KR970011555B1

KR970011555B1 - 항혈전제에 유효성분으로 함유되는 녹차 추출물 및 그의 제조방법

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Publication number: KR970011555B1
Application number: KR1019930018376A
Authority: KR
Inventors: 윤여표; 문동철; 이용문; 이세창; 박종범
Original assignee: 허계성
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1993-09-13
Publication date: 1997-07-12
Also published as: JPH07258103A; CN1107355A; FR2709965A1; KR950007862A; CN1087613C; DE4432549A1

Abstract

내용없음

Description

항혈전제에 유효성분으로 함유되는 녹차 추출물 및 그의 제조방법

제 1 도 내지 제 4 도는 응집촉진제인 ADP, 에피네프린, 콜라겐 또는 리스토세틴과 본 발명의 녹차 추출물을 투여하였을 때의 응집억제효과를 나타내는 각 그라프이다.

제 5 도는 응집촉진제인 에피네프린과 콜라겐을 먼저 병합투여하고, 본 발명의 녹차 추출물을 투여하였을 때의 혈전억제효과를 나타내는 그라프이다.

제 6 도는 본 발명의 녹차 추출물과 대조약물인 아스피린을 투여하였을 때의 출혈시간을 나타내는 그라프이다.

제 7 도는 본 발명의 녹차 추출물과 대조약물인 아스피린을 투여하였을 때의 전혈응고시간을 비교한 그라프이다.

제 8 도는 본 발명의 녹차 추출물과 대조약물인 아스피린을 투여하였을 때의 혈장응고시간을 나타내는 그라프이다.

[발명의 목적]

[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]

본 발명은 항혈전제에 유효성분으로 함유되는 녹차 추출물 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 녹차엽 건조물을 물 또는 물과 저급알콜의 혼합물로 열수(hot water) 추출하고, 클로로포름 추출과정없이 여과 및/또는 원심분리하여 비극성 물질을 제거한 다음, 그를 칼럼 크로마토그래피하여 동결건조시킴으로써, 폴리페놀류 25-30%, 에피갈로카테킨 칼레이트 40-70% 및 에피카테킨과 에피갈로카테킨의 혼합물 0-35%를 포함하는 녹차엽 엑기스 분말 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

녹차는 중국, 일본 등을 중심으로 한 극동지역에서 일상 기호품으로 자리잡고 있는 음료로서 건강에 대한 효용성이 전해지고 있다.

녹차엽에 존재하는 성분으로는 녹차탄닌류, 카페인, 아스코르빈산, 토코페롤류, 훌라보놀류, 다당류 및 베타카로텐 등이 있으며, 이중에서 카페인, 아스코르빈산 및 녹차탄닌류 등이 주를 이룬다. 카페인 및 아스코르빈산은 다른 식물 유래의 차에도 포함되어 있으나, 카테킨류로 대표되는 녹차탄닌류는 녹차에서만 찾아볼 수 있는 고유의 성분으로서, 에피카테킨(epicatechin : EC), 에피카테킨 갈레이트(epicatechin gallate : ECG), 에피갈로카테킨(epigallocatechin : EGC), 및 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate : EGCG)의 4종류를 주성분으로 함유하고, 그밖에 불소, 아연, 칼슘 및 마그네슘염의 무기물들을 함유하고 있다.

녹차 카테킨류의 주효능으로는 지질과산화의 억제작용을 비롯하여, 각종 질병에 관여하는 활성산소 작용의 억제, 발암물질의 변이원성 억제, 콜레스테롤 재흡수 억제작용, 항균·항바이러스 작용, 충치예방 및 소취작용 등 여러 효과가 알려져 있다. 특히 1990년대에 들어와 이들 성분 중 EGCG에 의한 발암물질의 발생(initation) 과정 및 발암촉진자(promotor)에 대한 억제작용이 알려지는 등 다각적인 결과가 보고되고 있어, 녹차 카테킨류로부터 항암 치료제의 개발이 유력시되고 있다.

아울러, 몇몇의 연구자들은 녹차로부터 혈소판응집억제능을 지닌 약리성분을 추출하였다. 예를 들면, 왕(Wang) 등은 녹차로부터 추출한 다당류가 실험실적 및 생체내 조건에서 혈전용해의 효과를 가지는 보고하고 있으며(참조 : Wagn Shuru et al., Zhoogcaoyao, 23(5) : 254-256(1992), 센(Shen) 등은 녹차로부터 추출한 폴리페놀이 실험실적 조건에서 혈전의 형성을 감소시키는 것을 보고하고 있다(참조 : Shen Xinnan et al., Yingyang Xuebao, 15(2) : 147-151(1993)).

또한, 일본국 특허공개 제 평2-184626호에서는 녹차엽, 우롱차엽, 또는 홍차엽에 열수를 20~40L/kg 첨가하고 10~30분간 침출시키고, 농축 및 동결건조시켜 가용성 추출물을 얻거나, 상기 엽을 열수추출하고, 이어 클로로포름 추출하여 카페인 등의 천연고분자를 제거한 다음, 에틸아세테이트로 다시 추출하여 조(組) 카텐킨류를 얻고 있다. 이렇게 얻은 가용성 추출물 또는 조 카텐킨류를 친수성 유기용매인 아세톤을 용출용매로 사용한 칼럼크로마토그라피함으로써, 30% ECG 및 70% EGCG를 함유하는 가장 바람직한 차-카테킨류 분획을 얻었다. 상술한 바와 같이 얻은 ECG 및/또는 EGCG, 이 성분을 포함하는 가용성 추출물 또는 차-카텐킨류가 시판의 항혈전제 아스피린보다 높은 혈소판응집억제능을 가지고 있음을 실험실적으로 입증하고, 그들의 혈소판 응집 억제제로서의 용도를 개시하고 있다.

그러나, 상기의 문헌에 개시된 방법으로 얻은 가용성 추출물에 포함된 ECG 및 EGCG의 양은 30% 정도로서 그의 함량이 낮은 것으로 나타났다. 또한, 상기 문헌은 다양한 혈소판 응집 촉진물질에 대한 혈소판 응집 억제효과를 조사하지 않고, 주로 콜라겐에 대해서만 응집 억제효과를 조사하였을 뿐만 아니라, 생체내 항혈전 효과와 항혈액응고능을 병행하여 조사하지 않았으므로, 상술한 방법으로 얻은 녹차 추출물은 바람직한 혈소판 응집억제제로서 부적합하다는 단점을 가지고 있었다.

