KR940008032B1

KR940008032B1 - 면역억제제 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR940008032B1
Application number: KR1019910700795A
Authority: KR
Inventors: 히로시 나가세; 코오지 카와이; 슈우 마쯔모토; 타카시 엔도오; 요시아키 카쯔라; 코오헤이 아라카와
Original assignee: 토오레 카부시키가이샤; 마에다 카쯔노수케
Priority date: 1989-11-28
Filing date: 1990-11-28
Publication date: 1994-09-01
Also published as: EP0456833B1; NO912940D0; GR3015266T3; FI913583A0; DE69017434T2; ATE119039T1; JP2906654B2; AU639053B2; WO1991007966A1; CA2045481A1; EP0456833A1; AU6876891A; KR920700643A; EP0456833A4; US5332818A; JPH03223288A; ES2069100T3; DK0456833T3; DE69017434D1; NO912940L

Abstract

내용 없음.

Description

면역억제제 및 그 제조방법

면역억제제는, 주로 장기를 이식할 때에 생기는 거절반응을 억제하기 위하여 필요불가결한 것이다.

1980년 이전에는 실제로 면역억제제라고 호칭되는 것이 없었고, 가장 쉽게 생각되는 취장이식에 조차 성공률은 7% 이하였다.

1980년에 도달하여 사이클로스폴린 A가 출현하고, 장기 이식의 성공률이 비약적으로 향상되며, 진실한장기이식 시대가 시작하였다. 그러나, 사이클로스폴린 A은 신장에 대한 독성이 대단히 강하고, 현재에서는 다른 약과 병용하여, 사이클로스폴린 A의 사용량을 약간이라도 줄이는 고안이 이루어져 있다. 1984년에, 방선균에서 FK-506이 발견되었다.

이 화합물은 사이클로스폴린 A의 10배에서 100배의 면역억제 효과가 있다고 말하며, 당초는 콩팥 독성등의 부작용도 그다지 없다고 생각되고 있었지만(사이언스, 1월호, 62, 1989년), 최근에 와서는 이 FK-506은 콩팥독성은 사이클로스폴린 A보다 강하고, 더우기 간독성도 강하다는 것이 명학하게 되어 이들의 화합물 대신 저독성으로서, 면역역제 활성이 강한 약재가 요구되고 있다.

또, 일반적으로, 약물의 투여방법으로서는, 의사가 입회할 필요가 없고, 자택에서도 손쉽게 투여할 수 있는 점에서 경구투여가 가장 뛰어나지만, 사이클로스폴린 A은 경구제로서의 활성이 불충분하다.

한편, 모르핀 등의 진통약의 작용 기구의 연구를 통하여, 뇌를 시작으로 하는 각종 장기에는 이들 물질이 특이적으로 결합하는 부위, 즉, 오피오이드 수용체가 존재하고 있는 것이 알려져 있다.

그리고, 이 수용체에 결합하여 진통작용등의 약리작용을 발현하는 화합물은 작용제(agonist)로 호칭하고있다.

또, 상기한 오피오이드 수용체에 친화성을 보유하고 있지만, 그 자체는 오피오이드 작용을 보유하지 않고, 오피오이드 물질의 작용과 대항하는 물질은 오피오이드 길항제(antigonist)라고 호칭된다.

이와 같은 오피오이드 길항제로서는, 종래에, 나로키손, 나르토렉손이 알려져 있고, 모르핀 등의 작용제의 진통작용의 해명이나, 모르핀 등 마약의 투여에 의하여 발생하는 부작용인 호흡억제의 치료에 이용되고있다.

최근에는, 이 오피오이드 수용체에, μ,x,δ의 3개의 서브타입이 존재하고 있는 것이 발견되어, 각각의 서브타입의 작용을 연구하기 위하여, 각각의 수용체 서브타입에 특이적으로 결합하는 리간드, 즉 작용제,길항제가 요구되고 있다.

실제에, 이들의 서브타입중에서 μ수용체에 비교적 선택성을 나타내는 모르핀의 부작용중에서도 중독한 탐뇨성, 호흡억제등은 μ수용체에서 발생하고 있는 것이 명확하게 되었다.

