LU85890A1

LU85890A1 - METHOD AND DEVICE FOR MEASURING ENZYME CONCENTRATIONS

Info

Publication number: LU85890A1
Application number: LU85890A
Authority: LU
Inventors: Herbert P Silverman
Original assignee: Rohrback Tech
Priority date: 1984-07-06
Filing date: 1985-05-09
Publication date: 1986-01-14
Also published as: NL8500845A; GB8514285D0; JPS6125052A; FR2567268A1; GB2161274A; BE902067A; DE3516230A1

Description

-1- ff ff « * 1 Beschreibung <* _ __ ______ -. _—-1- ff ff «* 1 Description <* _ __ ______ -. _—

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur 5 Bestimmung der Konzentrationen von aktiven Populationen von Enzymen oder enzymhaltigen Populationen, wie z.B. Bakterien, Hefen oder dgl.The invention relates to methods and devices for determining the concentrations of active populations of enzymes or enzyme-containing populations, e.g. Bacteria, yeast or the like

Üblicherweise werden derartige Populationen durch mikro-10 skopische Verfahren oder durch kompliziertere Verfahren, wie z.B. die Messung der optischen Trübung von die Populationen enthaltenden Flüssigkeiten, bestimmt. In der USPS 3 506 544 ist ein Verfahren zur Messung der Konzentration bestimmter Partner von Enzym-katalysierten Reaktionen 15 unter Verwendung eines elektrochemisch-reversiblen Redox-Such populations are usually generated by microscopic methods or by more complicated methods, e.g. the measurement of the optical turbidity of liquids containing the populations. USPS 3,506,544 describes a method for measuring the concentration of certain partners of enzyme-catalyzed reactions 15 using an electrochemically reversible redox

Paares beschrieben. Das Enzym, ein Redox-Paar, wie Methylenblau, ein Substrat, wie Glucose, und ein kompatibles leitfähiges Medium, wie z.B. eine gepufferte Wasserlösung, * werden in einer Elektrolysezelle gemischt, durch die ein 20 Strom geschickt wird durch Anlegen einer Spannung an ein Elektrodenpaar. Die Elektroden wurden bisher in der Regel aus einem Edelmetall gefertigt. Unter der Einwirkung des Enzyms wird das oxidierte Redox-Paar in einer der Konzentration des Enzyms entsprechenden Rate bzw.Couple described. The enzyme, a redox couple such as methylene blue, a substrate such as glucose, and a compatible conductive medium such as e.g. a buffered water solution, * are mixed in an electrolytic cell through which a current is sent by applying a voltage to a pair of electrodes. So far, the electrodes have generally been made from a noble metal. Under the action of the enzyme, the oxidized redox couple is at a rate corresponding to the concentration of the enzyme or

25 Geschwindigkeit reduziert. Das reduzierte Redox-Paar wird an der Anode der Zelle einer Rückoxidation unter- -worfen, wodurch ein Zellenstrom entsteht, der proportional zur Konzentration des reduzierten Redox-Paares ist. Es wurde gezeigt, daß die Rate bzw. Geschwindigkeit 30 der Zunahme des Stromes proportional zur Konzentration des Enzyms in der Lösung ist.25 speed reduced. The reduced redox couple is subjected to back-oxidation at the anode of the cell, resulting in a cell current that is proportional to the concentration of the reduced redox couple. The rate or rate of increase in current has been shown to be proportional to the concentration of the enzyme in the solution.

Die verschiedenen bekannten Verfahren zur Messung von - Enzymen oder Bakterienpopulationen weisen bestimmte 35 Nachteile auf. Einige sind für die Bestimmung sehr niedriger Konzentrationen nicht empfindlich genug oder arbeiten sehr langsam oder erfordern zu viele Stufen ^ 5 i ! rv < 5 -2- Λ «-♦ < 1 zur wirksamen Durchführung der Bestimmungen (Messungen).The various known methods for measuring enzymes or bacterial populations have certain 35 disadvantages. Some are not sensitive enough for the determination of very low concentrations or work very slowly or require too many levels ^ 5 i! rv <5 -2- Λ «- ♦ <1 for the effective implementation of the determinations (measurements).

Einige sind auch sehr teuer, insbesondere diejenigen, in denen Edelmetall- oder ähnliche Elektroden verwendet werden. Es wurde auch gefunden, daß bei der Analyse einer 5 speziellen Probe gelegentlich unerklärliche Fehler auf-treten.Some are also very expensive, especially those that use precious metal or similar electrodes. It was also found that inexplicable errors occasionally occur when analyzing a particular sample.

Ein anderes Problem tritt bei den bekannten Vorrichtungen auf, wenn die gleiche Apparatur nacheinander zur Messung 10 mehrerer Proben verwendet wird. Es wurde gefunden, daß durch den Transport der Elektroden von einer Proben-Zelle in eine andere Proben-Zelle die zweite Zelle oder Probe durch Enzyme oder andere Komponenten, die von den Elektroden absorbiert worden sind, kontaminiert wird.Another problem arises with the known devices when the same apparatus is used successively for measuring 10 several samples. It has been found that by moving the electrodes from one sample cell to another sample cell, the second cell or sample is contaminated by enzymes or other components that have been absorbed by the electrodes.

15 Auch ist große Vorsicht erforderlich, um sicherzustellen, daß die Zelle in sehr genau gemessenen Füllhöhen gefüllt , wird, die identisch sind mit denjenigen, die zum Eichen derselben verwendet werden, um sicherzustellen, daß die Λ in den Elektrolyten eingetauchten Flächen der Elektroden- 20 Oberfläche· konstant bleiben. Selbst bei Anwendung großer Vorsicht in dieser Beziehung treten jedoch bei den Messungen unerklärliche Fehler auf.15 Great care must also be taken to ensure that the cell is filled at very accurately measured fill levels that are identical to those used to calibrate it to ensure that the Λ surfaces of the electrodes 20 immersed in the electrolyte Surface · remain constant. However, even with great care in this regard, inexplicable errors occur in the measurements.

