<Desc/Clms Page number 1>
EMI1.1
Rohrback Technology Corporation C > te Seattle, Washington (Verenigde Staten van Amerika) "Werkwijze en inrichting voor het meten van enzym- concentraties" I. C. : Verenigde Staten van Amerika octrooiaanvrage no 628.514 ingediend op Juli 6,1984 in naam
EMI1.2
van Berber : Silverman waarvan de aanvraagster Z > de rechthebbende is.
<Desc/Clms Page number 2>
P.Werkwijze en inrichting voor het meten van enzymconcentraties.
De uitvinding heeft betrekking op werkwijzen en inrichtingen voor het bepalen van concentraties van aktieve populaties van enzymen of enzymbevattende populaties, zoals bacterien, gisten en dergelijke.
Traditioneel worden dergelijke populaties geteld door microscopische technieken of door meer gekunstelde methodes, zoals de meting van optische troebeling van vloeistoffen, die de populaties bevatten. In het Amerikaanse octrooischrift 3.506. 544 wordt een methode beschreven voor het meten van de concentratie van bepaalde componenten van door enzym gekatalyseerde reakties onder toepassing van een elektrochemisch omkeerbaar redoxkoppel. Het enzym, een redoxkoppel zoals methyleenblauw, een substraat zoals glucose, en een verenigbaar geleidend medium zoals een gebufferde wateroplossing, worden gemengd in een elektrolytische cel, waardoorheen een stroom wordt gevoerd door het drukken van een voltage over een paar elektroden.
De elektroden zijn typisch gemaakt van edelmetaal.. De aktiviteit van het enzym reduceert het geoxydeerde redoxkoppel met een snelheid overeenkomend met de concentratie van het enzym.
Het gereduceerde redoxkoppel wordt onderworpen aan heroxydatie aan de anode van de cel, waardoor een celstroom wordt geproduceerd, die evenredig is met de concentratie van het gereduceerde redoxkoppel. De toenamesnelheid van de stroom blijkt dus evenredig te zijn met de enzymconcentratie in de oplossing.
De verschillende tot nog toe bekende methodes voor het meten van enzymen of bacterienpopulaties leden aan bepaalde gebreken. Sommige waren niet voldoende gevoelig om zeer lage concentraties te ontdekken, of waren zeer langzaam, of vereisten te veel trappen om de bepalingen efficient te maken.
Sommigen waren ook erg duur, in het bijzonder die waarbij edelmetaal of dergelijke elektrodes werden gebruikt. Ook werd gevonden dat soms onverklaarbare fouten optraden bij de analyse van een bepaalde soort.
<Desc/Clms Page number 3>
Een ander probleem bij de tot nog toe bekende inrichtingen kwam aan de oppervlakte toen hetzelfde apparaat achtereenvolgens werd gebruikt voor meervoudige monsters. Gevonden werd, dat het overbrengen van de elektrodes van de ene monstercel naar de andere de tweede cel of monster verontreinigde met enzymen, of andere componenten die geabsorbeerd waren door de elektroden. Ook was grote zorg vereist om ervoor te zorgen, dat de cel gevuld was tot zeer nauwkeurig gemeten dieptes, identiek aan die gebruik om haar te calibreren, opdat de elektrodeoppervlakte ondergedompeld in het elektrolyt constant bleef. Zelfs bij grote zorg in dit opzicht traden echter onverklaarbare fouten in de metingen op.
Nog een ander probleem bij de bekende stand van de techniek werd ontmoet vanwege de noodzaak om de oplossing voor het laten lopen van de proef te ontluchten. Gevonden werd dat onder sommige omstandigheden onvoorstelbare hoeveelheden aerobe bacterien konden worden gedesaktiveerd vanwege de ontluchtingstrap. Wanneer daarentegen de oplossing niet ontlucht werd, verstoorde de resterende zuurstof de juistheid van de meting, daar deze bijdroeg tot de reaktie aan de anode, waarop de meting was gebaseerd.
Deze en andere problemen bij de bekende stand van de techniek konden in hoge mate worden opgeheven of voorkomen volgens de uitvinding.