이 연구에 의하여, 오피오이드계의 진통제의 중독한 부작용인 탐뇨성, 호흡억제등이 없는 이상적인 진통제를 합성하는 데는, 적어도 μ수용체를 피하고, χ 또는 δ수용체에 선택성이 높은 화합물을 지향하는 것이 바람직하다고 생각된다.

이와 같이, 오피오이드 수용체의 서브타입으로 선택성이 높은 길항제는 진통제의 작용기서의 연구뿐만 아니라 이상적인 진통제의 개발에 필요하다.

더우기, 최근에는 오피오이드 수용체가 면역계에 관계하고 있는 것이 발견되고, 특히, 그중 μ수용체에 작용하는 모르핀으로 대표되는 작용제는 면역억제 작용을 나타내고, 인캐파린으로 대표되는 δ수용체의 작용제는 면역증강작용을 나타내는 것이 보고되었다(Plotnikoff저, Enkephalins and endorphins, Strees and immune system, Plenum Press,1986년) .

현재, 모르핀으로 대표되는 μ수용체 작용제의 면역억제 작용에 대한 보고는 많이 존재하지만 ,μ수용체의 작용제는 탐뇨성, 호흡억제 등의 중독한 부작용을 보유하여 면역억제제로서 개발하는 것은 곤란하다.

발명의 개시

본 발명은, 독성이 낮고, 경구제로서도 충분한 면역억제성을 보유하는 신규하며 이상적인 면역억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또, 본 발명은 번잡한 후처리를 필요로 하지 않고, 고수율로 본 발명의 면역억제제를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본원 발명자는 상술한 목적을 달성하기 위하여, 예의 연구한 결과, 사이클로스폴린 A이나 FK-506과 전혀 작용기서가 다른 면역억제제 및 그 고수율의 제조방법을 발견하기에 이르러 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은, δ-오피오이드 길항제 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 면역억제제를 제공한다.

더우기, 본 발명은, 나르토랙손 또는 그 영과 페닐히드라진 유도체를 용매중 메탄술폰산 존재하에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 하기식[6]

[식중, R₇은 수소, 염소 브롬, 불소, 메틸, 메톡시 또는 니트로를 표현한다]으로 표시되는 나르톨인돌 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 면역억제제는, 종래의 사이클로스폴린 A이나 FK-506의 결점이었던 독성을 대폭으로 개선하면서, 비경구 투여뿐만 아니라, 경구투여에 의하여도 뛰어난 면역억제활성을 나타낸다.

또, 본 발명의 면역억제제의 제조방법에 의하면 간단한 조작으로 고수율로 면역억제제를 제조할 수 있게된다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

상술한 바와 같이, 본 발명의 면역억제제는 δ-오피오이드 길항제 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 한다. 여기서 말하는 δ-오피오이드 길항제는 전기자극에 의한 MVD 표본의 수축을 DADLE또는 DPDPE가 억제하는 것을 저해하는 화합물군으로, 바람직하게는 그 효력이 Ke 값으로 50이하의 화합물군을 가리킨다(H. W. Kostertitz 등, Br. J. Pharmaco1. Vo1. 46,764, 1972, P.S. Portoghese등, Eur. J. Pharmacol., Vo1. 146,185, 1988).

Ke 값은, 식 Ke=[길항제]/(IC₅₀비-1)로 표현된다.

여기서, IC₅₀비는, 길항체 존재하에서 측정된 작용체의 IC₅₀을, 길항제가 존재하지 않는 상태에서 측정된IC₅₀값으로 나눈 값을 표시한다. 또, Ke 값은 IC₅₀비에 길항제의 농도를 고리에 넣기 위하여 도입된 값이다. 따라서, Ke 값이 작을수록 길항체 활성이 강하게 된다. δ-오피오이드 길항제로서 바람직한 것으로,하기 일반식[1]으로 표시되는 것을 들 수 있다.

