CN113144057B - 一种西红花提取物及其制备方法和其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种西红花提取物，所述提取物中含有西红花苷‑I、西红花苷‑Ⅱ和苦番红花素，所述西红花苷‑I、西红花苷‑Ⅱ和苦番红花素的重量百分含量之和不低于30％，其中，提取物中的苦番红花素的重量百分含量不低于8％，总糖的重量百分含量不低于50％。该提取物具有抗氧化作用和活血化瘀功能，能有效清除HDPH和ABTS自由基，保护机体组织免受自由基的攻击，减轻氧化损伤程度。

Description

一种西红花提取物及其制备方法和其应用
技术领域
本发明涉及中药领域，具体涉及一种西红花提取物及其制备方法和其应用。
背景技术
西红花(Stigma Croci)又称番红花、藏红花，被全球誉为最贵的药用植物、最上好的染料、最高档的香料。据《本草纲目》记载，西红花“活血、主心气忧郁，又治惊悸”，具有功效明确的抗氧化、抗衰老、美容祛斑和防治心脑血管疾病等作用，被列为珍稀名贵中药材。
西红花中的有效成分包括西红花苷-Ⅰ(Crocin Ⅰ)、西红花苷- Ⅱ(Crocin Ⅱ)、苦番红花素(Picrocrocin)等水溶性物质以及以藏红花醛(Safranal)为主的挥发性物质。《中国药典》(2020年版一部) 以西红花苷-I、苷-II和苦番红花素控制西红花质量，这些成分均为水溶性活性物质。充分提取西红花的活性成分，获得高含量、质量稳定的水溶性提取物以充分发挥其治疗药效是当前急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种西红花提取物，所述提取物中所含西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素的重量百分含量之和不低于30％，其中，苦番红花素的重量百分含量不低于8％。
本发明优选的技术方案中，提取物中所含西红花苷-I、西红花苷- Ⅱ和苦番红花素的重量百分含量之和不低于60％，其中，苦番红花素的重量百分含量不低于16％。
本发明优选的技术方案中，提取物中所含西红花苷-I、西红花苷- Ⅱ和苦番红花素的重量百分含量之和不低于80％，其中，苦番红花素的重量百分含量不低于25％。
本发明优选的技术方案中，提取物中所含西红花苷-I、西红花苷- Ⅱ和苦番红花素的重量百分含量之和不低于90％，其中，苦番红花素的重量百分含量不低于30％。
本发明优选的技术方案中，提取物中的西红花苷-I：西红花苷-Ⅱ：苦番红花素的质量比为1:0.1-0.6:0.3-1.2，优选为 1:0.3-0.5:0.6-0.9。
本发明优选的技术方案中，提取物中总糖的重量百分含量不低于 50％。
本发明的另一目的在于提供一种西红花提取物的制备方法，包括以下步骤：取西红花加入5-50倍(v/w)、浓度为0-100％(v/v)的乙醇水溶液,提取1-20h，固液分离，收集滤液，为西红花提取液，减压蒸馏，分离挥发性物质和溶剂，蒸馏物干燥，即得。
本发明优选的技术方案中，将制得的西红花提取液，减压蒸馏，分离挥发性物质和有机溶剂，蒸馏物采用萃取或树脂吸附的任一种或其组合进行纯化，收集西红花纯化液，蒸馏分离挥发性物质和有机溶剂，干燥，即得西红花提取物。
本发明优选的技术方案中，蒸馏分离挥发性物质和有机溶剂，先收集蒸馏前期30-40分钟的蒸馏液，再回收有机溶剂，前期收集的蒸馏液精馏，收集75℃以下的馏分，即得西红花精油，西红花精油中藏红花醛的重量百分含量大于60％。
本发明优选的技术方案中，西红花精油可以单独使用，也可以与上述西红花提取物复配使用。
本发明优选的技术方案中，所述西红花为粉碎成20-100目的西红花粉，优选为20-40目的粗粉。
本发明优选的技术方案中，所述乙醇水溶液的提取次数为1-5次，优选为2-4次。
本发明优选的技术方案中，所述分离选自离心、过滤、膜过滤的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述西红花提取液经过浓缩过滤处理后，再用于树脂或萃取纯化处理，所述浓缩过滤步骤为，将西红花提取液蒸馏除去挥发性物质和有机溶剂至相对密度1.0-1.2，得西红花浓缩液，将西红花浓缩液加入1-10倍水(v/v)搅拌后固液分离，得到的滤液用于树脂或萃取纯化处理。
本发明优选的技术方案中，所述浓缩选自常压蒸馏或减压蒸馏的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述减压蒸馏的真空度为-0.06到 -0.12MPa，优选为-0.09到-0.10MPa。
