KR20240094390A

KR20240094390A - 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20240094390A
Application number: KR1020220176629A
Authority: KR
Inventors: 이태훈; 이선우; 박상욱; 지하오 첸; 데바네얀 조셉
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2022-12-16
Filing date: 2022-12-16
Publication date: 2024-06-25
Also published as: WO2024128359A1

Abstract

본 발명은 특정 화합물을 포함함으로써, 파골세포 분화 및/또는 생성을 억제하는 효과를 가져, 골다공증 등을 포함하는 골질환에 대한 우수한 약효 및 건강기능성을 나타낼 수 있는 조성물에 관한 것이다.

Description

골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical compositions for preventing or treating bone diseases}

본 발명은 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 구체적으로 파골세포의 분화 및/또는 생성을 억제하는 효과를 갖는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

뼈 조직 리모델링은 파골 세포를 통한 뼈 재흡수에 의해 조절되는 반면, 뼈 형성은 조골 세포를 사용하여 조절된다. 파골 세포는 뼈를 흡수하여 뼈 손실을 일으키는 다핵의 큰 세포이다. 건강한 뼈에서 뼈 재흡수와 뼈 형성 사이의 역학은 통합되고 균형이 잡혀있다.

그러나, 뼈 흡수가 뼈 형성을 초과하여 발생하게 되면 골다공증과 같은 일반적인 골질환이 발생할 수 있다. 골다공증에 대한 가장 일반적이고 이용 가능한 치료법은 비스포스포네이트 및 핵 인자 카파-B(NF-κB) 리간드(RANKL) 항체의 수용체 활성화제와 같은 항흡수 약물을 사용하는 것이다. 그러나 비스포스포네이트계 약물의 사용은 턱뼈 괴사, 저칼슘혈증, 위장관 장애 등의 부작용과 관련이 있고, 따라서 효과적이고 새로운 골다공증 치료제 발굴이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제1992821호

본 발명은 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공함에 있다.

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:

[화학식 1], 상기 식에서, R₁은 H이고 R₂는 이고; 또는 R₁은 -OX₁이고 R₂는 H이고, 상기 X₁은 또는 이고, 상기 Q₂는 -CF₃, -CCl₃ 또는 이고, 상기 Q₁은 C_1-5인 알킬이고, 상기 R₃는 C_1-5인 알킬 또는 할로젠 원소임.

2. 위 1에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 것인, 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:

[화학식 2], [화학식 3].

3. 위 1에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 것인, 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물: [화학식 4], [화학식 5], [화학식 6] 및 [화학식 7].

4. 위 1에 있어서, 상기 골질환은 골절, 골다공증, 류마티스 관절염, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축, 골관절염 및 무혈성대퇴골괴사로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.

5. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품:

6. 위 5에 있어서, 상기 골질환은 골절, 골다공증, 류마티스 관절염, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축, 골관절염 및 무혈성대퇴골괴사로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.

본 발명의 조성물은 파골세포 분화 및/또는 생성을 억제하는 효과를 가짐으로써 골질환에 대한 우수한 약효 및 건강기능성을 나타낼 수 있다.

도 1은 본원 실시예의 2-NPPA 유도체의 합성 경로를 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 본원 실시예의 D-35-SL-04, D-35-SL-06, D-35-SL-10이 in vitro에서 BMP2-유도 조골세포 분화에 유의한 효과를 보이지 않은 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본원 실시예의 D-35-SL-10이 in vitro에서 RANKL 유도 파골세포 형성을 약화시킨 실험 결과를 나타낸 것이다. *P < .05, **P < .01, ***P < .001 vs. 비히클 처리 Con(0 μM); "Con": M-CSF 및 RANKL 처리; "M": M-CSF 처리, scale bar= 200μm.
도 4는 본원 실시예의 D-35-SL-10이 in vitro에서 RANKL에 의해 유도된 F-액틴 고리 형성 및 골 흡수를 억제한 실험 결과를 나타낸 것이다. 막대: ±SD; *P < .05, **P < .01, ***P < .001 vs. 비히클 처리 대조군 (M+R, 0 μM D-35-SL-10 처리); “M": M-CSF 처리; "M+R": M-CSF 및 RANKL 처리; scale bar = 200 μm.
도 5는 본원 실시예의 D-35-SL-10이 파골세포의 기능과 파골세포 특이적 유전자 발현을 억제한 실험 결과를 나타낸 것이다. 막대: ±SD; *P < .05, **P < .01, ***P < .001 vs. 비히클 처리 대조군 (M+R, 0 μM)
도 6은 본원 실시예의 D-35-SL-10이 RANKL에 의해 유도된 TRAF6 발현과 P13K/AKT 및 IκBa/NF-κB 신호 전달 경로의 활성화를 억제한 실험 결과를 나타낸 것이다. "M": M-CSF; "R": RANKL; "D": DMSO; 각 그룹에서 DMSO 백분율은 동일하다.
도 7a-b는 본원 실시예의 D-35-SL-10이 OVX 유도 골다공증 마우스 모델에서 골 손실을 완화한 실험 결과를 나타낸 것이다. *P < .05, **P < .01, ***P < .001 vs. 비히클 처리 대조군 (OVX 또는 2-NPPA 처리)
도 8은 본원 실시예의 D-35-SL-10에 대한 ADME 분석 결과를 도식화한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 화합물은 N-페닐 아세트아마이드 및 모르폴린을 핵심 작용기로 하며, N-페닐에 추가적인 치환기 도입을 통해 효과적으로 파골세포 분화를 억제함으로써 골질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.

구체적으로, 상기 식에서, R₁은 H이고 R₂는 이고; 또는

R₁은 -OX₁이고 R₂는 H이고, 상기 X₁은 또는 이고, 상기 Q₂는 -CF₃, -CCl₃ 또는 이고, 상기 Q₁은 C_1-5인 알킬이고, 상기 R₃는 C_1-5인 알킬 또는 할로젠 원소일 수 있다.

상기 C_1-5인 알킬은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 측쇄의, 포화된, 1가 탄화수소 그룹, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, tert-부틸, n-펜틸, n-헥실 또는 이들의 이성질체일 수 있다.

상기 할로젠 원소는 F, Cl, Br 또는 I일 수 있고, 구체적으로 F 또는 Cl일 수 있다.

예를 들면 상기 화학식의 R₃결합 위치는 [화학식 2] 또는 [화학식 3]으로 표시될 수 있다.

예를 들면, 상기 화합물은 [화학식 4], [화학식 5], [화학식 6] 및 [화학식 7]로 이루어진 군에서 선택된 화학식으로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명에 포함되는 화합물은 천연으로부터 유래될 수도 있고, 공지의 화학적 합성 방법을 이용하여 합성될 수도 있다.

상기 화합물의 염은 약학적으로 허용되는 염일 수 있다.

염은 예를 들면 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산， 인산, 황산， 브롬화수소산, 요드화수소산， 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트，페닐-치환된 알카노에이트， 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류， 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적 또는 식품학적으로 무독한 염류로는 설페이트， 피로설페이트， 바이설페이트， 설파이트， 바이설파이트, 니트레이트， 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트， 메타포스페이트， 피로포스페이트 클로라이드，브로마이드， 아이오다이드, 플루오라이드， 아세테이트 프로피오네이트， 데카노에이트， 카프릴레이트， 아크릴레이트， 포메이트， 이소부티레이트， 카프레이트， 헵타노에이트， 프로피을레이트, 옥살레이트， 말로네이트， 석시네이트， 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트， 말리에이트， 부틴- 1,4-디오에이트, 핵산 -1，6-디오에이트, 벤조에이트， 클로로벤조에이트， 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트， 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트，벤젠설포네이트， 를투엔설포네이트， 클로로벤젠설포네이트， 크실렌설포네이트，페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트， 페닐부티레이트， 시트레이트， 락테이트，β-하이드톡시부티레이트, 글리콜레이트， 말레이트， 타트레이트 메탄설포네이트， 프로판설포네이트， 나프탈렌 -1-설포네이트 나프탈렌 -2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함할 수 있다.

상기 산 부가염은 통상의 방법， 예를 들면， 화학식 1로 표시되는 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고， 이 염을 수화성 유기 용매, 예를 들면 메탄을， 에탄을， 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 화학식 1로 표시되는 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고， 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한， 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고， 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때， 금속염으로는 나트륨， 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한， 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예를 들어，질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 약학 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 골질환은 조골세포와 파골세포의 활성 불균형에 의해 유발되는 것 일 수 있다.

뼈는 살아 있는 조직이기 때문에 오래된 뼈는 일정하게 파괴되고 다시 새로운 뼈를 만들어내는 재형성 과정을 거친다. 이러한 과정 중에서 파골세포는 오래되어 불필요하게 된 뼈 조직을 파괴하여 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지할 수 있도록 도와주고, 조골세포는 파괴된 뼈를 다시 재생시키는 역할을 한다. 이 작용은 하루 24시간 계속 일어나며 1년에 성인의 뼈의 약 10 내지 30%가 이런 식으로 다시 만들어진다. 그러므로 파골세포와 조골세포 간의 균형은 매우 중요하며, 이 균형은 여러 호르몬과 기타 몸의 화학 성분 등에 의해 조절된다.