De uitvinding voorziet nu in een werkwijze en een inrichting voor het meten van de concentratie van een enzymatisch middel in een oplossing, waardoorheen een elektrische stroom wordt gevoerd tussen een contraelektrode en een langgerekte cilindrische grafietelektrode met lage porositeit en hoge dichtheid. De grafietelektrode wordt rond zijn lengteas gedraaid in de oplossing, die ook een redoxkoppel bevat en substraat, die gekatalyseerd worden door het enzymatische middel onder reaktie en verandering van het redoxkoppel van de ene oxydatietoestand naar de andere.
De verandering in oxydatietoestand bewerkstelligt een verandering in stroom door de rote-
<Desc/Clms Page number 4>
rende elektrode, welke verandering verband houdt met de snelheid van veranderen van de oxydatietoestand van het redoxkoppel, dat op zijn beurt verband houdt met de concentratie van het enzymatische middel.
Het ondergedompelde gedeelte van de grafietelektrode is over zijn gehele oppervlak, uitgezonderd het eindoppervlak, bedekt met een beschermende isolatielaag, zoals een epoxyhars, die niet geleidend, inert en ondoordringbaar voor de componenten van de oplossing is. Dit stelt in staat tot een hoge precisie en reproduceerbaarheid van de metingen, en maakt het ook mogelijk dezelfde elektroden te gebruiken voor een reeks van opeenvolgende metingen van concentraties van enzymatische middelen in verschillende oplossingen eenvoudig door een gedeelte van het blootgestelde einde van de elektroden tussen opeenvolgende metingen te verwijderen.
Bij de onderhavige methode wordt ook de ontluchting van de oplossing overwogen om zuurstof te verwijderen alvorens de stroom te meten. Voor bepaalde enzymatische middelen, zoals aerobe bacterie, werd gevonden dat de precisie sterk wordt verbeterd door het redoxkoppel en het substraat in de oplossing
EMI4.1
te brengen alvorens te ontluchten. el
Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm wordt overwogen dinatrium EDTA te gebruiken om de precisie van de analyse aanzienlijk te verbeteren.
Figuur 1 toont een inrichting voor het meten van enzymatisch middelconcentratie volgens de uitvinding,
Figuur 2 toont grafisch een voorbeeld van de stroom door het aanvoelcircuit uitgezet tegen de tijd,
Figuur 3 toont grafisch het verband tussen de reaktiesnelheid en de bacterieconcentratie gedurende de oplossingbeproeving en
Figuur 4 is een dwarsdoorsnede van de grafietelektrode langs de lijn 4-4 van figuur).
Figuur 1 toont een actinische glazen houder 10, die een oplossing 12 bevat, waarvan de concentratie aan enzyma-
<Desc/Clms Page number 5>
tisch middel moet worden beproefd. Het enzymatische middel kan zelf een enzym zijn of een gist ; het nut van de uitvinding wordt echter speciaal overwogen voor oplossingen, die bacterien bevatten.
Oplossing 12 bevat water, dat gebufferd wordt
EMI5.1
met geschikte bufferingsmiddelen, zoals kaliumdihydrogeenfosfaat < el (KH2P04) en dikaliumhydrogeenfosfaat (K2HP04) tot een pH van 7,0. De optimale pH hangt af van het bepaalde enzymatische middel, dat men beproeft, maar typisch is een neutrale pH van 7,0 voldoende. Men voegt dinatriumzout van ethyleendiaminetetraazijnzuur (dinatriumedetaat of dinatrium EDTA) toe in een hoeveelheid voldoende om de concentratie ervan ongeveer 0, 01 molair te doen zijn in de oplossing 12. Het is gebleken dat hierdoor de verstoring wordt gereduceerd van metaalionen, die aanwezig kunnen zijn in de oplossing als onzuiverheden, en die anders de neiging zouden hebben de enzymatische aktiviteit of de stroom door oplossing 12 ongunstig te beinvloeden en foutieve resultaten op te leveren.
Gemeend wordt dat het dinatrium EDTA complexen vormt met de metaalionen onder voorkoming van het neerslaan ervan bij de procesomstandigheden (welk neerslaan anders de bacterien of ander te analyseren enzymatisch middel zou occluderen). De effektieve en optimale hoeveelheden van dinatrium EDTA zullen dus afhangen van de aanwezige metaalionen en kunnen worden bepaald door routineexperimentering.
Men voegt een substraat en een redoxkoppel toe aan de oplossing. Het gekozen substraat en redoxkoppel moeten van een type zijn, dat zich laat onderwerpen aan katalytische werking door het te beproeven bepaalde enzymatische middel. Typisch worden voor de meeste bacterien uitstekende resultaten bereikt met een oplossing 12, die ongeveer 0, 01 molair concentratie aan glucose en ongeveer 0, 0001 molair concentratie aan methyleenblauw (methylthioninechloride) bevat.