Ein weiteres Problem des Standes der Technik ist zurückzu-25 führen auf die Notwendigkeit, die Lösung vor Durchführung des Tests zu entlüften. Es wurde gefunden, daß unter j bestimmten Umständen un vorhersehbare Mengen an aeroben | Bakterien desaktiviert werden können durch die Entlüf- 1 tungsstufe. Wenn andererseits die Lösung nicht entlüftet 1 30 wirä' stört der zurückbleibende Sauerstoff die Präzision | der Messung, da er zur Reaktion an der Anode, auf der die I Messung basiert, beiträgt.Another problem with the prior art is due to the need to vent the solution prior to performing the test. It has been found that, under certain circumstances, unpredictable levels of aerobic | Bacteria can be deactivated by the ventilation step. On the other hand, if the solution is not deaerated 1 30, the remaining oxygen disturbs the precision | the measurement because it contributes to the reaction at the anode on which the I measurement is based.

! ] * Diese und weitere Probleme der bekannten Verfahren können | 35 durch die vorliegende Erfindung stark gemildert oder j eliminiert werden.! ] * These and other problems of the known methods can be 35 can be greatly mitigated or eliminated by the present invention.

i f I 4 : Π » a \ v e -3- I-·- « » % 1 Die vorliegende Erfindung-betrifft ein Verfahren und eine - > *i f I 4: Π »a \ v e -3- I- · -« »% 1 The present invention relates to a method and a -> *

Vorrichtung zur Messung der Konzentration eines enzymatischen Agens in einer Lösung, in der ein elektrischer Strom zwischen einer.Gegenelektrode und einer länglichen, 5 zylindrischen Graphitelektrode mit hoher Dichte und niedriger Porosität fließt. Die Graphitelektrode wird um ihre Längsachse gedreht in der Lösung, die auch ein Redox-Paar und ein Substrat enthält, die durch das enzymatische Agens katalysiert werden, so daß sie reagieren 10 und das Redox-Paar von einem Oxidationszustand in einen anderen überführt wird. Die Änderung des Oxidationszustandes bewirkt eine Änderung des die sich drehende Elektrode durchfließenden Stromes, die in Beziehung steht zur Rate bzw. Geschwindigkeit der Änderung des Oxidationszustandes 15 des Redox-Paares, die ihrerseits in Beziehung steht zur Konzentration des enzymatischen Agens.Device for measuring the concentration of an enzymatic agent in a solution in which an electric current flows between a counter electrode and an elongated, 5 cylindrical graphite electrode with high density and low porosity. The graphite electrode is rotated about its longitudinal axis in the solution, which also contains a redox couple and a substrate, which are catalyzed by the enzymatic agent so that they react 10 and the redox couple is transferred from one oxidation state to another. The change in the oxidation state causes a change in the current flowing through the rotating electrode, which is related to the rate or speed of the change in the oxidation state 15 of the redox couple, which in turn is related to the concentration of the enzymatic agent.

Der eingetauchte Abschnitt der Graphitelektrode ist auf s, seiner gesamten Oberfläche mit Ausnahme der Stirnfläche 20 (Endoberfläche) mit einer schützenden Isolierschicht, beispielsweise aus einem Epoxyharz, die nicht-leitend, inert und für die Bestandteile der Lösung undurchlässig ist, überzogen. Dies erlaubt die Durchführung hochpräziser und reproduzierbarer Messungen und ermöglicht auch 25 die Verwendung der gleichen Elektrode für eine Reihe von aufeinanderfolgenden Messungen der Konzentrationen von enzymatischen Agentien in verschiedenen Lösungen durch einfaches Entfernen eines Teils des freiliegenden Endes der Elektrode zwischen aufeinanderfolgenden Messungen.The immersed portion of the graphite electrode is coated on s, its entire surface with the exception of the end face 20 (end surface) with a protective insulating layer, for example made of an epoxy resin, which is non-conductive, inert and impermeable to the components of the solution. This allows high-precision and reproducible measurements to be made and also enables the same electrode to be used for a series of successive measurements of the concentrations of enzymatic agents in different solutions by simply removing part of the exposed end of the electrode between successive measurements.

3030th

Das hier beschriebene Verfahren umfaßt auch die Entlüftung der Lösung zur Entfernung von Sauerstoff vor Messung des Stromflusses. Für bestimmte enzymatische Agen-i tien, wie z.B. aerobe Bakterien, wird, wie gefunden 35 wurde, die Präzision stark erhöht durch Einführen des Redox-Paares und des Substrats in die Lösung vor Durchführung der Entlüftungsstufe. j r\ * 1 ^ -4- * ψ * • * 1 Gemäß bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die Erfindung » * die Verwendung von Dinatrium-EDTA, um die Präzision der Analyse wesentlich zu verbessern.The method described here also includes venting the solution to remove oxygen before measuring the current flow. For certain enzymatic agents, e.g. aerobic bacteria, as found 35, the precision is greatly increased by introducing the redox couple and substrate into the solution prior to performing the deaeration step. j r \ * 1 ^ -4- * ψ * • * 1 According to preferred embodiments, the invention comprises * using disodium EDTA to substantially improve the precision of the analysis.