구체적으로, 상기 골질환은 파골세포 과분화 또는 조골세포 활성 감소에 의한 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 골질환은 파골세포 과분화에 의한 것일 수 있다.

파골세포가 과분화되면 파골세포가 비정상적으로 증가하여 과도한 골 흡수가 나타나, 뼈 속의 골이 소실되어 골 밀도가 낮아질 수 있으며, 예를 들어, 골다공증, 골연화증, 골감소증, 골위축, 치주염 등 다양한 질환이 나타날 수 있다.

상기 골질환은 골절, 골다공증, 류마티스 관절염, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축, 골관절염 또는 무혈성대퇴골괴사, 골결손, 골절 골다공증성 골절, 당뇨병성 골절, 불유합골절, 골형성 부전증, 골연화증성 골절, 골형성 장애, 퇴행성 골질환, 부정교합, 골 유합장애, 가관절증, 골 괴사, 골 관절염, 골종양, 골암 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 골질환은 골절, 골다공증, 류마티스 관절염, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축, 골관절염 또는 무혈성대퇴골괴사 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 치주염은 치근단 세균감염에 대한 면역세포의 방어작용에 의한 염증반응이다. 치주염에 주로 관여하는 호중구는 염증매개물질인 프로스타글란딘을 분비한다. 프로스타글란딘 등의 세포신호전달 물질에 의해 골조직을 흡수하는 파골세포가 활성화되어 염증부위 주변의 치조골 소실이 관찰된다. 또한, 만성 치주염은 지속적인 치주근단 부분의 염증 및 치조골 부식을 나타내는 데, 치주염이 악화되어 치아를 살릴 수 없는 경우 발치를 하고 임플란트를 시행한다. 이를 예방하기 위해 치주염 초기단계에서 감염을 일으키는 세포수 감소를 위한 항생제 투여 및 염증매개물질에 의한 파골세포 활성화를 극복할 수 있는 파골세포 억제제를 투여하여 만성치주염의 완화 및 치료를 기대할 수 있다.

본 발명의 용어 "예방"이란, 골질환을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명의 용어 "치료"란, 골질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전 되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 용어 "약학적으로 허용되는"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미할 수 있다.

나아가 본 발명의 약학 조성물은 종래에 알려져 있는 골질환의 치료 물질과 혼합하여 제공될 수도 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 골질환의 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 용어 "개체"란 골질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

필요에 따라, 본 발명의 약학 조성물은 공지의 항골질환 화합물을 추가적으로 포함할 수 있다.

이러한 항골질환 화합물로는 신코닌, 갈색거저리 추출물, 알로에-이모딘 및 오메가-3 지방산, 아르테아뉴인 B, 인돌-2-카르복실레이트 유도체, 유포비아 인자 L1, 스컬캅플라본 유도체, 프락시넬론 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 0.01~1000mg/kg/day로, 바람직하게는 0.1~500㎎/kg/day로 투여하는 것이 바람직하 나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1 에 대한 설명, 구체적인 예시, 효과에 대한 상세한 설명은 전술한 바와 같아 중복을 피하기 위해 생략한다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 염은 식품학적으로 허용되는 염일 수 있으며, 구체적인 예시는 전술한 범위 내 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 골질환은 전술한 범위 내의 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 건강기능식품은 담체, 희석제, 부형제 및 첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다.

상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제(치즈, 초콜렛 등), 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 조성물은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리 케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.

본 발명의 건강기능식품을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

하기의 실시예에서, 상기 화학식 4 내지 7은, 화학식 4 (D-35-SL-10), 화학식 5 (D-35-SL-04), 화학식 6 (D-35-SL-06), 화학식 7 (KCB 27)의 명칭으로 사용되었다.

실험 방법

1. 화학 실험

모든 시약은 구입하여 추가 정제 없이 사용하였다. ¹H 스펙트럼은 CDCl₃(중수소화된 클로로포름)에서 기록 되었다. 또는 500-, 400- 및 600-MHz NMR 분광계에서 DMSO-d₆(중수소화 디메틸 설폭사이드). 데이터는 다음과 같이 보고된다: 화학적 이동(chemical shift), 다중성(s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, m = 다중선), 결합 상수(Hz) 및 통합. ¹³C 스펙트럼은 126MHz 및 101MHz NMR 분광계 에서 CDCl₃ 또는 DMSO-d₆에 기록되었고 공명(δ)은 ppm으로 표시되었다. 고해상도 질량 스펙트럼은 비행 시간(TOF) 질량 분석기에 기록되었다. 400-MHz ¹H NMR 및 ¹³C NMR은 JEOL, ECZ-400R에 기록되었다. 500MHz ¹H NMR 및 ¹³C NMR은 Agilent-ProPulse NMR 분광계에서 기록되었다. 600MHz ¹H NMR 및 ¹³C NMR은 Agilent-VNMRS 600(20K cryoprobe) NMR 분광계에서 기록되었다.

2. 화합물 합성 방법

2.1. D-35-SL-01 및 D-35-SL-02 의 합성

시판되는 3-플루오로-4-니트로페놀( 1 )(5.00g, 31.8mmol)을 아세토니트릴(ACN)(10mL)에 용해시키고 모르폴린(3.05g, 35.0mmol)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반하고 박층 크로마토그래피(TLC)로 모니터링하였다. 감압하에 아세토니트릴을 증발시킨 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(EtOAc)로 희석하고 H₂O 및 염수 용액(포화 NaCl 용액)으로 세척하였다. 분리된 유기상을 MgSO₄로 건조하고 여과하고 진공 농축하여 3-모폴리노-4-니트로페놀( 2 )(6.90g, 30.8mmol)을 황색 결정으로 97% 수율로 얻었다. 얻어진 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 3-모폴리노-4-니트로페놀( 2 )(6.9g, 30.8mmol) 및 Zn(9.6g, 150mmol)을 MeOH:H₂O(2:1, 150mL)와 함께 0℃에서 교반하였다. 혼합물을 아세트산(HOAc)(50 mL)으로 처리하고 황색 용액이 무색이 될 때까지 교반하였다. 혼합물을 증류하고 섬모를 통해 여과하고 EtOAc로 세척하였다. 여액을 물 및 염수 용액으로 세척하였다. 분리된 유기상을 MgSO₄로 건조 하고 여과하고 농축하였다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(n- 헥산/EtOAc = 1:1)로 정제하여 4-아미노-3-모르폴리노페놀( 3 )(5.6g, 29.0mmol)을 회갈색 고체로 94% 수율로 얻었다. 이미다졸(3.94g, 58mmol) 및 CH₂Cl₂ (35mL) 용액을 3 (5.6g, 29.0mmol) 및 tert- 부틸디메틸실릴 클로라이드(TBDMSCl)(5.22g, 34.8gmmol) 의 혼합물에 천천히 첨가하였다. 이어서 이 혼합물을 25℃ 에서 7시간 동안 교반하고 TLC 분석으로 모니터링하였다. 혼합물을 CH₂Cl₂로 희석하고 H₂O 및 염수 용액으로 세척하였다. 분리된 유기상을 MgSO₄로 건조하고 여과하고 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(n- 헥산/EtOAc = 7:3)로 정제하여 원하는 실릴 보호된 생성물, 4-(( tert- 부틸디메틸실릴)옥시)-2-모폴리노아닐린( 4 )(8.6g, 28mmol)을 연한 황색 오일로서 97% 수율로 얻었다.

메틸 2-브로모아세테이트( 5 )(9.18g, 60mmol), 2-클로로페놀(6.43g, 50mmol) 및 K₂CO₃ (8.97g, 65.0mmol)의 혼합물을 디메틸 포름아미드(DMF)(20 mL) 80℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 25℃로 냉각하고, EtOAc로 희석하고, H₂O 및 염수 용액으로 세척하였다. 분리된 유기상을 MgSO₄로 건조하고 여과하고 농축하였다. 메틸 2-(2-클로로페녹시)아세테이트( 6 )(1.14g, 57.0mmol) 인 연한 황색 액체를 95% 수율로 얻었고 정제 없이 다음 단계에 사용했다. 메틸 2-(2-클로로페녹시)아세테이트(1.14g, 57.0mmol) 및 KOH(5.5g, 98.6mmol)의 혼합물을 메탄올(30mL)에 첨가하고 흰색 고체가 형성될 때까지 35℃에서 교반하였다. 혼합물을 H₂O (30 mL)로 처리하고 Et₂O로 세척하였다. 수성 층을 HCl 수용액을 사용하여 pH ~4로 조정하였다. 수성 혼합물을 Et₂O로 추출 하고 분리된 유기상을 MgSO₄로 건조하고 여과하고 농축하였다. 연한 흰색 고체인 2-(2-클로로페녹시)아세트산( 7 )(9.68g, 51.9mmol)을 91% 수율로 얻었으며, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 옥살릴 클로라이드(7.02g, 78.0mmol)를 7 (9.68g, 51.9mmol) 및 CH₂Cl₂ (20mL)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물에 DMF 몇 방울을 첨가한 다음 실온에서 2시간 동안 교반하였다. CH₂Cl₂ 및 과량의 옥살릴 클로라이드를 증발시킨 후, 원하는 생성물인 2-(2-클로로페녹시)아세틸 클로라이드( 8 )(1.06g, 51.9mmol)를 얻어 다음 단계에 사용하였다.

