KR101992821B1

KR101992821B1 - 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101992821B1
Application number: KR1020170147353A
Authority: KR
Inventors: 김정렬; 장규윤; 박시형; 강미애
Original assignee: 전북대학교 산학협력단
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2019-06-25
Also published as: KR20190051547A; WO2019093673A2; WO2019093673A3

Abstract

본 발명은 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 치주염(periodontal disease)과 같은 골질환의 예방 또는 치료제나 기능성 식품의 첨가제로 새용될 수 있으며, 뼈의 형성 및 재생을 촉진하는 치료에 유용하게 활용될 수 있다는 이점을 가지고 있다.

Description

골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for treating and preventing bone disease comprising metformin}

본 발명은 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 골 형성에 관여하는 조골세포의 Ang1의 발현을 향상시키며, 파골세포로의 분화를 억제하는 효과를 갖는 골질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 건강식품 조성물에 관한 것이다.

고령화 사회가 급속도로 진행됨에 따라, 노인성 질환이 사회적인 문제로 떠오르고 있다. 이중에서도 골질환은 고령의 환자들의 사망 원인 질환 중에서 큰 비중을 차지하고 있을 뿐만 아니라 재생이 어렵고 치명적이며, 치료비용도 높다.

골(bone)은 골을 흡수하는 파골세포(osteoclast)와 골을 형성하는 조골세포(osteoblast)의 조화로 양질의 골이 유지되는데 이 두 가지 세포의 불균형이 골의 질환을 야기하는 것으로 알려져 있다. 이러한 불균형을 야기하는상황 중에서도 특히, 폐경기 이후 여성의 에스트로젠 결핍, 만성 염증에 의한 염증 인자의 증가, 류마티스 관절염, 치주염과 같은 골 질환 등이 파골세포의 형성 및 활성의 원인이 되는 것으로 알려져 있다.

이를 치료하기 위하여 다양한 연구들이 진행되었으나, 기존에 임상에서 많이 사용되는 골다공증 치료제는 Bisphosphonate 계열의 약물로서 주로 골의 hydroxyapatite와 결합하여 파골세포의 작용을 저해하고 파골세포의 세포 사멸을 유도할 뿐만 아니라 파골세포의 분화를 직접적으로 억제한다고 보고되고 있다. 또한, 흔하게 사용되는 약제이기는 하지만 bisphosphonate는 위장관의 불편감이나 치명적인 하악골의 괴사를 야기하는 것으로 알려져 있다.

따라서 적은 부작용과 높은 안전성의 특징을 지닌 약물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 혈관 신생과 관련된 Ang1의 발현을 효과적으로 향상시키고, 파골세포 분화(differentiation)를 유의적으로 억제하며, RANKL-유도된 파골세포 형성(osteoclastogenesis)을 현저하게 억제하는 새로운 화합물을 완성하였으며, 상기 화합물이 골질환 치료용 약학 조성물, 및 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국등록특허공보 제10-1761194호

따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 메트포민이 Ang1 발현을 촉진하여, 조골세포의 분화를 촉진하고 파골세포의 분화를 감소시켜 골 분해를 억제시킴에 따라, 이를 유효성분으로 하는 골질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 메트포민을 유효성분으로 함유한 우수한 골질환 예방 또는 개선 효과를 갖는 건강식품을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골질환(bone disease) 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 메트포민은 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.

[화학식 1]

상기 메트포민은 Ang1의 발현을 촉진하는 것일 수 있다.

상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 무혈성대퇴골괴사(Avascular necrosis of the Femoral Head) 및 치주염(periodontal disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

상기 조성물은 파골세포 분화 및 파골세포 형성(osteoclastogenesis)을 억제하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 조골세포의 분화 또는 활성을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

상기 메트포민은 Ang1의 발현을 촉진하는 것일 수 있다.

상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis) 및 치주염(periodontal disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

상기 건강식품은 파골세포 분화 및 파골세포 형성(osteoclastogenesis)을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 골아세포 분화를 촉진시키는 Angiopoietin1 발현을 유도하고, alkaline phosphatase 활성을 증가시키며, 조골세포의 이동성을 개선함으로써, 조골세포 형성 촉진의 효과를 나타낸다.

또한, 골 형성과 분화와 관련된 제I형 콜라겐, 오스테오칼신(osteocalcin), bine sialoprotein, distal-less homeobox 5, Runt-related transcription factor 2, osterix 및 alkaline phosphatase 단백질의 발현이 향상되었고, 파골세포 분화를 유도하는 단백질 혹은 유전자는 하향조절하는 것을 확인한 바, 골질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 구체적으로 골다공증(osteoporosis), 골연화증(osteomalacia), 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis), 치주염(periodontal disease)과 같은 골질환의 예방 또는 치료제나 기능성 식품의 첨가제로 새용될 수 있으며, 뼈의 형성 및 재생을 촉진하는 치료에 유용하게 활용될 수 있다는 이점을 가지고 있다.

