DE4432549A1

DE4432549A1 - Pharmazeutische Erzeugnisse mit Antithromboseaktivität sowie Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE4432549A1
Application number: DE4432549A
Authority: DE
Original assignee: HUR KYE SUNG
Current assignee: HUR KYE SUNG
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1994-09-13
Publication date: 1995-03-16
Also published as: JPH07258103A; CN1107355A; FR2709965A1; KR950007862A; CN1087613C; KR970011555B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Er zeugnisse gemäß Anspruch 1 mit antithrombotischen, Thrombo genese-hemmenden und Thromboseursache-hemmenden Aktivitä ten.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Her stellung dieser pharmazeutischen Erzeugnisse gemäß Anspruch 9 sowie ein allgemeines Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus grünem Tee gemäß Anspruch 11.

Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Erzeugnisse mit antithrombotischen, Throm bogenese-hemmenden und Thromboseursache-hemmenden Aktivitä ten, welche pharmakologisch annehmbare gepulverte Extrakte aus Blättern von grünem Tee als einen Wirkstoff enthalten, welcher neu und stabil ist, und eine hervorragende Aktivi tät bei der Thromboseursachenhemmung aufweist und herge stellt wird, indem ein verbessertes progressives Verfahren verwendet wird (hiernach werden antithrombotisch, Thrombo genese-hemmend und Thromboseursache-hemmend als "antithrom botisch" bezeichnet).

Grüner Tee ist im Fernen Osten, ausgehend von China und Japan, als ein Luxusartikel mit medizinischen Werten aner kannt worden.

Die Blätter von grünem Tee enthalten Gerbstoffe aus grünem Tee (Tannine), Koffein, Ascorbinsäure, Tocopherole, Flavonole, Polysaccharide und β-Carotin usw. als chemische Bestandteile. Unter diesen sind Koffein, Ascorbinsäure und die Tannine aus grünem Tee die Hauptbestandteile. Koffein und Ascorbinsäure sind in vielen anderer Kräutertees ent halten, jedoch stellen die Tannine aus grünem Tee, welche durch die Catechine verkörpert werden, einen außergewöhnli chen Bestandteil dar, welcher nur in grünem Tee gefunden wird. Vier Hauptcatechine in grünem Tee sind Epicatechin, Epicatechingallat, Epigallocatechin und Epigallikatechin gallat. Andere anorganische Substanzen, wie zum Beispiel Fluor, Zink, Calcium und Magnesium sind ebenfalls enthal ten.

Es war bekannt, daß Catechine aus grünem Tee verschie dene Wirkungen zeigen, unter anderem als Hauptwirkung die Hemmung der Lipidhyperoxidation und zusätzlich die Hemmung der Reaktion von aktivem Sauerstoff, von welcher angenommen wird, daß sie viele Arten von Krankheiten verursacht, die Hemmung der Cholesterolreabsorption, anticarcinogene Akti vität, antivirale-antibakterielle Aktivität, antikariöse Aktivität und desodorierende Aktivität usw. In den frühen 90er Jahren wurde entdeckt und berichtet, daß Epigalloca techingallat, eines der Catechine, die Entstehung von Car cinogenen und die Wirkung von carcinogenen Promotoren unterdrückt. Daher wurde ausgehend von diesen ermutigenden Ergebnissen erwartet, daß aus Catechinen aus grünem Tee Antikrebsmedikamente entwickelt würden.

Die große Menge an Untersuchungen, die durch die gegen wärtigen Erfinder durchgeführt wurden, und sich auf die pharmakologischen Wirkungen von Bestandteilen aus grünem Tee bezogen, führten zu dem Ergebnis, daß Bestandteile aus grünem Tee eine überragende antithrombotische Aktivität be sitzen und dies führte zu der vorliegenden Erfindung.

Daher ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, wei tere pharmazeutische Erzeugnisse mit antithrombotischer Ak tivität zur Verfügung zu stellen.

Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung der oben erwähnten Erzeug nisse sowie ein allgemeines Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus grünem Tee zur Verfügung zu stellen.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt durch ein pharmazeuti sches Erzeugnis gemäß Anspruch 1. Verfahrenstechnisch er folgt die Lösung der Aufgabe durch ein Verfahren gemäß An spruch 9 sowie durch ein Verfahren gemäß Anspruch 11.

Das Trennverfahren von Catechinen aus grünem Tee kann in drei Schritte unterteilt werden: 1. Extraktionsverfah ren, 2. Eliminationsverfahren und 3. Reinigungsverfahren.

Das bestehende Extraktionsverfahren wird mit erwärmtem Wasser, gekühltem Wasser, Methanol, Ethanol oder einer ge eigneten Mischung daraus durchgeführt. In dem Verfahren zur Eliminierung von anderen Bestandteilen außer den Wirkbe standteilen, werden hochpolare Lösungsmittel, wie z. B. Chloroform, Ethylacetat oder Diethylether, welches organi sche Lösungsmittel sind, die sich nicht mit Wasser mischen, verwendet, um die Eliminierungswirkung zu maximieren. Zur endgültigen Reinigung wird ein Verteilungsextraktionsver fahren verwendet, dessen Hauptwirkungsweise auf der unter schiedlichen Polarität des organischen Lösungsmittels be ruht. Heutzutage werden die Verfahren der Säulenchromato graphie und Hochgeschwindigkeitsflüssigchromatographie für das Reinigungsverfahren verwendet. Das Reinigungsverfahren durch die Verteilungsextraktionsmethode wird von einigen Problemen begleitet, wie z. B. Zeitverzögerung für Aufbau, hohe Unterhaltskosten und Gefahr bei der Handhabung von or ganischen Lösungsmitteln wie Chloroform, Methylisobutylke ton usw. Bei dem chromatographischen Verfahren werden ver breitet Sephadex oder Polymere für das Verfahren benutzt, aber dieses Reinigungsverfahren benötigt weitere Verbesse rungen, dahingehend, daß seine Extraktionsbedingungen kom plex und zeitaufwendig sind und viel Arbeitskraft benöti gen. Auf der anderen Seite zeigt die Reinigungsmethode durch Hochgeschwindigkeitsflüssigchromatographie eine zeitsparende Wirkung und eine stärkere Reinigungseffizienz, jedoch sind das System und das Elutionslösungsmittel teuer, und es ist möglich, daß die Trennsäule leicht reißt.