4 (6.16g, 20.0mmol)와 트리에틸아민(4.05g, 40mmol) 의 혼합물을 CH₂Cl₂ (30mL)에 녹이고 0℃에서 15분 동안 교반하였다. 이 혼합물에 9 (6.15g, 30.0mmol) 및 CH₂Cl₂ (15mL)의 용액을 30분 동안 적가하였다. 생성된 반응 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂로 희석하고 H₂O 및 염수 용액으로 세척하였다. 유기상을 MgSO₄로 건조하고 여과하고 농축하였다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(n- 헥산/EtOAc = 7:3)로 정제하여 N- (4-((tert- 부틸디메틸실릴)옥시)-2-모르폴리노페닐)-2-(2-클로로페녹시)아세트아미드 ( D -35-SL-01 )(8.40g, 17.6mmol, 88% 수율). ¹H NMR(400MHz, CDCl3) δ 9.32(s, 1H), 8.24-8.21(m, 1H), 7.45-7.42(m, 1H), 7.26-7.21(m, 1H), 7.02-6.94(m, 2H), 6.67-6.63(m, 2H), 4.68(d, J = 1.4Hz, 2H), 3.73-3.71(m, 4H), 2.78-2.76(m, 4H), 0.96(s, 9H), 0.18(s, 6H); ¹³C NMR(101MHz, CDCl₃) δ 165.3, 153.0, 152.7, 143.2, 130.9, 128.3, 126.2, 123.3, 123.1, 121.3, 116.5, 114.2, 112.7, 77.1, 68.1, 52.7, 52.7, 52.7, 67 4.3; HRMS (FD-TOF) m/z: [M]+ C₂₄H₃₃N₂O₄SiCl 에 대한 계산치 476.18926 ; found 476.18917.

D-35-SL-01 (3.00g, 6.29mmol)의 용액을 DCM(20mL) 중 테트라부틸암모늄 플루오라이드(TBAF)(THF 중 1M 용액, 12.6mL, 12.6mmol)로 처리하고 25 ℃ 에서 교반 하였다. 2시간 동안 감압 하에서 DCM을 증발시킨 후, 혼합물을 EtOAc로 희석하고 H₂O 및 염수 용액으로 세척하였다. 분리된 유기상을 MgSO₄로 건조하고 여과하고 진공 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(n- 헥산/EtOAc = 1:1)로 정제하여 2-(2-클로로페녹시) -N- (4-하이드록시-2-모폴리노페닐)아세트아미드 ( D-35-SL-02 ) 를 형성하였다. (2.21g, 6.10mmol, 97% 수율) ; ¹H NMR(400MHz, DMSO-d6) δ 9.40(s, 1H), 9.01(s, 1H), 7.91(d, J = 8.8Hz, 1H), 7.49(dd, J = 7.8, 1.6Hz, 1H), 7.31-7.27 (m, 1H), 7.15(dd, J = 8.4, 1.4Hz, 1H), 7.01(td, J = 7.7, 1.4Hz, 1H), 6.57(d, J = 2.6Hz, 1H)), 6.50(dd, J = 8.8, 2.6Hz, 1H), 4.77(s, 2H), 3.60-3.58(m, 4H), 2.68-2.66(m, 4H); ¹³C NMR(101MHz, DMSO - d₆) δ 165.5, 155.0, 153.1, 144.1, 130.7, 129.1, 124.0, 123.3, 122.0, 121.8, 114.9, 111.3, 108.0, 68.6, 62.57, 5 ; HRMS (FD-TOF) m/z: [M]+ C₁₈H₁₉N₂O₄Cl 362.10279에 대한 계산치; found 362.10268.

2.2. D-35-SL-03~10 의 합성

2.2.1. 일반적인 절차 A

D-35-SL-02 (50.0mg, 0.14mmol) 및 카르복실산(0.14mmol)을 DCM(2mL)에 첨가한 후, N, N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)(58.0mg, 0.28mmol) 를 적가하였다. 밀리몰). 생성된 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 EtOAc로 희석하였다. 여액을 H₂O 및 염수 용액으로 세척하였다. 분리된 유기상을 MgSO₄로 건조하고 여과하고 진공 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 D-35-SL의 에스테르 유도체를 얻었다.

2.2.2. 일반적인 절차 B

D-35-SL-02 (50.0mg, 0.14mmol) 및 Et₃N (28.3mg, 0.28mmol)을 CH₂Cl₂(25mL)에 용해시키고 0℃ 에서 15분 동안 교반하였다. 이 혼합물에 산 클로라이드 또는 설포닐 클로라이드(0.17mmol) 및 CH₂Cl₂(10mL) 의 용액을 30분 동안 적가하였다. 생성된 반응 혼합물을 먼저 25℃에서 12시간 동안 교반한 다음 CH₂Cl₂로 희석하고 H₂O 및 염수 용액으로 세척하였다. 분리된 유기상을 MgSO₄로 건조 하고 여과하고 농축하였다. 잔류물을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 D-35-SL 에스테르 유도체를 생성하였다.

2.2.3. 4-(2-(2-클로로페녹시)아세트아미도)-3-모르폴리노페닐 2-플루오로벤조에이트 ( D-35-SL-03 )

절차 B 에 따라, 2-플루오로벤조일 클로라이드(26.9mg, 0.17mmol)으로 D-35-SL-03 을 흰색 고체(60.12mg, 0.12mmol, 90% 수율)로 수득하였다; ¹H NMR(400MHz) δ 9.51(s, 1H), 8.52 -8.47 (m, 1H), 8.09(td, J = 7.5, 1.8Hz, 1H), 8.02(td, J = 7.7, 1.9Hz, 1H ) ), 7.65-7.51(m, 2H), 7.45(dd, J = 7.9, 1.6Hz, 1H), 7.33-7.18(m, 3H), 7.10-6.95(m, 2H), 4.74(s, 2H), 3.79-3.72(m, 4H), 2.86-2.79(m, 4H); ¹³C NMR(101MHz, CDCl₃) δ 168.5(d, J = 3.3Hz), 166.0, 163.9(d, J = 19.7Hz), 162.6(d, J = 262.6), 152.9, 147.2, 142.9, 135.5(d, J = 9.2Hz), 132.6, 130.9, 130.3, 128.3, 124.3(d, J = 4.0Hz), 124.2(d, J = 3.9Hz), 123.5, 121.0, 118.6, 117.4(d, J = 13.9Hz ) ), 117.2(d, J = 14.0Hz), 114.5(d, J = 15.2Hz), 69.0, 67.0, 52.6; HRMS (FD-TOF) m/z: [M]+ C₂₅H₂₂N₂O₅FCl에 대한 계산치 484.11958; found 484.11988.

2.2.4. 4-(2-(2-클로로페녹시)아세트아미도)-3-모르폴리노페닐 트리플루오로메탄술포네이트 ( D-35-SL-04 )

절차 B 에 따라, 트리플루오로메탄설포닐 클로라이드(28.4mg, 0.17mmol)으로 D-35-SL-04 를 연한 황색 고체로서 수득하였다(58mg, 0.12mmol, 85% 수율); ¹H NMR(400MHz, CDCl3) δ 9.48(s, 1H), 8.52(d, J = 9.0Hz, 1H), 7.46-7.44(m, 1H), 7.28-7.24(m, 1H), 7.10-7.01(m, 3H), 6.97(dd, J = 8.2, 1.1Hz, 1H), 4.71(s, 2H), 3.78-3.75(m, 4H), 2.83-2.81(m, 4H). ¹³C NMR(101MHz, CDCl₃) δ 166.1, 152.8, 145.7, 143.4, 132.5, 131.0, 128.4, 123.7, 123.3, 121.4, 118.8(q, J = 322.2Hz), 118.2, 614.6, 160.9, 160.6, 160.9, 52.5; 19F NMR(376MHz) δ -72.58; HRMS (FD-TOF) m/z: [M]+ C₁₉H₁₈N₂O₆F₃SCl에 대한 계산치 494.05207; found 494.05196.