도 1은 FDA에서 승인된 화합물 각각에 대한 Ang1 발현을 측정한 ELISA 결과이다.
도 2a는 U2OS세포에 다양한 농도로 메트포민(0, 2.5, 6, 10 μM)을 처리하였을 때, Ang1 발현정도를 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 2b는 Mg63세포에 다양한 농도로 메트포민(0, 2.5, 6, 10 μM)을 처리하였을 때, Ang1 발현정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2c는 U2OS 및 MG63 세포에 메트포민을 처리한 실험군(5 μM), DMSO(0.1%)를 처리한 대조군에서의 Ang1, Ang2이 발현 여부를 확인하기 위하여, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 3a는 다양한 농도의 메트포민이 U2OS, MG63 세포에서 세포 이동성에 미치는 영향을 보여주는 세포 이동분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 3b, c는 메트포민으로 처리한 U2OS, MG63 세포에서 상처 치료효과를 분석한 결과(b: 6시간, c: 18시간)를 나타내는 사진이다.
도 4a, b는 U2OS(a), MG63(b) 세포에서 메트포민에 의한 조골세포(osteoblast) 분화를 확인하기 위해, pNPP 기질을 사용하였을 때 ALP 활성을 측정하여 비교한 그래프이다.
도 4c, d는 U2OS(c), MG63(d) 세포에서 메트포민에 의한 조골세포(osteoblast) 분화를 확인하기 위해, 칼슘침전을 Alizarin Red S 염색법으로 분석하여 측정된 흡광도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 U2OS 및 MG63 세포에서 메트포민에 의한 조골세포 분화의 단백질 마커 발현을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다.
도 6a는 U2OS와 MG63 세포에서 메트포민에 의한 p38과 인산화된-p38의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 측정하여 나타낸 결과이다.
도 6b는 U2OS와 MG63 세포에서 메트포민에 의해 p38 및 Runx2 또는 OSX 사이의 단백질 상호작용의 관계를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과이다.
도 7은 U2OS, MG63 세포에서 메트로핀이 파골세포 분화의 단백질 마커와 IL-6 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 7a는 Raw264.7 세포에서 메트포민에 의해 IL-6 발현을 웨스턴 블롯 및 SDS-PGAE로 분석한 결과이다.
도 7b는 Raw264.7 세포에서 메트포민에 의해 IL-6, pIκbα, Iκbα, IKKβ, NFκB p65, c-Src, TRAP 및 Cathepsin K의 발현양상을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.
도 8은 Raw264.7 세포에서 메트포민에 의한 파골세포 분화의 억제 활성을 확인한 것으로, 도 8a는 단핵 세포에서 RANKL로 유도된 Raw264.7 다핵세포를 TRAP 염색법으로 염색한 후, 측정한 사진이고, 도 8b는 단핵 세포로부터 분화된 Raw264.7 다핵세포의 수를 카운팅하여 나타낸 그래프이다.
도 8c는 RANKL 처리된 Raw264.7 세포의 분화에서 메트로민에 대한 TRAP(Acid phosphatase) 활성을 분석하여 도시한 그래프이다.
도 9는 AVN 랫트(rat) 동물모델에서 메트포민의 효과를 확인한 것으로, 도 9a는 BSA를 모의 쥐 모델에 주사한 정상대조군(sham BSA), 메트포민을 모의 랫트 동물모델에 주사한 제1실험군(sham Met), BSA를 AVN 랫트 동물모델에 주입한 음성대조군(AVN BSA) 및 메트포민을 AVN 랫트 동물모델에 주입한 제2실험군(AVN Met)에 대한 μCT의 이미지이다. 상기 영상은 대퇴골두 영역, 대퇴골두의 중앙, 두정(coronal), 시상하부(sagittal)의 3D μCT 재구성 이미지이다.
도 9b는 4개의 군에서 대퇴골두의 형태학적 지표를 확인한 것으로, 수치는 평균±표준편차(n = 5)로 표기하였고, **은 정상대조군(sham BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, p<0.001임을 의미한다. #, ##는 음성대조군(AVN BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, #는 p<0.01, ##은 p<0.001임을 의미한다.
도 9c는 BSA를 모의 랫트 동물모델에 주사한 정상대조군(sham BSA), 메트포민을 모의 랫트 동물모델에 주사한 제1실험군(sham Met), BSA를 AVN 랫트 동물모델에 주입한 음성대조군(AVN BSA) 및 메트포민을 AVN 랫트 동물모델에 주입한 제2실험군(AVN Met)에 대한 H&E, Safranin-O 염색법으로 분석한 이미지이다. 도면에서 검은색 바는 500 μm를 의미하고, 흰색 바는 50 μm를 의미한다. 본 도면에서 BV는 뼈의 부피, Tb. N은 골소주(trabecular) 수, Tb.Sp는 골소주 간의 평균거리, Tb.Th는 골소주의 두께, TV는 조직 부피, Po는 공극률을 의미한다.
도 10은 ANV 쥐 모델에서 메트포민의 메커니즘을 확인하고자 한 것으로, 도 10a는 ALPL, DMP1, vWF 및 TRAP에 대하여 대퇴골두의 골단(epiphysis)을 면역조직화학적 염색으로 나타낸 이미지이다. 검은 화살표로 표기된 영역은 vWF가 발현된 곳을 나타낸 것이다.
도 10b는 BSA를 모의 쥐 모델에 주사한 정상대조군(sham BSA), 메트포민을 모의 쥐 모델에 주사한 제1실험군(sham Met), BSA를 AVN 쥐 모델에 주입한 음성대조군(AVN BSA) 및 메트포민을 AVN 쥐 모델에 주입한 제2실험군(AVN Met)에서 혈관밀도를 퍼센트로 나타낸 것이다. 수치는 평균±표준편차(n = 4)로 나타내었고, *은 정상대조군(sham BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, p<0.01임을 의미한다. #는 음성대조군(AVN BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, #는 p<0.01임을 의미한다.
도 10c는 0.16 ㎟당 TRAP 양성세포(파골세포)의 수를 나타낸 그래프이다. 수치는 평균±표준편차(n = 4)로 나타내었고, **은 정상대조군(sham BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, p<0.001임을 의미한다. ##은 음성대조군(AVN BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, #는 p<0.001임을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면은 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골질환(bone disease) 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이며, 본 발명의 다른 측면은 메트포민(Metformin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 골질환 예방 및 개선용 건강식품에 관한 것이다.