한편, 일반적으로 종래에 사용되고 있는 녹차의 카텐킨류 분리과정은 1) 추출과정, 2) 제거과정 및 3) 정제과정의 세단계로 나눌 수 있다. 종래의 일반적인 추출과정은 열수, 냉수, 메탄올 또는 에탄올 및 이들의 적절한 배합의 혼합물을 이용하고 있고, 추출액으로부터 유효성분은 이외의 다른 성분을 제거하는 과정은 주로 물과 섞이지 않는 유기용매로 추출제거효과를 최대로 하기 위하여, 주로 극성이 큰 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 디에틸에테르 등을 사용하고 있다. 최종적 정제과정은 유기용매의 서로 다른 극성 차이를 이용한 분배추출법이 주로 이용되고 있으며, 최근 들어 칼럼크로마토그래피 또는 고속액체크로마토그래피가 이용되고 있다. 분배추출법에 의한 정제과정은 추출조작에 시간이 많이 걸리며, 클로로포름, 메틸이소부틸케톤 등 유기용매를 다량 사용하기 때문에, 분리조작시 경제성 및 안정성에 문제가 있다. 칼럼크로마토그래피법에 의한 정제방법에는 세파덱스 또는 폴리머 계통의 수지 등이 사용되고 있으나, 전술한 추출 및 제거과정과 연결되어 최적의 녹차 카텐킨류 분리를 제공할 수 있는 칼럼 수지, 용출용매, 용출조건 등은 상이한 바, 이의 최적화 과정은 상당한 실험을 요구하고 있다. 고속액체크로마토그라피에 의한 정제법은 신속한 효율성 및 순수하게 정제할 수 있다는 장점을 가지고 있으나, 측정장치의 구입 및 용출용매의 고가, 그리고 분리컬럼의 열화 등의 문제점을 가지고 있다.

[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]

이에, 본 발명자들은 상술한 문제점을 해결하고자 예의 연구노력한 결과, 열수추출액을 여과 또는 원심분리법에 의하여 잔존물을 일차적으로 완전히 제거하였으며, 세파텍스 LH-20 칼럼크로마토그래피하고, 분리용매를 단순화하여 물과 아세톤, 디옥산, 메탄올 또는 이소프로판을 혼합용액으로 일회 세척에 의하여 수용성인 카페인, 유리아미노산류 및 당류 뿐만 아니라, 테페노이드류 및 착색성분을 완전히 씻어낼 수 있었다. 따라서, 기존방법과 같은 탈 카페인 작업이 따로 필요없게 되며, 클로로포름, 메틸이소부틸게톤 등과 같은 유기용매를 사용함으로써 최종적인 제품에서 나타나는 유기용매, 또는 유기용매로부터 유래되는 오염물질의 혼입을 방지할 수 있다. 그 결과, 적황색 부분만이 칼럼의 선단에 존재하게 되며, 이는 육안으로 쉽게 관찰할 수 있다. 한편, 남아있는 적황색 부분을 물-아세톤 또는 디옥산 혼합용매에 의하여 한꺼번에 용리하여 활성성분을 최대한의 수율로 얻어낼 수 있으며, 본 발명의 방법으로써 공지방법의 결점으로부터 완전히 벗어날 수 있었다.

아울러, 녹차엽 건조물을 물 또는 물과 저급알콜의 혼합물로 열수추출하고, 클로로포름 추출과정없이 원심분리하여 비극성 물질을 제거하고 이어 에틸아세테이트 추출한 다음, 물과 아세톤, 디옥산, 메탄올 또는 이소프로판올 혼합용액을 분리용매로 사용하여 칼럼크로마토그라피하고, 얻은 활성분획을 동결건조시켜 제조한 녹차 추출물이 폴리페놀류 25-30%, EGCG 40-70%, EC와 ECG의 혼합물 0-35%를 포함하고, 그 추출물은 ADP, 에피네프린, 콜라겐, 리스토세틴(ristocetin) 등의 다양한 혈소판 응집 촉진물질에 대한 혈소판 응집 억제효과가 우수하고, 더불어 생체내 항혈전 효과와 혈혈액응고능도 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

결국, 발명의 주된 목적은 상술한 열수추출, 여과 및/또는 원심분리, 에틸아세테이트 추출, 칼럼크로마토그라피 및 동결건조시켜, 폴리페놀류 25-30%, EGCG 40-70%, EC와 ECG의 혼합물 0-35%를 포함하는 녹차엽 엑기스 분말의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 방법으로 제조된 녹차엽 엑기스 분말을 유효성분으로 하고, 약학적 제제의 제조에 통상적으로 사용되는 부형제, 희석제 및 항산화제 등의 보조제를 포함하는 항혈전제를 제공하는 것이다.

[발명의 구성 및 작용]

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명에서는 녹차엽 건조물을 물 또는 물과 저급알콜의 혼합물로 열수추출하고, 클로로포름 추출과정없이 여과 및/또는 원심분리하여 비극성 물질을 제거하고 농축한 다음, 에틸아세테이트로 반복추출하여 얻은 유기용매층을, 물과 아세톤, 디옥산, 메탄올 또는 이소프로판올의 혼합용액을 분리용매로 사용하여 칼럼크로마토그라피하고, 얻은 활성성분을 동결건조시켜 녹차엽 엑기스 분말(녹차 추출물)을 제조한다. 상기에서, 추출액의 농축시, 유효성분들이 항산화 효과가 있다는 점을 고려하여 반드시 n-부탄올을 추출액의 1/4정도 가하여, 추출액이 농축시 상부의 공기에 노출되어 산화되지 않도록 항상 n-부탄올의 용적을 유지한다.