Um die obigen Probleme zu lösen, haben die gegenwärti gen Erfinder eine breite Forschung mit verschiedenen Metho den durchgeführt. Als Ergebnis davon waren die gegenwärti gen Erfinder in der Lage, den Rückstand des hydrothermalen Extraktes durch Zentrifugation insgesamt abzutrennen, und durch Verwendung einer Sephadex LH-20 Säule zur Chromato graphie und einem Lösungsmittel zur vereinfachten Trennung, sowohl Terpenoide als auch Farbbestandteile, wie auch was serlösliches Koffein, freie Aminosäuren, und Saccharide durch einmaliges Spülen mit einer 15%igen Lösungsmischung aus Wasser-Aceton oder Dioxan zu reinigen. Daher muß eine zusätzliche Koffeineliminierung nach dem etablierten Ver fahren in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht durchgeführt werden, und weiterhin konnte das Hinzukommen von Verunreinigungen, welche aus dem organischen Lösungs mittel stammten oder jenen, die in dem Endprodukt gefunden wurden, durch die Verwendung von Chloroform, Methyliso butylketon usw. wirklich verhindert werden. Als Ergebnis wird nur der gelbrote Anteil auf die obere Schicht der Chromatographiesäule aufgebracht und kann leicht mit dem bloßen Auge beobachtet werden. Auf der anderen Seite können aktive Bestandteile aus dem Rest des gelbroten Anteils in einer maximalen Ausbeute erhalten werden, indem gleichzei tig mit einer 60%igen Lösungsmittelmischung aus Wasser-Ace ton oder Dioxan eluiert wird. Das Verfahren der vorliegen den Erfindung ist genauer als die etablierten Verfahren. Auf der Grundlage dieser Funde wurde die vorliegende Erfin dung durch wiederholte breite Forschung vervollständigt.

Im ersten Schritt der Verfahren der vorliegenden Erfin dung wurde grüner Tee mit erwärmtem Wasser extrahiert. Bei dem Konzentrierungsverfahren wurde sichergestellt, daß im Hinblick auf die antioxidierenden Wirkungen der Wirkbe standteile ca. 1/4 an n-Butanol zu dem Extrakt zugegeben wurde. Während des Konzentrierungsverfahrens wurde die Ka pazität von n-Butanol zu jeder Zeit während der Extraktion aufrecht erhalten, um den Extrakt so daran zu hindern, von der Luft oxidiert zu werden, indem er an die Oberfläche exponiert wird. In der Zwischenzeit wurde ein Konzentrie rungsvorgang der zuletzt hergestellten Wirkbestandteile durch Gefriertrocknung durchgeführt. Als Ergebnis wurde Wasser vollständig eliminiert, wobei gleichzeitig das Zusammensetzungsverhältnis zwischen Konzentrat und Wirkbe standteilen nach dem Gefriertrocknen kaum verändert war.

Das getrocknete Pulver der Wirkbestandteile war gelb braun, sehr löslich in Wasser und über sechs Monate stabil, da es nicht hygroskopisch war. Daher konnte das getrocknete Pulver leicht zu pharmazeutischen Erzeugnissen verarbeitet werden.

Als ein Ergebnis von wiederholter Prüfung des oben er wähnten Verfahrens, enthielt jede Charge ein konstantes Zu sammensetzungsverhältnis der Wirkbestandteile.

Nach Klassifizierung der Zusammensetzung der aktiven Fraktion war das Zusammensetzungsverhältnis wie folgt: 30% Polyphenole, 60% einer Mischung aus Epigallicatechingallat und Epicatechin und die kleine Menge von 6% Epigalloca techin.

Das allgemeine Extraktionsverfahren von Extrakten aus grünem Tee in der vorliegenden Erfindung wird nun detail lierter in Bezug auf jede der folgenden Methoden beschrie ben werden.

Extraktion

Im ersten Schritt werden getrocknete grüne Teeblätter oder gerösteter Tee als Ausgangsmaterial zehn Minuten lang mit erwärmten Wasser in dem Bereich von 70-90°C extra hiert. Vorzugsweise wird die Extraktion ohne Kochen unter Rühren beendet. Unlösliche Materialien aus dem Extrakt wer den mit einem gut bekannten Verfahren wie Filtration unter erhöhtem Druck, Vakuumfiltration oder Filtration durch Zen trifugation behandelt.

Erwärmtes Wasser für die Extraktion kann gewöhnlich in einer Menge von 5 bis 100 mal des Gewichtes an grünem Tee eingesetzt werden, während 10 bis 30 mal des Gewichts an grünem Tee die besten Ergebnisse erzielen. Der Anteil von Extraktionslösungsmittel in erwärmtem Wasser, welcher ver wendet werden könnte, liegt bei Mischen in alkoholischem Lösungsmittel in dem Bereich von 5-50%. Obwohl die Ex traktionsdauer von der Temperatur abhängt, beträgt sie nor malerweise von 30 Sekunden bis zu einer Stunde, oder bevor zugt von 5 Minuten bis 20 Minuten.

Konzentrierung unter vermindertem Druck

Wenn erwärmtes Wasser als das Extraktionslösungsmittel benutzt wurde, wurden 10-50% (v/v) n-Butanol, bevorzugt 20%, zu dem erhaltenen Extrakt zugegeben und dieser Zustand wurde beibehalten, bis der Konzentrierungsschritt unter vermindertem Druck beendet war, um ein Kochen des Extraktes zu verhindern, und einen direkten Kontakt der Wirkbestand teile in dem Extrakt mit Luft durch das an der Oberfläche des Extraktes vorliegende n-Butanol zu blockieren, mit dem Ziel, eine Änderung der Zusammensetzung der Wirkbestandtei le zu verhindern.

Die Konzentrierung wurde mit Erwärmen unter verminder tem Druck in dem Bereich von ca. 10-70 mmHg, z. B. bei un gefähr von 50°C bis 70°C durchgeführt, um ein viskoses Ex trakt (mit einem Gehalt an Wasser von ca. 10% bis 30% (w/w)) zu erzeugen.

Die Zeitdauer für die Konzentrierung bei vermindertem Druck hängt von den Bedingungen des verminderten Drucks ab, aber es dauert von ca. 30 Minuten bis zu 2 Stunden. Bei dem Verfahren der Konzentrierung unter vermindertem Druck soll te die Temperatur nicht über 90°C liegen, um einen Verlust oder eine Zerstörung der Wirkbestandteile in dem Extrakt zu verhindern.

Gefriertrocknung

Die gereinigte Flüssigkeit von der Säule wird durch ei ne Konzentrierung unter vermindertem Druck bei Raumtempera tur ohne Erwärmen konzentriert und wird schnell eingefroren und gelagert. Gefriertrocknung kann Sublimate und restli ches Wasser vollständig eliminieren, indem die Probe bei extrem niedrigen Temperaturen unter Verwendung eines unter halb von -100°C kühlenden Mittels unter Vakuumbedingungen aufbewahrt wird. Die Zeitdauer zum Trocknen hängt von der Menge der Probe, der Oberfläche, der Temperatur des Kühl mittels und der Kapazität der Vakuumpumpe ab, aber voll ständig getrocknetes Material kann innerhalb von 12 bis 24 Stunden erhalten werden.

Getrocknetes Pulver, welches durch das obige Verfahren erhalten wurde, enthält Epigallocatechingallat (EGCG), ei nen der Wirkbestandteile von grünen Teeblättern, darge stellt durch die folgende Formel:

in dem Verhältnis von ca. 50-70% (w/w) in dem Ex trakt.

Da das hier erhaltene trockene Pulver nicht hygrosko pisch ist, und ein geringes spezifisches Volumen hat, ist es möglich, pharmazeutische Erzeugnisse in Form von Pulver, Granulat, feinem Granulat oder Tabletten durch gut bekannte Verfahren herzustellen.