本发明优选的技术方案中，所述减压蒸馏的温度为40-80℃，优选为50-60℃。
本发明优选的技术方案中，所述树脂吸附处理包括上柱、洗除杂质、收集洗脱液处理。
本发明优选的技术方案中，所述萃取处理包括下述步骤，在西红花提取液中加入5-15倍体积(v/v)的有机溶剂，萃取1-5次，分离，收集有机层浓缩至相对密度为1.0-1.2。
本发明优选的技术方案中，所述萃取所用有机溶剂选自正丁醇、正丙醇、异丁醇、乙酸乙酯中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述洗脱步骤选用乙醇水溶液进行洗脱。
本发明优选的技术方案中，所述树脂选自大孔吸附树脂；优选的，采用非极性至中等级性的聚苯乙烯基大孔吸附树脂；优选的，采用 HP-20、XAD-4、XAD-16、D101、LX-11、LX-68、LX-11、LX-68、AB-8、 HPD100、HPD200、HPD300、HPD400、HPD450型大孔吸附树脂中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述上柱是将西红花提取液加到树脂一端，不被吸附的部分物质流经树脂从另一端流出，流速为1-4倍树脂体积/h。
本发明优选的技术方案中，所述水洗脱的流速为2-5倍树脂体积/h。
本发明优选的技术方案中，所述乙醇水溶液洗脱中，用于洗脱的乙醇水溶液浓度≥10％(V/V)，流速为1-4倍树脂体积/h。
本发明优选的技术方案中，所述蒸馏选自常压浓缩、减压浓缩中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，所述干燥选自喷雾干燥、真空干燥、减压干燥、冷冻干燥中的任一种或其组合。
本发明优选的技术方案中，喷雾干燥的真空度为-0.06到-0.12MPa，进风温度100-140℃，物料温度40-80℃。
本发明优选的技术方案中，真空干燥的真空度-0.06到-0.12MPa，干燥温度为40-80℃。
本发明优选的技术方案中，冷冻干燥的预冻温度为-40到-15℃；第一阶段升华干燥的真空度为1-150Pa，物料温度为-40到-15℃；第二阶段解析干燥的真空度为5-200Pa，物料温度为-15-30℃。
本发明的另一目的在于提供一种西红花药物组合物，所述药物组合物由本发明的西红花提取物和药学上可接受的载体组成。
本发明的药物组合物可为本领域熟知的各种剂型，并可采用本领域常规的制剂技术制备得到。
本发明的优选技术方案中，所述组合物的制剂选自口服制剂或外用制剂的任一种。
本发明的优选技术方案中，所述的口服制剂选自口服液体制剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、散剂、露剂、泡腾剂、混悬液、丸剂、滴丸、合剂、糊剂、乳剂、茶剂的任一种。
本发明的优选技术方案中，所述的外用制剂选自凝胶剂、膏剂、贴膏剂、霜剂、软膏剂、搽剂、洗剂、栓剂、涂抹剂、凝膏剂、喷雾剂、软膏剂的任一种。
本发明的优选技术方案中，所述的药学上可接受的载体为本领域熟知用于制备所需制剂的常用赋形剂或辅料。
本发明所述的口服制剂或外用制剂常用的赋形剂或辅料选自填充剂 (又称稀释剂)、润滑剂(又称助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、矫味剂、赋香剂的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述粘合剂选自糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、明胶浆、淀粉浆、羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述填充剂选自乳糖、糖粉、糊精、淀粉、纤维素、无机钙盐、氯化钙、硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙、山梨醇、甘氨酸、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述润滑剂选自微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、胶态二氧化硅、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述崩解剂选自淀粉、羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、交联聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述湿润剂选自十二烷基硫酸钠、水或醇的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述抗氧剂选自亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述抑菌剂(杀菌剂)选自0.5％苯酚、 