5 Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:5 The invention is explained below with reference to the accompanying drawings. Show it:

Fig. 1 eine Vorrichtung zur Messung der Konzentrationen eines enzymatischen Agens gemäß der vorliegenden 10 Erfindung;1 shows a device for measuring the concentrations of an enzymatic agent according to the present invention;

Fig. 2 in graphischer Form ein Beispiel des Stromflusses durch den Meßkreis, aufgetragen gegen die Zeit; 152 shows in graphical form an example of the current flow through the measuring circuit, plotted against time; 15

Fig. 3 in graphischer Form die Beziehung zwischen derFig. 3 shows in graphical form the relationship between the

Reaktionsgeschwindigkeit bzw. -rate und der Bakterienkonzentration während des Lösungstests; und 20 Fig. 4 eine Querschnittsansicht der Graphitelektrode entlang der Linien 4-4 der Fig. 1.Reaction speed or rate and the bacterial concentration during the solution test; and FIG. 4 is a cross-sectional view of the graphite electrode along lines 4-4 of FIG. 1.

Die Fig. 1 zeigt einen aktinischen Glasbehälter 10, der eine Lösung 12 enthält, deren Konzentration an enzymati-25 schem Agens getestet bzw. bestimmt werden soll. Das enzymatische Agens kann umfassen oder enthalten ein Enzym ~ selbst oder eine Hefe; die vorliegende Erfindung ist jedoch insbesondere brauchbar für Bakterien enthaltende Lösungen.1 shows an actinic glass container 10 which contains a solution 12 whose concentration of enzymatic agent is to be tested or determined. The enzymatic agent may comprise or contain an enzyme itself or a yeast; however, the present invention is particularly useful for solutions containing bacteria.

3030th

Die Lösung 12 enthält Wasser, das unter Verwendung ge-v eigneter Puffer, wie z.B. Kaliumdihydrogenphosphat (K^PO^) und Dikaliumhydrogenphosphat (K2HP04) auf einen a pH-Wert von 7,0 abgepuffert ist. Der optimale pH-Wert 35 hängt von dem speziellen getesteten enzymatischen Agens ab, in der Regel ist jedoch ein neutraler pH-Wert von 0 7,0 zufriedenstellend. Das Dinatriumsalz der Ethylendi- [ ΓΜ 1 * * # - ΞΙ amintetraessigsäure (Dinatriumedetat oder Dinatrium- ' 4 EDTA) wird in einer Menge zugegeben, die ausreicht, um seine Konzentration etwa 0,01 molar in der Lösung 12 zu machen. Es wurde gefunden, daß dadurch die Störung 5 von Metallionen, die in der Lösung als Verunreinigungen vorhanden sein können, herabgesetzt wird, die sonst die enzymatische Aktivität oder den Stromfluß durch die Lösung 12 beeinflussen und fehlerhafte Ergebnisse liefern würden. Es wird angenommen, daß das Dinatrium-EDTA mit 10 den Metallionen Komplexe bildet, um ihre Ausfüllung unter Verfahrensbedingungen zu verhindern (die sonst Bakterien oder andere enzymatische -Agentien, die analysiert werden sollen, einschließen könnte). Die wirksamen und optimalen Mengen an Dinatrium-EDTA hängen von den vorhandenen Metall-15 ionen ab und können durch Routineversuche ermittelt werden.Solution 12 contains water which can be prepared using suitable buffers, e.g. Potassium dihydrogen phosphate (K ^ PO ^) and dipotassium hydrogen phosphate (K2HP04) is buffered to a pH of 7.0. The optimal pH 35 depends on the particular enzymatic agent tested, but usually a neutral pH of 0 7.0 is satisfactory. The disodium salt of ethylenedi [ΓΜ 1 * * # - ΞΙ aminetetraacetic acid (disodium edetate or disodium '4 EDTA) is added in an amount sufficient to make its concentration about 0.01 molar in solution 12. It has been found that this reduces the perturbation 5 of metal ions which may be present in the solution as impurities, which would otherwise influence the enzymatic activity or the current flow through the solution 12 and would give incorrect results. It is believed that the disodium EDTA complexes with the 10 metal ions to prevent their filling under process conditions (which could otherwise include bacteria or other enzymatic agents to be analyzed). The effective and optimal amounts of disodium EDTA depend on the metal 15 ions present and can be determined by routine experimentation.

^ Der Lösung werden ein Substrat und ein Redox-Paar zugesetzt.^ A substrate and a redox pair are added to the solution.

Das ausgewählte Substrat und das ausgewählte Redox-Paar ä sollten von einem Typ sein, der einer katalytischen Wir- 20 kung durch das getestete spezielle enzymatische Agens unterliegt. In der Regel werden für die meisten Bakterien ausgezeichnete Ergebnisse erzielt bei Verwendung einer Lösung 12, die Glucose in einer etwa 0,01-molaren Konzentration und Methylenblau (Methylthioninchlorid) in einer 25 etwa 0,0001-molaren Konzentration enthält.The substrate and redox pair selected should be of a type that is subject to catalytic action by the particular enzymatic agent tested. As a rule, excellent results are obtained for most bacteria when using a solution 12 which contains glucose in an approximately 0.01 molar concentration and methylene blue (methylthionine chloride) in an approximately 0.0001 molar concentration.

Das Innere des Behälters 10 ist durch die Hälse 14, 16, 18 und 20 zugänglich. Nachdem alle Komponenten eingeführt worden sind, wird ein inertes Gas, wie z.B. Argon, 30 durch die Leitung 30 und das Verteilerrohr 32 eingeleitet, so daß es durch die Öffnungen 34 nach oben durch die * 'Lösung 12 hindurchperlt. Dieses Verfahren wird in derThe interior of the container 10 is accessible through the necks 14, 16, 18 and 20. After all components have been introduced, an inert gas, e.g. Argon, 30 introduced through line 30 and manifold 32 so that it bubbles up through openings 34 through solution 12. This procedure is used in the

Regel etwa 5 min lang durchgeführt, um den größten Teil -- des freien Sauerstoffs aus der Lösung 12 zu entfernen.Usually performed for about 5 minutes to remove most of the free oxygen from solution 12.