Außerdem ist das erhaltene trockene Pulver wenig giftig und kann durch orale Verabreichung appliziert werden. Das getrocknete Pulver kann zu pharmazeutischen Erzeugnissen, wie z. B. Kapsel, Pulver, Granulat, Mikrogranulat, Weichkap sel und Flüssigkeit, in Verbindung mit pharmazeutisch annehmbaren Vehikeln (z. B. Stärke, Lactose, Calciumcarbo nat, Calciumphosphat usw.), Bindemitteln (z. B. Stärke, Gummi arabicum, Carboxymethylcellulose, Hydroxymethylcellu lose, kristalline Cellulose usw.), Gleitmitteln (z. B. Magnesiumstearat, Talkum usw.), Trennmitteln (z. B. Carboxy methylcellulosecalcium, Talkum, synthetisches Aluminiumsi likat usw.), Verdünnungsmitteln (z. B. Wasser, Pflanzenöl usw.) verarbeitet werden.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfin dung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausfüh rungsbeispielen sowie anhand der Zeichnung.

Es zeigen:

Fig. 1-4 Diagramme, welche die antithrombotischen Wir kungen des antithrombotischen Mittels der vor liegenden Erfindung auf die Agglutination, wel che durch ADP, Adrenalin (Epinephrin), Collagen bzw. Ristocetin als Agglutinationsauslöser induziert wird, vergleichen,

Fig. 5 ein Diagramm, welches die antithrombotischen Wirkungen des antithrombotischen Mittels der vorliegenden Erfindung auf die Agglutination zeigt, wenn Adrenalin und Collagen zusammen da mit verabreicht wurden,

Fig. 6 ein Diagramm, welches die Blutungszeiten zeigt, wenn das antithrombotische Mittel der vorlie genden Erfindung und Aspirin als eine Kontrolle verabreicht wurden,

Fig. 7 ein Diagramm, welches die gesamten Blutgerin nungszeiten zeigt, wenn das antithrombotische Mittel der vorliegenden Erfindung und Aspirin als eine Kontrolle verabreicht wurden, und

Fig. 8 ein Diagramm, welches die Plasmagerinnungszei ten zeigt, wenn das antithrombotische Mittel der vorliegenden Erfindung und Aspirin als eine Kontrolle verabreicht wurden.

Die folgenden Beispiele definieren nicht die vorliegen de Erfindung, erklären diese aber in größerem Detail.

Beispiel 1

200 g getrocknete grüne Teeblätter, gerösteter Tee oder grüner Instanttee wurden von 70°C-90°C mit 4000 ml er wärmtem Wasser 20 min lang extrahiert. Der erhaltene Ex trakt wurde durch Filterpapier filtriert, um die unlösli chen Bestandteile davon abzutrennen. Es wurde dann wieder durch Zentrifugation bei 2000 rpm 10 min lang abgeschieden.

Das Filtrat (ca. 3500 ml) wurde gesammelt und unter vermindertem Druck bei 70°C mit einem Vakuumrotationsver dampfer konzentriert, um 400 ml Extrakt zu erhalten. Die 400 ml Extrakt wurden in 400 ml Chloroform gelöst, um die nichtpolaren Bestandteile vollständig zu entfernen. Der oben erwähnte Extraktions-Entfernungsschritt wurde mehr als dreimal wiederholt. Die wäßrige Phase wurde mit 400 ml Ethylacetat dreimal extrahiert, um eine organische Lösungs mittelschicht von ca. 1200 ml zu erhalten und dann wurde das erhaltene Material bei 50°C mit einem Vakuumrotations verdampfer vollständig auf 50 ml konzentriert. 200 ml Ace ton oder Dioxan wurden zu dem Konzentrat zugegeben und es wurde wieder auf 20 ml konzentriert. 20 ml des Konzentrats wurden auf eine Sephadex LH-20 Säule (Innendurchmesser 35 mm, Länge 550 mm, Sephadex Nettogewicht 200 g) aufgetragen. Zuerst wurde mit 3000 ml Wasser-Aceton oder Wasser-Dioxan (84 : 15, v/v) gespült bis die gelbgrüne oder braungefärbte Phase vollständig eluiert ist, und dann wird eine Elution mit Wasser-Aceton oder Wasser-Dioxan-Lösung (40 : 60, v/v) begonnen. Wenn das gelbbraune oder gelbe Band, welches auf der oberen Schicht der Säule absorbiert war, von dem oberen Ende der Säule zu eluieren beginnt, werden die Fraktionen gesammelt und bei 70°C mit einem Vakuumverdampfungstrockner auf 50 ml konzentriert. Das Konzentrat wird über Nacht bei unter -20°C gelagert und mit einem Gefriertrockner getrock net, um 8,6 g an getrocknetem Pulver (Rückstandsanteil von EGCG : 70%) zu erhalten.

Der Rückstandsanteil von EGCG in getrocknetem Pulver kann durch die folgende Gleichung berechnet werden:

Anteil von EGCG (%) = Peakfläche mit EGCG/Gesamtpeak fläche×100

5 mg des getrockneten Pulvers, welches durch die obigen Verfahren gewonnen wurde, wird in 5 mg Methanol gelöst und 5 µl der resultierenden Lösung werden in eine Hochgeschwin digkeitsflüssigchromatographie eingespritzt, um den Gehalt an EGCG zu messen.

Bedingungen für die Messung durch Hochgeschwindigkeits flüssigchromatographie:
Gerät: Hochgeschwindigkeitsflüssigchromatograph (P- 6300, Hitachi, Japan)
Elutionsmittel: Lösungsmittelmischung aus Acetonitril- Ethylacetat-0,05% Phosphorsäure (12 : 2 : 86, v/v/v)
Säule: Cosmosil 5C18 (4,6 mm Innendurchmesser×150 mm Länge) (Nakalei Tesque Co., Japan)
Säulentemperatur: 40°C
Wellenlänge: 280 nm

Unter den obigen Bedingungen beträgt die Rückhaltezeit von EGCG 6,9 min. Als das Ergebnis der obigen Messung be trägt der Rückstandsanteil von EGCG 70%. Die Rückstandsan teile von EGCG in getrocknetem Pulver, welche in den Bei spielen 2 bis 6 erhalten wurden, werden mit demselben Ver fahren wie oben beschrieben gemessen.