0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述酸碱调节剂(pH调节剂)选自盐酸、枸橼酸、氢氧化钠、氢氧化钾、枸橼酸钠、枸橼酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸钾、苹果酸钠、苹果酸钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述乳化剂选自聚山梨酯-80、没酸山梨坦、普流罗尼克F-68，卵磷酯、豆磷脂的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述增溶剂选自吐温-80、胆汁、甘油的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述调味剂选自蜂蜜、糖浆、甜蜜素的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，将本发明的西红花提取物与药学上可接受的缓释制剂载体或控释制剂载体按其制备要求加以混合，再按照本领域熟知的缓释制剂或控释制剂的制备方法，如加入阻滞剂包衣或将本发明的西红花提取物微囊化后，将其制成缓释微丸或控释微丸的任一种。
本发明所述的缓释制剂载体或控释制剂载体包括但不仅限于油脂性掺入剂、亲水胶体或包衣阻滞剂等，所述的油脂性掺入剂选自单硬脂酸甘油酯、氢化蓖麻油、矿油、聚硅氧烷或二甲基硅氧烷等；所述的亲水胶体选自羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、阿拉伯胶、西黄耆胶或卡波普的任一种或其组合；所述的包衣阻滞剂选自乙基纤维素(EC)、羟丙甲基纤维素(HMPC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、丙烯酸类树脂的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案中，所述药物组合物中的药学上可接受载体的用量或其种类根据药物组合物中有效成分的理化性质和含量、制剂类型、制剂的溶出及生物利用度等因素而定。
本发明的另一目的在于提供本发明的西红花提取物或西红花药物组合物用于制备治疗中老年人轻度脑动脉硬化或其所致的头晕头痛、耳鸣耳聋、视物模糊、记忆力减退、腰膝酸软、肢体麻木的任一种病症或其并发病症的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供本发明的西红花提取物或西红花药物组合物用于制备治疗脑动脉硬化所致病症、心脑血管疾病的任一种或其并发病症的药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供本发明的西红花提取物或西红花药物组合物用于制备防治老年痴呆症或其并发病症的药物中的应用。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
除非另有说明，本发明采用中国药典的检测方法检测西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素的含量，采用菲林试剂法测定总糖的含量。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1、本发明的西红花提取物含有高含量的西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素，按优选工艺制备的西红花提取物中三个主要活性成分的含量高达90％以上。实验研究证明该提取物具有优异的抗氧化作用和活血化瘀功能，有效清除HDPH和ABTS自由基，保护机体组织免受自由基的攻击，减轻氧化损伤程度，减轻或抑制血栓形成，降低血粘度，防治因血栓形成或高血粘度引起的心脑血管疾病等功效。
2、本发明的制备工艺通过蒸馏步骤分离收集了西红花的挥发性成分，通过过滤或离心步骤分离除去了包括不溶于水的花蕊纤维素和脂溶性成分，确保提取物只保留以高纯度西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素为主的水溶性活性成分。收集的西红花精油可以单独使用，也可以与西红花提取物合并后使用。