상술한 방법으로 녹차 추출물을 제조한 결과, 완전히 수분을 제거할 수 있었음은 물론이고, 농축액의 조성과 동결건조 후의 유효성분의 조성비는 거의 변화가 없었다. 건조된 유효성분 분말은 회갈색이며, 물에 잘 녹으며, 6개월 이상 보관시에도 흡습성이 없어 매우 안정하였다. 따라서 건조된 분말은 쉽게 약학적 제제로 제조될 수 있다.

상기의 방법을 반복하여 실시하여 본 결과, 각 배취에 따른 활성성분을 함유한 제품의 각 성분조성이 거의 일치하였다. 이 활성분획의 조성을 조사한 결과, 폴리페놀류 25-30%, 에피갈로가테킨 갈레이트 40-70%, 에피카테킨과 에피갈로가테킨의 혼합물 0-35%를 포함하고 있었다. 이는 지금까지 보고된 추출방법으로 분리된, 혈소판 응집 억제능을 갖는 녹차 추출물의 조성과는 매우 상이하다.

본 발명 녹차 추출물의 일반적인 추출방법은 하기의 각 방법에 의하여 보다 구체적으로 설명된다.

추출방법

출발물질인 건조된 녹차엽을 그대로 또는 덕음차를 70-90℃의 열수로 10분 이상 추출한다. 이때, 추출에 사용된 열수는 녹차엽 중량당 5-100배, 바람직하게는 10-30배의 양으로 사용하고, 추출시간은 추출온도에 따라 다르나, 일반적으로 30초 내지 1시간, 바람직하게는 5-20분이다. 열수 추출 용매의 조성은 5-50% 정도의 알콜성 용매를 혼합하여 사용할 수도 있다.

상기 추출 혼합물을 바람직하게는 교반하면서 비등하지 않는 범위에서 추출을 완료한다. 추출액중의 불용성의 물질은 가입여과, 흡인여과 또는 원심분리와 같은 공지의 방법에 의하여 여과하여 여과액을 수득한다.

감압하 농축방법

상기 추출방법으로 얻은 추출물에 약 10-50%(v/v), 바람직하게는 20% 정도의 n-부탄올을 가하고 감압하 농축조작이 완전히 끝날 때까지 이 비율을 유지시켜, 추출물의 비등을 방지하는 한편, 추출물내 유효성분들의 공기와의 직접 접촉을 방해하여, 성분조성의 변화를 방지한다.

농축은 약 50-70℃에서 가열하면서 감압하, 예를 들어, 10-70mmHg에서 수행함으로써, 점성 추출물(물함량 약 10-30%(w/w))을 제조한다. 감압하 농축에 필요한 시간은 감압정도에 따라 다르나, 약 30분-2시간이다. 감압하 농축방법에 있어서, 농축온도는 추출물 중의 유효성분의 손실 또는 파괴를 막기 위하여 90℃ 이상으로 상승되지 않도록 한다.

에틸아세테이트 추출, 칼럼크로마토그래피 및 동결건조방법

상기의 감압농축액을 에틸아세테이트로 수회 반복추출하고, 유기용매층을 농축하여, 칼럼크로마토그래피, 가장 바람직하게는 세파덱스 LH-20 칼럼크로마토그래피한다. 이때, 분리용매는 물과 아세톤, 디옥산, 메탄올 또는 이소프로판올의 혼합용액을 사용한다.

칼럼으로부터 얻은 정제액을 감압하 농축방법에 의하여, 열을 가하지 않은 상온에서 농축한 후, 급속히 냉동시켜 보관한다. 동결건조방법은 -100℃ 이하의 냉매에 의하여 극저온상태에서 진공상태에 시료를 정치하여, 승화성이 있는 물질과 잔류하는 물을 완전히 제거할 수 있다. 건조시간은 시료의 양, 표면적, 냉매온도 및 진공펌프의 용량에 따라 좌우되나 약 12-24시간 이내에 완전히 건조품을 얻을 수 있다.

이렇게 수득된 건조분말은 흡습성이 없고 비용적이 적은 분말이므로, 공지의 방법에 따라 분말, 미세과립, 과립 또는 정제와 같은 약학적 제제로 제조하기에 적당하다.

또한, 이렇게 수득된 건조분말은 독성이 적으며, 경구투여될 수 있다. 건조된 분말은 약학적으로 허용할 수 있는 부형제(예, 녹말, 락토오스, 탄산칼슘, 인산칼슘 등), 결합제(예, 녹말, 아라비아고무, 카르복시메틸셀룰로오즈, 히드록시메틸셀룰로오즈, 결정성셀룰로오즈 등), 운활제(예, 마그네슘스테아레이트, 활석 등) 및 분해제(카르복시메틸셀룰로오즈 칼슘, 활석 합성알루미늄 실리케이트 등), 희석제(물, 식물유 등)와 혼합함으로써 캡슐, 분말, 과립 미세과립 또는 정제, 소프트캅셀 및 액제와 같은 약학적 제제로 될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

녹차 추출물의 제조(I)

녹차엽 건조물, 덕음차 또는 시판 녹차 200g을 70-90℃의 열수 4.000ml로 20분간 추출하였다. 이때, 덕음차는 녹차엽의 건조물을 세절하여 녹차를 제조하기 전의 반가공품을 일컫는다. 얻은 추출액은 일차여과하여 불용물을 걸러낸 다음, 여액을 다시 100rpm에서 10분간 원심분리하여 침전된 잔사를 제거하였다. 상층의 여액(약 3,500ml)을 모아 진공회전증발기로 70℃에서 약 400ml가 될 때까지 감압농축하고, 클로로포름 400ml로 추출하여 비극성 화합물들을 완전히 제거하였다. 이와 같은 추출은 3회 이상 실시하였다. 이어서 수층을 에틸아세테이트 400ml로 3회 반복 추출하여 얻은 유기용매층 약 1,200ml를 진공회전증발기로 50℃에서 50ml까지 농축한 다음, 농축액에 아세톤 또는 디옥산 200ml를 가하고 다시 농축하여 20ml가 되게 하였다. 농축액 20ml를 세파덱스 LH-20 컬럼(내경 35mm× 길이 550mm, 세파덱스 준중량 200g)의 상부에 주입한 다음, 물-아세톤 또는 물-디옥산(84 : 15, 용적비)의 용액 3,000ml로 충분히 세척하고, 칼럼 내의 녹황색 및 갈색층이 완전히 용출되었다고 판단되면, 물-아세톤 또는 물-디옥산 혼합용액(40 : 60, 용적비)으로 용출하기 시작하여, 칼럼 상층부에 흡착되어 있던 황갈색 내지 황색 띠(band)가 칼럼 선단에 용출되기 시작하면 그 분획을 받아 빈공증발건조기로 70℃에서 50ml까지 농축하였다. 농축액은 -20℃ 이하에서 1일 보관후, 소량씩 동결건조기에서 완전히 건고시켜 8.6g의 건조분말을 얻었다(EGCG 잔류비 : 70%).