Toegang tot het inwendige van houder 10 wordt verkregen door halzen 14, 16, 18 en 20. Wanneer de inhouden
<Desc/Clms Page number 6>
alle op hun plaats zijn, wordt een inert gas, zoals argon, geinjekteerd door leiding 30 en verspreidingsbuis 32, en borrelt daarbij door openingen 34 omhoog in oplossing 12. Deze procedure wordt typisch gevolgd gedurende ongeveer 5 minuten om de meeste vrije zuurstof uit de oplossing 12 te spuien. Het borrelende argon en eventuele vluchtige materialen zoals zuurstof, gaan omhoog door dampruimte 35 en worden verwijderd uit houder 10 door middel van uitlaat 36. Zowel de inlaat 30 als de uitlaat 36 zijn afsluitend gestoken door een stop 38 met twee gaten in toevoerhals 14.
Een afzonderlijk glazen vat 11, dat een oplossing 13 bevat, is elektrolytisch verbonden met het systeem in vat 10 door middel van zoutbrug 100, bestaande uit agar en kaliumchloride. De oplossing 13 bevat een geschikt elektrolyt, typisch een 0, 1 molaire ferri EDTA oplossing, of anders een waterige kaliumchlorideoplossing.
Toegang tot het inwendige van vat 11 wordt verkregen door halzen 15, 17 en 19. Oplossing 13 kan desgewenst ook worden ontlucht door injektie van een inert gas, zoals argon, door toevoerleiding 31 en afvoerleiding 33, waarbij het door openingen 37 in oplossing 13 omhoogborrelt. Het borrelende argon en de zuurstof, en eventueel andere vluchtige materialen, gaan omhoog door dampruimte 39 en worden verwijderd uit vat 1 1 door middel van afvoerleiding 41. Toevoerleiding 31 en afvoerleiding 41 zijn beide afsluitend gestoken door een stop 43 met twee gaten in toevoerhals 15.
Een batterij of gelijkspanningsbron 40 is voorzien van een potentiometer 42, bestaande uit een weerstand 46 met een schuifcontact 44 erop. Het schuifcontact 44 is door middel van geleider 50 verbonden aan contraelektrode 52. De contraelektrode 52 kan gemaakt zijn van elk geschikt elektrodemateriaal. Voor de meeste doeleinden blijkt een ijzeren elektrode voldoende te zijn. De contraelektrode 52 is afdichtend bevestigd in toevoerhals 17 door middel van stop 54.
Een grafietelektrode 56 met hoge dichtheid en
<Desc/Clms Page number 7>
lage porositeit is bevestigd in toevoerhals 20 van vat 10 door middel van stop 57 en is verbonden door geleidingsdraad 58 via amperemeter 60 en leiding 62 met de positieve kant van de accu.
Een referentieelektrode 70, zoals een verzadigde calomelelektrode, is door stop 42 gestoken in toevoerhals 18 van vat 10 en verbonden door leidingen 74 en 76 via voltmeter 78 met leiding 58 van de grafietelektrode.
Bij het in werking stellen van de inrichting is het van belang de grafietelektrode 56 te draaien om representatief contact van de elektrode met de componenten van oplossing 12 te verzekeren om het redoxkoppel te vervangen, dat gebruikt wordt aan het oppervlak van de elektrode. Dit wordt bereikt met een aandrijforgaan 80 en een tandwielmechanisme 82, schematisch getoond in figuur 1. Men kan met succes een reeks van rotatiesnelheden gebruiken. Het verdient echter de voorkeur de elektroden hierbij te laten draaien met snelheden van ongeveer 100-2000 omw/min. Men kan lagere snelheden gebruiken, maar bij te lage snelheden kan de elektrode gevoeliger worden voor uitwendige vibraties en minder gevoelig voor het opsporen van lage concentraties van bacteri n.
Bij het begin van een proef schuift men het schuifcontact 44 langs weerstand 46 totdat voltmeter 78 nage-
EMI7.1
noeg op 0, 0 staat. Na of gelijktijdig met het spuien van de C2 opgeloste zuurstof in oplossing 12 met argon, worden eventueel resterende sporen zuurstof bij voorkeur verwijderd door toevoegen van bijvoorbeeld genoeg ferro EDTA om de gemeten stroom door amperemeter 60 te doen afnemen tot nagenoeg 0.