3、本发明制得的西红花提取物中含有高达90％以上的西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素，尤其是苦番红花素的含量高达30％以上。具有三种活性成分比例固定，质量稳定，药效确切，生产工艺简单有效，既实现了资源综合利用，又适合工业化生产等优点。
附图说明
图1工艺流程图
图2实施例1-4的西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量；
图3实施例1、实施例3和4对自由基的清除能力。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1本发明西红花提取物的制备
(1)称取西红花5kg；
(2)向粗粉中加入40L 50％的乙醇水溶液，回流提取1小时，过滤，滤液备用；将滤渣加入30L 50％的乙醇水溶液，回流提取1小时，过滤；收集并合并两次提取液备用；
(3)将提取液置于真空度-0.08Pa、65℃条件下减压浓缩至相对密度1.2(50℃测定)，得浓缩液；
(4)在步骤(3)制得的浓缩液中加入纯水30L，搅拌溶解后，离心，将上清液以15L/h的流速流过5L HPD100型大孔吸附树脂后，再用 20L纯水以15L/h的流速洗脱，再用25L70％乙醇水溶液以20L/小时的流速洗脱树脂，将收集的洗脱液置于真空度-0.08Pa、65℃条件下浓缩至1.0，再在喷雾压力-0.08Pa，喷雾速度50ml/分钟，物料温度60℃，进风温度120℃条件下喷雾干燥，得西红花提取物，按照中国药典方法测定西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量(见图1)。
实施例2本发明西红花提取物制备
(1)称取西红花5kg，粉碎成过40目筛的粗粉；
(2)将粗粉加入70L 70％的乙醇水溶液，渗漉提取，过滤，得提取液；
(3)取提取液，于真空度-0.09Pa，温度75℃真空浓缩，收集前30分钟蒸馏液，蒸馏物继续浓缩至相对密度1.2，得浓缩液；蒸馏液置精馏塔精馏，收集75℃以下的馏分，即得西红花精油，HPLC法测定精油中藏红花醛的含量，结果藏红花醛的重量百分含量为63.8％；
(4)取浓缩液，加水调整体积至40L，依次加入200L、100L、100L 正丁醇萃取3次，得萃取液；
(5)取萃取液，于真空度-0.09Pa,温度70℃真空浓缩至密度为 1.08g/ml，再在喷雾压力-0.08Pa，喷雾速度50ml/分钟，物料温度60℃，进风温度120℃条件下喷雾干燥，得西红花提取物，按照中国药典方法测定西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量(见图1)。
实施例3
(1)称取西红花5kg，粉碎成过40目筛的粗粉；
(2)将粗粉中加入100L 95％乙醇水溶液渗漉提取，过滤，得提取液；
(3)将提取液于真空度-0.12Pa，温度40℃条件下真空浓缩至相对密度1.2，得浓缩液；
(4)将浓缩液预冷冻至-15℃，于真空度1-80Pa，物料温度 -40--15℃条件下升华干燥2小时，再在真空度50-200Pa，物料温度 -15-30℃条件下解析干燥2小时，粉碎，得西红花提取物，按照中国药典方法测定西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量(见图1)。
实施例4
(1)称取西红花5kg，粉碎得过40目筛的粗粉；
(2)在粗粉中分别加入50L、40L水浸渍提取2次，过滤，收集滤液，为提取液；
(3)将提取液按5L/小时的上样流速过5L D101型大孔吸附树脂，将活性成分吸附到树脂上，用15L纯水按10L/小时的流速过树脂，以洗除杂质，再用25L 20％乙醇水溶液按20L/小时的流速过树脂，将活性成分洗脱，收集洗脱液；
(4)将洗脱液于真空度-0.07Pa,温度75℃真空浓缩至相对密度 1.2，得浓缩液；
(5)将浓缩液预冷冻至-30℃，于真空度30-150Pa，物料温度 -40--15℃条件下升华干燥2小时，再在真空度50-150Pa，物料温度 -15-20℃条件下解析干燥2小时，粉碎，得西红花提取物，按照中国药典方法测定西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素含量(见图1)。
实施例5散剂
西红花散剂的组成：