본 발명자들은 골질환을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 생체 분자를 개발하고자 노력하였고, 그 결과, 본 발명자들은 Ang1을 발현할 수 있고, 파골세포의 골 분해를 방지 및 억제하고, 조골세포의 분화를 촉진할 뿐만 아니라, 혈관 생성 효과를 동시에 가짐으로써, 동물의 세포 또는 조직에서 골질환을 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 메트포민은 기존에 제2형 당뇨병 치료제로 개발되었던 화합물로, 독성이나, 약물 동태학 등을 긴 시간과 비용을 들여 평가할 필요가 없으며, 약물 대사와 상호작용에 대하여 이미 알려져 있으므로, 이러한 실험을 다시 수행할 필요없이 바로 상용화가능하다는 장점을 갖는다.

본 발명에 있어서, 상기 메트포민은 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.

[화학식 1]

골형성과 골흡수의 균형이 깨지면 골질환으로 진행되며, 이러한 골질환 중에서 난치성 골질환으로는 골다공증(osteoporosis), 불유합(non-union) 골절, 골괴사증(osteonecrosis), 골연화증(osteomalacia), 골결손, 골감소증(osteopenia), 골위축(bone atrophy), 골관절염(osteoarthritis) 및 치주염(periodontal disease) 등이 있고, 추가적으로 무혈성 대퇴골괴사(Avascular necrosis of the Femoral Head)도 이에 포함된다. 이는 외상, 음주, 스테로이드제 복용 등의 복잡한 요인들로 인하여 고관절을 이루는 대퇴골 골두에 혈액 공급이 중단되어 뼈가 파괴되는 난치성 골질환이다. 골다공증은 정상인보다 골량이 현저히 감소하는 것으로, 골의 양적 감소를 주 병변으로 하는 대사성 골질환에 속한다.

앞선 언급한 바와 같이 현재까지 다양한 치료제들이 개발되어 왔으나, 근복적 원인을 해결하지 못하므로 임시적 방편에 불구하며 지속적으로 섭취하지 않으면 재발하게 되는 문제가 있다. 또한, 부작용이 있거나, 비용이 터무니없이 비싸 환자에게 쓰이지 못하는 단점이 있다.

이를 해결하기 위하여 생체분자를 기반으로 하는 다양한 펩타이드 치료제가 개발되어 있으나, 이들은 생체 외 혹은 동물모델에서만 그 안정성과 치료효과가 밝혀졌을 뿐이므로, 생체 안정성, 치료효과를 입증하기 위한 임상시험 과정 등을 거쳐야한다는 문제가 있다.

게다가 새로운 약물 치료제를 개발하는 것은 엄청난 비용과 시간이 소요되기 때문에, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 기존에 임상연구가 진행되어, 최종적으로 허가받은 약물들에 대하여 새로운 용도를 개발함으로써, 시간 및 비용을 절감함과 동시에 우수하고 안정성 높은 약물을 제공하고자 하였다.