상기 방법에 의하여 얻어진 건조분말 5.0mg을 정밀히 취하여 메탄올 5.0mg에 녹이고, 이중 5㎕를 고속액체크로마토그라피하여 EGCG의 함량을 측정하였는데, 그 결과 EGCG의 잔류비율은 70%이었다. 이때, EGCG의 잔류비율은 아래의 식에 의하여 계산하였다.

EGCG의 잔류비율(%)=EGCG 해당 피크면적/전체 피크면적×100

<고속액체크로마토그라피 측정조건>

측정기기 : 고속액체크로마토그라피(P-6300, 일본 히타치 공업사)

용리조건 : 아세토니트릴-에틸아세테이트-0.05% 인산(12 : 2 86, v/v) 혼합용매

분리컬럼 : Cosmosil 5C18(4.6mm i.d.×150mm L) (일본 Nakalai Tesque사)

칼럼온도 : 40℃

측정파장 : 280nm

이와 같은 조건하에서 EGCG의 잔류시간은 6.9분이었다.

후술하는 실시예 2~6에서 수득된 건조분말의 EGCG 잔류비율도 상기와 같은 방법으로 평가하였다.

[실시예 2]

녹차 추출물의 제조(II)

녹차엽 건조물, 덕음차 또는 시판 녹차 1.5kg을 70℃의 물-에탄올(90 : 10, 용적비) 혼합용액 20.0리터로 20분간 추출하고, 추출액은 여지를 사용하여 일차여과하여 불용물을 제거하였다. 여액(약 19.0리터)을 모아 진공회전증발기로 70℃에서 감압농축하여 점성 추출물을 얻고, 이 점성 추출물을 다시 온수 2.0리터에 용해시키고, 500ml씩 나누어 클로로포름-n-헥산 혼합용매(80 : 20, 용적비) 500ml로 추출하여 비극성 화합물들을 완전히 제거하였다. 상기 추출제거조작은 3회 이상 실시하였다. 이어서 수층을 에틸아세테이트 500ml로 3회 반복 추출하여 얻은 유기층 약 1,500ml를 진공회전증발기로 50℃에서 완전히 건조시키고, 건조물에 아세톤 500ml를 가하고 다시 농축하여 50ml로 하였다. 농축액 50ml를 세파덱스 LH-20 칼럼(내경 70mm× 길이 500mm, 세파덱스 순중량 400g)의 상부에 주입하고, 물 4.0리터로 수용성 물질을 제거한 후, 물-아세톤(70 : 30, 용적비)의 용액 3.0리터로 충분히 세척하여 칼럼 내의 녹황색 및 갈색층이 완전히 용출되었다고 판단되면, 물-아세톤(40 : 60, 용적비)용액으로 용출하기 시작하여, 칼럼 상층부에 흡착되어 있던 황갈색 내지 황색 띠가 칼럼 선단에 용출되기 시작하면 그 분획을 받아 진공증발건조기로 70℃에서 100ml까지 농축하였다. 농축액은 -20℃ 이하에서 1일 보관후 소량씩 동결건조기에서 완전히 건고시켜 43.8g의 건조분말을 얻었다(EGCG 잔류비 54%).

[실시예 3]

녹차 추출물의 제조(III)

녹차엽 건조물, 덕음차 또는 시판 녹차 200g을 70-90℃의 열수, 4,000ml로 20분간 추출하고, 추출액은 일차여과하여 불용물을 걸러낸 다음, 여액을 다시 2000rpm에서 10분간 원심분리하여 침전된 잔사를 제거하였다. 상층의 여액(약 3,500ml)을 모아 진공회전증발기로 70℃에서 약 400ml가 될 때까지 감압농축한 다음, 에틸아세테이트 400ml로 3회 반복 추출하여 얻은 유기용매층 약 1,200ml를 진공회전증발기로 50℃에서 50ml까지 농축하였다. 농축액에 이소프로판올 200ml를 가하고 다시 농축하여 20ml가 되게 한 다음, 농축액 20ml를 세파덱스 LH-20 컬럼(내경 35mm×길이 550mm, 세파덱스 순중량 200g)의 상부에 주입하고, 물-아세톤(85:15, 용적비)의 용액 3,000ml로 충분히 세척하여, 칼럼 내의 녹황색 및 갈색층이 완전히 용출되었다고 판단되면, 물-아세톤(55:45, 용적비) 용액 5.0리터로 용출하기 시작하여, 칼럼 상층부에 흡착되어 있던 황갈색 내지 황색 띠(band)가 칼럼 선단에 용출되기 시작하면 그 분획을 받아 진공증발건조기로 70℃에서 50ml까지 농축하였다. 세파덱스 LH-20 칼럼은 아세톤 2.0리터로 칼럼내 잔류하는 비극성 물질을 용출시킨 후 재사용할 수 있다. 농축액은 -20℃ 이하에서 1일 보관후, 소량씩 동결건조기에서 완전히 건고시켜 14.7g의 건조분말을 얻었다(EGCG 잔류비 : 62%).