Beispiel 2

1,5 kg getrocknete grüne Teeblätter, gerösteter grüner Tee oder grüner Instanttee werden bei 70°C 20 min lang mit 20 l einer Lösungsmischung aus Wasser-Ethanol (90:10, v/v) extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird durch Papier filter filtriert und die unlöslichen Bestandteile werden abgetrennt. Das Filtrat (ca. 19,0 l) wird gesammelt und un ter vermindertem Druck bei 70°C mit einem Vakuumrotations verdampfer konzentriert, um ein viskoses Extrakt zu erhal ten. Das viskose Extrakt wird in 2,0 l heißem Wasser ge löst, diese werden zu 500 ml Portionen aliquotiert und mit 500 ml einer Lösungsmittelmischung aus Chloroform-n-Hexan (80 : 20, v/v) extrahiert, um nichtpolare Bestandteile vollständig zu entfernen. Der obige Extraktions-Entfer nungsschritt wird mehr als dreimal wiederholt. Die wäßrige Schicht wird mit 500 ml Ethylacetat dreimal extrahiert, um eine organische Schicht von ca. 1,5 l zu erhalten, und vollständig bei 50°C mit einem Vakuumrotationsverdampfer getrocknet. 500 ml Aceton werden zu dem getrockneten Mate rial hinzugegeben und es wird auf 50 ml konzentriert. 50 ml des Konzentrats werden auf das obere Ende einer Sephadex LH-20 Säule (Innendurchmesser 70 mm×Länge 500 mm, Sepha dex Nettogewicht 400 g) aufgetragen. Nach Entfernen des löslichen Materials mit 4,0 l Wasser, wird zuerst mit 3,0 l Wasser-Aceton-Lösung (70 : 30, v/v) gespült, bis die gelb grüne oder braungefärbte Phase vollständig eluiert ist, und dann wird begonnen, mit Wasser-Aceton-Lösung (40 : 60, v/v) zu eluieren. Wenn das gelbbraune oder gelbe Band, welches an der oberen Schicht der Säule absorbiert war, beginnt von dem oberen Ende der Säule zu eluieren, werden die Fraktio nen gesammelt und bei 70°C mit einem Vakuumverdampfungs trockner auf 100 ml konzentriert. Das Konzentrat wird über Nacht bei unter -20°C gelagert und mit einem Gefriertrock ner getrocknet, um 43,8 g getrocknetes Pulver (Rückstands anteil von EGCG : 54%) zu erhalten.

Beispiel 3

200 g getrocknete Blätter von grünem Tee, gerösteter grüner Tee oder grüner Instanttee werden 20 min lang bei 70°C bis 90°C mit 4 l heißem Wasser extrahiert. Das erhal tene Extrakt wird durch Filterpapier filtriert und von den unlöslichen Bestandteilen abgetrennt, und das Filtrat wird 10 min lang bei 2000 rpm zentrifugiert, um die ausgefällten Rückstände zu entfernen. Das obere Filtrat (ca. 3,5 l) wird gesammelt und unter vermindertem Druck bei 70°C mit einem Vakuumrotationsverdampfer konzentriert, um 400 ml Extrakt zu erhalten. Die wäßrige Phase wird mit 400 ml Ethylacetat dreimal extrahiert, um eine organische Phase von ca. 1,2 l zu erhalten und die organische Phase wird bei 50°C mit ei nem Vakuumrotationsverdampfer vollständig bis auf 50 ml ge trocknet. 200 ml Isopropanol werden zu dem getrockneten Ma terial zugegeben und auf 20 ml konzentriert. 20 ml des Kon zentrates werden auf eine Sephadex LH-20 Säule (Innendurchmesser 35 mm×Länge 550 mm, Sephadex Nettoge wicht 200 g) aufgetragen. Zuerst wird mit 3,0 l Wasser-Ace ton-Lösung (85 : 15, v/v) Lösung gespült, bis die gelbgrüne oder braungefärbte Phase vollständig eluiert ist, und dann wird begonnen, mit 5,0 l Wasser-Aceton-Lösung (55 : 45, v/v) zu eluieren. Wenn das gelbbraune oder gelbe Band, wel ches an die obere Schicht der Säule absorbiert war, vom oberen Ende der Säule zu eluieren beginnt, werden die Frak tionen gesammelt und bei 70°C mit einem Vakuumverdampfungs trockner auf 50 ml konzentriert. Die Sephadex LH-20 Säule kann wiederverwendet werden, indem die restlichen nichtpo laren Materialien auf der Säule mit 2,0 l Aceton eluiert werden. Das Konzentrat wird über Nacht bei unter -20°C gelagert und mit einem Gefriertrockner getrocknet, um 14,7 g getrocknetes Pulver (Rückstandsanteil von EGCG: 62%) zu erhalten.

Beispiel 4

100 g getrocknete Blätter von grünem Tee, gerösteter grüner Tee, oder grüner Instanttee werden 10 min lang bei 70°C bis 90°C mit 1,0 l heißem Wasser extrahiert. Der er haltene Extrakt wird durch Filterpapier filtriert und die unlöslichen Bestandteile werden abgetrennt. Der Nieder schlag wird durch 10 min Zentrifugation bei 2000 rpm ent fernt. Das obere Filtrat (ca. 800 ml) wird gesammelt und unter vermindertem Druck bei 70°C mit einem Vakuumrotati onsverdampfer konzentriert, um 100 ml Extrakt zu erhalten. Die wäßrige Phase wird mit 100 ml Ethylacetat dreimal extrahiert, um eine organische Phase von ca. 280 ml zu er halten, und bei 50°C mit einem Vakuumrotationsverdampfer vollständig getrocknet, um in einen viskosen Zustand über führt zu werden. 150 ml Methanol werden zu dem getrockneten Material zugegeben und auf 15 ml konzentriert. 15 ml Kon zentrat werden auf das obere Ende einer Sephadex LH-20 Säule (Innendurchmesser 35 mm×Länge 550 mm, Sephadex Net togewicht 200 g) aufgetragen. Zuerst wird mit 4,0 l Wasser- Aceton-Lösung (85 : 15, v/v) Lösung gespült, bis die gelb grüne oder braungefärbte Phase vollständig eluiert ist, und dann wird begonnen, mit Wasser-Aceton-Lösung (30 : 70, v/v) zu eluieren. Wenn das gelbbraune oder gelbe Band, welches an der oberen Schicht der Säule absorbiert ist, von dem oberen Ende der Säule zu eluieren beginnt, werden die Frak tionen gesammelt und bei 70°C mit einem Vakuumverdamp fungstrockner auf 30 ml konzentriert. Das Konzentrat wird über Nacht bei unter -20°C gelagert und mit einem Gefrier trockner getrocknet, um 5,5 g getrocknetes Pulver (Rück standsanteil von EGCG: 58%) zu erhalten.