다시 말해 본 발명의 조성물은 U2OS, MG63 세포에서 Ang1 발현 유도를 촉진하고 있었고, 이와 더불어 Ⅰ-thyroxine에 의하여 조골세포 분화를 활성화하고 있음을 후술하는 실험예를 통해 확인하였다.

또한, 조골세포의 분화는 미분화된 뼈 조직(mineralized bone matrix)의 침착을 포함한 복잡한 생물학적 과정을 통해 이루어지므로, 본 발명의 조성물을 처리하였을 때, 세포에서 뼈조직의 미분화(mineralization)가 종료된 다음, 뼈 주위에 형성되는 칼슘침착이 발생하는지 여부를 관찰하였다. 그 결과 미분화된 뼈 조직에서 collagen type I alpha 1 chain(COL1A1), osteocalcin(OC), osteopontin(OPN), bone sialoprotein(BSP), bone morphogenic proteins(BMPs), transforming growth factors-(TGF-β), 및 inorganic hydroxyapatite을 상향조절(upregulation)하고 있음을 알 수 있었다(웨스턴 블롯, trap 활성 분석 등).

또한, 본 발명에 따른 조성물은 조골세포 분화에 필수적인 distal-less homeobox(Dlx), runt-related transcription dactor 2(Runx2), osterix(OSX), β-catenin의 발현 여부를 조사한 결과, DMSO 0.1%를 처리한 대조군에 비해 2 배 이상으로 조골세포의 분화를 촉진하는 역할을 수행하고 있음을 확인하였다.

결론적으로 메트포민은 U2OS와 MG63 세포에서 Angiopoietin1 발현을 증가시키고, 조골세포분화를 유도하는 것으로 확인되었으나, Raw264.7에서 파골세포 분화는 억제하는 것으로 확인되었다. 보다 확실하게 대퇴골두 괴사 동물모델(ischmemic osteonecrosis)에서 치료 효과를 관찰한 결과, 메트포민이 잠재적인 뼈 재생성 치료제로 사용될 수 있음을 다시한번 확인하였다.

본 발명의 유효성분인 메트포민은 현재 제2형 당뇨병의 치료를 위한 약물로 사용되고 있고, 특히 정상적인 신장기능을 가진 과체중 또는 비만환자를 위하 1차 약물로 사용되었었다. 메트포민은 혈당 수치를 개선하고, 심혈관 질환을 예방하는 효과를 갖는 것으로 알려져 있으며, 작용기전은 간에서 AMP 활성 단백질 키나제(AMPK)를 활성화시켜 지방산의 합성을 억제하고 세포 내로 포도당 흡수를 촉진하여 대사 증후군을 억제하므로, 다낭성 난소 증후군을 치료할 수 있을 뿐, 골질환 특히, 무혈성대퇴골괴사에 대해서는 전혀 치료효과에 대해서 암시되거나 언급된 적이 없었다.

본 발명에서 FDA 승인 의약품 라이브러리를 ELISA 시스템으로 스크리닝하여 Ang1발현을 유도하는 종래 화합물들을 선별하였고, 이 중에서 메트포민이 잠재적인 골형성 활성을 가지고 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

또한, 상기 조성물은 파골세포 분화 및 파골세포 형성(osteoclastogenesis)을 억제하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하여, 상기 골질환에 대하여 예방 또는 치료 효과를 가지고 있으며, 구체적으로 무혈성대퇴골괴사에 대하여 우수한 예방 또는 치료효과를 가지고 있다.

본 발명의 조성물에서, 유효성분의 함량은 특별히 한정할 필요는 없으나, 3 μM 이상일 수 있고, 바람직하게는 5 μM 이상인 것이면 조골세포 분화 및 형성을 유도하고, 파골세포의 분화 및 형성을 억제하여, 골질환의 개선, 치료 또는 예방 효과를 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 본 발명의 메트로민의 골질환 개선, 치료 또는 예방 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.

상기 건강식품이란, 상기 메트로민을 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태로 제제화 한 것일 수 있고, 또는 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하여 일반 식품 형태로 제조한 것으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

상기 건강식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강식품에 있어서의 메트로민의 첨가량은, 대상인 건강식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태의 건강식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다.

상기 건강식품은 유효성분으로서 메트로민 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

예컨대, 본 발명의 건강식품이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 메트로민 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

또한 메트로민을 유효성분으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 결명자 유산균 발효물은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 0.1 g/kg 이상 포함된다. 메트로민은 기존에 약물로서 임상실험, 독성실험 등이 완료되어 상용화되던 화합물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 메트로민의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

상기 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

상기 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10g/㎏이다.