[실시예 4]

녹차 추출물의 제조(IV)

녹차엽 건조물, 덕음차 또는 시판 녹차 100g을 70-90℃의 열수 1.0리터 10분간 추출하고, 그 추출액은 일차여과하여 불용물을 걸러낸 다음, 여액을 다시 2000rpm에서 10분간 원심분리하여 침전된 잔사를 제거하였다. 상층의 여액(약 0.8리터)을 모아 진공회전증발기로 70℃에서 약 100ml가 될 때까지 감압농축한 다음, 에틸아세테이트 100ml로 3회 반복 추출하여 얻은 유기용매층 약 280ml를 진공회전증발기로 50℃에서 점조상태까지 농축하였다. 농축액에 메탄올 150ml를 가하고 다시 농축하여 15ml가 되게 한 다음, 농축액 15ml를 세파덱스 LH-20 컬럼(내경 35mm×길이 550mm, 세파덱스 순중량 200g)의 상부에 주입하고, 물-메탄올(85:15, 용적비)의 용액 4.0리터로 충분히 세척하여, 칼럼 내의 녹황색 및 갈색층이 완전히 용출되었다고 판단되면, 물-메탄올(30:70, 용적비)용액으로 용출하기 시작하여, 칼럼 상층부에 흡착되어 있던 황갈색 내지 황색 띠(band)가 칼럼 선단에 용출되기 시작하면 그 분획을 받아 진공증발건조기로 70℃에서 30ml까지 농축하였다. 농축액은 -20℃ 이하에서 1일 보관후 소량씩 동결건조기에서 완전히 건고시켜 5.5g의 건조분말을 얻는다(EGCG 잔류비 : 58%).

[실시예 5]

녹차 추출물의 제조(V)

녹차엽 건조물, 덕음차 또는 시판 녹차 200g을 70-90℃의 열수 4,000ml로 20분간 추출하고, 추출액은 일차여과하여 불용물을 걸러낸 다음, 여액을 다시 2000rpm에서 10분간 원심분리하여 침전된 잔사를 제거하였다. 상층의 여액(약 3,500ml)을 모아 진공회전증발기로 70℃에서 약 400ml가 될 때까지 감압농축한 다음, 에틸아세테이트 400ml로 3회 반복 추출하여 얻은 유기용매층 약 1,200ml를 진공회전증발기로 50℃에서 50ml까지 농축하였다. 농축액에 이소프로판올 200ml를 가하고 다시 농축하여 20ml가 되게 한 다음, 농축액 20ml를 세파덱스 LH-20 컬럼(내경 35mm×길이 550mm, 세파덱스 순중량 200g)의 상부에 주입하고, 물-이소프로판올(90 : 10, 용적비)의 용액 2.5리터로 충분히 세척하여, 칼럼 내의 녹황색 및 갈색층이 완전히 용출되었다고 판단되면, 물-이소프로판올(50:50, 용적비)용액으로 용출하기 시작하여 칼럼 상층부에 흡착되어 있던 황갈색 내지 황색 띠(band)가 칼럼 선단에 용출되기 시작하면 그 분획을 받아 진공증발건조기로 70℃에서 40ml까지 농축하였다. 농축액은 -20℃ 이하에서 1일 보관후, 소량씩 동결건조기에서 완전히 건고시켜 10.2g의 건조분말을 얻는다(EGCG 잔류비 : 70%).

[실시예 6]

녹차 추출물의 제조(VI)

녹차엽 건조물, 덕음차 또는 시판 녹차 200g을 40-65℃의 물-에탄올(50:50, 용적비) 혼합용액 4.0리터로 60분간 추출하고, 추출액은 일차여과하여 불용물을 걸러낸 다음, 여액을 다시 2000rpm에서 10분간 원심 분리하여 침전된 잔사를 제거하였다. 상층의 여액(약 3.0리터)을 모아 진공회전증발기로 70℃에서 완전히 감압농축한 다음, 농축 건고물을 물-메탄올(80:20, 용적비) 혼합용액 500ml에 가온하면서 녹인 후, 에틸아세테이트 400ml로 3회 반복 추출하여 얻은 유기용매층 약 1,200ml를 진공회전증발기로 50℃에서 50ml까지 농축하였다. 농축액에 디옥산 200ml를 가하고 다시 농축하여 20ml가 되게 한 다음, 농축액 20ml를 세파덱스 LH-20 컬럼(내경 35mm×길이 550mm, 세파덱스 순중량 200g)의 상부에 주입하고, 물-디옥산(85:15, 용적비)의 용액 3,000ml로 충분히 세척하여 칼럼 내의 녹황색 및 갈색층이 완전히 용출되었다고 판단되면, 물-디옥산(40:60, 용적비)용액으로 용출하기 시작하여, 칼럼 상층부에 흡착되어 있던 황갈색 내지 황색 띠(band)가 칼럼 선단에 용출되기 시작하면 그 분획을 받아 진공증발건조기로 70℃에서 50ml까지 농축하였다. 농축액은 -20℃ 이하에서 1일 보관후, 소량씩 동결건조기에서 완전히 건고시켜 7.8g의 건조분말을 얻는다(EGCG 잔류비 : 55%).

상술한 실시예 1~6에서 얻은 건조분말의 혈소판 응집 억제능을 측정하였다. 혈액응고현상은 크게 나누어 혈중 유효성분인 혈소판이 역할을 하는 일차지혈과 유효성분을 제외한 소위 혈장성분이 관여하는 이차지혈로 구분된다. 이중 혈전형성억제 및 혈액응고를 방지하기 위하여는 일차지혈로 구분된다. 이중 혈전형성억제 및 혈액응고를 방지하기 위하여는 일차지혈의 차단제의 개발이 근본적인 치료제로서의 가치가 있다고 할 수 있다.

[실험실시예]

<일차지혈에 대한 효과>

1. 혈소판응집 억제 시험

항혈소판 응집효과는 Aggrecorder II Pa-3220(Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd.)를 사용하여 본(Born)에 의한 탁도 측정법(Turbidimetric method)으로 조사하였다. 조사원리는 혈소판풍부혈장(platelets rich plasma : PRP)의 혈소판 수를 200,000-400,000/㎣ 정도로 조정하고, 여기에 응집 촉진물질(ADP, 에피네프린(epinephrine), 콜라겐(collagen), 리스토세틴(ristocetin))을 넣어 응집시키면서, 응집 때문에 오는 흡광도(OD)의 변화를 관찰하는 것이다.