De stroom door het proefcircuit (dat wil zeggen tussen grafietelektrode 56 en contraelektrode 52) zoals gemeten door amperemeter 60, wordt afgezet als getoond in figuur 2.
Typisch is de stroombehandeling met de tijd aanvankelijk niet lineair, maar na een korte duur stelt zich een lineair verband in. De helling van het lineaire gedeelte van de lijn (aangeduid door de raaklijn in figuur 2) is evenredig met de reaktiesnelheid van het redoxkoppel aan elektrode 56, vanwege de kata-
<Desc/Clms Page number 8>
lytische werking van het enzymatische middel. Een typisch verband tussen de reaktiesnelheid en de concentratie aan
EMI8.1
bacterien in een oplossing verzadigd met glucose en methyleenblauw (met betrekking tot de hoeveelheid beschikbare bacterie) wordt getoond in figuur 3.
Dit voorbeeld wordt uitgevoerd met een 300 ml monster vloedwater in houder 10 met 0, 112 g dinatrium EDTA om de-oplossing 0, 001 molair te maken aan dinatrium EDTA. Aan deze oplossing voegt men 1, 633 g KH2P04 en 3,136 g K2HP04 toe om de oplossing 0,1 molair aan fosfaat te maken. Men stelt de pH in op 7 onder toepassing van 0,5 N NaOH en 0,5 g glucose
EMI8.2
- 4 (0, 01 M) en voegt 15 ml 0, 01 M methyleenblauw (5 x 10 M) aan de oplossing brengt de oplossing dan in contact met de elektrodes, waarbij men de roterende elektrode tevoren heeft schoongemaakt door polijsten met fijn zandpapier en daarna polijsten op een glasplaat. De koolelektrode heeft een bloot-
EMI8.3
2 gesteld onderoppervlak van 0, 30 draait met 1000 omw/min.
De voltage wordt zodanig ingesteld, dat de roterende elektrode op 0,00 volt is ten opzichte van de verzadigde calomelelektrode. Men meet de stroom als funktie van de tijd. Wanneer de helling van de verandering in stroom met de tijd constant wordt, bepaalt men de helling en berekent het aantal bacterien op basis van de calibreringskromme. In dit voorbeeld gebruikt men de reaktiesnelheden bepaald uit de helling van de raaklijn in figuur 2, zoals getoond door de stippellijnen in figuur 3, om vast te stellen dat de bacterieconcentratie tussen 106 en 107 cellen ligt per ml oplossing, wanneer de reaktiesnelheid ongeveer 6,25 x zo is.
Men kan grafieken maken zoals in figuur 3 waarbij men standaardconcentraties van bacterien of andere enzymatische middelen gebruikt onder standaard proefomstandigheden. Nadat deze calibreringscurve is bepaald, kan deze herhaaldelijk gebruikt worden voor proeven op verschillende monsters van oplossing, die dezelfde of dergelijke bacterien of enzymatische middelen bevatten.
<Desc/Clms Page number 9>
Figuur 4 toont een dwarsdoorsnede langs lijn 4-4 van de grafietelektrode 56 met hoge dichtheid en lage porositiet, getoond in figuur l. De elektrode 56 bestaat uit een grafietkern 96, die typisch bestaat uit een ondoordringbaar cilindrisch element met zeer hoge zuiverheid en met een diameter van ongeveer 0, 1-10 bij voorkeur 0, 3-1, 0 cm. Het grafiet moet een porositeit hebben van minder dan ongeveer 10 %.
Dit is belangrijk om absorptie van oplossing te miniseren, dat anders zou kunnen worden overgedragen naar een volgend te beproeven monster. Ook heeft elke absorptie in tussenruimtes van porien van een elektrode een elektrisch effekt analoog aan het vergroten van het oppervlak van de elektrode, dat wil zeggen hierdoor neemt de oxydatiesnelheid van het redoxkoppel toe en er kunnen foutieve aflezingen worden verkregen, in het bijzonder bij lage elektrodedraaisnelheden.