Beispiel 5

200 g getrocknete Blätter von grünem Tee, gerösteter grüner Tee, oder grüner Instanttee werden bei 70°C bis 90°C 20 min lang mit 4 l heißem Wasser extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird durch Filterpapier filtriert und die unlösli chen Bestandteile werden abgetrennt. Der Niederschlag wird durch 10 min Zentrifugation bei 2000 rpm entfernt. Das Fil trat (ca. 3,5 l) der oberen Schicht wird gesammelt und un ter vermindertem Druck bei 70°C mit einem Vakuumrotations verdampfer konzentriert, um 400 ml Konzentrat zu erhalten. Die wäßrige Phase wird mit 400 ml Ethylacetat dreimal ex trahiert, um eine organische Phase von ca. 1,2 l zu erhal ten, und bei 50°C mit einem Vakuumrotationsverdampfer voll ständig getrocknet, um 50 ml Konzentrat zu erhalten. 200 ml Methanol werden zu dem getrockneten Material zugegeben und es wird auf 20 ml konzentriert. 20 ml Konzentrat werden auf das obere Ende einer Sephadex LH-20 Säule (Innendurchmesser 35 mm×Länge 550 mm, Sephadex Nettogewicht 200 g) aufge tragen. Zuerst wird mit 2,5 l Wasser-Isopropanol-Lösung (90 : 10, v/v) gespült, bis die gelbgrüne oder braungefärbte Phase vollständig eluiert ist, und dann wird begonnen, mit 5,0 l Wasser-Isopropanol-Lösung (50 : 50, v/v) zu eluieren. Wenn das gelbbraune oder gelbe Band, welches auf der oberen Schicht der Säule absorbiert war, von dem oberen Ende der Säule zu eluieren beginnt, werden die Fraktionen gesammelt und bei 70°C mit einem Vakuumverdampfungstrockner auf 40 ml konzentriert. Das Konzentrat wird über Nacht bei unter -20°C gelagert und mit einem Gefriertrockner getrocknet, um 10,2 g getrocknetes Pulver (Rückstandsanteil von EGCG: 70%) zu erhalten.

Beispiel 6

200 g getrocknete Blätter von grünem Tee, gerösteter grüner Tee, oder grüner Instanttee werden bei 40°C bis 65°C 60 min lang mit 4,0 l einer Wasser-Methanol-Lösung (5 : 50, v/v) extrahiert. Das erhaltene Extrakt wird durch Filterpa pier filtriert und von den unlöslichen Bestandteilen abge trennt. Der Niederschlag wird durch 10 min Zentrifugation bei 2000 rpm abgetrennt. Das Filtrat (ca. 3000 ml) wird ge sammelt und unter vermindertem Druck bei 70°C mit einem Va kuumrotationsverdampfer konzentriert, um einen vollständig getrockneten Extrakt zu erhalten. Das getrocknete Material wird in 500 ml Wasser-Methanol-Lösung (80 : 20, v/v) ge löst, mit 400 ml Ethylacetat dreimal extrahiert, um eine organische Phase von ca. 1200 ml zu erhalten, und bei 50°C mit einem Vakuumrotationsverdampfer konzentriert, um ein Konzentrat von 50 ml zu erhalten. 200 ml Dioxan werden zu dem Konzentrat zugegeben und es wird wieder auf 20 ml kon zentriert. 20 ml Konzentrat werden auf das obere Ende einer Sephadex LH-20 Säule (Innendurchmesser 35 mm×Länge 550 mm, Sephadex Nettogewicht 200 g) aufgetragen. Als erstes wird mit 3,0 l einer Wasser-Dioxan-Lösung (85 : 15, v/v) gespült, bis die gelbgrüne oder braungefärbte Phase voll ständig eluiert ist, und dann wird begonnen, mit einer Was ser-Dioxan-Lösung (40 : 60, v/v) zu eluieren. Wenn das gelbbraune oder gelbe Band, welches an der oberen Schicht der Säule absorbiert war, von dem oberen Ende der Säule zu eluieren beginnt, werden die Fraktionen gesammelt und bei 70°C mit einem Vakuumverdampfungstrockner auf 50 ml konzen triert. Das Konzentrat wird über Nacht bei unter -20°C ge lagert und mit einem Gefriertrockner getrocknet, um 7,8 g getrocknetes Pulver (Rückstandsanteil von EGCG: 55%) zu er halten.

Die Plättchen-Antiagglutinationsaktivität wird mit der oben erhaltenen Fraktion gemessen. Die Blutgerinnung wird allgemein in primäre Hämostase durch die Wirkung von Plättchen, Wirkbestandteilen im Blut, und sekundäre Hämo stase durch Einbeziehung von Plasma, außer Plättchen, unterteilt. Unter anderem ist es nützlich, als ein grundle gendes Heilverfahren ein Inhibitionsmittel der primären Hä mostase zu entwickeln, um eine Thrombogenese oder Blutge rinnung zu verhindern.

Gerösteter Tee in der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf halbverarbeitete Waren, welche vorgefertigt sind, bevor sie durch feines Schneiden der getrockneten Blätter des grünen Tees zu dem endgültigen grünen Tee verarbeitet werden.

Versuchsbeispiel Auswirkungen auf die primäre Hämostase 1. Versuch zur Inhibition der Plättchenagglutination

Anti-agglutinative Wirkungen auf Plättchen werden durch das Trübungsmeßverfahren von Born, unter Verwendung eines Aggrecorder II PA-3220 (Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd.) ge messen. Das Prinzip des Verfahrens ist es, daß ein Plasma, welches reich an Plättchen ist (PRP), hergestellt wird, bei welchem die Plättchenmenge in dem Bereich von 200 000- 400 000/mm³ eingestellt ist, Agglutinationsauslöser (ADP, Adrenalin, Collagen, Ristocetin) dort hinzugegeben werden, und die Änderung der optischen Dichte aufgrund der Agglu tination aufgezeichnet wird. Blut wird von einer gesunden Person, welche eine normale Plättchenkapazität hat, abge nommen und in Röhrchen mit 3,8% Natriumcitrat als Antige rinnungsmittel, in einem Verhältnis von 1 : 9, verteilt. Eine Zentrifugation wird 10 min lang bei 160 G (1000 rpm) durchgeführt, um PRP zu erhalten, bei welchem die Plättchenmenge in dem Bereich von 200 000-400 000/mm³ eingestellt ist. Eine erneute Zentrifugation wird 10 min lang bei 2000 G (3400 rpm) durchgeführt, um plättchenarmes Plasma (PPP) zu erhalten. Ein Aggrecorder II PA-3220 wird für die Messung verwendet (37°C, 1000 rpm, Korrektur mit plättchenarmem Plasma). Nachdem sie in das Meßgerät trans feriert wurden, wurden das an Plättchen reiche Plasma und die Versuchsprobe wie sie waren von 3 bis 5 min lang so be lassen, und dann wurden Auslöser der Plättchenagglutination dort hinzugegeben und der Agglutinationsprozeß wurde 10 min lang gemessen. ADP, Adrenalin, Collagen und Ristocetin wur den als Auslöser der Plättchenagglutination verwendet.

Als ein Ergebnis des obigen Versuchs zeigt der Extrakt aus grünem Tee seine starke Unterbindung der Plättchen agglutination bei Auslösern in der Konzentration von 1 mg/ml. Die Auswirkungen der Antiagglutination zeigten sich in Inhibitionen von 60% mit ADP, 96,5% mit Adrenalin, 35,5% mit Collagen und 36,5% mit Ristocetin. Auf der anderen Seite zeigte Aspirin (0,1 mM) als Kontrolle 13,5% mit ADP, 79,5% mit Adrenalin, 72,6% mit Collagen und keine mit Ristocetin.

Fig. 1 zeigt ein Diagramm von Antiagglinationswirkun gen, wenn ADP als Agglutinationsauslöser und das antithrom botische Mittel der vorliegenden Erfindung injiziert wer den.