일반식[1]으로 표현되는 화합물중에서, 특히 바람직한 것은, R₁은 탄소수 1 내지 5의 알킬, 탄소수 3 내지6의 시클로알킬알킬, 탄소수 7 내지 10의 아랄킬, 또는, 알릴이고, R₂는 수소 또는 히드록시이며, R₃은 수소이고, R₄는 수소, 불소, 메틸, 메톡시 또는 니트로이며, R₅는 수소, X는 산소 또는 NR₆(여기서, R₆은 수소 또는 탄소수 1 내지 5의 알킬)인 것이다.

이들 중, 특히 바람직한 것은 하기식[3] 내지 [5]에 표시하는 것이다.

또한 식(3)의 화합물은, 나트로렉손에 인돌을 축환하므로써 나르톨인돌(NTI)로 명명되어 있고(P. S.Portoghese 등, J. Med. Chem., 제31권, No2.1988년).

식(5)의 화합물은, 그것에 관련되어 나록시인돌(NLl)로 명명하였다.

식(4)의 화합물은 나르톨벤조푸란(NTB)으로 명명된다.

또, 바람직한 δ-오피오이드 길항제로서 하기식(2)으로 표시되는 화합물도 들 수 있다.

본 발명의 일반식(1) 내지 (5)로 표시되는 화합물의 약리학적으로 허용되는 염이란, 바람직하기는 염산염, 황산염, 브롬화수소염, 인산염 등의 무기산염, 또는 메탄술폰산, 초산, 말레산, 푸마르산, 안식향산, 푸탈산, 글르타르산, 푸말산, 주석산, 시트르산, 젓간, 사과산, 톨루엔술폰산 등의 유기산염이 열거되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

일반식(1)으로 표시되는 화합물은 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다(P. S. Portoghese 등, J.Med. Chem., 제31권, No2, 282, 1988년). 특히, 일반식(l)으로 표시되는 화합물중, R_l이 알릴기, R₂가수산기, R₃,R₅가 수소, R₄가 전기한 정의와 동일한 화합물은 구체적으로 아래와 같은 방법으로 얻어진다.

즉, 나록손염산염을 페닐히드라진 또는 치환 페닐히드라진과 동시에 용매에 용해하고, 메탄술폰산을 가하여, 교반하면서 반응을 계속한 후, 반응혼합물을 실온까지 냉각시켜, 석출한 침전을 여과시키므로써, 일부메탄술폰산염으로서 얻어진다.

나머지는 모액(母液)을 탄산수소나트륨 중에서 중화한 후, 용매로 추출하므로써 얻어진다.

치환페닐히드라진 유도체로서는, 2-플루오르페닐히드라진, 4-플루오르페닐히드라진, 2-메틸페닐히드라진, 4-메틸페닐히드라진, 4-메톡시페닐히드라진, 4-니트로페닐히드라진 등의 할로겐, 메틸, 메톡시 또는 니트로에서 치환된 페닐히드라진을 열거할 수 있지만, 물론 이것으로 한정되는 것은 아니다.

히드라지 유도체는, 1 내지 10당량의 범위에 사용할 수 있고, 실용상 1 내지 2당량으로 충분히 만족할만한 결과가 얻어진다.

용매로서는, 알코올제의 용매가 바람직하고, 그중에서도 에탄올이 가장 바람직하게 사용된다.

반응온도는 0 내지 150℃의 범위에서 실행할 수 있지만, 그중에서도 20 내지 90℃가 바람직하고, 특히 80℃ 전후가 바람직하다.

또, 식(6)으로 표시되는 화합물은 나르토렉손 또는 그 염과 페닐히드라진 유도체를 용매중 메탄술폰산 존재하에서 반응시킴에 의하여 제조할 수 있고 바람직하기는 아래에 표시한 바와 같은 조건에 따라서 제조된다.

즉, 나르토렉손 염산염 또는 프리 나르토렉손을 페닐히드라진 유도체를 용매중 메탄술폰산 죤재하에서 반응시킴에 의하여 제조할 수 있고 바람직하기는 아래에 표시한 바와 같은 조건에 따라서 제조된다.