De bekleding 98 rond het buitenoppervlak van de cilindrische staaf 96 kan van elk geschikt ondoordringbaar materiaal zijn. Bij voorkeur gebruikt men een polymeer materiaal (zoals epoxyhars, polyurethan en dergelijke), daar de grafietstaven in dergelijke materialen kunnen worden gedoopt en de aanhechtende bekleding kan worden gehard in een betrekkelijk korte duur onder vorming van een taaie dichte beschermingslaag. De laag behoeft niet buitengewoon dik te zijn, mits zij ondoordringbaar is voor de vloeistof en werkt als een isolator tegen aanzienlijke stroom met betrekking tot de geleidbaarheid van het grafiet. In het algemeen zijn epoxybekledingen van ongeveer l mm dik aanvaardbaar gebleken.
Nadat de bekleding 98 is aangebracht, verwijdert men het eindgedeelte om een onbekleed grafietoppervlak HO (zie figuur)) aan het eind van de elektrode bloot te leggen.
Oppervlak HO vormt dus het enige contactgebied tussen het grafiet en de oplossing 12, waarbij de beschermingsbekleding 98 tot tenminste de dampruimte 35 van vat 10 loopt en bij voorkeur het gehele grafietgedeelte van de elektrode bedekt.
Het eindoppervlak 110 moet worden geslepen of
<Desc/Clms Page number 10>
geschuurd bijvoorbeeld met zeer fijn zandpapier om eventuele krassen te verwijderen en te voorzien in een mat oppervlak.
Het wordt dan bij voorkeur gepolijst onder toepassing van glad hard papier op een glad plat oppervlak, zoals een glazen plaat, totdat een metallieke glans het totale oppervlak HO bedekt. Men spoelt de elektrode dan met methanol en gedestilleerd water om eventuele olien of andere verontreinigingen vlak voor het gebruik te verwijderen.
Door te voorzien in een zeer glad glanzend on- doordringbaar oppervlak 110, kan een zeer hoge precisie worden bereikt bij het correleren van opeenvolgende metingen, daar kan worden voorzien in zeer reproduceerbare elektrische circuits met precieze blootgestelde oppervlaktegebieden van de grafietelektrode.
Een bijzonder aantrekkelijk kenmerk van de beklede grafietelektrode volgens de uitvinding is het nut ervan voor het uitvoeren van opeenvolgende proeven op verschillende soorten of monsters van oplossing 12. Men kan bijvoorbeeld de oplossing verwisselen of de elektrode kan uit de toevoerhals 20 worden getrokken en gebruikt in een ander vat 10 met een andere oplossing. Alvorens de grafietelektrode 56 in een nieuwe oplossing te steken, verwijdert men het onderste eindgedeelte (bijvoorbeeld door een gedeelte weg te slijpen) om er zeker van te zijn dat zelfs geringe hoeveelheden geabsorbeerde oplossing uit de vorige proef zijn verwijderd.
Gevonden werd dat door wegslijpen van ongeveer 6,25 mm of meer van de bodem van de elektrode, en daarna zanden en polijsten van het bodemoppervlak, de elektrode geschikt is voor gebruik met resultaten, die niet te onderscheiden zijn van een nieuwe elektrode. Bovendien werd gevonden, dat in tegenstelling met tot nog toe bekende elektrodes waarbij men bijvoorbeeld edelmetalen gebruikt, eventuele afzettingen of verontreinigingen van de buitenbekleding 98 van de elektrode niet de precisie van de proef aantasten. Het is dus niet nodig de elektrode weg te gooien wanneer het buitenoppervlak ervan gecorrodeerd wordt
<Desc/Clms Page number 11>
of bekleed met vreemde stoffen.
<Desc / Clms Page number 1>
EMI1.1
Rohrback Technology Corporation C> in Seattle, Washington (United States of America) "Method and Device for Measuring Enzyme Concentrations" I. C.: United States of America Patent Application No. 628,514 filed July 6,1984 in name
EMI1.2
van Berber: Silverman of which the applicant Z> is the entitled party.
<Desc / Clms Page number 2>
P. Method and device for measuring enzyme concentrations.
The invention relates to methods and devices for determining concentrations of active populations of enzymes or enzyme-containing populations, such as bacteria, yeasts and the like.
Traditionally, such populations have been counted by microscopic techniques or by more sophisticated methods, such as the measurement of optical turbidity of liquids containing the populations. In U.S. Patent 3,506. 544 describes a method for measuring the concentration of certain components of enzyme-catalyzed reactions using an electrochemically reversible redox couple. The enzyme, a redox couple such as methylene blue, a substrate such as glucose, and a compatible conductive medium such as a buffered water solution, are mixed in an electrolytic cell through which current is passed by pressing a voltage across a pair of electrodes.
