enzymatisch middel 10 aanzienlijk te verbeteren.

9. Werkwijze ter vervaardiging van een elektrode voor tenminste gedeeltelijke onderdompeling in een oplossing en het doen van precisiemetingen van stroomsterkte erdoorheen, met het kenmerk, dat men voorziet in een cilindrische grafiet- 15 geleider met een diameter van 0,1-10 cm en een porositeit van minder dan ongeveer 10 %, de oppervlakken van de zijkanten van genoemde cilindrische geleiders bekleed met een polymeer materiaal, dat ondoordringbaar is voor genoemde oplossing, en het eindoppervlak van genoemde cilindrische geleider afvlakt, glad-20 maakt en polijst tot een metallieke glans.

10. Elektrode, vervaardigd volgens de werkwijze van conclusie 9.

11. Werkwijze voor het meten van de enzymconcen-tratie in een waterige oplossing, die genoemd enzym bevat en 25 erin opgeloste zuurstof, met het kenmerk, dat men een monster van genoemde oplossing in een houder brengt, genoemde oplossing buffert tot een nagenoeg neutrale pH, een substraat en redoxkoppel toevoegt aan genoemde oplossing, genoemd substraat en redoxkoppel onderwerpt aan een wisseling van de ene oxydatie-30 toestand in een andere door katalytische werking van genoemd enzyme, genoemde opgeloste zuurstof verwijdert uit genoemde waterige oplossing na genoemd substraat en redoxkoppel eraan toegevoegd te hebben, voorziet in een elektiolytische oplossing in een afzonderlijk vat, genoemde waterige oplossing elektro-35 lytisch in verbinding brengt met genoemde elektrolytoplossing, §5 0 9 8 4 5' -13- een contraelektrode tenminste gedeeltelijk onderdompelt in genoemde elektrolytische oplossing, een grafietelektrode tenminste gedeeltelijk onderdompelt in genoemde waterige oplossing, welke genoemde grafietelektrode bestaat uit een cilindrische 5 grafietgeleider met een diameter van 0,1-10 cm en een porositeit van minder dan ongeveer 10 %, welke genoemde geleider een isolerende bekleding heeft boven de oppervlakken van de zijkanten ervan, welke genoemde bekleding ondoordringbaar is voor genoemde waterige oplossing, en waarbij het eindoppervlak van 10 genoemde cilindrische geleider vrij is van genoemde bekleding en vlak, glad en gepolijst tot een metallische glans, genoemde grafietelektrode ronddraait om zijn lengteas met een snelheid van 100-2000 omw/min en een elektrische potentiaal drukt tussen genoemde elektrode en- genoemde contraelektrode, 15 de stroom meet tussen genoemde contraelektrode en genoemde grafietelektrode, en de enzymconcentratie in genoemde waterige oplossing bepaalt uit de veranderingssnelheid van genoemde stroom.

12. Werkwijze volgens conclusie II, met het kenmerk, 20 dat men een contraelektrode gebruikt van ijzer.

13. Werkwijze volgens conclusie II, met het kenmerk, dat genoemd enzym bestaat uit bacteriën en genoemd substraat en redoxkoppel bestaat uit glucose en methyleenblauw.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, met het kenmerk, 25 dat metaalionen aanwezig zijn in genoemde waterige oplossing als onzuiverheden, en dat zij verder de trap omvat van het toevoegen van voldoende dinatrium EDTA eraan om verstoring van de precisie van de metingen van genoemd enzym door genoemde metaalionen te miniseren.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat men tenminste ongeveer 6,25 mm van het ondergedompelde einde van genoemde grafietelektrode verwijdert na meting van de stroom erdoorheen; het verkregen pas blootgelegde eindoppervlak ervan afvlakt, gladmaakt en polijst tot een metallieke 35 glans en genoemde grafietelektrode opnieuw gebruikt. 8500345 ♦ » -14-

16. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat men genoemde opgeloste zuurstof verwijdert uit genoemde waterige oplossing door een zuurstofvrij inert gas erdoorheen te laten borrelen. ^7, ^ -* r