즉, 나르토렉손 염산염 또는 프리 나르토렉손을 페닐히드라진 유도체와 함께 용매에 용해하고, 메탄술폰산을 가하여 교반하면서 더우기 반응을 계속한 후 반응혼합물을 실온까지 냉각시켜, 석출한 침전을 여과하므로써 순수한 메탄술폰산염으로서 얻어진다.

페닐히드라진 유도체는, 1 내지 10당량의 범위에서 사용할 수 있고 용매로서는, 알코올계의 것이 바람직하여 그중에서도 메탄올이 가장 바람직하게 사용된다.

반응온도는 0 내지 150℃의 범위에서 실행할 수 있지만, 그중에서 20 내지 90℃가 바람직하고, 특히 75내지 85℃가 바람직하다.

메탄술폰산은, 1 내지 20당량이 사용되며, 특히 8 내지 12당량이 바람직하다.

페닐히드라진 유도체로서는, 2-플루오르페닐히드라진, 4-플루오르페닐히드라진, 2-클로로페닐히드라진, 4-클로로페닐히드라진, 2-메틸페닐히드라진, 4-메틸페닐히드라진, 4-메톡시페닐히드라진, 4-니트로페닐히드라진 등을 열거할 수 있지만, 물론 이것으로 한정되는 것은 아니다.

메탄술폰산염 이외의 염은, 생성된 나르톨인돌의 메탄술폰산염을 유기용매로 현탁하고, 염기의 수용액으로 중화한 후 유기용매로 추출하므로써 얻어지는 프리 나르톨인돌을 재차 용매로 용해하고, 상당하는 산을 가하므로써 얻어진다.

또, 본 발명의 일반식(2)으로 표시되는 δ길항제, 국제공개 WO89/00995호에 명시되는 공지된 방법에 의하여 제조할 수 있다. 본 발명의 면역억제제를 임상으로 투여하는 경우, 그 제형으로서는, 주사제, 캡슐제, 좌제, 경구제 등 여러가지 형태가 사용된다.

그중에서도 주사제, 경구제가 바람직하게 사용된다.

또, 본 발명의 면역억제제는, 상기한 δ-길항제 그 자체라도 좋고, 또, 안정제, 완충제, 희석제, 등장제, 방부제 등의 부형제를 적당히 혼합하여도 좋다.

본 발명의 면역역제제는, 상기한 유효성분을 1 내지 90중량%, 보다 바람직하기는 30 내지 70중량% 함유하는 것이 바람직하다.

또, 본 발명의 면역억제제의 투여량은, 투여대상, 투여방법, 증상에 따라서 적당히 선택되지만, 유효성분으로 주사제의 경우는 0.001 내지 lg/1일의 범위로, 경구의 경우는 0.01 내지 10g/1일의 범위로 투여된다.

이하에, 본 발명의 실시예에 대하여 설명하지만, 본 발명은 이것으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명은, 면역억제제및 그 제조방법에 관한 것이다.

제1도는 본 발명의 면역억제제인 나록시인돌(NLI)의 농도변화에 의한 길항작용을 표시하는 도면,

제2도는 나르톨인돌(NTI)의 농도변화에 의한 길항작용을 표시하는 도면이다.

나록시인돌(NLI) 메에탄술폰산염 및 염산염의 합성

나록손염산염 1g과 페닐히드라진 0.3ml을 20ml의 에탄올에 용해하고, 가열, 환류중에 메탄술폰산 2.6ml을 가하고 교반하면서 다시 1.5시간 환류하였다.

반응혼합물을 실온까지 냉각시켜 석출한 결정을 여과하면, 0.25g의 나록시인돌 메탄술폰산염이 얻어진다.

모액을 탄산수소나트륨의 포화수용액으로 중화한 후 에탄올, 클로로포름을 가하여 교반한 후 슈우퍼셀로 여과하고, 여과액을 클로로포름으로 추출하며, 유기층을 합쳐서 황산나트륨으로 건조하였다.

이 유기층을 농축한 후, 세파데스칼럼(LH-20. MeOH)으로 정제하면 나머지의 나록시인돌이 얻어졌다.