The electrodes are typically made of precious metal. The activity of the enzyme reduces the oxidized redox couple at a rate corresponding to the concentration of the enzyme.
The reduced redox couple is subjected to reoxidation at the anode of the cell, producing a cell current proportional to the concentration of the reduced redox couple. The rate of increase of the current thus appears to be proportional to the enzyme concentration in the solution.
The various methods known hitherto for measuring enzymes or bacterial populations suffered from certain shortcomings. Some were not sensitive enough to detect very low concentrations, or were very slow, or required too many steps to make the assays efficient.
Some were also very expensive, especially those using precious metal or similar electrodes. It was also found that sometimes inexplicable errors occurred in the analysis of a particular species.
<Desc / Clms Page number 3>
Another problem with the hitherto known devices surfaced when the same device was used sequentially for multiple samples. It has been found that transfer of the electrodes from one sample cell to another contaminated the second cell or sample with enzymes or other components absorbed by the electrodes. Also great care was required to ensure that the cell was filled to very accurately measured depths, identical to that used to calibrate it, so that the electrode surface immersed in the electrolyte remained constant. However, even with great concern in this regard, inexplicable errors occurred in the measurements.
Yet another prior art problem has been encountered due to the need to vent the test run solution. It was found that under some circumstances, unimaginable amounts of aerobic bacteria could be deactivated because of the venting step. On the other hand, when the solution was not vented, the residual oxygen disrupted the accuracy of the measurement as it contributed to the reaction at the anode on which the measurement was based.
These and other problems in the prior art could be largely eliminated or prevented according to the invention.
The invention now provides a method and an apparatus for measuring the concentration of an enzymatic agent in a solution, through which an electric current is passed between a counter electrode and an elongated cylindrical graphite electrode of low porosity and high density. The graphite electrode is rotated about its longitudinal axis in the solution, which also contains a redox couple and substrate, which are catalyzed by the enzymatic agent under reaction and changing the redox couple from one oxidation state to another.
The change in oxidation state causes a change in current through the rotor
<Desc / Clms Page number 4>
electrode, which change is related to the rate of change of the oxidation state of the redox couple, which in turn is related to the concentration of the enzymatic agent.
The immersed portion of the graphite electrode is covered over its entire surface, except the end surface, with a protective insulating layer, such as an epoxy resin, which is non-conductive, inert and impervious to the components of the solution. This allows for high precision and reproducibility of the measurements, and also allows the same electrodes to be used for a series of successive measurements of concentrations of enzymatic agents in different solutions simply through a portion of the exposed end of the electrodes between successive delete measurements.
The present method also considers venting the solution to remove oxygen before measuring the flow. For certain enzymatic agents, such as aerobic bacteria, it was found that precision is greatly improved by the redox couple and the substrate in the solution
EMI4.1
before venting. el
In a preferred embodiment, it is contemplated to use disodium EDTA to significantly improve the precision of the analysis.
Figure 1 shows a device for measuring enzymatic agent concentration according to the invention,
Figure 2 graphically shows an example of the current through the sense circuit plotted against time,
Figure 3 graphically shows the relationship between the reaction rate and the bacterial concentration during the dissolution test and
Figure 4 is a cross-sectional view of the graphite electrode taken along line 4-4 of Figure).
Figure 1 shows an actinic glass container 10, containing a solution 12, the concentration of which is enzymatic
<Desc / Clms Page number 5>
tic means must be tested. The enzymatic agent itself may be an enzyme or a yeast; however, the utility of the invention is especially contemplated for solutions containing bacteria.
Solution 12 contains water which is buffered
EMI5.1
with suitable buffering agents, such as potassium dihydrogen phosphate <el (KH2PO4) and dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) to a pH of 7.0. The optimal pH depends on the particular enzymatic agent under test, but typically a neutral pH of 7.0 is sufficient. Disodium salt of ethylenediamine tetraacetic acid (disodium edetate or disodium EDTA) is added in an amount sufficient to make its concentration about 0.01 molar in the solution 12. It has been found to reduce the disturbance of metal ions which may be present in the solution as impurities, which would otherwise tend to adversely affect the enzymatic activity or flow through solution 12 and give erroneous results.