35 Das hindurchperlende Argon und irgendwelche flüchtigen Materialien, wie z.B. Sauerstoff, strömen nach oben durch den Dampfraum 35 und werden mittels der Auslaßleitung 36 aus dem Behälter 10 entfernt. Sowohl die Einlaßleitung 30 j i ΛΪ J - * ! i I * ·.35 The bubbling argon and any volatile materials such as Oxygen flows upward through the vapor space 35 and is removed from the container 10 by means of the outlet line 36. Both the inlet line 30 j i ΛΪ J - *! i I * ·.

i 1 . - 6- 1 als auch die Auslaßleitung 36 sind mittels eines Zwei-Loch- i Stopfens 38 innerhalb des Einführungshalses 14 dicht einge- j b ; paßt.i 1. - 6 1 and the outlet line 36 are tightly inserted within the insertion neck 14 by means of a two-hole plug 38; fits.

j I 5 Ein getrennter Glasbehälter 11, der eine Lösung 13 enthält, wird mit dem System in dem Behälter 10 mittels einer ' ✓ *j I 5 A separate glass container 11, which contains a solution 13, is connected to the system in the container 10 by means of a '✓ *

Salzbrücke 100, die aus Agar und Kaliumchlorid besteht, elektrolytisch verbunden. Die Lösung 13 enthält einen geeigneten Elektrolyten, in der Regel eine 0,1-molare 10 Eisen(III)-EDTA-Lösung oder alternativ eine wäßrige Kaliumchloridlösung.Salt bridge 100, which consists of agar and potassium chloride, is electrolytically connected. Solution 13 contains a suitable electrolyte, usually a 0.1 molar 10 iron (III) EDTA solution or alternatively an aqueous potassium chloride solution.

Der Zugang zum Innern des Behälters 11 wird erhalten durch die Hälse 15, 17 und 19. Die Lösung13 kann gewünschtenfalls 15 ebenfalls entlüftet werden durch Einleiten eines inerten Gases, wie Argon, durch die Einlaßleitung 31 und das s Verteilerrohr 33, und durch Herausperlenlassen durch die Öffnung-37 und nach oben durch die Lösung 13. Das hindurch-i perlende Argon und der Sauerstoff und irgendwelche anderen 20 flüchtigen Materialien strömen nach oben durch den Dampfraum 39 und werden mittels der Auslaßleitung 41 aus dem Behälter 11 entfernt. Die Einlaßleitung 31 und die Auslaßleitung 41 sind beide durch einen Zwei-Loch-Stopfen 43 innerhalb des Zuführungshalses 15 dicht eingepaßt.Access to the interior of the container 11 is provided through the necks 15, 17 and 19. The solution 13 can, if desired, also be vented 15 by introducing an inert gas, such as argon, through the inlet conduit 31 and the manifold 33 and bubbling out through the Opening 37 and up through solution 13. The bubbling argon and oxygen and any other 20 volatile materials flow up through vapor space 39 and are removed from container 11 via outlet conduit 41. The inlet line 31 and the outlet line 41 are both tightly fitted within the feed neck 15 by a two-hole plug 43.

2525th

Eine Batterie oder Gleichstromquelle 40 ist mit einem Potentiometer 42 mit einem PotentiometerSchieber 44 und einem Widerstand 46 ausgestattet. Der Schieber 44 steht durch den Leiter 50 mit der Gegenelektrode 52 in Ver-30 bindung. Die Gegenelektrode 52 kann aus irgendeinem geeigneten Elektrodenmaterial gefertigt sein. Für die * meisten Verwendungszwecke ist, wie gefunden wurde, eineA battery or DC power source 40 is equipped with a potentiometer 42 with a potentiometer slide 44 and a resistor 46. The slide 44 is connected by the conductor 50 to the counter electrode 52 in connection. Counter electrode 52 may be made of any suitable electrode material. For most * uses, it has been found to be one

Eisenelektrode zufriedenstellend. Die Gegenelektrode 52 ist innerhalb des Einführungshalses 17 mittels des Stopfens 35 54 dicht eingepaßt.Iron electrode satisfactory. The counter electrode 52 is tightly fitted within the insertion neck 17 by means of the plug 35 54.

Eine Graphitelektrode 56 mit hoher Dichte und niedriger j fN* \ ‘ # - 7 - % 1 Porosität ist innerhalb des Einführungshalses 20 des Be- ** * hälters 10 mittels des Stopfens 57 dicht eingepaßt ' und steht durch den Leiterdraht 58 über das Ampereme ter 60 und den Leiter 62 mit der positiven Seite der 5 Batterie 40 in Verbindung. Eine Bezugselektrode 70, wie z.B. eine gesättigte Kalomelelektrode, ist durch den Stopfen 72 in den Einführungshals 18 des Behälters 10 eingesetzt und steht mittels der Leiter 74 und 76 über das Voltmeter 78 mit dem Leiter 58 aus der Graphitelektro-10 de in Verbindung.A graphite electrode 56 with high density and low j fN * \ '# - 7 -% 1 porosity is tightly fitted within the insertion neck 20 of the ** container 10 by means of the plug 57 and is ter through the conductor wire 58 over the Ampereme 60 and the conductor 62 with the positive side of the 5 battery 40 in connection. A reference electrode 70, e.g. a saturated calomel electrode is inserted through the plug 72 into the insertion neck 18 of the container 10 and is connected by means of the conductors 74 and 76 via the voltmeter 78 to the conductor 58 from the graphite electrode 10 de.