얻어진 화합물을 초산에틸에 용해하고, 방냉하에서 염산포화된 초산에틸용액을 적하시키면 나록시인돌 염산염 0.87g이 얻어졌다.

여기서 얻어진 NLI의 메탄술폰산염 및 염산염의 원소분석치는, 아래와 같은 계산치와 일치하였다.

나록시인돌·메탄술폰산염(침형상결정, 분해점:253-257℃, 재결정용매:에탄올, 클로로포름)의 원소분석치:C₂₅H₂₄N₂O₃. M_eSO₃H.H₂0로서

계산치:C;60.68, H;5.88, N;5.44, S;6.23

실측치:C;60.65, H;5.75, N;5.32, S;6.14

NLI 염산염의 원소분석치:

계산치:C;67.33, H;5.88, N;6.28, S;7.95

실측치:C;67.00, H;5.92, N;6.02, S;7.60

[실시예 2]

나록시인돌의 합성

실시예 1에서 얻어진 나록시인돌의 염산염 0.78g을 클로로포름에 현탁시켜, 탄산수소나트륨의 포화수용액을 가하여 1시간 실온에서 교반하였다.

이 혼합물에 클로로포름을 가하고, 3회 추출한 후 유기층을 합쳐서 포화식염수로 세정하여 건조, 농축하면 0.6g의 순수한 나록시인돌이 얻어졌다.

얻어진 화합물의 분석 결과는 아래와 같았다.

IR(KBr)cm^-1:3392,2934,2840,1638,1620,1504,1458,928

NMR(CDC1₃):1.78(lH,d,j=12.7Hz), 2.20∼2.45(2H,complex pattern),2.62(2H,d,j=15. 6Hz), 2.75 ∼ 2.90 (2H, complex), 3.10 ∼ 3.25 (4H, complex), 5.15 ∼ 5.30 (2H, m) , 5.70 (1H, s), 5.90 (1H, m), 6.51(1H, d, j = 8.3Hz), 6.57(1H, d, j = 8.3Hz), 7.02 (1H, m), 7.14 (1H, m), 7.26(1H, m), 7.40 (1H, d, j = 7.8Hz), 8.19(1H, s)

MASS(FAB) : 399(M⁺-1)

또 이상의 조작에 있어서, 페닐히드라진 대신에 2-플루오르히드라진을 사용하면 7-플루오르나록시인돌이 얻어지며, 4-플루오르히드라진을 사용하면 5'-플루오르나록시인돌이 얻어지고, 2-메틸페닐히드라진을 사용하면 7'-메틸나록시인돌이 얻어지며, 4-메틸페닐히드라진을 사용하면 5'-메틸나록시인돌이 얻어지고, 4-니트로페닐히드라진을 사용하면 5'-니트로나록시인돌이 얻어진다.

[실시예 3]

나트륨인돌메탄술폰산염의 합성

나르토렉손염산염 1g과 페닐히드라진 0.3ml를 20ml의 에탄올에 용해하고, 가열, 환류중에 메탄술폰산 2.6ml를 가하고 교반하면서, 다시 1.5시간 환류하였다.

반응혼합물을 실온까지 냉각시켜 석출한 결정을 여과시키면, 1.1g의 나트륨인돌 메탄술폰산염이 얻어진다.

이 염을 에탄올에서 재결정하면, 0.93g의 나트륨인돌 메탄술폰산염(분해점>300℃)이 얻어졌다.

여기서 얻어진 나트륨인돌메탄술폰산염은 건조하면 아래와 같은 만족할만한 원소분석치를 표시하였다.

원소분석치 : C₂₆H₂₆N₂O₃, H₂O. CH₃SO₃H로서

계산치: C;61.35, H;6.10, N;5.30, S;6.07

실측치:C;61.61, H;6.04, N;5.28, S;5.77

[실시예 4]

나트륨인돌의 합성

실시예 3에서 얻어진 나트륨인돌메탄술폰산염 0.9g을 10ml의 클로로포름에 현탁하고, 탄산수소나트륨의 포화수용액을 가하여 실온에서 1시간 교반시킨후, 다시 클로로포름을 가해서 3회 추출하였다.