2.2.5. tert - 부틸( S )-4-(2-(( tert - 부톡시카르보닐) 아미노)-3-(4-(2-(2-클로로페녹시)아세트아미도)-3-모르폴린 오페녹시)-3-옥소프로필)-1H -이미 다졸 -1-카르복실레이트 ( D-35-SL-05 )

절차 B 에 따라, N,N'-디-tert-부톡시카르보닐-L-히스티딘(60.4mg , 0.17mmol)으로 D-35-SL-05를 연한 황색 고체로서 수득하였다(19.3mg, 0.03mmol, 20% 수율); ¹H NMR(500MHz, CDCl₃) δ 9.37(s, 1H), 8.07(d, J = 1.8Hz, 1H), 7.50(d, J = 9.2Hz, 1H), 7.34(dd, J = 8.0, 1.4Hz, 1H), 7.29-7.24(m, 2H), 6.97(ddt, J = 8.5, 2.9, 1.3Hz, 2H), 6.89(dd, J = 9.2, 2.5Hz, 1H), 6.64(d, J = 2.5Hz, 1H), 5.77(d, J = 8.8Hz, 1H), 4.75(dt, J = 9.0, 6.2Hz, 1H), 4.71(s, 2H), 3.81-3.76(m, 4H), 3.39-3.34(m, 4H), 3.11(dddd, J = 126.0, 14.7, 6.1, 0.8Hz, 2H), 1.61(s, 9H), 1.41(s, 9H). ¹³C NMR (125 MHz, CDCL₃) δ 170.1, 168.6, 155.2, 154.6, 149.4, 148.3, 143.3, 139.7, 131.8, 129.6, 128.2, 127.0, 122.3, 122.3, 122.2, 118.8, 117.1, 115.2, 108.3, 83.999.99.9. , 79.7, 68.4, 66.9, 53.8, 50.2, 29.2, 28.4, 27.9; HRMS (FD- TOF) m/z: C₃₄H₄₂N₅O₉Cl에 대한 [M]+ 계산치 699.26656 ; found 699.26671.

2.2.6. 4-(2-(2-클로로페녹시)아세트아미도)-3-모르폴리노페닐3-(N- (2-옥소-2-((2-(페닐티오)페닐)아미노)에틸)메틸설폰아미도)벤조에이트 ( D-35-SL-06 )

절차 A 에 따라, 3-(N-(2-옥소-2-((2-(페닐티오)페닐)아미노)에틸)메틸설폰아미도)벤조산(77.5mg, 0.17mmol)으로 D-35-SL-06을 다음과 같이 수득하였다. 연한 분홍색 고체(31.0mg, 0.04mmol, 28% 수율); ¹H NMR(500MHz, DMSO- d₆) δ 9.77(s, 1H), 9.32(s, 1H), 8.30-8.23(m, 2H), 8.08-8.03(m, 1H), 7.81-7.73(m, 2H), 7.78-7.52(m, 2H), 7.57-7.52(m, 1H), 7.51-7.40(m, 1H), 7.40-7.31(m, 3H), 7.31-7.25(m, 1H), 7.25-7.13(m, 5H), 7.13-7.01(m, 2H), 4.89(s, 2H), 4.58(s, 2H), 3.66(t, J = 4.5Hz, 4H), 3.19-3.15(m, 3H) ), 2.77(t, J = 4.6Hz, 4H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO - d₆) δ 170.3, 167.3, 167.0, 165.7, 164.0, 156.6, 153.0, 146.8, 143.1, 140.7, 130.2, 130.0, 129.9, 129.8, 129.6, 129.4, 129.2, 129.0, 128.7.7. , 128.6, 128.4, 127.1, 126.1, 124.4, 124.2, 122.9, 121.3, 120.6, 117.9, 114.7, 114.5, 68.2, 66.1, 51.9, 47.5, 33.3. HRMS (FD-TOF) m/z: C₄₀H₃₇N₄O₈S₂Cl 800.17358에 대한 [M]+ 계산치; found 800.17450.

2.2.7. 4-(2-(2-클로로페녹시)아세트아미도)-3-모르폴리노페닐 티오펜-2-카르복실레이트 ( D-35-SL-07 )

절차 A 에 따라, 티오펜-2-카복실산(21.8mg, 0.17mmol)으로 D-35-SL-07 을 연한 흰색 고체로 수득하였다(49.6mg, 0.1mmol, 76% 수율); ¹H NMR(500MHz, DMSO - d₆) δ 9.31(s, 1H), 8.27(d, J = 8.9Hz, 1H), 8.09(dd, J = 5.0, 1.3Hz, 1H), 8.02(dd, J = 3.8, 1.3Hz, 1H), 7.54(dd, J = 7.9, 1.6Hz, 1H), 7.38-7.30(m, 2H), 7.24-7.20(m, 2H), 7.12-7.04(m, 2H), 4.89(s, 2H), 3.70-3.62(m, 4H), 2.79-2.78(m, 4H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO - d₆) δ 165.8, 160.2, 156.6, 152.6, 146.5, 143.1, 135.3, 135.1, 131.8, 130.2, 128.7, 128.6, 122.9, 121.3, 120.6, 118.0, 114.8, 114.5, 68.2. , 66.1, 51.9. HRMS (FD-TOF) m/z: [M]+ C₂₃H₂₁N₂O₅SCl에 대한 계산치 472.08542; found 472.08519.

2.2.8. 4-(2-(2-클로로페녹시)아세트아미도)-3-모르폴리노페닐푸란-2-카르복실레이트 ( D-35-SL-08 )

절차 A 에 따라, 푸란-2-카복실산(19.4mg, 0.17mmol)으로 D-35-SL-08을 흰색 고체로 수득하였다(50.4mg, 0.11mmol, 80% 수율); ¹H NMR(500MHz, CDCl₃) δ 9.48(s, 1H), 8.51-8.47(m, 1H), 7.68(dd, J = 1.8, 0.9Hz, 1H), 7.45(dd, J = 7.9, 1.6 Hz, 1H), 7.38(dd, J = 3.5, 0.9Hz, 1H), 7.28-7.24(m, 1H), 7.07-6.96(m, 4H), 6.61-6.58(m, 1H), 4.72(s, 2H), 3.80-3.71(m, 4H), 2.86-2.79(m, 4H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCL₃) δ 171.1, 165.7, 156.9, 152.9, 147.2, 146.6, 143.8, 142.7, 130.8, 130.3, 128.2, 123.4, 123.1, 120.9, 119.6, 118.4, 114.3, 112.2, 69.0, 66.9. , 52.5. HRMS (FD-TOF) m/z: [M]+ C₂₃H₂₁N₂O₆Cl에 대한 계산치 456.10827; found 456.10817.

2.2.9. 4-(2-(2-클로로페녹시)아세트아미도)-3-모르폴리노페닐 프로피오네이트 ( D-35-SL-09 )

절차 B 에 따라, 프로피오닐 클로라이드(15.7mg, 0.17mmol)으로 D-35-SL-09를 연한 갈색 고체로서 수득하였다(54.8mg, 0.13mmol, 95% 수율); ¹H NMR(500MHz, CDCl₃) δ 9.45(s, 1H), 8.45-8.40(m, 1H), 7.44(dd, J = 7.9, 1.6Hz, 1H), 7.25(ddd, J = 8.2, 7.5 , 1.6Hz, 1H), 7.04-6.95(m, 2H), 6.94-6.88(m, 2H), 4.70(s, 2H), 3.78-3.70(m, 4H), 2.83-2.77(m, 4H), 2.57(q, J = 7.6Hz, 2H), 1.25(t, J = 7.6Hz, 3H); ¹³C NMR(126MHz, CDCl₃) δ 173.0, 165.6, 152.9, 147.2, 142.6, 130.8, 129.9, 128.2, 123.3, 123.1, 120.8, 118.3, 114.3, 114.3, 68.9, 29.69, 6.09, 56.69 HRMS (FD-TOF) m/z: [M]+ C₂₁H₂₃N₂O₅Cl에 대한 계산치 418.12900; found 418.12904.

2.2.10. 4-(2-(2-클로로페녹시)아세트아미도)-3-모르폴리노페닐 4-아세트아미도벤젠술포네이트 ( D-35-SL-10 )

절차 B 에 따라, 4-아세트아미도벤젠설포닐 클로라이드(39.7mg, 0.17mmol)으로 D-35-SL-10 (64.1mg, 0.11mmol, 83% 수율)을 분홍색 고체로서 수득하였다; ¹H NMR(500MHz, DMSO- d₆) δ 10.51(s, 1H), 9.22(s, 1H), 8.14(d, J = 8.9Hz, 1H), 7.80-7.77(m, 2H), 7.74-7.72(m, 2H) 7.49(dd, J = 7.9, 1.6Hz, 1H), 7.31(ddd, J = 8.3, 7.4, 1.6Hz, 1H), 7.15(dd, J = 8.4, 1.4Hz, 1H), 7.04(td, J = 7.7, 1.4Hz, 1H), 6.84(dd, J = 8.9, 2.7Hz, 1H), 6.65(d, J = 2.7Hz, 1H), 4.81(s, 2H), 3.60-3.53 (m, 4H), 2.50(p, J = 1.9Hz, 4H), 2.07(s, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO- d₆) δ 170.0, 166.3, 152.8, 145.5, 145.2, 143.3, 131.2, 130.6, 130.2, 129.0, 127.3, 123.3, 121.6, 121.1, 119.2, 118.8, 115.4, 114.8, 68.3, 68.3. , 66.3, 52.0, 24.4. HRMS (FD-TOF) m/z: [M]+ C₂₆H₂₆N₃O₇SCl에 대한 계산치 559.11745; found 559.11737.