Um die Apparatur in Betrieb zu setzen, ist es wichtig, die Graphitelektrode 56 zu drehen, um einen repräsentativen Kontakt der Elektrode mit den Bestandteilen der 15 Lösung 12 zu gewährleisten, um das an der Oberfläche der Elektrode verbrauchte Redox-Paar zu ersetzen. Dies wird erzielt durch Verwendung einer Antriebseinrichtung 80 und eines Getriebemechanismus 82, wie in Fig. 1 schematisch dargestellt. Es kann ein Bereich von Drehgeschwindigkeiten 20 mit Erfolg angewendet werden; es' ist jedoch bevorzugt, die Elektroden erfindungsgemäß mit Geschwindigkeiten von etwa 100 bis etwa 2000 Umdrehungen pro Minute (UpM) zu drehen. Es können auch niedrigere Geschwindigkeiten angewendet werden, bei zu niedrigen Geschwindigkeiten wird 25 die Elektrode jedoch empfindlicher gegen äußere Vibrationen und weniger empfindlich für die Messung (Bestimmung) von niedrigen Bakterienkonzentrationen.In order to operate the apparatus, it is important to rotate the graphite electrode 56 to ensure representative contact of the electrode with the components of the solution 12 to replace the redox pair consumed on the surface of the electrode. This is achieved by using a drive device 80 and a gear mechanism 82, as shown schematically in FIG. 1. A range of rotational speeds 20 can be used successfully; however, it is preferred to rotate the electrodes according to the invention at speeds of about 100 to about 2000 revolutions per minute (rpm). Lower speeds can also be used, but if the speeds are too low, the electrode becomes more sensitive to external vibrations and less sensitive to the measurement (determination) of low bacterial concentrations.

Um ein Testverfahren zu starten, wird der Potentiometer-30 Schieber 44 entlang der Widerstandseinrichtung 46 so eingestellt, bis die Ablesung auf dem Voltmeter 78 im wesentlichen 0,0 beträgt. Nach oder gleichzeitig mit dem Herausspülen des gelösten Sauerstoffs in der Lösung 12 mit Argon werden eventuelle verbleibende Spuren an 35 Sauerstoff vorzugsweise entfernt durch Zugabe von beispielsweise genügend Eisen(II)-EDTA, um den gemessenen Stromfluß durch das Amperemeter 60 auf im wesentlichen j 0 herabzusetzen.To start a test procedure, the potentiometer 30 slider 44 is adjusted along the resistance device 46 until the reading on the voltmeter 78 is substantially 0.0. After or simultaneously with the flushing out of the dissolved oxygen in the solution 12 with argon, any remaining traces of oxygen are preferably removed by adding, for example, enough iron (II) EDTA to reduce the measured current flow through the ammeter 60 to substantially j 0 .

·: - /·: - /

"W"W

- 8- t, 4 * % » - 1 Der Stromfluß durch den Testkreis (d.h. zwischen der »*- 8- t, 4 *% »- 1 The current flow through the test circuit (i.e. between the» *

Graphitelektrode 56 und der Gegenelektrode 52)', gemessen s mittels des Amperemeters 60, wird, wie in der Fig. 2 darge- stellt graphisch( gegen die Zeit aufgetragen. In der 5 Regel ist die Änderung des Stromes mit der Zeit zu Be- . ginn nicht-linear, nach einer kurzen' Zeitspanne entsteht jedoch eine lineare Beziehung. Die Steigung des linearen Abschnittes der Linie (angezeigt durch die Tangentenlinie in der Fig. 2) ist proportional zur Reaktionsgeschwin-10 digkeit bzw. -rate des Redox-Paares an der Elektrode 56 als Folge der katalytischen Wirkung des enzymatischen "·· Reagens. Eine typische Beziehung zwischen der Reaktions rate bzw. -geschwindigkeit und der Bakterienkonzentration in einer mit Glucose und Methylenblau gesättigten Lösung 15 (relativ zur Menge der verfügbaren Bakterien) ist in der Fig. 3 dargestellt.Graphite electrode 56 and counter electrode 52) ', measured by means of ammeter 60, is plotted against time as shown in FIG. 2. In general, the change in current over time is noticeable. not linear, but after a short period of time there is a linear relationship The slope of the linear portion of the line (indicated by the tangent line in Figure 2) is proportional to the rate of reaction of the redox couple of the electrode 56 as a result of the catalytic action of the enzymatic reagent. A typical relationship between the reaction rate or rate and the bacterial concentration in a solution 15 saturated with glucose and methylene blue (relative to the amount of available bacteria) is shown in FIG 3 shown.

Dieses Beispiel wurde durchgeführt unter Verwendung einer 300 ml-Flutwasserprobe in dem Behälter 10 mit 0,112 g » — 20 Dinatrium-EDTA, um die Lösung 0,001-molar an Dinatrium-EDTA zu machen. Zu dieser Lösung wurden 1,633 g K^PO^ und 3,136 g K^HPO^ zugegeben, um die Lösung 0,1-molar an Phosphat zu machen. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von 0,5 n NaOH auf 7 eingestellt und es wurden 0,5 g -4 25 (0,01 M) Glucose und 15 ml 0,01 M Methylenblau (5 x 10 M) zu der Lösung zugegeben. Dann wurde die Lösung mit den . Elektroden in Kontakt gebracht, wobei die sich drehende Elektrode vorher durch Polieren mit feinem Sandpapier und anschließendes Polieren auf einer Glasplatte gerei-30 nigt worden war. Die Kohlelektrode wies eine freiliegende untere Oberfläche von 0,30 cm2 auf und wurde mit 1000 UpM gedreht.This example was performed using a 300 ml flood water sample in container 10 with 0.112 g »- 20 disodium EDTA to make the solution 0.001 molar in disodium EDTA. 1.633 g of K ^ PO ^ and 3.136 g of K ^ HPO ^ were added to this solution to make the solution 0.1 molar in phosphate. The pH was adjusted to 7 using 0.5 N NaOH and 0.5 g -4 25 (0.01 M) glucose and 15 ml 0.01 M methylene blue (5 x 10 M) were added to the solution admitted. Then the solution with the. Electrodes brought into contact, the rotating electrode having been previously cleaned by polishing with fine sandpaper and then polishing on a glass plate. The carbon electrode had an exposed bottom surface of 0.30 cm2 and was rotated at 1000 rpm.