유기층을 합쳐서 포화식염수로 세정하여 건조농축시키면 순수한 나트륨인돌 0.7g이 얻어진다.

얻어진 화합물의 븐석결과는 아래와 같았다.

IR(KBr)cm^-1:3392,2926,2838,1638,1622,1504,1458

NMR(CDC1₃):0.07(2H, m), 0.58(2H, m), 0.88(1H, m), 1.80(1H, m),2.20∼2.60(complex pattern), 2.63(1H, d, j =153Hz), 2.90 (1H, d, j =15.3Hz), 3.14(1H, d, j =18.5Hz), 5.70(1H, s), 6.59(2H, m), 7.03(1H, m), 7.18 (1H, m), 7.29 (1H, d, j = 8.3Hz), 7.41(1H, d, j = 8.3Hz)

MASS (FAB) : 413 (M -1), 415(M +1)

[실시예 5]

실시예 1 또는 3에서 각각 얻어진 나록시인돌 염산염 및 나트륨인돌메탄술폰산염을 사용하여, 아래의 방법으로 길항제 활성을 측정하였다.

즉 모르모트의 회장(回腸)(μ,x수용체를 함유함) 및 마우스의 수정관(μ,δ수용치를 함유함)을 사용하고,각각 장기의 적출표본의 전기자극에 의한 수축을 모르핀(δ), EKC(K), DADLE(δ)의 각각의 작용제 억제하는 것을 저해하는 능력을 측정하였다.

결과를 표 1에 표시하였다.

[표 1]

시험과내에 있어서 NTI와 NLI의 길항작용

*는 S.E를 의미함.

표 1의 결과로부터, NTI와 NLI를 비교하면, δ수용체에 대한친화성은, NLI는 약간 NTI에 뒤떨어져 있지만, μ, x수용체에 대한 δ수용체의 선택성에 관해서는, NTI가 각각 약 100배인 것에 비교하여, NLI는 각각 약 250배와 400배로서, 대단히 뛰어나고 있다.

다음에, NLI, NTI의 농도가 각 수용체의 길항작용에 대하여 영향이 있는지를 제1도 및 제2도에 표시하였다.

제l도 및 제2도에 표시되는 바와 같이, NTI의 3개의 수용체에 대한 길항작용은 각각 농도 의존적으로 증가하고 있다. 한편, NLI는 농도를 높게 하면 할수록 μ, x수용체에 대한 δ수용체 선택성이 증가하는 것을 나타내고 있으며, 뛰어난 이상인적인 δ선택적 길항제라고 말할 수 있다.

[실시예 6]

마이토젠반응의 억제

마우스의 비세포를 콘카나바린 A(이하, ConA라고 약칭함)의 존재하에서 시험관 배양하면 세포가 분일, 증식하게 된다(마이토젠반응).

이 계에, 본 발명에 관한 면역억제제 및 비교예로서 사이클로스폴린 A를 첨가하고, 마이토젠 반응에 대한 작용을 조사하였다.

구체적으로는, C57BL/6마우스를 죽여서 비장을 적출하여,19% 소(牛) 태아혈청 함유 RPMI 1640배양액(이하, RPMI 1640이 라고 약칭함) 을 사용하여, 비세포부유액 (5 ×10⁶개/ml) 을 조제하였다.

이 부유액 100μ1을 96웰 평저 마이크로플레이트의 웰에 넣고, 다시 ConA함유(4μg/ml) RPMI1640 배양액 50μ1, 및 표-2에 표시되는 농도의 피검화합물함유 RPMI1640 배양액 50μl을 첨가하고 48시간 배양하였다(37℃,5% CO2).

대조군에는 RPMI 1640 배양액 50μ1을 첨가하였다.

그리고 배양종료 8시간전에,[³H]티미딘 2μCi를 첨가하였다. 배양종료 후, 셀하아베스터에 의하여 비세포를 여과지위로 회수하였다.