Fig. 2 zeigt ein Diagramm von Antiagglutinationswirkun gen, wenn Adrenalin als Agglutinationsauslöser und das an tithrombotische Mittel der vorliegenden Erfindung injiziert werden.

Fig. 3 zeigt ein Diagramm von Antiagglutinationswirkun gen, wenn Collagen als Agglutinationsauslöser und das an tithrombotische Mittel der vorliegenden Erfindung injiziert werden.

Fig. 4 zeigt ein Diagramm von Antiagglutinationswirkun gen, wenn Ristocetin als Agglutinationsauslöser und das an tithrombotische Mittel der vorliegenden Erfindung injiziert werden.

Als Ergebnis des Versuchs wurde bewiesen, daß das an tithrombotische Mittel der vorliegenden Erfindung starke Auswirkungen auf die Antiagglutination der Plättchen be sitzt.

2. Messung der antithrombotischer Aktivität

Die Induktion eines Versuchsthrombus wird auf der Grundlage des Verfahrens von Dimino et al. durchgeführt. Männliche ICR Ratten mit einem Gewicht von 20-30 g werden in dem Versuch verwendet. Die Induktion des Thrombus wird ausgelöst, indem ein Auslöser der Plättchenagglutination (Adrenalin, Collagen) in die Schwanzvene der Ratte inji ziert wird, und der Thrombus bildet sich schnell in einer Kapillare. Beschleunigungsmaterialien für die Agglutination werden, in diesem Experiment durch Mischen von 15 µl Colla gen, 400 mM Adrenalin und 100 µl einer physiologischen Salzlösung hergestellt. Diese wird mit 100 µl pro 20 g Rat tengewicht in die Schwanzvene der Ratte injiziert. 2 Stun den vor dem Start des Versuchs werden je 100 mg davon und 10 mg der Versuchsprobe pro kg Rattengewicht injiziert, um die antithrombotischen Wirkungen von Extrakten aus grünem Tee herauszufinden. Das Gesamtvolumen der Injektion sollte nicht über 0,4 ml liegen. Die Antithrombosewirkungen der Extrakte aus grünem Tee werden berechnet durch den Prozent satz an überlebenden Ratten, die vor dem Tod oder der Para lyse der Hinterbeine bewahrt wurden, welche durch eine In jektion des Auslösers der Plättchenagglutination auftreten kann. Die hier verwendete Definition der Paralyse beruht auf der Grundlage des Verlustes der Hinterbeinbewegungs fähigkeit über 15 min oder bei kontinuierlichem Schütteln.

Bei dem Versuch das geeignete Volumen für eine Throm businduktion mit Adrenalin und Collagen herauszufinden, konnte die Mischung aus 15 µg Collagen, 400 µM Adrenalin und 100 µl physiologischer Salzlösung bei diesem Versuch zu 95% einen Thrombus induzieren. Ob ein Thrombus gebildet wurde oder nicht, wurde durch den Tod oder die Paralyse der Hinterbeine über 15 min durch Injektion des Auslösers der Plättchenagglutination bestimmt. Die Paralyse der Hinter beine wurde anhand der Merkmale von sowohl Kriechen als auch Zittern gemessen. Wenn 100 mg/kg Extrakte aus grünem Tee in die Bauchhöhle induziert wurden, zeigt sich eine 66%ige Schutzwirkung, und wenn 10 mg/kg injiziert wurden, eine 44%ige Schutzwirkung. Auf der anderen Seite zeigte Aspirin (100 mg/kg) als Kontrolle eine 45%ige Schutzwir kung.

Fig. 5 zeigt ein Diagramm der antithrombotischen Wir kungen, wenn Adrenalin und Collagen als Agglutinationsaus löser verabreicht wurden, und dann die Verabreichung eines Antithrombosemittels der vorliegenden Erfindung folgte.

Mit diesem Versuch wurde bewiesen, daß das Antithrombo semittel der vorliegenden Erfindung starke antithromboti sche Wirkungen hat, welche denen des Aspirins bei nur einem Zehntel der Menge des Aspirins entsprechen.

3. Versuch zur Blutgerinnung (1) Bestimmung der Blutungsdauer

Männlichen Sprague-Dauley Ratten, die von 180-200 g wiegen, wird das Versuchsmaterial einmal pro Tag 10 Tage lang verabreicht. Die Ratte wird durch eine intraperitonea le Injektion von Natriumpentobarbitallösung (400 mg/kg) be täubt. Der Schwanz der betäubten Ratte wird in einer Länge von 5 mm vom Ende aus aufgeschnitten und der aufgeschnitte ne Schwanz wird bei 37,5°C bis zu 5 cm in eine Salzlösung getaucht. Die Zeitdauer vom Aufschneiden des Schwanzes bis zur Hämostase wird gemessen.

Als Ergebnis dieses Versuchs wurde die Blutungsdauer abhängig von dem verabreichten Volumen vergrößert: 113,2 ± 19,6 s bei 10 mg/kg, 250,7 ± 117,3 s bei 100 mg/kg, 509,8 ± 1,6 s bei 300 mg/kg in der Versuchsgruppe, verglichen mit 65,0 ± 12,9 s in der Kontrollgruppe.

Im Fall der Verabreichung von Aspirin (100 mg/kg) lag sie über der Kontrollgruppe bei 165,1 ± 34,3 s. Die Ergeb nisse sind in Fig. 6 gezeigt. Diese zeigt ein Diagramm der Blutungsdauer, wenn das Antithrombosemittel der vorliegen den Erfindung und Aspirin als Kontrolle verabreicht werden.

(2) Bestimmung der gesamten Blutgerinnungszeit

Am nächsten Tag nach der Bestimmung der Blutungsdauer wird die Ratte durch Ether betäubt, und 4,5 ml Blut werden mit einer Plastikspritze, welche 0,5 ml einer 3,13%igen Na triumcitratlösung enthält, aus ihrem Herz entnommen. Das entnommene Blut wird vorsichtig in der Spritze gemischt, 1 ml Blut wird in ein Glasteströhrchen gegeben, wobei 1,7% CaCl₂·2H₂O (200 µl) dazugegeben werden, und unter Rühren wird die Zeitdauer der Bildung der Koagulation bei Raumtem peratur gemessen.

Als Ergebnis dieses Versuchs war die gesamte Blutgerin nungszeit abhängig von dem verabreichten Volumen verlän gert: 130,1 ± 20,5 s bei 10 mg/kg, 140,9 ± 14,2 s bei 100 mg/kg, 150,6 ± 17,6 s bei 300 mg/kg in der Versuchsgruppe, verglichen mit 109,4 ± 14,0 s in der Kontrollgruppe. Außer dem benötigte Aspirin (100 mg/kg) als Kontrolle 137,2 ± 19,4 s. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt, welche ein Diagramm der gesamten Blutgerinnungszeit zeigt, wenn das Mittel der vorliegenden Erfindung und Aspirin verabreicht wurden.