c Die Spannung wurde so eingestellt, daß die sich drehende 35 Elektrode bei 0,00 Volt gegen die gesättigte Kalomel-elektrode lag. Der Strom wurde als Funktion der Zeit gemessen. Als die Steigung der Änderung des Stromes mit dem rc The voltage was adjusted so that the rotating electrode was at 0.00 volts against the saturated calomel electrode. The current was measured as a function of time. As the slope of the change in current with the r

Ablauf der Zeit konstant wurde, wurde die Steigung be- j i ”4 f 9 ♦ - 9- - 1 stimmt und die Anzahl der Bakterien errechnet auf derAfter the time had become constant, the slope was determined and the number of bacteria was calculated on the

Basis der Eichkurve. In diesem Beispiel wurden die Rëak- - tionsgeschwindigkeiten bzw. -raten, ermittelt aus der Steigung der Tangentenlinie in Fig. 2,dazu verwendet, 5 wie durch die unterbrochenen Linien in Fig. 3 dargestellt, zu ermitteln, daß die Bakterienkonzentration 6 7 ' zwischen 10 und 10 Zellen pro ml Lösung lag, wenn die -9Basis of the calibration curve. In this example, the reaction speeds or rates, determined from the slope of the tangent line in FIG. 2, were used to determine 5, as shown by the broken lines in FIG. 3, that the bacterial concentration 6 7 'between 10 and 10 cells per ml of solution when the -9

Reaktionsgeschwindigkeit bzw. -rate etwa 6,25 x 10 betrug.Reaction speed or rate was about 6.25 x 10.

1010th

Graphische Darstellungen ähnlich der Fig. 3 können hergestellt werden unter Verwendung vpn Standard-Konzentrationen von Bakterien oder anderen enzymatischen Agentien bei Standard-Testbedingungen. Nachdem diese Eichkurve 15 hergestellt worden ist, kann sie wiederholt für Tests mit unterschiedlichen Proben von Lösungen, welche die gleichen oder ähnliche Bakterien oder enzymatische Agentien enthalten, verwendet werden.Graphs similar to FIG. 3 can be made using standard concentrations of bacteria or other enzymatic agents under standard test conditions. After this calibration curve 15 has been produced, it can be used repeatedly for tests with different samples of solutions which contain the same or similar bacteria or enzymatic agents.

20 Die Fi9* 4 zeigt einen Querschnitt entlang den Linien 4-4 der in Fig. 1 dargestellten Graphitelektrode 56 mit hoher Dichte und niedriger Porosität. Die Elektorde 56 besteht aus einem Graphitkern 96, der in der Regel aus einem sehr hochreinen, undurchlässigen zylindrischen 25 Element mit einem Durchmesser innerhalb des Bereiches von etwa 0,1 bis etwa 10 cm, vorzugsweise von etwa 0,3 bis etwa 1,0 cm, besteht. Der Graphit sollte eine Porosität von weniger als etwa 10 % besitzen. Dies ist wichtig, um die Absorption von Lösung, die dann in eine an-30 schließend getestete Probe eingeschleppt werden könnte, minimal zu halten. Auch hat irgendeine Absorption in die Zwischenräume der Poren einer Elektrode einen elek- xr trischen Effekt analog zur Vergrößerung der Oberfläche der Elektrode, d.h. sie erhöht die Rate bzw. Geschwin-35 digkeit der Oxidation des Redox-Paares und kann zu fehlerhaften Ablesungen, insbesondere bei niedrigen Elektrodenumdrehungsgeschwindigkeiten, führen.20 Fi9 * 4 shows a cross section along lines 4-4 of the graphite electrode 56 shown in FIG. 1 with high density and low porosity. The electrode 56 consists of a graphite core 96, which generally consists of a very high-purity, impermeable cylindrical element with a diameter within the range from about 0.1 to about 10 cm, preferably from about 0.3 to about 1.0 cm , consists. The graphite should have a porosity of less than about 10%. This is important to minimize the absorption of solution that could then be introduced into a sample subsequently tested. Any absorption into the interstices of the pores of an electrode also has an electrical effect analogous to the enlargement of the surface of the electrode, i.e. it increases the rate or rate of oxidation of the redox pair and can lead to erroneous readings, especially at low electrode rotation speeds.

t i % -10- - 1 Der Überzug-98 um die äußere Oberfläche des zylindri schen Stabes 96 herum kann aus irgendeinem geeigneten undurchlässigen Material bestehen. Vorzugsweise wird ein polymeres Material (beispielsweise ein Epoxyharz, Poly-5 urethan oder dgl.) verwendet, da die Graphitstäbe in diese Materialien eingetaucht werden können und der daran haftende Überzug innerhalb einer verhältnismäßig kurzen Zeitspanne gehärtet werden kann unter Ausbildung einer zähen, dichten Schutzschicht. Die Schicht braucht 10 nicht übermäßig dick zu sein, vorausgesetzt, daß sie für die Flüssigkeit undurchlässig ist und als Isolator gegenüber dem beträchtlichen Stromfluß relativ zur elektrischen Leitfähigkeit des Graphits fungiert. Im allgemeinen haben sich Epoxyüberzüge einer Dicke von etwa 1 mm als 15 akzeptabel erwiesen.t i% -10- - 1 The coating 98 around the outer surface of the cylindrical rod 96 can be made of any suitable impervious material. Preferably, a polymeric material (e.g., an epoxy resin, poly-5 urethane, or the like) is used because the graphite rods can be immersed in these materials and the coating adhered thereto can be cured within a relatively short period of time to form a tough, dense protective layer. The layer need not be excessively thick, provided that it is impermeable to the liquid and acts as an insulator from the considerable current flow relative to the graphite's electrical conductivity. In general, about 1 mm thick epoxy coatings have been found to be acceptable.