상기 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실험재료 및 방법

1) 실험재료

메트포민(Metformin), 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO), 글리세롤(glycerol), 글리신(glycine), 소듐클로라이드(sodium chloride), 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), Trizma base 및 Tween20은 모두 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. FDA-승인된 약물(SCREEN-WELLㄾ FDAapproved drug library V2)은 Enzo Life Sciences(Farmingdale, NY, USA)로부터 얻어 사용하였다.

2) 세포배양

U2OS, MG63, Raw264.7 세포주(ATCC, Manassas, VA, USA)는 10% FBS(fetal bovine serum, Invitrogel)과 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin, Invitrogen)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 배지에서 배양하였고, 37 ℃에서 5% CO₂ 조건을 유지하였다.

3) FDA 승인된 약물 라이브러리 스크리닝

U2OS 세포(1×10⁴ per cell)를 96 웰 플레이트에 분주하고, 37 ℃, CO₂ 배양기에서 밤새 배양하였다. 각 웰에 존재하는 세포에, DMSO(vehicle control) 또는 FDA-승인된 약물 라이브러리(5 μM)의 화합물을 각각 처리한 후, 37 ℃m 5% CO₂ 조건하에서 1 시간동안 배양하였다. 각 세포 배양액(50 ㎕)을 96 웰 플레이트에 옮겨, 세포로부터 분비된 Ang1의 수준을 측정하였다. 상업저그로 이용가능한 quantitative sandwich ELISA (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 상온에서 1 시간동안 Ang1에 대한 항체와 함께 세포 배양배지를 배양하여 수행하였다. 세척후, 상기 96 웰 플레이트의 각 웰에 peroxidase substrate(TMB)를 첨가하여 15 분동안 배양한 다음, ELISA stop 용액을 첨가하였다. 상기 각 시료의 흡광도(optical density)를 450 ㎚, 마이크로플레이트 리더기(MQ Quant, Bio-Tek, Winooski, VT, USA)로 측정하였다.

4) ELISA 분석

세포 상층액(supernatant)에서 Ang1 수준을 sandwich ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. U2OS와 MG63 세포(1×10⁴ per well)를 96 웰 플레이트에 분주하였다(triplicate). 이후, 상기 세포에 L-thyroxine을 처리하고, 이의 상층액을 회수하였다. 상기 분석은 제조사의 매뉴얼에 다라 수행되었고, 각 시료의 흡광도를 마이크로플레이트 리더기로 450 ㎚에서 측정하였다.

5) 상처 치료효과 분석

U2OS 및 MG63 세포(1×10⁵ per well)를 각각 6 웰 플레이트에 분주하고, 분석하기 전에 먼저, 무혈청배지에서 18 시간 배양하였다. 컨플루언트 세포(confluent cell)에 P200 피펫팁을 사용하여 인위적인 상처를 냈다. 0 시간에서의 상태를 기록하기 위해 현미경 사진을 즉시 촬영하고, 세포 배양배지를 1% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 바꾸어 준 후, 세포를 대조군(DMSO 0.1%) 또는 메트포민(실험군)으로 처리하였다. 세포의 이동은 관찰된 시점에서 현미경으로 관찰하고 포획하였다.

6) 세포 이동분석(Migration assay analysis)

U2OS, MG63 세포(1×10⁵ per well)을 챔버세포이동장치(pore size:8 ㎛, Corning Life Sciences, Lowell, MA, USA)의 챔버 상에 분주하고, 무혈청배지로 배양하였다. 다음, 세포를 무혈청배지(DMSO 0.1%)만으로 처리한 대조군과 메트로민이 포함된 무혈청배지로 처리한 실험군으로 제조하였다. 6 시간이 지난 후, 멤브레인-트래버싱된 세포를 고정시키고, crystal violet 용액으로 염색하였다.

7) ALP 분석

U2OS와 MG63 세포(1×10⁵ per well)를 6 웰 플레이트에 각각 분주하고, 이의 ALP 활성을 ALP 활성 검출키트 키트(Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)를 사용하여 측정하였다. 간략하게 PBS로 회수한 세포를 세척한 뒤, 용해하고, 원심분리하였다. 상기 가용성 분획물(soluble fraction)은 효소 활성 분석을 위해 사용되었다. 상기 가용성 분획물(80 ㎕)와 5 mM pNPP 기질 50 ㎕를 96 웰 플레이트에 넣고, 25 ℃, 암전하에서 1 시간동안 배양하였다. 여기에 20 ㎕ 반응종료 용액(stopping solution)을 첨가하여, 반응을 종료시켰다. 각 시료의 흡광도를 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 405 ㎚에서 측정하였다.