여과지는 건조 후, 톨루엔계 신틸레이터를 놓은 바이어트에 넣고, 액체신틸레이션 카운터로 방사능을 측정하였다.

마이토젠 반응억제율은 다음식에 의하여 산출하였다.

결과를 표2에 표시하였다.

[표 2]

표2에 표시되는 바와 같이, 본 발명에 관한 면역억제제는 콘카나발린 A에 의하여 세포가 증식하는 것을 억제하는 것이 명확하게 되었다.

또, 콘카나발린 A자극에 의한 시험관에서의 실험시에, 사이클로스폴린 A는 1g/m1에서 이미 세포독성이 관찰되지만, 본 발명에 관한 면역억제제는 같은 양에서 독성을 전혀 볼 수 없다.

이와같이, 본 발명의 화합물은 사이클로스폴린 A와 동등한 활성을 나타내며 독성은 낮다고 하는 면역역제제로서 이상적인 성질을 보유하는 것이 명확하게 되었다.

[실시예 7]

MLR반응의 억제

유전적으로 다른 2계통의 마우스 비세포를 혼합하여 시험관내에서 배양하면, 비세포가 상태를 인식하여 분열, 증식을 일으킨다(MLR 반응).

이 계통에 NTI, NTB 및 NLI염산염 및 비교예로서 사이클로스폴린 A를 첨가하고, MLR반응에 대한 작용을 조사하였다.

우선, Balb/c 마우스를 죽여서 비장을 적출하고, RPMI 1640을 사용하여 비세포 부유액(1×10⁷개/ml)을 조사하였다.

이 비세포에 대하여, 마이토마이신 C함유 RPMI l640중에서 30분간 배양(37℃)하므로써 마이토마이신처리를 실시하였다.

또, C 57BL/6 마우스를 죽여서 비장을 적출하고, RPMI 1640을 사용하여 비세포 부유액(1×106개/ml)을 조제하였다.

다음에, C 57BL/6마우스 비세포부유액 100μ1, 마이토마이신 처리 Balb/c 마우스 비세포부유액 50μ1 및피검화합물함유 RPMI 1640배양액 50μ1을 96웰 평저마이크로플레이트의 웰에 넣고, 72시간 배양(37℃,5%CO₂)하였다.

대조군에는 RPMI 1640배양액 50μ1을 첨가하였다.

배양종료전 8시간에 있어[3H] 티미딘 2μCi를 첨가하였다.

배양종료 후, 센하아베스터에 의하여 비세포를 여과지위에서 회수하였다.

여과지는 건조 후, 톨루엔계 신틸레이터에,넣고 바이어르에 넣고, 액체신틸레이션 카운터로 방사능을 측정하였다.

MLR 반응억제물은 다음 식에 의하여 산출하였다.

결과를 표3에 표시하였다.

[표 3]

표3에 표시되는 바와 같이 NTI, NTB 및 NLI 염산염에 의하여 MLR 반응이 억제되는 것이 명확하게되었다.

[실시예 8]

이식편 대 숙주반응의 억제

F1 마우스에 친계의 마우스의 비세포를 이식하면, 이식편 대 숙주반응이 일어나는 것이 알려져 있다.

이 계에 있어서, NTI, NTB 및 사이클로스폴린 A를 F1 마우스에 투여하고, 이식편 대 숙주반응에 대한 작용을 조사하였다.

우선, C 57BL/마우스를 죽여서, 비장을 적출하고, 인사완충생리 식염수를 사용하여 비세포부유액(2×10⁸개/ml)을 조제하였다.

다음에, 이 비세포부유액 50μ1을 BDF1 마우스의 좌측 뒷다리 발밑피하에 투여하였다.

같은 날로부터 피검화합물 투여를 1일 1회 5일간 계속하였다.

투여량은 100mg/kg으로 하고, 0.5% 카르복시메틸 셀룰로오스(이하, CMC라고 약칭함)액에 현탁하고 경구투여하였다.

대조군에는 0.5% CMC만을 마찬가기로 투여하였다.

비세포를 투여한 날에서 7일째에 마우스를 죽이고, 좌우의 뒷다리 무릎을 임파절을 적출하고, 그 중량을 측정하였다.