3. 생물 실험

3.1. 재료 및 시약

2-NPPA (순도 > 99% )는 ChemBridge ( ID#7628815 , 캘리포니아, 미국)에서 얻었다. 모든 화합물은 KCB(Korean Chemical Bank)에서 공급받았다(표 1). 항 -TRAF6 ( B-10 ), 항 - 카텝신 K(#48353) 및 항-c-Src(#sc-8056)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Dallas, TX, USA)로부터 구입하였고; 항-포스포-NF-κB ( # 3033s ), 항-NF- κB(#4764s), 항-NFATc1(#8032s), 항-PI3K ( # 9252s ) , 항-포스포-PI3K (#4511s), 항-유비퀴틴, lys48-특이적, 항-c-fos(#4384s), 항-포스포-AKT(#4060s), 항-포스포-IκBa(#2859s), 항-AKT(#9272s) 및 항-IκBa(#9242s)는 Cell Signaling Technology(Boston, MA, USA)에서 구입했다. nti-β-액틴(#A5441)은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구입했다. ECL 버퍼 (#RPN2106) 는 iNtRON(Seoul, Korea)에서 구입했다. Horseradish peroxidase(HRP)-컨쥬게이션 된 2차 항체(#7074S)는 Cell Signaling Technology(미국 메사추세츠주 보스턴)에서 얻었다.

3.2. 골수 유래 대식세포 분리 및 배양

파골 세포는 BMM에서 분화되었다. TRAP 염색 분석은 종래의 방법으로 수행되었다(Z. Chen, M. Ding, E. Cho, J. Seong, S. Lee, T.-H. Lee, 2-NPPA Mitigates Osteoclastogenesis via Reducing TRAF6-Mediated c-fos Expression, Frontiers in Pharmacology, 11 (2021), E. Cho, Z. Chen, J. Lee, S. Lee, T.H. Lee, PSTP-3,5-Me Inhibits Osteoclast Differentiation and Bone Resorption, Molecules, 24 (2019)). 모든 동물실험은 전남대학교 IACUC의 승인을 받았다(승인번호: CNU IACUC-YB-201 9 - 49).

3.3. 체외 파골 세포 형성 및 세포 생존력 분석

BMM(웰당 1 x 10⁴ 세포)을 96-웰 플레이트에서 배양하고 처리하였다. DMSO 처리군에서 성숙한 파골세포가 형성될 때까지 30ng/mL의 M-CSF와 50ng/mL의 RANKL로 처리했다. 고정 후 약 30 분 동안 4.0% 포름알데히드를 사용 하여 세포를 염색하고, TRAP-염색 키트를 사용하여 세포를 염색하였다. 파골 세포 영역의 확산은 현미경으로 볼 수 있다. BM의 실행 가능성 (1 x 10⁴ 세포/웰) 세포 생존능 분석 키트를 사용하여 평가했다.

3.4. 골 재흡수 및 F-액틴 링 면역형광 분석

파골세포의 골흡수활성은 골흡수 분석키트를 이용하여 제조사의 지시에 따라 평가하였다. BMM(2 x 10⁴ 세포/웰)을 키트 제공 코팅 플레이트에 시딩했다. 키트에서 제공하는 코팅된 플레이트에 BMM(2 x 10⁴ 세포/웰)을 시딩했다. 성숙한 파골세포가 관찰될 때까지 M-CSF 및 RANKL을 포함하는 배지를 다음날 지시된 용량의 D-35-SL-10 및 2-NPPA의 유무에 관계없이 교체하였다. 그런 다음, 각 웰의 상청액 100μL를 수확하여 검은색 폴리프로필렌 96웰 마이크로 플레이트에 넣었다. SpectraMax i3x 형광 플레이트 판독기(여기 파장: 485nm; 방출 파장: 535nm)를 사용하여 각 웰의 형광 강도를 측정하였다. 탈회된 구멍 영역(Pit area)은 현미경으로 볼 수 있었고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산했다. F-액틴 고리를 가시화하기 위해 로다민 결합 팔로이딘 염색 검정(Thermo Fisher Scientific)을 수행하였다.

3.5. RNA 분리 및 qRT-PCR

QIAzol RNA 용해 시약(Qiagen Sciences, Valencia, CA, USA)을 사용하여 BMM에서 전체 RNA를 분리했다.

3.6. 웨스턴 블로팅 분석

파골 세포의 전체 단백질은 RIPA 완충액(#89900; Thermo Fisher Scientific)에서 세포 용해를 사용하여 추출한 다음 1X Halt 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 혼합물(Thermo Scientific)을 첨가했다. 13,300rpm에서 30분 동안 원심분리하여 세포 용해물을 제거한 후 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석을 사용하여 전체 세포 용해의 단백질 농도를 측정했다. 그런 다음, 샘플을 12% SDS-page 젤을 사용하여 웨스턴 블롯 후 처리했다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인으로 옮긴 후, 5% 탈지유를 사용하여 1.5시간 동안 차단한 다음 표시된 1차 항체(1:1000 희석)와 함께 4℃에서 밤새 배양했다. HRP-결합 2차 항체(1:2000 희석)를 실온에서 1시간 동안 멤브레인과 함께 인큐베이션하고 제조업체의 프로토콜에 따라 ECL 시약으로 현상했다.

3.7. OVX 유도 골다공증 마우스 모델

본 실험의 암컷 쥐는 특정 병원균이 없는 시설에서 자랐다. D-35-SL-10의 생체 내 분석을 위해 OVX 유발 골다공증 마우스 모델을 확립했다. 간략히, 7주령 C57BL/6 암컷 마우스를 4개 그룹: Sham, OVX, D-35-SL-10 및 2-NPPA)로 준비하였다. OVX, D-35-SL-10 및 2-NPPA 그룹의 마우스는 OVX 수술을 받은 반면 Sham 그룹의 마우스는 복부 절개만 받았다. OVX 수술 후 1주일 동안 회복한 후, D-35-SL-10 및 2-NPPA 그룹의 모든 마우스에게 D35-SL-10 및 2-NPPA(10 mg/kg, 10% Tween 80과 10% DMSO의 혼합물)을 4주 동안 매일 사용한다. 가짜 및 대조군(OVX) 그룹은 10% Tween 80 및 10% DMSO 주입의 동일한 부피의 혼합물을 받았다. 쥐의 체중은 매주 측정되었다. 마우스를 안락사시킨 후 CTX-1 분석을 위해 혈청을 수집하고 micro-CT 분석을 위해 대퇴골을 4.0% paraformaldehyde로 고정하였다.

3.8. 마이크로 CT 스캐닝

한국기초과학지원연구원(대한민국, 광주)에서 Quantum GX Micro-CT 이미징 시스템(PerkinElmer, Hopkinton, MA, USA) 을 사용하여 Micro-CT 스캐닝을 수행 하였다.

3.9. 통계 분석

Dunnett의 다중 비교 테스트를 사용한 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 여러 그룹 간의 차이를 비교했다(GraphPad Prism 8.0, San Diego, CA, USA). Unpaired Student's test( t -test)를 사용하여 두 그룹 간의 차이를 비교했다( * P < .05; ** P < .01; *** P < .001; NS, 유의하지 않음). 모든 데이터는 평균±표준편차(SD)로 표현하였다.

실험 결과

1. 화학 실험

1.1. 화합물 구조

모든 화합물은 분자량이 282~487 사이인 작은 아세트아미드 유도체이며, 구체적인 화학식은 아래와 같다.

1.2. 2 2-(2-클로로페녹시)-N-(2-모폴리노페닐)아세트아미드 유도체의 합성

본 발명에서는 2-NPPA의 구조적 특징과 KCB에서 얻은 아세트아미드 유도체(표 1), 그리고 초기 히트 화합물을(표 2) 활용하여 새로운 화합물을 설계했다. 2-(2-클로로페녹시)-N-(2-모르폴리노페닐) 아세트아마이드 유도체인 새로운 화합물의 핵심 골격은 페닐 고리의 모르폴린과 아세트아마이드의 알파 탄소에 결합된 2-클로로페녹시를 포함한다. 실용적인 합성의 관점에서, 피페라진의 단일치환 반응은 다단계 공정이므로 피페라진보다 페닐 고리에 모르폴린을 도입하는 것이 훨씬 쉽다. 2-모르폴리노페닐 고리에 하이드록실기를 포함하는 중간체 D-35-SL-02를 후기 기능화를 통해 합성하여 원하는 화합물을 얻었다.