8) Alizarin Red S 염색분석

U2OS와 MG63 세포(1×10⁴ per well)를 96 웰 플레이트에 분주하고, 각 세포를 배지만 처리한 비히클대조군과 메트로민이 포함된 배지를 처리한 Metformin 처리군으로 제조한 후(1 시간 반응), 세포를 20 일 동안 배양하였다. 상기 배양액을 매일매일 메트로민이 첨가된 배지로 교환해주었다. 세포를 20일째에 4% 파라포름알데히드(Sigma Aldrich)로 20 ℃, 15분동안 처리하여 고정하였다. 세포를 두차례에 걸쳐 증류수(deionized water, ddH2O)로 세척하고, 40 mM Alizarin Red S 수용액(pH 4.2)로 15 분동안 처리하였다. 세포는 ddH2Ofh 두차례 세척한 다음 이미지를 촬영하였다. 정량적 분석을 위해 염색된 세포를 10%(w/v) 아세틸 피리디늄 클로라이드(acetyl pyridinium chloride, Sigma Aldrich) 수용액(in ddH2O)로 30 분 동안 추출하였다. 그리고 나서 각 시료의 흡광도를 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 570 ㎚에서 측정하였다.

9) 웨스턴 블롯 분석

U2OS, MG63 세포(1×10⁵ per well)를 6 웰 플레이트에 각각 분주하고, 각 세포를 배지만 처리한 비히클대조군과 메트로민이 포함된 배지를 처리한 Metformin 처리군으로 제조한 후(1 시간 반응), 세포를 회수하고, RIPA 퍼버(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 사용하여 용해하였다. 웨스턴 블롯으로 분석하기 위해, 처리된 세포의 세포 배양액을 Microcon YM-10(Millipore Corp., Bedford, MA, USA)으로 농축하였다. 단백질 농도는 Bradford(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 확인하였고, 각 단백질 시료는 10-15% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분리한 다음, 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 막(Millipore, Bedford, MA, USA)으로 옮겼다. 0.05% Tween 20과 3% BSA(bovine serum albumin, Sigma Aldrich)을 포함하는 버퍼로 1 시간동안 블록(blocking)한 후, 상기 막을 특이적 항체를 이용하여 4 ℃에서 밤새 반응시켰다. p-p38, 038, ALP, COL1A1, BSP, OC(Cell Signaling Technology), RUNX2, OSX, Dlx5, β-actin, IL-6, pIκbα, Iκbα, IKKβ, NFκB p65, c-Src, TRAP, Cathepsin K(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), Ang1 및 Ang2(Abcam)에 대한 1차 항체를 1:1000 비율로 희석하여 사용하였다. 세척한 후, 1:10000 비율로 희석한 HRP-결합된 이차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies)(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)를 사용하여 배양하였다. 단백질 발현은 ECL 검출 시스템(GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ, USA)을 사용하였고, 막은 ChemiDoc^™ MP Imaging System(Bio-Rad)을 사용하여 확인하였다.

10) 면역침전 분석( Immunoprecipitation analysis)

U2OS, MG63 세포를 PBS로 2차례에 걸쳐 세척하고, RIPA 버퍼를 사용하여 용해시켰다. 상기 용해물로부터 세포 침전물을 제거하기 위하여, 상기 용해물을 16,000 g에서 10 분동안 원심분리하였다. 총 단백질 농도는 Bradford(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 확인하였다. 이후 상기 용해물을 항체와 함께 4 ℃에서 밤새 회전(rotating) 배양시킨 후, 50% 단백질 A- 또는 단백질 G-아가로스 슬러리 25 ㎕를 첨가하여 1 시간동안 회전배양시켰다. 단백질 A/G 비드를 회수하고, 용해 퍼버(lysis buffer)로 두차례에 걸쳐 세척한 다음, 10 또는 12% SDS-PAGE(SDS??polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 면역침전물을 분석하였고, 웨스턴 블롯 분석으로 관찰하였다.

11) TRAP 염색 분석

Raw264.7 세포(1×10³ per well)을 6-웰 플레이트에 각각 분주하였다. 세포에 RANKL 100 ng/㎖을 처리하고, 배지만 처리한 비히클 대조군과 메트로민(Metformin)을 포함한 배지로 처리한 메트로민 처리군을 제조하였다. 2 또는 7일째, 세포를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고, 제조사 매뉴얼(Abcam)에 따라 TRAP 활성을 염색하였다. TRAP-양성 다핵세포(multinucleated cell((nuclei>3)를 현미경(Leica DM IL LED; Leica)을 사용하여 파골세포로 채취하였다.