(3) Bestimmung der Plasmagerinnungszeit

Plasma wird aus dem in dem obigen Versuch gesammelten Blut durch Zentrifugation bei 25 000 rpm erhalten. Eine vereinigte Probe mit 100 µl Plasma und 50 µl einer 50 mM CaCl₂ Lösung wird bei 37°C in einem Teströhrchen geschüt telt. Die verstrichene Zeit vom Zugeben des CaCl₂ bis zum Beobachten des Gerinnsels wird gemessen.

Als Ergebnis dieses Versuchs wurde die Plasmagerin nungsdauer abhängig von dem verabreichten Volumen vergrö ßert: 177, 5 ± 37,6 s bei 10 mg/kg, 219,8 ± 57,9 s bei 100 mg/kg, 233,1 ± 83,2 s bei 300 mg/kg in der Versuchsgruppe und 146,2 ± 26,5 s bei der Kontrolle. Im Fall von Aspirin (100 mg/kg) als Kontrolle, dauerte es 222,5 ± 40,2 s. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt. Diese zeigt ein Diagramm der Plasmagerinnungszeit, wenn das Mittel der vorliegenden Erfindung und Aspirin injiziert wurden.

4. Inhibition der Lipidhyperoxidation und der Enzymak tivität im Plasma a) Bestimmung von Inhibitionswirkungen bei der Malon dialdehyd (MDA)-Herstellung

1 ml einer Plättchenaufschwemmungslösung wird zu einer isotonischen Lösung eines Extraktes aus grünem Tee (Endkonzentration 1 mg/ml) zugegeben, und dazu werden Ca⁺⁺ und Collagen zugegeben. Danach werden zu der resultierenden Mischung 2 ml TBA zugegeben, gefolgt von Erwärmen für 20 min bei 90°C, dann wird es auf Raumtemperatur abgekühlt und 10 min lang bei 3000 rpm zentrifugiert. Die optische Dichte der roten Lösung, welche sich im oberen Teil der prezipi tierten Plättchen befindet, wird bei 535 nm gemessen, und die Menge an produziertem MDA wird aufgrund des molaren Ab sorptionsindex des MDA-TBA Konjugates von 1,56×10⁵ be rechnet, wodurch die inhibitorische Wirkung des Extraktes aus grünem Tee gegenüber der Lipidhyperoxidation gezeigt wird.

Die Menge an produziertem MDA, welche durch die Reakti on des Sekundärproduktes der Lipidhyperoxidation erzeugt wird, kann als ein Kriterium der gesamten Lipidhyperoxida tion verwendet werden. Extrakte aus grünem Tee zeigten diese Wirkungen in dem gleichen Ausmaß mit Aspirin, welches die Aktivität von Phospholipase A2 Inhibitoren, wie z. B. Primaquin, Chinacrin und Oxygenase inhibiert.

b) Bestimmung der Aktivität der Abgabe von Arachidon säure

Ein Extrakt aus grünem Tee (Endkonzentration 1 mg/ml), Ca⁺⁺ und Collagen werden zu 1 ml einer Plättchenaufschwem mungslösung zugegeben und bei 37°C inkubiert. Nach 30 min werden die Plättchen rasch durch einen Membranfilter abge trennt und das Filtrat wird unter pH 3 angesäuert. Die re sultierende Lösung wird zweimal mit 2 ml Extraktionslö sungsmittel (Chloroform : Methylalkohol = 1 : 1, v/v) ex trahiert. Die durch Zentrifugation erhaltene untere Chloro formschicht wird in ein anderes Teströhrchen überführt und durch Stickstoffgas getrocknet. Das getrocknete Material wird mit 50 µl Dimethylformamid (DMF) gelöst und zu der re sultierenden Lösung werden 50 µl DMF Lösung, welche 12 mM Monodansylcadaverin und 2 µl Diethylphosphorocyanidat ent hält, zugegeben, und die resultierende Mischung wird bei Raumtemperatur 15 min lang stehen gelassen, so daß Arachi donsäure mit Fluoreszenz markiert wird.

Die mit Fluoreszenz markierte Arachidonsäure wird mit 50% Methanol : Acetonitril durch ein Elutionsverfahren mit linearem Gradienten auf einer Umkehrphasensäule eluiert und mit einer Anregungswellenlänge von 340 nm und einer Flua reszenzwellenlänge von 520 nm nachgewiesen.

Wie durch die quantitative Bestimmung der Arachidonsäu re gezeigt, ist die Änderung der Arachidonsäure durch Ex trakte aus grünem Tee geringer als die von Primaquin und Chinacrin. Daher wird angenommen, daß Extrakte aus grünem Tee eine Lipidhyperoxidation und eine Plättchenagglutinati on durch Inhibierung von Cyclooxygenase oder Lipoxygenase, eher als Phospholipase als Wirkbestandteil in den Plättchen verhindern.

6. Therapeutische Hyperlipidämiewirkungen - Antiperoxi dationswirkung (in vitro)

Der Extrakt aus grünem Tee wird zu einer Lebermikroso menfraktion (1,5 mg Protein/ml) einer Ratte hinzugegeben, und Cystein (Endkonzentration 500 µM) und Eisensulfat (Endkonzentration 5 µM) werden dazu hinzugegeben und die resultierende Mischung wird 30 min lang bei 37°C inkubiert. 3 ml 10%ige Trichloressigsäure wird dazu hinzugegeben und 2 ml des Überstandes werden nach einer Zentrifugation abge nommen. 0,67% TBA Lösung wird dazu hinzugegeben und die re sultierende Lösung wird in kochendem Wasser 15 min lang ak tiviert und nach dem Abkühlen wird die optische Dichte ge messen.

7. Untersuchungen über eine physiologische Funktionali tät - Antihypertoniewirkungen (in vitro) Inhibitionswirkungen gegenüber dem Angiotensin-umwan delnden Enzym (ACE)

ACE ist ein Enzym, welches auf Renin-Angiotensine wirkt, welche eine Schlüsselrolle bei der Steuerung des Blutdrucks, Körperflüssigkeiten und Elektrolyten in vivo spielen. Dieses Enzym wandelt Angiotensin I zu aktivem An giotensin II um, indem es ein Dipeptid (His-Leu) von dem C- terminalen Ende von ANG I, welches von Renin produziert wird, abspaltet. Das Enzym spielt ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Kreislaufs in einem lebenden Körper, da es ANG II im hypertonischen System aktiviert und Bradykinin im hypotonischen System inaktiviert.

Demgemäß kann aufgrund der Inhibitionswirkung des Ex traktes aus grünem Tee auf das Enzym, die Wirkung des Ex traktes aus grünem Tee als einem Blutdruck-senkenden Mittel bewiesen werden.

Aspirin ist ein starkes Antikoagulationsmittel, jedoch ist es wegen ernster Magenstörungen unmöglich, es länger einzunehmen. Im Gegensatz dazu wurde von dem antithromboti schen Mittel der vorliegenden Erfindung bewiesen, daß es sowohl keine Nebenwirkungen wie eine Magenstörung zeigt, als auch die gleiche oder sogar eine größere Wirkung wie Aspirin aufweist.