도 1에서, 2-NPPA 유도체(2-NPMA)의 합성 경로를 도식화하여 나타내었다. 각 단계의 반응 조건은 다음과 같다: (a) 모르폴린, ACN, 80℃, 2시간; (b) Zn, AcOH, MeOH:H2O, 0℃, 실온, 4시간; (c) TBDMSCl, 이미다졸, DCM, rt, 7시간; (d) 2-클로로페놀(6), K₂CO₃, DMF, 80℃, 밤새; (e) KOH, 35℃, 0.5시간, H₂O, 6N HCl(pH = 4); (f) (COCl)₂, DMF, DCM, 실온, 2시간; (g) TEA, DCM, 0℃, 실온, 밤새; (h) TBAF, DCM, RT, 2시간; (i) 상응하는 카르복실산, DCC, DCM, rt, 밤새; (j) 상응하는 산 염화물, TEA, 0℃, 실온, 밤새.

구체적으로, 3-플루오로-4-니트로페놀( 1 )과 모르폴린의 반응은 친핵성 방향족 치환을 통해 3-모르폴리노-4-니트로페놀( 2 )을 생성했다. 생성된 생성물의 니트로기를 아민으로 환원시켜 중간체 3을 얻었다. 3의 수산기를 실릴기로 보호하여 화합물 4를 생성하였다. 메틸 2-브로모아세테이트( 5 )와 2-클로로페놀의 반응으로 메틸 2-(2-클로로페녹시)아세테이트( 6 )가 생성되었다. 화합물 6의 에스터기는 가수분해되어 또 다른 중간체인 산 클로라이드 8로 전환된 카르복실산 화합물인 화합물 7을 형성하였다. 중간체 4 및 8의 반응은 아미드 결합의 형성을 통해 D-35-SL-01을 생성하였다. 실릴 그룹의 탈보호는 D-35-SL 시리즈 화합물의 핵심 골격을 형성하는 D-35-SL-02를 제공했다. D-35-SL-02의 수산기는 다양한 카르복실산 또는 산 염화물과 반응하여 상응하는 아실화 생성물 D-35-SL-03 ~ 10을 양호한 수율로 형성하였다.

KCB 화합물의 파골세포 생성 억제 효과(%)

KCB	O/C 억제(%)	KCB	O/C 억제(%)
1	2.16±2.71	23	9.43±3.43
3	45.49±5.97	25	27.09±5.60
4	(-) 16.33±15.88	26	14.49±13.35
5	40.06±2.71	27	94.58±0.49
6	(-) 28.39±4.69	29	30.85±1.42
7	34.72±8.32	30	61.34±3.96
8	86.42±6.54	32	31.36±6.69
9	5.65±14.32	33	38.63±4.01
10	70.67±11.85	34	(-) 16.89±7.76
11	54.13±2.62	36	13.55±11.87
12	(-) 23.57±6.76	37	52.65±7.30
13	95.35±0.51	38	56.82±2.56
15	62.07±0.97	39	81.78±0.74
17	78.78±3.75	40	76.57±0.79
20	(-) 5.49±18.19	43	74.88±5.03
21	38.27±1.48	44	(-) 21.71±2.78

파골 세포 형성 및 골 형성에 대한 억제 효과(%).

화합물	O/C 억제(%)^a,b	O/B 억제(%)^a,b
KCB- 27	94.58±0.49	2.77±4.20
KCB- 12	비활성^c	감지되지 않음
KCB- 36	13.55±11.87	감지되지 않음
KCB- 15	62.07±0.97	감지되지 않음
KCB- 29	30.85±1.42	감지되지 않음
KCB- 30	61.34±3.96	감지되지 않음
알렌드로네이트	67.88±6.91	감지되지 않음

a RANKL 유도 BMDM 또는 BMP2 유도 골형성(O/B)에서 퍼짐 면적에 의한 파골세포(O/C) 억제 농도(%)는 2 μM이다. 억제 (%) 값 은 3회 반복의 평균 ± SD로 표시된다.

b 모든 활성 화합물은 비세포독성 농도에서 테스트되었다.

c "비활성" 은 파골 세포 분화에 억제가 없음을 나타낸다.

2. 생물 실험

2.1. KCB 화합물 라이브러리에서 선택된 후보 물질의 억제 효과 RANKL에 의한 파골세포 형성 및 구조-활성 관계(SAR) 분석

KCB 화합물에 대한 예비 SAR 연구는 페닐 고리에 모르폴린 그룹을 갖는 아세트아마이드 유도체가 파골세포 분화에 큰 억제 효과를 나타냄을 시사했다(표 1). 보다 효과적이면서 세포 독성이 낮은 화합물을 발견하기 위해 KCB 화합물 라이브러리에서 하위 구조 기반 선택을 시도하고 추가 선택 및 수정을 위한 초기 히트에 대해 모르폴린 그룹을 포함하는 화합물을 선택했다. 선정된 화합물의 파골세포 형성 억제 효과(%)를 표 2에 나타내었다. 그 중 KCB-27은 파골세포 형성에 대한 강력한 억제 효과가 있음에도 불구하고 골 형성에 유의한 간섭을 나타내지 않았다.

따라서, 하부 구조의 일부로 페닐 고리에서 모르폴린 그룹을 사용했다. 추가 구조 수정을 위해 초기 히트의 SAR을 분석했다. 이 화합물 모두의 핵심 백본은 N-(2-모르폴리노페닐)아세트아미드로 구성되었다. 이러한 예비적인 결과를 통해 다음과 같은 제안을 얻을 수 있다.

1) Morpholine 및 N-phenyl acetamide는 핵심 작용기이다.

2) 아세트아마이드의 알파 위치에 아릴옥시 치환기를 포함하는 화합물(KCB-8, -13, -27)이 더 높은 억제 효과를 보인다.

3) 아세트아마이드의 알파 위치에 아릴설포닐 또는 아릴 설파이드 치환기를 포함하는 KCB-15, -29 및 -30은 우수한 억제 효과를 나타내었지만, 아릴 옥시 치환기를 갖는 상위 3개 아세트아마이드(KCB-8, -13, -27)보다는 억제 효과가 낮았다.

4) N-페닐 고리의 5번 위치의 치환기 추가는 억제 효과를 더욱 높인다.

2.2. 합성된 10종의 신규 화합물의 RANKL 유도 파골세포 형성 억제 효과 및 SAR 분석

TRAP 염색 분석을 수행하여 10가지 새로운 2-NPMA 유도체의 억제 효과를 매핑하였다(표 3). D-35-SL-04, D-35-SL-06 및 D-35-SL-10이 파골 세포 형성을 크게 억제했다. 파골 세포 분화 동안 TRAP 활성을 방지하는 D-35-SL-10에 의해 가장 높은 생체 활성이 입증되었다. 합성된 10개의 새로운 2-NPMA 유도체에 대한 SAR 연구는 4가지 중요한 특징을 나타낸다.

1) N-페닐 고리(D-35-SL-01 및 02)의 4번 위치에서 히드록실 또는 실릴에테르 치환체는 높은 억제 효과를 나타내지 않았으며,

2) 플루오로벤조에이트(D-35-SL-03), 티오펜-2-카르복실레이트(D-35-SL-07), 푸란-2-카르복실레이트(D-35-SL-08) 및 프로피오네이트(D-35-SL-09)와 같은 단순 아릴- 또는 알킬-치환 카르복실레이트는 더 낮은 억제 효과를 나타냈고,

3) L-히스티딘 치환기(D-35-SL-05)는 긍정적인 효과를 나타내지 않았으며,

4) sulfonate 및 sulfonyl 치환기는 다른 치환기보다 높은 억제 효과를 보였다.

새로운 2-NPPA 유도체 화합물의 파골세포 분화 억제 효과(%)

화합물	O/C 억제(%)^a,b	화합물	O/C 억제(%)^a,b
D -35-SL-01	34.81±3.74	D -35-SL-07	39.27±8.52
D -35-SL-02	27.12±10.07	D -35-SL-08	31.39±10.33
D -35-SL-03	34.18±6.88	D -35-SL-09	32.82±5.84
D -35-SL-04	50.46±5.67	D -35-SL-10	61.46±4.96
D -35-SL-05	34.63±6.57	KCB -27	52.52±11.34
D -35-SL-06	50.88±6.83	2-NPPA	42.04±8.33

a 1 μM의 화합물은 RANKL-유도된 BMDM에서 파골세포 분화(TRAP 활성)를 억제(%)하였다. 억제(%) 값은 최소 5회 반복의 평균±SD로 표시된다.

b 모든 활성 화합물은 비세포독성 농도에서 테스트되었다.

2.3. D-35-SL-04, D-35-SL-06 및 D-35-SL-10 의 조골세포 분화에 대한 영향 분석

파골 세포 형성에 대한 높은 억제 효과가 나타난 D 35-SL-04, D 35-SL-06 및 D 35-SL-10를 선택하여 조골세포 분화에 대한 영향을 추가 분석했다.