12) TRAP(Acid phosphatase ) 활성 분석

6 웰 플레이트에 분주된 Raw264.7 세포(1×10⁵ per well)의 TRAP(acid phosphatase) 활성을 TRAP 활성 검출 키트(Abcam)를 사용하여 분석하였다. 간략하게, 세포를 회수하고, PBS로 세척한 뒤, 용해하고 원심분리하였다. 일련의 과정을 통해 분리된 가용성 분획물을 효소 분석을 사용하였고, 상기 가용성 분획물(80 ㎕)과 5 mM pNP 기질을 96 웰 플레이트에 첨가하여 25 ℃, 암전분위기 하에서, 1 시간동안 배양하였다. 상기 반응을 20 ㎕ 반응종료 용액(stopping solutio)을 첨가하여 중지시키고, 각 시료의 흡광도(optical density)를 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 405 ㎚에서 측정하였다.

13) 통계 분석

실험 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 평균±표준 편차로 표시되며, SPSS 소프트웨어(version 19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)와 동등한 차이가 있을 때, paired t-test를 사용하여 각 군간의 차이를 분석하였다. 모든 통계학적 분석은 양면(two-sided)으로 검사하였고, P 값이 0.05 미만이면 통계학적으로 유의한 것으로 간주한다.

<결과>

실험예 1. 선별

U2OS, MG63 세포에서 메트로민은 Ang1 발현을 증가시켰고, 세포 이동성을 증가시켰다. Ang1은 골형성을 조절할 수 있다고 알려진 골격근 세포를 포함하는 다양한 세포유형에서 세포 부착 및 생존을 향상시키는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명에서는 Ang1에 대하여 내인성 발현을 활성화시킬 수 있는 새로운 화합물을 개발하고자 하였다.

이를 위해 본 발명은 Ang1 발현에 FDA로부터 승인된 821개의 의약품 라이브러리를 적용하였고, 이로부터 Ang1 발현과 관련된 활성을 갖는 화합물을 1차적으로 선별하였다. 구체적으로 U2OS 세포를 96 웰 플레이트에 각각 분주하고, 상기 FDA 승인된 화합물을 각각 세포에 첨가하여, 1 시간동안 배양한 뒤, 각 세포배양액을 96 웰 플레이트로 옮겨 ELISA 키트로 측정하였다. 각 웰을 Ang1 항체와 기질 및 반응정지 용액으로 순차적으로 배양한 후, 흡광도를 450 ㎚에서 측정하였고, DMSO 비히클 대조군에 비해 2배 이상의 Ang1 발현을 유도한 화합물들을 일차적으로 선택하여 표 1에 나타내었다.

구분	약물	위치	용도
A	Tolcapone	1-H10	Antiparkinson
B	MetforminㅇHCl	2-C09	Antidiabetic
C	Sodium Phenylbutyrate	2-G11	Antineoplastic
D	Flucytosine	8-B03	Antimycotic
E	Hydroxyzine Dihydrochloride	8-E02	Antihistamine
F	Lacosamide	8-F05	Anticonvulsant
G	Leucovorin Calcium Pentahydrate	8-F10	Antitoxicity

표 1에 나타낸 바와 같이 조골세포와 유사한 U2OS 세포에서 ELISA를 통해, 각각의 화합물이 Ang1 발현을 유도하는지 분석하여 가장 우수한 발현 효과를 갖는 화합물을 선별하였고, 이들 각각의 Ang1 발현정도, Ang1, Ang2 발현정도를 비교한 결과 가장 그 효과가 뛰어난 메트포민(Metformin)을 최종적으로 선별하였다.

실험예 2. Ang1 발현에 대한 메트로핀의 효과

메트로핀 용량에 따른 Ang1 발현 조절 실험을 위해 U2OS 및 MG63 세포를 96- 웰 플레이트에 접종하고 37 ℃에서 밤새 배양했다. 이어서 세포에 다양한 농도의 메트포민(2.5, 5, 10 μM)(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1 %)(대조군)를 처리하고 1 시간 동안 배양 하였다. 세포 배양 배지를 회수하여 ELISA를 사용하여 Ang1 발현 여부를 확인하였다. 도면에서 통계적 의의(*)는 P<0.05로 하였다. 실험은 총 3회 수행하였고, 오차 막대는 표준편차를 나타내며, 통계적 분석은 paired t-test로 하였다.

도 2a는 U2OS세포에 다양한 농도로 메트포민(0, 2.5, 6, 10 μM)을 처리하였을 때, Ang1 발현정도를 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 2b는 Mg63세포에 다양한 농도로 메트포민(0, 2.5, 6, 10 μM)을 처리하였을 때, Ang1 발현정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 2a, b에 나타난 바와 같이, 메트포민이 U2OS와 MG63에서 Ang1 발현을 유도한다는 것을 확인하였다. 두 세포모두에서 Ang1 단백질의 발현 수준이 메트포민을 처리한 군에서 용량 의존적으로 유의하게 증가하였음을 확인하였다.