西红花提取物 1kg
蔗糖 98kg
聚乙二醇PEG4000 1kg
西红花散剂的制备方法，包括下述步骤：
称取实施例1制备的西红花提取物，将其与粉碎至80目以下的蔗糖和聚乙二醇PEG4000，置于混合机中混合均匀，分装，即得。
实施例6冻干粉针剂
西红花冻干粉针剂的组成：
Figure BDA0003099103980000131
西红花冻干粉针剂的制备方法，包括下述步骤：
取按实施例1制备的西红花提取物、亚硫酸钠，置配液罐中，加注射用水，先过活性炭粗滤，再用5-50nm微孔滤膜过滤，按单次服用剂量进行注射液分装入西林瓶，冷冻干燥，即得。
实施例7颗粒剂
西红花颗粒剂的组成：
Figure BDA0003099103980000132
西红花颗粒剂的制备方法，包括下述步骤：
取按实施例1制备的西红花提取物、麦芽糊精、粉碎至60目以下的蔗糖，置于湿法混合机中混合均匀，加入95％乙醇水溶液，湿法混合制粒，70℃干燥，过30目筛整粒，得颗粒，再加入粉碎至60目以下的聚乙二醇PEG4000混合均匀，即得。
实施例8胶囊剂
西红花胶囊剂的组成：
Figure BDA0003099103980000141
西红花胶囊剂的制备方法，包括下述步骤：
取按实施例2制备的西红花提取物、微晶纤维素、预胶化淀粉置于湿法混合机中混合均匀，加入纯水适量，湿法混合制粒，沸腾干燥，至物料温度达到40℃时卸料，过30目筛整粒，得药物组合物颗粒，再加入硬脂酸镁混合均匀，按照300mg/粒的剂量填充胶囊，即得。
实施例9西红花片剂
西红花片剂的组成：
Figure BDA0003099103980000142
Figure BDA0003099103980000151
西红花片剂的制备方法，包括下述步骤：
取实施例2制备的西红花提取物、微晶纤维素、乳糖置于湿法混合机中混合均匀，加入纯水适量，湿法混合制粒，沸腾干燥，至物料温度达到40℃时卸料，过30目筛整粒，得颗粒，加入硬脂酸镁混合均匀，按照400mg/粒的剂量压片，即得。
实施例10口服溶液剂
西红花口服溶液剂的组成：
西红花提取物 1kg
蔗糖 100kg
饮用水 加至1000L
西红花口服溶液剂的制备方法，包括下述步骤：
称取所需量实施例2制备的西红花提取物，将其置于配液罐中，加饮用水至1000L，搅拌，混合均匀，过滤，灭菌，即得。
试验例1本发明西红花提取物的抗氧化作用研究
(1)实验材料
西红花提取物溶液：取实施例1-4的西红花提取物各10mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加纯水稀释并定容，得到浓度为1.0mg/mL的西红花提取物溶液。临用前将溶液加纯水稀释，得到不同浓度的西红花提取物溶液。
VC溶液：取VC约10mg，精密称定，置10mL容量瓶中，加纯水稀释并定容，得到浓度为1.0mg/mL的维生素C储备液。临用前将储备液加纯水稀释，得到不同浓度的VC溶液。
(2)DPPH自由基清除率
取DPPH试剂粉末约2mg，精密称定，置50mL容量瓶中，加无水乙醇超声溶解并定容，得到浓度为0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，转移至 100mL三角瓶中。
每组取1mL DPPH乙醇溶液与等体积的不同浓度的样品溶液(西红花提取物溶液、维生素C溶液)混匀，在室温下避光放置30min。
在波长为517nm处测定其吸光度，每组平行测定3次，取平均值。选用维生素C溶液作为阳性对照。观察记录结果，计算半数抑制浓度 IC50，结果见图2。
DPPH自由基清除率RDPPH用如下公式计算：
RDPPH/％＝(1-(Ai-Aj)/A0)×100
式中：Ai为DPPH乙醇溶液与样品溶液反应后测得的吸光度；Aj为以水代替DPPH乙醇溶液时测得的吸光度；A0为以水代替样品溶液作为空白对照时测得的吸光度。
(3)ABTS自由基清除率
取ABTS试剂粉末约0.192g，精密称定，置50mL容量瓶中，用纯水超声溶解并定容，得到浓度为7mmol/L的ABTS溶液，转移至100mL 三角瓶中。精确称取0.378g过硫酸钾粉末加入至10mL容量瓶中，用纯水定容，于40℃水浴超声溶解，得到浓度为140mmol/L的过硫酸钾溶液。准确量取0.88mL过硫酸钾溶液与50mL ABTS溶液混合，于室温下在暗处反应24h形成ABTS自由基储备液。使用前用纯水稀释80倍(至测样时的空白对照在波长为734nm处的吸光度为(0.7±0.02)，得到 ABTS溶液。