구체적으로, 8주령 암컷 마우스의 대퇴골에서 일차 조골세포를 분리하고, 각 지시된 용량의 D 35-SL-04, D 35-SL-06 및 D-35-SL-10를 DMSO 용매에서 100 ng/mL의 BMP2를 사용하여 조골세포 분화를 유도한 후 9일째에 ALP 염색을 수행하였다. 각 실험군의 ALP 염색 강도를 ImageJ를 사용하여 측정하였고, 이로부터 분석된 조골세포 분화 억제 (%)를 하기 표 4-7 및 도 2에 나타내었다. 억제(%) 값은 4회 반복의 평균±SD로 표시되었다.

화합물 (농도 μM)		염색강도	ALP 양성 강도의 BMP2 그룹에 대한 %	조골세포 분화 (%)	조골세포 분화 억제 (%)
DMSO	No BMP2	13770	5.07518797	15.63±6.98	84.38±6.98
		41565	15.31954887
		58905	21.71052632
		55335	20.39473684
	BMP2	246840	90.97744361	100±5.23	0±5.23
		278970	102.8195489
		281520	103.7593985
		277950	102.443609

D-35-SL-04	0.25	186660	68.79699248	93.05±14.21	6.95±14.21
		265200	97.7443609
		274125	101.0338346
		283815	104.6052632
	0.5	279990	103.1954887	88.8±14.55	11.16±14.55
		271830	100.1879699
		232050	85.52631579
		180285	66.44736842

D-35-SL-04	1	210375	77.53759398	92.22±9.19	7.78±9.19
		249135	91.82330827
		276165	101.7857143
		265200	97.7443609
	2	274380	101.1278195	100.1±3.96	(-)0.07±3.96
		274635	101.2218045
		283050	104.3233083
		253980	93.60902256
	4	262395	96.71052632	94.60±5.11	5.40±5.11
		251685	92.76315789
		275145	101.4097744
		237405	87.5

D-35-SL-06	2	264180	97.36842105	97.02±6.63	2.98±6.63
		283050	104.3233083
		271320	100
		234345	86.37218045
	4	228990	84.39849624	81.91±5.24	18.09±5.24
		224145	82.61278195
		236895	87.31203008
		198900	73.30827068
D-35-SL-10	2	258825	95.39473684	98.14±1.64	1.86±1.64
		270300	99.62406015
		267240	98.4962406
		268770	99.06015038
	4	247860	91.35338346	89.73±4.34	10.27±4.34
		260355	95.95864662
		236130	87.03007519
		229500	84.58646617

도 2에서 보는 바와 같이, ALP 염색 분석 결과 D 35-SL-04, D 35-SL-06 및 D-35-SL-10 모두 농도가 2μM 미만에서 조골 세포 분화에 유의한 영향을 미치지 않았다. 즉, 상기 화합물들이 조골세포 분화에는 유의미한 영향 없이 파골 세포 형성을 억제함으로써 골다공증 억제에 사용될 수 있음을 시사한다.

2.4. D-35-SL-10 의 RANKL-유도 파골세포 형성 억제 효과

파골 세포 형성에 대한 합성된 새로운 화합물의 억제에 대한 기본 메커니즘을 광범위하게 조사하기 위해 추가 평가를 위해 파골 세포 형성에 대한 가장 높은 억제 효과를 나타내는 D-35-SL-10을 선택했다. D-35-SL-10는 성숙한 파골 세포의 형성을 농도 의존적으로 억제했으며(도 3a). 지시된 농도의 D-35-SL-10 처리의 TRAP 활성을 358.29 nM의 IC50으로 측정하여 나타내었다(도 3b, 3c).

또한 억제 효과를 결정하기 위해 D-35-SL-10의 세포독성을 조사하였다. D-35-SL-10의 세포 생존율 분석 결과는, 적어도 농도가 4μM 미만일 때 BMDM의 세포 생존율에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 시사했다. 따라서, D-35-SL-10은 조골세포 분화에는 유의한 영향을 미치지 않고 성숙한 파골 세포의 형성을 감소시킴으로써 골다공증을 억제하는 데 사용될 수 있다.

구체적으로, 도 3a는 파골세포 분화에 대한 D-35-SL-10의 억제 효과를 TRAP 염색을 사용하여 나타낸 것이다. 30 ng/mL의 M-CSF 및 50ng/mL의 RANKL이 사용되었다. 이어서 파골세포 형성을 가시화하기 위해 TRAP-염색법을 수행하였다. 2-NPPA는 대조군 억제제로 사용되었다. 도 3b에서 각 그룹의 TRAP 활성을 OD540 nm에서 측정하였다. 도 3c에서 파골 세포 분화에 대한 D-35-SL-10의 IC50은, 지시된 용량의 D-35-SL-10으로 테스트한 후, 각 그룹의 TRAP 활성을 기반으로 계산되었다. 도 3d에서, 48시간에 지시된 투여량 처리의 세포 생존율은 세포 생존율 검정 키트의 사용을 수반하였다.

2.5. D-35-SL-10 의 F-액틴 벨트의 RANKL 유도 형성 및 골 흡수 억제

F-액틴 고리의 형성은 파골세포의 골 재흡수와 관련이 있을 수 있다. 본 실험에서 체외에서 RANKL 유도 파골 세포 형성에서 액틴 고리 형성에 대한 D-35-SL-10의 효과를 조사하기 위해, 면역 형광 분석을 수행했다. 액틴 벨트는 M-CSF 및 RANKL 자극 후에 잘 형성되었지만 F-액틴 벨트의 크기와 수는 지시된 농도의 D-35-SL-10 및 2-NPPA로 처리한 후에 상당히 감소했다(도 4a). 1 μM의 D-35-SL-10으로 처리하면 2-NPPA 처리에서 관찰된 것보다 F-액틴 고리의 크기가 더 크게 감소했다. 파골세포 골 흡수에 대한 D-35-SL-10의 시험관내 효과를 분석하기 위해 플루오레세인아민-표지된 인산칼슘 플레이트를 사용하였다. 재흡수된 구멍 영역은 광학 현미경을 사용하여 이미지화되었다(도 4b). 결과는 M-CSF 및 RANKL 자극 후 유일한 M-CSF 처리 그룹과 비교할 때 골 흡수 구멍 영역의 크기와 수가 크게 증가했음을 시사한다. D-35-SL-10 처리는 용량 의존적 방식으로 이러한 매개변수를 극적으로 감소시켰다. 또한, 1000 nM의 2-NPPA로 처리한 후 얻은 것과 비교했을 때 D-35-SL-10으로 처리한 후 피트 영역의 백분율이 감소했다(도 4b-d). 흡수 관련 형광 강도에 대해서도 유사한 경향이 관찰되었다(도 4c). 이러한 결과는 D-35-SL-10이 성숙한 파골 세포의 형성을 손상시켜 F-액틴 벨트의 형성을 감소시킴으로써 파골 세포 형성 및 골 흡수를 억제함을 시사한다.

구체적으로, 도 4a는 표시된 그룹의 존재 하에서 파골 세포 형성 동안 액틴 고리 형성의 시각화를 나타낸다. 도 4b는 BMDM을 플루오레세인아민-표지된 인산칼슘 플레이트에서 배양하고 지시된 용량의 D-35-SL-10 및 2-NPPA로 6일 동안 처리한 결과이다. 이어서, 각 그룹의 형광 강도를 각각 485 및 535 nm의 여기 및 방출 파장으로 측정하여 도 4c에 나타냈다. 탈염 면적은 ImageJ를 사용하여 계산되었다(도 4d).

2.6. D -35-SL-10의 RANKL에 의해 유도된 파골세포 특이적 유전자 발현의 억제

파골세포 분화에 필요한 유전자의 발현에 대한 D-35-SL-10의 억제 효과를 분석하기 위해 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 도 5a-f에서 볼 수 있듯이, 표시된 유전자의 상대적인 mRNA 발현이 30ng/mL의 M-CSF와 50ng/mL의 RANKL(검은색 막대)로 처리했을 때 현저하게 증가한 반면, D-35-SL-10은 표시된 유전자의 전사 수준을 현저하게 감소시켰다(회색 막대). 이는 파골 세포의 분화 및 기능에 대한 D-35-SL-10의 억제 역할을 뒷받침하는 결과이다.

구체적으로, 도 5a-f는 지시된 파골세포 특이적 유전자의 상대적인 mRNA 수준 발현은 0, 1, 2 및 4일 동안 1 μM의 D-35-SL-10을 사용하여 처리 유무에 관계없이 qRT-PCR을 사용하여 측정한 결과이다. 그래프의 검은색 막대는 M-CSF 및 RANKL 처리군을 나타내고 회색 막대는 D-35-SL-10 처리군을 나타낸다. 전사 수준은 0일의 발현으로 정규화되었다. 본 실험에서 사용된 qRT-PCR 프라이머는 실험 방법에서 설명되었다. 모든 실험은 세 번 수행되었다.