Als das Ergebnis des obigen Versuchs besitzen Extrakte aus grünem Tee gemäß der vorliegenden Erfindung eine her ausragende antithrombotische Wirkung.

Daher können Extrakte aus grünem Tee nach der vorlie genden Erfindung als Antithrombosemittel, Thrombogenese hemmende Mittel oder Thromboseursache-hemmende Mittel ver wendet werden.

Test der akuten Toxizität

Eine physiologische Salzlösung, welche einen Extrakt aus grünem Tee enthält, wird durch orale und intravenöse Applikation ICR-Ratten verabreicht. Der LD₅₀-Wert wird durch die Sterblichkeit nach 72 Stunden berechnet. Die Aus wertung erfolgt nach der Up-and-down-Methode. Die Ergeb nisse sind wie folgt.

Wie nach den obigen Ergebnissen beurteilt, hat das An tithrombosemittel der vorliegenden Erfindung eine geringe akute Toxizität.

Der Extrakt aus grünem Tee gemäß der vorliegenden Er findung kann von 1,0-2000 mg/kg, von einem bis zu vielen Malen pro Tag, abhängig von Alter, Geschlecht oder Sympto men des Patienten oder dem Zweck der Vorsorge dosiert wer den.

Die Extrakte aus grünem Tee gemäß der vorliegenden Er findung können zu pharmazeutischen Erzeugnissen verarbeitet werden, indem sie mit gewöhnlichen Hilfsstoffen wie z. B. Vehikel, Bindemittel, Gleitmittel, Lösungsmittel, Verdün nungsmittel usw. gemischt werden.

Es folgen Beispiele von Erzeugnissen gemäß der vorlie genden Erfindung.

Zubereitungsbeispiel 1
Zubereitung einer Tablette
Extrakte aus grünem Tee\|10 mg
Lactose	20 mg
Stärke	20 mg
Magnesiumstearat	geeignete Mengen

Die obigen Bestandteile werden gemäß allgemeinen Her stellungsmethoden von Tabletten zu 50 mg Tabletten verar beitet.

Zubereitungsbeispiel 2
Zubereitung von Kapseln
Extrakte aus grünem Tee\|100 mg
Lactose	20 mg
Stärke	19 mg
Talkum	1 mg
Magnesiumstearat	geeignete Mengen

Die obigen Bestandteile werden gemäß allgemeinen Her stellungsverfahren von Kapseln in 50 mg Kapseln gefüllt.

Zubereitungsbeispiel 3
Zubereitung einer Flüssigkeit
Extrakte aus grünem Tee\|100 mg
Isomerisierte Saccharide	10 mg
Honig	500 mg
Nikotinsäureamid (amtl. Arzneibuch)	20 mg
Koffeinanhydrid (amtl. Arzneibuch)	30 mg
Natriumbenzoat	70 mg

Die obigen Bestandteile werden gemäß allgemeinen Her stellungsmethoden von Flüssigkeiten zu einer Flüssigkeit gemischt, in braune 100 ml Flaschen gefüllt, abgedichtet und pasteurisiert.

Zubereitungsbeispiel 4
Zubereitung einer Injektionslösung
Extrakte aus grünem Tee\|5 mg
Steriles Wasser	geeignete Mengen

Die obigen Bestandteile werden gemäß allgemeinen Her stellungsverfahren zu einer Injektionslösung verarbeitet und in 2 ml Ampullen gefüllt, abgedichtet und sterilisiert.

Zubereitungsbeispiel 5
Zubereitung von Weichkapseln
1) Bestandteile zum Füllen
Extrakte aus grünem Tee\|10 mg
Polyethylenglycol	230 mg
Glycerin	20 mg

2) Bestandteile für die Trockenhülle (Gew.-%)
Gelatine\|52%
Glycerin	32%
Anidrisorb 35/70	12%
Wasser	5%

Die obigen Bestandteile werden gemäß allgemeinen Her stellungsverfahren von Weichkapseln zu Weichkapseln verar beitet.

Zubereitungsbeispiel 6
Zubereitung von Granulat
Extrakte aus grünem Tee\|10 mg
Lactose	25 mg

Die obigen Bestandteile werden mit einer Extrusionsgra nuliermaschine zu Granulat verarbeitet.

Auf der anderen Seite kann der Extrakt aus grünem Tee gemäß der vorliegenden Erfindung als Zusammensetzung ver wendet werden, in welcher der Extrakt aus grünem Tee mit anderen gut bekannten pharmakologischen Materialien, welche unterschiedliche Wirkungen haben, gemischt werden. Solche Zusammensetzungen sind in den Umfang der vorliegenden Er findung eingeschlossen.

Claims

1. Pharmazeutisches Erzeugnis mit Antithromboseaktivität, enthaltend einen Extrakt aus grünem Tee als einen Wirk bestandteil und pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe, das durch ein herkömmliches Herstellungsverfahren in eine pharmazeutische Form gebracht wurde.

2. Pharmazeutisches Erzeugnis gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Form ein Pulver ist.

3. Pharmazeutisches Erzeugnis gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Form eine Tablette ist.

4. Pharmazeutisches Erzeugnis gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Form eine Kapsel ist.

5. Pharmazeutisches Erzeugnis gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Form eine Flüssigkeit ist.

6. Pharmazeutisches Erzeugnis gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Form eine Weichkapsel ist.

7. Pharmazeutisches Erzeugnis gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Form eine Injektionslösung ist.

8. Pharmazeutisches Erzeugnis gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Form ein Granulat ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutischen Erzeugnisses mit Antithromboseaktivität, wobei man einen Extrakt aus grünem Tee als Wirkbestandteil, zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen, unter Verwendung eines herkömmlichen Herstellungsver fahrens in eine pharmazeutische Form bringt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man den Extrakt aus grünem Tee dadurch herstellt, daß man
getrocknete grüne Teeblätter, gerösteten Tee oder grü nen Instanttee mit Wasser oder einer Lösungsmischung aus Wasser und niedrigem Alkohol zur Entfernung unlös licher Bestandteile hydrothermal extrahiert,
den erhaltenen Extrakt konzentriert,
das erhaltene Konzentrat mit Wasser löst,
die erhaltene Lösung zur Entfernung nichtpolarer Mate rialien mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert,
die erhaltene wäßrige Schicht konzentriert und
die Flüssigkeit, welche von dem erhaltenen Konzentrat abgetrennt wurde, durch eine Säule erneut konzentriert.

11. Verfahren zur Herstellung eines Extraktes aus grünem Tee, wobei man
getrocknete grüne Teeblätter, gerösteten Tee oder grü nen Instanttee mit Wasser oder einer Lösungsmischung aus Wasser und niedrigem Alkohol zur Entfernung unlös licher Bestandteile hydrothermal extrahiert,
den erhaltenen Extrakt konzentriert,
das erhaltene Konzentrat mit Wasser löst,
die erhaltene Lösung zur Entfernung nichtpolarer Mate rialien mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, die erhaltene wäßrige Schicht konzentriert und
die Flüssigkeit, welche von dem erhaltenen Konzentrat abgetrennt wurde, durch eine Säule erneut konzentriert.