每组取1mL不同浓度的样品溶液(西红花提取物、维生素C)与4 mL ABTS溶液混合，振荡30s，于室温下避光反应6min。在波长为734 nm处测定其吸光度，每组平行测定3次，取平均值。选用抗坏血酸溶液作为阳性对照。观察记录结果，计算半数抑制浓度IC50，结果见图2。
ABTS自由基清除率RABTS用如下公式计算：
RABTS/％＝(1-(Ai-Aj)/A0)×100
其中，Ai为ABTS溶液与样品溶液反应后测得的吸光度；Aj为以水代替ABTS溶液时测得的吸光度；A0为以水代替样品溶液作为空白对照时测得的吸光度。
试验例2西红花提取物的抗静脉血栓作用研究
1.实验材料
1.1药品、试剂及配制
实施例1制备的西红花提取物，复方血栓通胶囊(规格：0.5g/粒)；肝素钠注射液规格(2ml:12500单位)，盐酸肾上腺素注射液(规格：1ml:1mg)。
配制方法：复方血栓通胶囊，取内容物研磨成细粉，取2g溶于30ml 水配制成阳性药；取药物组合物，称取0.3g、0.6g、1.2g分别溶于50ml 水制成小剂量、中剂量和大剂量受试药。
给药剂量：按体重给药，10ml/kg。
1.2实验仪器及设备
DZF-6050真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；BSA5201电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；BSA224S电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；KQ5200B超生波清洗仪，昆山超声仪器厂； BWS-10数显恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；VORTEX3000涡旋振荡仪，德国WIGGENS；TGL-16G离心机，上海安亭科学仪器厂；LBY-N68 全自动自清洗血流变仪，北京普利生仪器有限公司；日立7080全自动生化分析仪，日本日立贸易有限公司；Cary60紫外可见分光光度计,安捷伦科技(中国)有限公司；BIO-TEK ELX800型酶标仪，美国BIO-TEK 仪器有限公司。
1.3实验动物
雄性SD种大鼠，体重200-250g，购于上海实验动物研究中心。雌性昆明种小鼠，体重18-22g，购于上海实验动物研究中心。
2.实验方法
2.1分组及给药
体重为200-250g的SD大鼠60只，随机分成6组，每组10只，灌胃给药。
模型组：蒸馏水(10ml/kg)
阳性对照组：复方血栓通胶囊0.600g/kg
西红花提取物组：小剂量组(75mg/kg)、中剂量组(150mg/kg)、大剂量组(300mg/kg)。
每天一次，连续5日。
2.2下腔静脉结扎致大鼠静脉血栓模型的建立
第五天给药一小时后，以25％乌拉坦(4ml/kg)麻醉，正中打开腹腔，分离下腔静脉，并于左肾静脉下方用细丝线结扎下腔静脉，缝合腹壁。
2.3大鼠静脉血栓重量的测定
结扎后3小时后重新打开腹腔，在结扎线下方2cm处夹闭血管，剪下此段血管，取出血栓，并用滤纸吸去浮血，用电子天平立即称量血栓湿重，60℃干燥24小时后称量血栓干重。
试验数据以均数±标差
Figure BDA0003099103980000191
表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较方差齐性用q检验，方差不齐用Dunnett’s t检验。采用SPSS软件包进行分析。P＜0.05为有显著性差异。
与模型组比较，阳性药复方血栓通胶囊有显著抑制静脉血栓形成作用，差别有统计学意义。
表1 西红花提取物对大鼠静脉血栓形成的影响
Figure BDA0003099103980000192
Figure BDA0003099103980000193
Figure BDA0003099103980000201
注：与模型组比较，*表示P<0.05。
试验例3西红花提取物的抗“肝气郁结和寒凝”型血瘀证作用研究
1.实验材料
同试验例2。
2.实验方法
2.1分组及给药
体重为200-250g的SD大鼠60只，随机分成6组，每组10只，灌胃给药。
正常组：蒸馏水(10ml/kg)
模型组：蒸馏水(10ml/kg)
阳性药组：复方血栓通胶囊0.600g/kg
西红花提取物组：小剂量组(75mg/kg)、中剂量组(150mg/kg)、大剂量组(300mg/kg)。
每天一次，连续5日。
2.2“肝气郁结和寒凝”型血瘀证模型的建立