2.7. D -35-SL-10은 RANKL에 의해 유도된 파골세포 단백질 발현 및 P13K/AKT 및 IκBa/NF-κB 신호 전달 경로의 불활성화를 억제했다.

D-35-SL-10이 파골세포 형성 및 기능을 억제하는 메커니즘을 이해하기 위해 RANKL에 의해 유도된 파골세포 단백질을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 주요 재흡수 프로테아제 CtsK, NFATc1, c-fos, c-src 및 TRAF6의 단백질 수준은 대조군과 비교했을 때 D-35-SL-10과 함께 배양 후 감소하였다(도 6a). IκB/NF-κB 및 PI3K/AKT/NFATc1 신호는 TRAF6가 RANKL-RANK 복합체에 모집되는 것으로부터 촉발되어 파골세포의 분화에 중요한 역할을 했다. IκB/NF-κB 및 PI3K/AKT 신호 활성화 분석 결과는 이들이 D-35-SL-10 배양에서 농도 의존적 방식으로 억제되는 반면, RANKL 자극이 인산화된 P13K, AKT, IκBa 및 NF-κB의 단백질 수준을 상당히 증가시킴을 제안한다. IκB의 분해는 D-35-SL-10에 의해 저해되었다(도 6d). 이러한 결과는 D-35-SL-10이 TRAF6의 발현을 감소시킨 후 IκBa/NF-κB 및 P13K/AKT/NFATc1 신호 전달 경로의 불활성화를 통해 RANKL에 의해 유도된 파골 세포 생성을 억제함을 시사한다.

구체적으로, 도 6a에서, BMDM을 유도 배지에서 0, 1, 2 또는 4일 동안 1 μM의 D-35-SL-10과 함께 배양하고, 세포 용해물을 처리한 후 표시된 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과를 나타냈다. 도 6b는 D-35-SL-10 처리 유무에 관계없이(48시간) TRAF6의 K48-매개 Ub를 TRAF6 항체로 IP 후 웨스턴 블롯을 사용하여 분석한 결과이다. 도 6c 및 6c에서, BMDM을 표시된 용량의 D-35-SL-10으로 처리하고, PI3K, AKT, IκBa 및 NF-κB의 인산화 및 총 단백질을 면역블롯팅을 사용하여 분석했다. GAPDH/β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다.

2.8. D-35-SL-10의 k48-연결 유비퀴틴화 촉진을 통한 TRAF6 발현 억제

상기 실험의 결과는 D-35-SL-10이 TRAF6의 발현을 감소시키고 파골 세포 형성을 차단한다는 것을 시사했다. E3 ligase인 TRAF6는 RANKL 자극 후에 활성화된다. TRAF6의 k63 연결 유비퀴틴화(k63-linked ubiquitination)는 IκB/NF-κB의 활성화를 매개하는 반면, TRAF6의 k48 연결 유비퀴틴화는 RANKL 배양 후 단백질 수준을 감소시켰다. 이를 통해 D-35-SL-10이 TRAF6의 단백질 수준을 감소시키면서(도 6a) TRAF6의 k48 연결 유비퀴틴화 활성화로 인해 TRAF6 단백질 발현이 감소한다는 가설을 세웠다. 흥미롭게도, 도 6b에 나타낸 바와 같이, TRAF6-합성된 lys48-특이적 폴리유비퀴틴 사슬은 M-CSF 및 RANKL 자극 그룹에서 관찰된 것과 비교했을 때 D-35-SL-10으로 24시간 동안 처리한 후 유의하게 증가하였다. 따라서 이 결과는 D-35-SL-10이 k48 연결 유비퀴틴화를 촉진하여 TRAF6의 발현을 감소시킴을 시사한다.

2.9. D-35-SL-10 처리 후 생체 내 OVX-유도 골 손실 억제

파골 세포 골 흡수 질환 생체 내에서 D-35-SL-10의 잠재적 예방 역할을 추가로 확인하기 위해 OVX 유도 골다공증 마우스 모델(도 7a-b)을 확립했다. Sham, OVX, D-35-SL-10 및 2-NPPA 그룹의 자궁 사진이 도 7e에 나타나 있다. 이는 OVX 유도 골 손실 모델이 성공적으로 확립되었음을 나타낸다. 각 그룹의 마우스 체중을 매주 기록하였다(도 7d). 대퇴골의 관심 부위에 대한 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT) 분석 결과, OVX 마우스는 섬유주 골량을 광범위하게 상실한 반면, D-35-SL-10 처리군에서는 도 7a, 도 7b와 같이 유의하게 감소한 것으로 나타났다. 또한, 골 표면 밀도, 섬유주 분리, 섬유주 수 및 섬유주 부피는 2-NPPA 그룹에 비해 D-35-SL-10 처리 후 더 강한 회복을 보였다. CTX-1의 혈청 바이오마커 분석은 OVX 후 혈청 수준이 유의하게 증가한 반면 D-35-SL-10 및 2-NPPA 처리 후 감소했음을 보여주었다(도 7c). 이러한 결과는 D-35-SL-10이 2-NPPA에 의해 나타난 것보다 더 큰 항골다공증 효과를 가질 수 있음을 의미한다.

구체적으로, 도 7a에서, Sham(n = 7), OVX(n = 7), D-35-SL-10(n = 7) 및 2-NPPA(n = 7) 처리에서 마우스의 대표적인 마이크로 CT 이미지를 재구성하여 나타냈다. 도 7b는 대퇴골의 관심 부위에 대한 마이크로 CT 분석 결과를 정량적으로 측정한 것이다. 도 7c는 CTX-1 효소 반응 분석, 도 7d는 in vivo 실험을 위한 각 군의 마우스 체중을 나타내었다.

3. ADME 분석

SwissADME 데이터베이스를 이용하여 D-35-SL-10을 ADME(Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) 분석한 결과는 하기 표 8 및 도 8과 같다.

친유성
Log Po/w (iLOGP)	3.68
Log Po/w (XLOGP3)	3.45
Log Po/w (WLOGP)	4.24
Log Po/w (MLOGP)	2.23
Log Po/w (SILICOS-IT)	2.74
Consensus Log Po/w	3.27
수용성
Log S (ESOL)	-5.11
용해도	4.35e-03 mg/ml; 7.76e-06 mol/l
클래스	중간 정도로 용해
Log S (Ali)	-5.90
용해도	7.12e-04 mg/ml ; 1.27e-07 mol/l
클래스	중간 정도로 용해
Log S (SILICOS-IT)	-8.18
용해도	3.68e-06 mg/ml ; 6.58e-09 mol/l
클래스	난용성
약동학
GI absorption	낮음
BBB permeant	No
P-gp substrate	No
CYP1A2 inhibitor	No
CYP2C19 inhibitor	Yes
CYP2C9 inhibitor	Yes
CYP2D6 inhibitor	Yes
CYP3A4 inhibitor	Yes
Log Kp (skin permeation)	-7.27 cm/s
약물유사성
Lipinski	Yes; 1 violation: MW>500
Ghose	No; 2 violation: MW>480, MR>130
Veber	No; 1 violation: Rotors>10
Egan	No; 1 violation: TPSA>131.6
Muegge	Yes
Bioavailability score	0.55
의료화학
PAINS	0 alert
Brenk	1 alert; sulfonic_acid_1
Leadlikeness	No; 2 violations: MW>350, Rotors>7
Synthetic acceessibility	3.91

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 1]

상기 식에서, R₁은 H이고 R₂는 이고; 또는
R₁은 -OX₁이고 R₂는 H이고, 상기 X₁은 또는 　이고,
상기 Q₂는 -CF₃, -CCl₃ 또는 이고,
상기 Q₁은 C_1-5인 알킬이고,
상기 R₃는 C_1-5인 알킬 또는 할로젠 원소임.
청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 것인, 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 2]

[화학식 3]
.
청구항 1에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식으로 표시되는 화합물로 이루어진 군에서 선택된 것인, 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물:
[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]
및
[화학식 7]
.
청구항 1에 있어서, 상기 골질환은 골절, 골다공증, 류마티스 관절염, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축, 골관절염 및 무혈성대퇴골괴사로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품:
[화학식 1]

상기 식에서, R₁은 H이고 R₂는 이고; 또는
R₁은 -OX₁이고 R₂는 H이고, 상기 X₁은 또는 　이고,
상기 Q₂는 -CF₃, -CCl₃ 또는 이고,
상기 Q₁은 C_1-5인 알킬이고,
상기 R₃는 C_1-5인 알킬 또는 할로젠 원소임.
청구항 5에 있어서, 상기 골질환은 골절, 골다공증, 류마티스 관절염, 치주염, 파제트병, 골연화증, 골감소증, 골위축, 골관절염 및 무혈성대퇴골괴사로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 파골세포 과분화로 유발되는 골질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.