Nachdem der Überzug 98 aufgebracht ist, wird der Endabschnitt entfernt, um eine unbeschichtete Graphitober-. fläche 110 am Ende der Elektrode freizulegen (vgl. Fig.After coating 98 is applied, the end portion is removed to cover an uncoated graphite. Expose surface 110 at the end of the electrode (see Fig.

! 20 1) . Die Oberfläche 110 stellt somit die einzige Kontakt- j fläche zwischen dem Graphit und der Lösung 12 dar, wobei ! der Schutzüberzug 98 mindestens bis zu dem Dampfraum 35 des! 20 1). The surface 110 thus represents the only contact surface between the graphite and the solution 12, where! the protective coating 98 at least up to the vapor space 35 of the

Behälters 10 verläuft und vorzugsweise den gesamten Graphitabschnitt der Elektrode bedeckt.Container 10 extends and preferably covers the entire graphite portion of the electrode.

2525th

Die Stirnfläche (Endoberfläche) 110 sollte geschliffen oder geschmirgelt werden, beispielsweise mit sehr feinem Sandpapier, um irgendwelche Kratzer zu entfernen und eine ebene Oberfläche zu erzeugen. Vorzugsweise wird 30 sie dann poliërt unter Verwendung von glattem hartem Papier auf einer harten ebenen Oberfläche, wie z.B. einer Glasplatte, bis ein metallischer Glanz die gesamte Oberfläche 110 bedeckt. Dann wird die Elektrode unmit-c telbar vor der Verwendung mit Methanol und destillier- 35 tem Wasser gespült, um irgendwelche Öle oder sonstige Verunreinigungsmittel zu entfernen.The face (end surface) 110 should be sanded or sanded, for example with very fine sandpaper, to remove any scratches and create a flat surface. Preferably, it is then polished using smooth, hard paper on a hard, flat surface, e.g. a glass plate until a metallic luster covers the entire surface 110. Then the electrode is rinsed immediately before use with methanol and distilled water to remove any oils or other contaminants.

4 J4 years

Γ,Γ,

VV

v -11- ! ψ m 1 Durch Herstellung einer sehr glatten, glänzenden, undurchlässigen Oberfläche 110 kann eine hohe Präzision in Korrelation zu den nachfolgenden Messungen erzielt werden, da sehr gut reproduzierbare elektrische 5 Meßkreise mit genauen freiliegenden Oberflächengrößen der Graphitelektrode hergestellt werden können.v -11-! ψ m 1 By producing a very smooth, shiny, impermeable surface 110, a high degree of precision can be achieved in correlation to the subsequent measurements, since very reproducible electrical 5 measuring circuits with precise exposed surface sizes of the graphite electrode can be produced.

Ein besonders attraktives Merkmal der erfindungsgemäßen beschichteten Graphitelektrode ist ihre Verwendbarkeit 10 zur Durchführung aufeinanderfolgenden Tests mit verschiedenen Mustern oder Proben der Lösung 12. So kann beispielsweise die Lösung geändert werden oder die Elektrode kann aus dem Einführungshals 20 herausgezogen und in einem anderen Behälter 10 mit einer anderen 15 Lösung verwendet werden. Vor dem Einführen der Graphitelektrode 56 in eine neue Lösung wird der untere Endabschnitt entfernt (beispielsweise durch Abschleifen ii& eines Teils), um sicherzustellen, daß auch geringfügigen Mengen an absorbierter Lösung aus dem vorherge-20 henden Test entfernt worden sind. Es wurde gefunden, daß durch Abschleifen von etwa 0,64 cm (1/4 inch) oder mehr des Bodens der Elektrode und anschließendes Schmirgeln und Polieren der Bodenoberfläche die Elektrode für die Wiederverwendung geeignet ist unter Erzielung 25 von Ergebnissen, die von denjenigen einer neuen Elektrode nicht zu unterscheiden sind. Darüber hinaus wurde im Gegensatz zu den bekannten Elektroden, in denen beispielsweise Edelmetalle verwendet werden, gefunden, daß irgendwelche Ablagerungen oder eine Verunreinigung des 30 äußeren Überzugs 98 der Elektrode die Genauigkeit des Tests nicht beeinflussen (beeinflußt). Es ist somit nicht erforderlich, die Elektrode wegzuwerfen, wenn ihre äußere Oberfläche mit von außen einwirkenden Agentien korrodiert oder beschichtet ist.A particularly attractive feature of the coated graphite electrode according to the invention is its usability 10 for carrying out successive tests with different samples of the solution 12. For example, the solution can be changed or the electrode can be pulled out of the insertion neck 20 and in another container 10 with another 15 solution can be used. Before inserting graphite electrode 56 into a new solution, the lower end portion is removed (e.g. by grinding ii & part) to ensure that even small amounts of absorbed solution have been removed from the previous test. It has been found that by grinding about 1/4 inch or more of the bottom of the electrode and then sanding and polishing the bottom surface, the electrode is suitable for reuse to achieve results different from those of a new one Electrode are indistinguishable. Furthermore, in contrast to the known electrodes in which, for example, noble metals are used, it was found that any deposits or contamination of the outer coating 98 of the electrode did not affect the accuracy of the test. It is therefore not necessary to throw away the electrode if its outer surface is corroded or coated with external agents.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend unter Bezugnahme r auf spezifische bevorzugte Ausführungsformen näher j Ύ 35 -12- h * * ί ' 1 erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständ- * lieh, daß sie darauf nicht beschränkt ist, sondern auch viele andere Verwendungen und Abänderungen umfaßt, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung 5 verlassen wird.Although the invention was explained in more detail above with reference to specific preferred embodiments j j 35 -12- h * * ί '1, it is, however, obvious to the person skilled in the art that it is not limited to these, but also many other uses and modifications without departing from the scope of the present invention 5.