于给药的第5天，给药后1小时，除正常组外各组大鼠均开始按“肝气郁结和寒凝”型血瘀证模型法，以0.1％肾上腺素0.2ml/只皮下注射，一天2次，间隔6小时，并在其间将大鼠四肢捆绑固定在蛙板上，放入冰水浸没至胸口，浸泡1次5min，室温20℃左右，如此处置，即形成模型，血液增黏，增浓，易凝。处置后全部大鼠禁食，不禁水。
2.3大鼠血液流变学的测定
第6天各组大鼠均腹腔注射乌拉坦(4ml/kg)麻醉，剖腹，腹主动脉抽血6-7ml，分成2份，放入预先用肝素处理的试管，一份3ml，用长针吸约1ml的全血入血沉管，一小时后，观察红细胞的下降距离，以测定血沉值；然后将压积管放入冷冻离心机中3500r/min离心30min，以测定红细胞压积；试管中剩余全血用全自动自清洗血流变仪测全血粘度的低切(10s-1)、中切(60s-1)、高切(120s-1)及计算血沉K值。另一份3-4ml的全血于室温放置1h左右后，放入冷冻离心机中3000r/min 离心10min，取上清液，即所需血浆。用全自动自清洗血流变仪测血浆粘度(120s-1)。
2.4数据统计
试验数据以均数±标差
Figure BDA0003099103980000211
表示，多组间比较用单因素方差分析，两组间比较方差齐性用q检验，方差不齐用Dunnett’s t检验。采用SPSS软件包进行分析。P＜0.05为有显著性差异。
与正常组比较，模型组的全血粘度(低、中、高切)均显著升高；与模型组比较，复方血栓通胶囊及西红花提取物小剂量组对全血粘度无明显影响，西红花提取物中、大剂量组对低切、中切全血粘度有明显影响，对于高切全血粘度无显著影响，结果见表2 。
表2 西红花提取物对大鼠全血粘度的影响
Figure BDA0003099103980000212
Figure BDA0003099103980000213
Figure BDA0003099103980000221
注：与正常组比较，△表示P<0.05；△△表示P<0.01；△△△表示P<0.001；与模型组比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (24)

1.一种西红花提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：取西红花加入5-50倍(v/w)、浓度为0-100％(v/v)的乙醇水溶液,提取1-20h，固液分离，收集滤液，为西红花提取液，减压蒸馏，分离挥发性物质和溶剂；蒸馏物采用萃取或树脂吸附的任一种或其组合进行纯化，收集西红花纯化液，蒸馏分离挥发性物质和有机溶剂，干燥，即得西红花提取物；
所述西红花提取液经过浓缩过滤处理后，再用于树脂或萃取纯化处理，所述浓缩过滤步骤为，将西红花提取液浓缩至相对密度0.8-1.2，浓缩温度为40-80℃，得西红花浓缩液，将西红花浓缩液加入1-10倍水(v/v)搅拌后固液分离，得到的滤液用于树脂或萃取纯化处理；
所述萃取处理包括下述步骤，在西红花提取液中加入5-15倍体积(v/v)的有机溶剂，萃取1-5次，分离，收集有机层浓缩至相对密度为1.0-1.2，所述萃取所用有机溶剂选自正丁醇；
所述树脂选自大孔吸附树脂、非极性至中等级性的聚苯乙烯基大孔吸附树脂D101、HPD100中的任一种或其组合；所述树脂吸附处理包括上柱、洗除杂质、收集洗脱液处理，所述上柱是将西红花提取液上树脂，流速为1-4倍树脂体积/h，所述洗脱步骤选用乙醇水溶液进行洗脱，用于洗脱的乙醇水溶液浓度≥10％(v/v) ，流速为1-4倍树脂体积/h；
所述提取物中所含西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素的重量百分含量之和不低于80％，其中，苦番红花素的重量百分含量不低于25％，提取物中的西红花苷-I：西红花苷-Ⅱ：苦番红花素的质量比为1:0.1-0.6:0.3-1.2。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，蒸馏分离挥发性物质和有机溶剂，先收集蒸馏前期30-40分钟的蒸馏液，再回收有机溶剂，前期收集的蒸馏液精馏，收集75℃以下的馏分，即得西红花精油，西红花精油中藏红花醛的重量百分含量大于60％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，西红花精油单独使用，或与上述西红花提取物复配使用。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述西红花为粉碎成20-100目的西红花粗粉。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述西红花为粉碎成20-40目的西红花粗粉。