The disodium EDTA is believed to form complexes with the metal ions preventing their precipitation under the process conditions (which would otherwise occlude the bacteria or other enzymatic agent to be analyzed). Thus, the effective and optimal amounts of disodium EDTA will depend on the metal ions present and can be determined by routine experimentation.
A substrate and a redox couple are added to the solution. The substrate and redox couple selected must be of a type which can be subjected to catalytic action by the particular enzymatic agent to be tested. Typically, for most bacteria, excellent results are achieved with a solution 12 containing about 0.01 molar concentration of glucose and about 0.001 molar concentration of methylene blue (methylthionine chloride).
Access to the interior of container 10 is through necks 14, 16, 18 and 20. When the contents
<Desc / Clms Page number 6>
all in place, an inert gas, such as argon, is injected through line 30 and dispersion tube 32, bubbling up through openings 34 into solution 12. This procedure is typically followed for about 5 minutes to remove most of the free oxygen from the solution 12 to blow. The bubbling argon and any volatile materials, such as oxygen, rise through vapor space 35 and are removed from container 10 by outlet 36. Both inlet 30 and outlet 36 are sealed through a plug 38 with two holes in feed neck 14.
A separate glass vessel 11 containing solution 13 is electrolytically connected to the system in vessel 10 by salt bridge 100 consisting of agar and potassium chloride. The solution 13 contains a suitable electrolyte, typically a 0.1 molar ferric EDTA solution, or else an aqueous potassium chloride solution.
Access to the interior of vessel 11 is through necks 15, 17 and 19. Solution 13 may also be vented, if desired, by injecting an inert gas, such as argon, through supply line 31 and discharge line 33, bubbling upward through openings 37 in solution 13 . The bubbling argon and oxygen, and any other volatile materials, rise through vapor space 39 and are removed from vessel 11 by drain line 41. Supply line 31 and drain line 41 are both sealed through a plug 43 with two holes in supply neck 15 .
A battery or DC voltage source 40 is provided with a potentiometer 42, consisting of a resistor 46 with a sliding contact 44 thereon. The sliding contact 44 is connected to counter electrode 52 by conductor 50. Counter electrode 52 may be made of any suitable electrode material. An iron electrode appears to be sufficient for most purposes. Counter electrode 52 is sealed in feed neck 17 by means of plug 54.
A high density graphite electrode 56 and
<Desc / Clms Page number 7>
low porosity is attached in supply neck 20 of vessel 10 by plug 57 and is connected by lead 58 through ammeter 60 and lead 62 to the positive side of the battery.
A reference electrode 70, such as a saturated calomel electrode, is inserted through plug 42 into supply neck 18 of vessel 10 and connected through leads 74 and 76 through voltmeter 78 to lead 58 of the graphite electrode.
When operating the device, it is important to rotate the graphite electrode 56 to ensure representative contact of the electrode with the components of solution 12 to replace the redox couple used on the surface of the electrode. This is accomplished with a driver 80 and a gear mechanism 82 shown schematically in Figure 1. A range of rotational speeds can be successfully used. However, it is preferable to rotate the electrodes at speeds of about 100-2000 rpm. Lower speeds can be used, but at too low speeds the electrode can become more sensitive to external vibrations and less sensitive to detecting low concentrations of bacteria.
At the start of a test, the sliding contact 44 is moved along resistor 46 until voltmeter 78 reads
EMI7.1
is at 0, 0. After or simultaneously with sputtering the C2 dissolved oxygen in solution 12 with argon, any remaining traces of oxygen are preferably removed by adding, for example, enough ferrous EDTA to decrease the measured current through ammeter 60 to near zero.
The current through the test circuit (i.e., between graphite electrode 56 and counter electrode 52) as measured by ammeter 60 is turned off as shown in Figure 2.
Typically, the flow treatment is not linear over time, but after a short duration, a linear relationship sets in. The slope of the linear portion of the line (indicated by the tangent line in Figure 2) is proportional to the rate of reaction of the redox couple at electrode 56, because of the
<Desc / Clms Page number 8>
lytic action of the enzymatic agent. A typical relationship between the reaction rate and the concentration of
EMI8.1
bacteria in a solution saturated with glucose and methylene blue (relative to the amount of available bacteria) is shown in Figure 3.