좌우의 임파절 중량차를 계산하고, 이식편 대 숙주반응의 지표로 하였다.

얻어진 결과는, 스튜던트의 t검정에 의하여 대조군에 대해서, 위험률 P<0.02 혹은 P<0.05이며, 유의한것에는 * * 표 혹은 *표를 붙였다.

이식편 대 숙주반응억제율은 다음식에 의하여 산출하였다.

결과를 표4에 표시하였다.

[표 4]

표4에 표시된 바와 같이, NTI, NTB에 의하여 이식편 대 숙주반응은 억제되었다. 특히, 본 실시예에 있어서는, 피검화합물의 투여는 경구로 실시한 것이지만, 사이클로스폴린 A보다 강한 활성을 표시하였다.

더우기, 이 이식편 대 숙주반응의 실험은 장기이식의 모델 실험으로서 유명한 것이고, 이 실험에서 사이클로스폴린 A보다 강한 활성을 표시한 것은 면역억제제로서 사용할 수 있는 것을 의미하는 것이다.

산업상의 이용 가능성

본 발명의 면역억제제는 이상과 같이 구성되었으므로, 종래의 사이클로스폴린 A이나 FK-506의 결점이었던 독성을 대폭으로 개선하면서 뛰어난 면역억제활성을 나타내고, 경구투여도 가능하다. 따라서, 본 발명의 면역억제제는 장기이식시에 생기는 거절반응을 억제하기 위하여 사용할 수 있다.

또, 본 발명의 면역억체체의 제조방법에 의하면 간단한 조작으로 고수율로 면역억제제를 제조할 수 있게되어 공업적으로 대량생산을 실시할 수 있게 되었다.

Claims

하기 일반식(1)

[식중, R₁은 탄소수 1 내지 5의 알킬, 탄소수 3 내지 6의 시클로알킬알킬, 탄소수 7 내지 10의 알릴을 표시하고, R₂는 수소, 히드록시 또는 탄소수 1 내지 5의 알카노일옥시를 표시하고, R₃는 수소, 탄소수 1 내지 5의 알킬 또는 탄소수 1 내지 5의 알카노일을 표시하며, X는 산소 또는 Y가 결합한 질소를 표시하고,Y는 수소 또는 탄소수 1 내지 5의 알킬기를 표시하며, R₄와 R₅은 별개로 수소, 불소, 염소, 브롬, 니트로, 탄소수 1 내지 5의 알킬, 또는 R₄, R₅을 결합하여 벤조를 표시한다]로 표시되는 δ-오피오이드 길항제 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 면역억제제.
제2항에 있어서, 일반식[1]에 있어서, R₁은 탄소수 1 내지 5의 알킬, 탄소수 3 내지 6의 시클로알킬알킬, 또는 알릴이고, R₂는 수소 또는 히드록시이며, R₃는 수소이고, R₄는 수소, 불소, 메틸, 메톡시 또는니트로이며, R₅는 수소, X는 산소 또는 NR₆(여기서, R₆은 수소 또는 탄소수 1 내지 5의 알킬)인 것을 특징으로 하는 면역억제제.
제2항에 있어서, 전기한 일반식[1]로 표시되는 δ-오피오이드 길항제는 하기식[3]으로 표시되는 것을 특징으로 하는 면역억제제.
제2항에 있어서, 전기한 일반식[1]으로 표시되는 δ-오피오이드 길항제는 하기식[4]으로 표시되는것을 특징으로 하는 면역역제제.
제2항에 있어서, 전기한 일반식[1]으로 표현되는 δ-오피오이드 길항제는 하기식[5]으로 표시되는것을 특징으로 하는 면역억제제.
나트로렉손 또는 그 염과 페닐히드라린 유도체를 용매중에서 메탄술폰산 존재하에 반응시키는 것을 특징으로 하는 하기식[6]

[식중, R₇은 수소, 염소, 브롬, 불소, 메틸, 메톡시 또는 니트로를 표시한다]으로 표시되는 나르톨인돌 유도체의 제조방법.