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙醇水溶液的提取次数为1-5次。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述乙醇水溶液的提取次数为2-4次。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离选自离心、过滤、膜过滤的任一种或其组合。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓缩选自常压浓缩或减压浓缩的任一种或其组合。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述减压浓缩的真空度为-0.06到-0.12MPa。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述减压浓缩的真空度为-0.09到-0.10MPa。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水溶液洗脱的流速为2-5倍树脂体积/h。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥选自喷雾干燥、真空干燥、减压干燥、冷冻干燥中的任一种或其组合。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，喷雾干燥的真空度为-0.06到-0.12MPa，进风温度100-140℃，物料温度40-80℃。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，真空干燥的真空度-0.06到-0.12MPa，干燥温度为40-80℃。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，冷冻干燥的预冻温度为-40到-15℃；第一阶段升华干燥的真空度为1-150Pa，物料温度为-40到-15℃；第二阶段解析干燥的真空度为5-200Pa，物料温度为-15-30℃。
17.如权利要求1-16任一项所述的制备方法制备得到的西红花提取物，其特征在于，提取物中所含西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素的重量百分含量之和不低于80％，其中，苦番红花素的重量百分含量不低于25％，提取物中的西红花苷-I：西红花苷-Ⅱ：苦番红花素的质量比为1:0.1-0.6:0.3-1.2。
18.如权利要求17所述的提取物，其特征在于，提取物中所含西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ和苦番红花素的重量百分含量之和不低于90％，其中，苦番红花素的重量百分含量不低于30％。
19.如权利要求17所述的提取物，其特征在于，提取物中的西红花苷-I：西红花苷-Ⅱ：苦番红花素的质量比为1:0.3-0.5:0.6-0.9。
20.如权利要求17所述的提取物，其特征在于，提取物中总糖的重量百分含量不低于50％。
21.一种西红花药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由权利要求17-20任一项所述的西红花提取物或权利要求1-16任一项所述的方法制备的西红花提取物和药学上可接受的载体组成。
22.如权利要求21所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为散剂、冻干粉针剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、口服溶液剂的任一种。
23.如权利要求17-20任一项所述的西红花提取物或权利要求1-16任一项所述的制备方法制备得到的西红花提取物或如权利要求21-22任一项所述的西红花药物组合物用于制备治疗中老年人轻度脑动脉硬化或其所致的头晕头痛、耳鸣耳聋、视物模糊、记忆力减退、腰膝酸软、肢体麻木的任一种病症或其并发病症的药物中的应用。
24.如权利要求17-20任一项所述的西红花提取物或权利要求1-16任一项所述的制备方法制备得到的西红花提取物或如权利要求21-22任一项所述的西红花药物组合物用于制备治疗脑动脉硬化所致病症、心脑血管疾病的任一种或其并发病症的药物中的应用。
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