조사방법은 혈소판 기능이 정상인 건강한 사람으로부터 항 응고제로 3.8% 소디움 시트레이트 튜브에 1:9의 비율로 채혈하였다. PRP를 얻기 위해, 160×g(1,000rpm)에서 10분간 원심분리하고, 혈소판 수는 200,000-400,000/㎣가 되도록 조절하였다. 혈소판결여혈장(paltelets poor plasma : PPP)을 얻기 위해, 2,000×g(3,400rpm)에서 10분 동안 더 원심분리하였다. Aggrecorder II Pa-3220을 이용하여 시험하였는데, 온도는 37℃, 회전수는 1,000rpm으로 고정하고, 혈소판결여혈장으로 보정하였다. 혈소판풍부혈장과 시료를 측정기기로 옮긴 후, 3-5분 정도 미리 방치하고, 혈소판 응집 촉진물질을 가한 후, 10분간 응집과정을 측정하였다.

상술한 혈소판 응집시험 결과, 녹차 추출물은 1mg/ml에서 모든 응집 촉진물질에 의한 혈소판 응집을 강력히 억제하는 작용을 나타내었다. ADP에서는 60%의 억제효과, 에피네프린에서는 96.5%의 억제효과, 콜라겐에서는 35.3%의 억제효과, 리스토세틴에서는 36.5%의 억제효과를 나타내었다. 반면에, 대조약물인 시판의 항혈전제 아스피린(Aspirin)(0.1mM)의 경우에는 ADP에서 13.5%의 억제효과, 에피네프린에서 79.5% 억제효과, 콜라겐에서는 72.6% 억제효과를 나타내었으나, 리스토세틴에서는 전혀 억제효과가 없었다.

제 1 도는 응집촉진제인 ADP와 본 발명의 녹차 추출물을 투여하였을 때의 응집억제효과를 나타내는 그라프이고, 제 2 도는 응집촉진제인 에피네프린과 본 발명의 녹차 추출물을 투여하였을 때의 응집억제효과를 나타내는 그라프이며, 제 3 도는 응집촉진제인 콜라겐과 본 발명의 녹차 추출물을 투여하였을 때의 응집억제효과를 나타내는 그라피이고, 제 4 도는 응집촉진제인 리스토세틴과 본 발명의 녹차 추출물을 투여하였을 때의 응집억제효과를 나타내는 그래프이다. 본 실험의 결과로부터, 본 발명의 녹차 추출물은 탁월한 혈소판 응집억제효과가 있음을 알 수 있었다.

2. 생체내 항혈전 작용의 측정

실험적 혈전의 유도는 디미노(Dimino) 등의 실험방법에 준하여 실시하였다. 이때, 사용하는 마우스는 몸무게 약 20-30g 정도의 숫컷 ICR 마우스이고, 혈전의 유발은 혈소판 응집 촉진물질(에피네프린, 콜라겐)을 마우스의 꼬리정맥에 주사하여 미소혈관내에 급속히 형성되도록 하며, 사용된 응집촉진물질은 15㎍의 콜라겐과 400μM 농도의 에피네프린이 생리식염수 100μl에 함유되도록 조제하고, 마우스 몸무게 20g당 100μl의 용량으로 꼬리정맥에 주사하였다.

녹차 추출물의 항혈전 효과를 알아보기 위하여, 실험시작 2시간 전에 마우스 몸무게 1kg당 100mg과 10mg씩의 시료를 투여하며, 이때 투여 전체 용량은 0.4ml 이하로 하였다. 녹차 추출물의 항혈전효과는 혈소판 응집 촉진물질의 투여로 인하여 발생하는 마우스 뒷다리의 마비나 죽음으로부터 보호된 실험동물의 숫자의 백분율로 계산하며, 여기서 마비는 15분 이상 뒷다리의 기능을 상실하거나 떨림 상태가 지속될 때를 기준으로 하였다.

적당한 혈전을 유발하는 에피네프린과 콜라겐의 농도를 결정한 결과, 15㎍의 콜라겐과 40μM의 에피네프린이 100μl의 생리식염수에 포함되도록 하여 정맥내 주사함으로써, 95%의 혈전을 유발시킬 수 있었다. 혈전 생성 여부는 혈소판 응집 촉진물질을 투여한 후 치사 여부와 뒷다리 마비가 15분 이상 지속된 경우로 판정하였으며, 뒷다리 마비는 끌면서 기어 다니다가 떨림현상이 수반되는 상태를 판정의 기준으로 삼았다.

상술한 항혈전 시험 결과, 마우스 몸무게 Kg당 100mg의 녹차 추출물을 복강내 투여한 경우 66%의 예방 효과를 보였고, 10mg을 복강내 투여한 경우 44%의 예방효과를 보였다. 반면, 대조약물인 아스피린(Aspirin)(100mg/Kg)에서는 45%의 예방효과를 보였다.

제 5 도는 응집촉진제인 에피네프린과 콜라겐을 먼저 투여하고, 본 발명의 녹차 추출물을 투여하였을 때의 항혈전억제효과를 나타내는 그라프이다.

본 실험의 결과로부터, 본 발명의 녹차 추출물은 탁월한 항혈전 효과가 있음이 확인되었으며, 이 효과는 아스피린의 약 1/10의 용량에서 아스피린과 동등한 효과가 있음이 밝혀졌다.

3. 혈액응고 시험

(1) 출혈시간(Bleeding Time)의 측정

몸무게 180-200g의 숫컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 흰쥐에 하루에 한번 10일간 시료를 투여하였다. 휜쥐에 소디움 펜토바르비탈(sodium pentobarbital : 400mg/Kg)을 복강내 투여하여 마취시키고, 꼬리 끝부분에서 5mm 되는 곳을 잘라 꼬리의 5cm 되는 곳까지 37.5℃의 염수(saline)용액에 담구어 지혈될 때까지의 시간을 측정하였다.