This example is performed with a 300 ml sample of flood water in container 10 with 0.112 g disodium EDTA to make the solution 0.001 molar to disodium EDTA. To this solution, 1.633 g of KH2PO4 and 3.136 g of K2HPO4 are added to make the solution 0.1 molar of phosphate. The pH is adjusted to 7 using 0.5 N NaOH and 0.5 g of glucose
EMI8.2
- 4 (0.01 M) and adding 15 ml 0.01 M methylene blue (5 x 10 M) to the solution then contact the solution with the electrodes, previously rotating the rotating electrode by polishing with fine sandpaper and then polish on a glass plate. The carbon electrode has an exposed
EMI8.3
2 set bottom surface of 0.30 rotates at 1000 rpm.
The voltage is adjusted so that the rotating electrode is at 0.00 volts relative to the saturated calomel electrode. The current is measured as a function of time. When the slope of the change in current becomes constant with time, the slope is determined and the number of bacteria is calculated based on the calibration curve. In this example, the reaction rates determined from the slope of the tangent line in Figure 2, as shown by the dotted lines in Figure 3, are used to determine that the bacterial concentration is between 106 and 107 cells per ml of solution, when the reaction rate is about 6, 25 times so.
Graphs can be made as in Figure 3 using standard concentrations of bacteria or other enzymatic agents under standard test conditions. Once this calibration curve has been determined, it can be used repeatedly for tests on different samples of solution containing the same or the like bacteria or enzymatic agents.
<Desc / Clms Page number 9>
Figure 4 shows a cross-sectional view along line 4-4 of the high density and low porosity graphite electrode 56 shown in Figure 1. The electrode 56 consists of a graphite core 96, which typically consists of an impermeable cylindrical element of very high purity and with a diameter of about 0.1-10, preferably 0.3-1.0 cm. The graphite should have a porosity of less than about 10%.
This is important to minimize absorption of solution, which could otherwise be transferred to a subsequent sample to be tested. Also, any absorption in interstices of pores of an electrode has an electrical effect analogous to increasing the surface area of the electrode, i.e., this increases the oxidation rate of the redox couple and erroneous readings can be obtained, especially at low electrode turning rates .
The coating 98 around the outer surface of the cylindrical rod 96 may be of any suitable impermeable material. Preferably, a polymeric material (such as epoxy resin, polyurethane and the like) is used, since the graphite rods can be dipped in such materials and the adhesive coating can be cured in a relatively short time to form a tough dense protective layer. The layer need not be excessively thick as long as it is impermeable to the liquid and acts as an insulator against significant current with respect to the conductivity of the graphite. Generally, epoxy coatings of about 1 mm thick have been found acceptable.
After coating 98 is applied, the end portion is removed to expose an uncoated graphite surface HO (see Figure) at the end of the electrode.
Surface HO thus forms the only contact area between the graphite and the solution 12, the protective coating 98 extending to at least the vapor space 35 of vessel 10 and preferably covering the entire graphite portion of the electrode.
The end surface 110 must be ground or
<Desc / Clms Page number 10>
sanded, for example, with very fine sandpaper to remove any scratches and provide a matte surface.
It is then preferably polished using smooth hard paper on a smooth flat surface, such as a glass plate, until a metallic gloss covers the entire surface HO. The electrode is then rinsed with methanol and distilled water to remove any oils or other contaminants just before use.
By providing a very smooth glossy impermeable surface 110, very high precision can be achieved in correlating successive measurements, since highly reproducible electrical circuits with precise exposed surface areas of the graphite electrode can be provided.
A particularly attractive feature of the coated graphite electrode according to the invention is its utility for carrying out successive tests on different types or samples of solution 12. For example, the solution can be exchanged or the electrode can be pulled out of the feed neck 20 and used in a other vessel 10 with another solution. Before inserting the graphite electrode 56 into a new solution, the lower end portion is removed (e.g. by grinding away a portion) to ensure that even small amounts of absorbed solution have been removed from the previous run.
It has been found that by grinding about 6.25 mm or more from the bottom of the electrode, and then sanding and polishing the bottom surface, the electrode is suitable for use with results indistinguishable from a new electrode. In addition, it has been found that, in contrast to heretofore known electrodes using, for example, precious metals, any deposits or impurities from the outer coating 98 of the electrode do not affect the precision of the test. Thus, it is not necessary to discard the electrode if its outer surface is corroded
<Desc / Clms Page number 11>
or covered with foreign matter.