10 15 ** 2° * 25 3010 15 ** 2 ° * 25 30

VV

3535

Claims

5 claims M

1. Method for measuring the concentration of an enzymatic agent in a first solution, in which a first

10 electrode is at least partially immersed, a second electrode being at least partially immersed in a second solution · 'which is in electrolytic connection with the first solution, and wherein an electrical potential is applied to the first electrode and the second electrode, and the resulting flowing current between the electrodes is related to the concentration of the enzymatic agent in the first solution, characterized in that the first electrode used is a graphite conductor with a porosity sufficiently low to be significant Prevent absorption of more solution than about 1/4 inch below its surface. 2. The method according to claim 1, characterized in that a graphite conductor with a porosity of less than * 10 is used as approximately 10%. · * 3. 'Method according to claim 1 or 2, characterized in that the conductor used is cylindrical and around it

5 longitudinal axis is rotated at a speed sufficient to ensure representative contact of the same with the components of the first solution.

4. The method according to claim 3, characterized in 10 that the speed is within the range of about 100 to about 2000 revolutions per minute (rpm).

5- The method according to claim 3 or 4, characterized in 15 that the immersed portion of the cylindrical conductor is coated on its entire surface with the exception of the immersed end face with an electrically insulating layer which is un- for the first solution. is permeable. 20th

6. The method according to any one of claims 3 to 5, characterized in that the cylindrical conductor has a diameter between about 0.1 and about 10 cm.

7. The method according to claim 6, characterized in that the conductor has a diameter between about 0.3 and about 1.0 cm.

8 · The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the first solution contains or consists of an aqueous solution containing the enzymatic agent, a redox couple and the substrate, and that it also includes the step of adding a sufficient amount of disodium EDTA to the first solution to thereby substantially improve the precision of the measurement of the concentration of the enzymatic agent. »Ψ for 4 Λ; -15- * lg. A process for producing an electrode for at least partial immersion in a solution and for carrying out precise measurements of the current flowing through it, characterized in that 5 is a cylindrical graphite conductor with a diameter within the range from approximately 0.1 to approximately 10 cm and * · · A porosity of less than about 10% is produced, the surfaces of the sides of the cylindrical conductor are coated with a polymeric material which is impermeable to the solution, and the end face of the cylindrical conductor is flattened, smoothed and polished to Achieving a metallic sheen.

10. Electrode as obtained in the method according to claim 9. i 1

11. A method for measuring the enzyme concentration in an aqueous solution containing an enzyme and dissolved oxygen, characterized in that a sample of the solution is introduced into a container, the solution is buffered to a substantially neutral pH, | a substrate and a redox pair are added to the solution, the substrate and the redox pair being converted from one oxidation state to another by the catalytic action of the enzyme, the dissolved oxygen is removed from the aqueous solution after the substrate and the redox couple of the solution! '; 30 have been added, an electrolytic solution is provided in a separate container 4, the aqueous solution and the electrolytic solution are connected to one another electrolytically =; 35 a counter electrode is at least partially immersed in the electrolytic solution,! I S. / »J> t -16 * L 1 a graphite electrode is at least partially immersed in the aqueous solution, the graphite electrode consisting of a cylindrical graphite conductor with a diameter within the range from about 0.1 to about 10 cm 5 and a porosity of less than about 10%, which has an insulating coating on the surfaces of its sides which is impermeable to the aqueous solution, while the end face of the cylindrical conductor is free of the coating and is flattened, smooth and 10 polished to achieve this a metallic luster, the graphite electrode is rotated about its longitudinal axis at a speed within the range of about 100 to about 2000 revolutions per minute (rpm) and an electrical potential is applied between the graphite electrode and the counter electrode, which potential is between the counter electrode and the graphite electrode flowing current is measured, and the enzyme concentration in the aqueous solution from the G Speed or rate of change of the flowing current is determined.

12. The method according to claim 11, characterized in that. [that the counter electrode is made of iron. [[| 25 13. The method according to claim 11 or 12, characterized in that the enzyme contains or comprises bacteria and that the i! Substrate and the redox couple glucose and methylene blue? contain or include. i.

14. The method according to any one of claims 11 to 13, characterized in that metal ions are present as impurities in the aqueous solution and that it also includes the step of adding enough disodium EDTA to the solution to an interaction ( Interference) between the metal ions 35 and the precision of the measurements of the enzyme. v:! * ï * - ν ’ί - * -17-

15. The method according to any one of claims 11 to 14, characterized in that it also comprises the removal of at least approximately 1/4 inch of the submerged end of the graphite electrode after measurement of the current flowing through it. Flatten, smooth and polish the resulting newly exposed face of the same until a metallic gloss is achieved and the graphite electrode is reused.

16. The method according to any one of claims 11 to 15, characterized in that the dissolved oxygen is removed from the aqueous solution by bubbling through an oxygen-free inert gas. 15. o -----------: Γ 20 25 30 35