실험결과, 약물투여가 없는 대조군에서의 출혈시간은 65.0±12.9초, 대조약물인 아스피린(100mg/kg)에서는 165.1±34.3, 녹차 추출물 투여군에서는 10mg/kg에서 113.2±19.6초, 100mg/kg에서 250.7±117.3초, 300mg/kg에서 509.8±1.6초로서 현저하게 그리고 용량의존적으로 증가되었다. 따라서, 본 발명의 녹차 추출물은 아스피린보다 장시간의 출혈을 나타냄을 알 수 있었다(참조 : 제 6 도). 제 6 도는 본 발명의 녹차 추출물과 대조약물인 아스피린을 투여하였을때의 출혈시간을 나타내는 그라프이다.

(2) 전혈 응고시간(Whole blood clotting time)의 측정

출혈시간을 측정하고 1일 지난 후 흰쥐를 에테르에 마취시키고, 3.13% 소디움시트레이트 용액 0.5ml를 미리 넣은 플라스틱 주사기로 혈액을 심장으로부터 5ml 취하였다. 채취한 혈액은 가만히 혼합한 후 주사기에 모으고, 혈액 1ml를 유리시험관에 넣고 1.7% CaCl₂·2H₂O 200μl를 가하여 실온에서 가만히 흔들어주면서, 혈응괴가 생길 때까지의 시간을 측정하였다.

실험결과, 약물투여가 없는 대조군에서의 전혈응고시간이 109.4±14.0초, 대조약물인 아스피린(100mg/kg)에서는 137.2±19.4인데 반하여, 녹차 추출물 투여군에서는 10mg/kg에서 130.1±20.5초, 100mg/kg에서 140.9±14.2초, 300mg/kg에서 150.6±17.6초로서 용량의존적으로 약간씩 증가하였다(참조 : 제 7 도). 제 7 도는 본 발명의 녹차 추출물과 아스피린을 투여하였을 때의 전혈응고시간을 비교한 그라프이다.

(3) 혈장 응고시간(plasma clotting time)의 측정

상기에서 얻은 혈액 일부를 25,000rpm에서 원심분리하여 혈장을 얻고, 혈장 100μl, 염수 100μl 및 50mM CaCl₂50μl를 유리 시험관에 넣어 37℃에서 가만히 흔들어주면서 덩어리(clot)가 생길 때까지의 시간을 측정하였다.

실험결과, 약물투여가 없는 대조군에서의 혈장응고시간이 146.2±26.5초, 대조약물인 아스피린(100mg/kg)에서는 222.5±40.2, 녹차 추출물 투여군에서는 10mg/kg에서 177.5±37.6초, 100mg/kg에서 219.8±57.9초, 300mg/kg에서 233.1±83.2초로서 용량의존적으로 증가하였다(참조 : 제 8 도). 제 8 도는 본 발명의 녹차 추출물과 아스피린을 투여하였을 때의 혈장응고시간을 나타내는 그라프이다.

4. 혈소판 내 지지과산화 및 효솨 억제작용

a) MDA(malondialdehyde) 생성억제 효과의 측정

혈소판 부유액 1ml를 37℃에서 녹차 추출물의 등장액용액(최종농도 1mg/ml)에 가하고 Ca⁺⁺및 콜라겐을 첨가하였다. TBA 시약 2ml를 가하고 90℃에서 20분간 가온한 후, 실온으로 냉각하여 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 다음, 침강된 혈소판 상부의 적색 용액의 흡광도를 535nm에서 측정하고, MDA-TBA 포합체의 물흡광계수를 1.56×10⁵으로 계산하여 MDA 생성량을 산출하고, 녹차 추출물에 의한 지질과산화 억제활성을 비교하였다.

MDA 생성량은 지질과산화 과정의 제 2차 생성물로서 총지질 과산화의 척도로 사용되고 있다. 녹차 추출물은 포스포리파제 A2 억제자(phospholipase A2 inhibitor)인 프리마퀸(primaquine), 퀴나크린(quinacrine) 그리고 옥시제나제(oxygenase)의 활성을 억제하는 아스피린(Aspirin)과 비교하여 볼 때, 같은 정도의 수준(level)에서 지질과산화에 대한 억제효과를 나타내었다.

b) 아라키돈산 방출활성 측정

혈소판 부유액 1ml를 37℃에서 방치하면서 녹차 추출물(최종농도가 1mg/ml)에 가하고 Ca⁺⁺및 콜라겐을 첨가하였다. 30분 후 막여과기(membrane filter)로 혈소판을 신속히 제거하고, 여액을 pH 3이하의 산성으로 조정한 다음, 2ml의 추출용매(클로로포름 : 메탄올=1:1V/V)로 2회 추출하고, 원심분리하여 하부의 클로로포름층을 다른 시험관에 옮긴 후, 질소기체로 건조시켰다. 이 건조물은 디메틸포름아미드(DMF) 50μl에 녹이고, 12mM 모노단실 카다베린(monodansyl cadaverine)의 DMF 용액 5μl 및 디에틸포스포로시아니데이트(diethyphosphoro cyanidate) 2μl를 가하여 상온에서 15분간 방치하여 아라키돈산을 형광 표지하였다. 형광표지된 아라키돈산은 50% 메탄올: 아세토니트릴의 직선구배 용리에 의하여 역상컬럼에서 용출하며, 여기파장 340nm, 형광파장 520nm에서 검출되었다.

아라키돈산의 양적 동태를 살펴본 결과, 녹차 추출물에 의한 아라키돈산의 변화가 프리마퀸(primaquine) 및 퀴나크린(quinacrine)보다 적은 점으로 보아, 녹차 추출물들의 혈소판 내에서의 작용부위는 포스포리파제(phospholipase) A2보다는 시클로옥시제나제(cycloosygenase) 또는 리폭시제나제(lipoxygenase)를 억제함으로써, 지질과산화 및 혈소판 응집억제 효과를 나타내는 것으로 추정되었다.

6. 고지혈증 치료효과-항과산화작용(in vitro)

쥐(Rat)의 간 마이크로좀(microsome) 분획(1.5mg protein/ml)에 녹차 추출물을 가하고, 시스테인(cystein)(최종 농도 500μM), 황산제일철(최종농도 5μM)을 가하여, 37℃에서 30분간 방치하였다. 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 3ml를 가하고 원심분리하여 상층 2ml를 취한 다음, 0.67% TBA용액을 가하고 끓는 물에서 15분간 반응시키고, 냉각시켜 흡광도를 측정하였다.

7. 생체기능성에 대한 탐색-항고혈압 효과(in vitro) : 안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme : ACE) 억제효과

안지오텐신 전환효소(ACE)는 생체내의 혈압 및 체액, 전해질의 중요한 조절을 담당하는 레닌-안지오텐신(renin-angiotensin)계에 작용하는 효소이다. 본 효소는 레닌(renin)으로부터 산생되는 안지오텐신 I(ANG I)의 C 말단에서 디펩타이드(dipeptide)(His-Leu)를 유리시켜 활성형인 안지오텐신 II(ANG II)로 변환시킨다. 이 효소는 하이퍼텐시브 시스템(hypertensive system)의 ANG II를 산생하는 동시에 하이포텐시브 시스템(hypotensive system)의 브라디키닌(bradykinin)을 불활성화시키기 때문에, 생체의 순환조절에 중요한 역할을 하고 있다. 따라서, 이 효소에 대한 녹차 추출물의 억제효과에 대한 검색으로 혈압상승 억제제로서의 정도를 알 수 있다.

급성 독성 실험

녹차 추출물의 생리식염수 용액을 ICR계 마우스의 정맥내 및 경구적으로 각각 투여하여 72시간 후의 생사판정에 의하여 LD₅₀을 계산하였다. 계산에는 업 앤드 다운(up and down) 방법(1969년 일본 南出堂 발행, 高木, 小澤 공편[藥物學實驗] 제204-205페이지)을 사용하였으며, 그 결과는 다음과 같다.

이상의 실험에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 녹차 추출물은 급성독성이 극히 적음을 알 수 있었다.

본 발명의 녹차 추출물은 환자나 또는 투여할 사람의 나이, 성별, 증상 또는 예방목적에 따라서 체중 Kg당 1.00-2000.00mg을 일일 1회 내지 수회 분복할 수 있다.

본 발명의 녹차 추출물은 통상의 부형제, 결합제, 윤활제, 붕해제, 희석제 등과 같은 보조제와 혼합하여 약학적 제제를 제조할 수 있다.

다음의 제제실시예를 예시한다.

[제제실시예 1] 정제의 제조

녹차 추출물10mg

유당20mg

전분20mg

스테아린산 마그네슘적당량

상기의 성분을 통상의 정제 제조방법에 따라서 50mg의 정제로 타정하여 정제를 제조하였다.

[제제실시예 2] 캅셀제의 제조

녹차 추출물10mg

유당20mg

전분19mg

탈크 1mg

스테아린산 마그네슘적당량

상기의 성분을 통상 캅셀제의 제조방법에 따라서 50mg 용량의 캅셀에 충진하였다.

[제제실시예 3] 액제의 제조

녹차 추출물100mg

이성화당 10g

벌꿀500mg

니코틴산아마이드(약전) 20mg

무수카페인(약전) 30mg

안식향산나트륨 70mg

상기의 성분을 통상의 액제 제조방법에 따라서 제조하고, 100ml 용량의 갈색병에 충진하고 밀전하여 저온 살균처리하였다.

[제제실시예 4] 주사제의 제조

녹차 추출물5mg

멸균정제수적당량

상기의 성분을 통상의 주사제 제조방법에 따라서 제조하고, 2ml의 앰플에 충진하고 밀봉하여 멸균하였다.

[제제실시예 5] 연질캅셀의 제조

1) 충전조성물

녹차 추출물 10mg

폴리에틸렌글리콜230mg

글리세린 13mg

2) 건조한 외피조성물(중량%)

젤라틴52%

글리세린32%

ANIDRISORB 35/7012%

물 5%

상기의 조성물들을 통상의 연질캅셀 제조방법에 따라서 연질캅셀을 제조하였다.

[제제실시예 6] 과립제의 제조

녹차 추출물10mg

유당25mg

상기의 성분을 통상의 압출조립기로 압출시켜서 과립제로 제조하였다.

본 발명의 항혈전 녹차 추출물은 통상의 다른 약효를 가지는 약리물질과 혼합한 조성물로서 사용될 수도 있다. 이러한 조성물들도 또한 본 발명의 범위에 속함은 물론이다.

[발명의 효과]

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 폴리페놀류 25-30%, 에피갈로카테킨 갈레이트 40-70% 및 에피카테킨과 에피갈로카테킨의 혼합물 0-35%를 포함하는 본 발명의 녹차 추출물은 각종 응집 촉진물질에 대하여 위장장해의 부작용을 가지는 아스피린보다 우수한 혈소판응집 억제효과를 나타낼 뿐만 아니라, 생체내 항혈전 효과와 항혈액응고능도 동시에 나타내므로, 항혈전제로 매우 바람직하다. 또한 전기 추출물의 제조시 클로로포름 추출과정을 생략하고, 물과 아세톤, 디옥산, 메탄올 또는 이소프로판올의 혼합용액을 특정 분리용매로 사용한 칼럼 크로마토그라피를 채용함으로써, 본 발명 특유의 조성을 갖는 녹차 추출물이 제조된다.

Claims

녹차엽 건조물을 물 또는 물과 저급알콜의 혼합물로 열수추출하고, 여과 또는 원심분리하여 비극성 물질을 제거한 다음, 에틸 아세테이트로 반복 추출하여 얻은 유기용매층을, 물과 아세톤, 디옥산, 메탄올 또는 이소프로판올의 혼합용액을 분리용매로 사용하여 칼럼크로마토그래피하여 얻은 활성성분을 동결건조시키는 것을 특징으로 하는, 폴리페놀류 25 내지 30%, 에피갈로카테킨 갈레이트 40 내지 70% 및 에피카테킨과 에피갈로카테킨의 혼합물 0 내지 35%로 구성된 녹차 추출물의 제조방법.
항혈전제에 유효성분으로 함유되는 녹차 추출물에 있어서, 전기 녹차 추출물의 조성이 폴리페놀류 25 내지 30%, 에피갈로카테킨 갈레이트 40 내지 70% 및 에피카테킨과 에피갈로카테킨의 혼합물 0 내지 35%로 구성되는 것을 특징으로 하는 녹차 추출물.