앞선 Ang1 발현유도 결과가, 메트포민 처리에 의한 것인지 확인하기 위하여, 메트포민을 처리한 실험군과, 실험군의 배양액으로부터 회수한 총 단백질을 농축하고, 웨스턴 블롯으로 분석하고자 하였다. 구체적으로 U2OS 및 MG63 세포에서 Metformin에 의해 유도 Ang1 발현을 확인하기 위해, 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 5 μM의 메트포민(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1 %)(대조군)의 동량으로 처리하고 1 시간 동안 배양했다. 처리된 세포로부터의 세포 배양 배지를 웨스턴 블롯을 위해 Microcon과 함께 농축하고, SDS-PAGE 겔에 로딩한 후, 쿠마시 블루로 염색하였다. 이때, Ang1는 Angiopoetin1이고, Ang2는 Angipoietin2이다.

도 2c는 U2OS 및 MG63 세포에 메트포민을 처리한 실험군(5 μM), DMSO(0.1%)를 처리한 대조군에서의 Ang1, Ang2이 발현 여부를 확인하기 위하여, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석한 결과로, 이에 따르면 메트포민 5 μM을 첨가한 U2OS와 MG63 세포에서 Ang1 발현이 현저하게 증가하였음을 확인하였다. 메트포민이 Ang1 발현을 향상시켰으나, angiopoietin2 발현은 차이가 없었으므로, 이를 통해 메트포민이 Ang1 발현에 대해 특이적 활성을 가지고 있음을 알 수 있다.

다시 말해 U2OS 및 MG63 세포에서 혈관신생 Ang1 발현이 메트포민에 의해서만 강화된 것임을 알 수 있다.

실험예 3. 세포 이동성에 미치는 영향

실험예 2에서 나타난 세포의 이동성이 Ang1 발현에 의한 혈관 생성때문인지 메트포민에 의한 것인지 확인하고자 하였다. 구체적으로 U2OS와 MG63 세포를 6 웰 플레이트에 분주하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 세포에 다양한 농도의 메트포민(2.5, 5 및 10 μM)(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1 %)(대조군)으로 각각 처리하고 6 시간 동안 배양하였다. 멤브레인-트래버싱된 세포를 고정시키고 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다.

도 3a는 다양한 농도의 메트포민이 U2OS, MG63 세포에서 세포 이동성에 미치는 영향을 보여주는 세포 이동분석 결과를 나타내는 사진이다.

도 3a에 도시된 바와 같이, 멤브레인-트래버싱된 U2OS 및 MG63 세포가 메트포민에 의하여 증가되었음을 확인되었고, 메트포민 농도에 비례하여 향상되고 있음을 알 수 있다.

상처 치유 분석을 위해 U2OS와 MG63 세포를 6 웰 플레이트에 분주하고 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 이어서 세포에 다양한 농도의 메트포민(2.5, 5 및 10 μM)(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1 %)(대조군)으로 처리하고 6 시간과 18시간 동안 배양하였다. 세포의 이동은 관찰된 시점에서 현미경에 의해 관찰 및 포획되었다.

도 3b, c는 메트포민으로 처리한 U2OS, MG63 세포에서 상처 치료효과를 분석한 결과를 나타내는 사진으로, 이를 살펴보면 메트포민이 상처 봉합을 상당히 유도하고 있음을 확인하였다.

실험예 4. 메트포민의 조골세포 분화 효과

ALP는 조골세포 분화의 바이오마커로, 조골세포의 외부 원형질 막에서 세포 표면 효소에 위치하고 있다. 이는 무기 인산염(inorganic phosphate)을 방출하는 PME(phosphomonoesters)의 가수분해를 촉매하는 것으로, ALP 활성을 통해 조골세포 분화 및 미분화 여부를 평가할 수 있다.

ALP 활성은 pNPP를 기질로 사용하여 측정하였다. 구체적으로 U2OS 및 MG63 세포를 6 웰 플레이트에서 컨플루언스(confluence)까지 성장시키고, 여기에 다양한 농도의 메트포민(2.5, 5 및 10 μM)(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1 %)(대조군)을 처리하여 1 시간 동안 배양하였다. 세포를 회수하고 제조자의 프로토콜에 따라 처리하였다. 도면에서 통계적 의의(*)는 P<0.05로 하였다. 실험은 총 3회 수행하였고, 오차 막대는 표준편차를 나타내며, 통계적 분석은 paired t-test로 하였다. 여기서 구체적인 검출과정은 실험방법에서 7) ALP 분석을 참조한다.

도 4a는 U2OS, MG63 세포에서 메트포민에 의한 조골세포(osteoblast) 분화를 확인하기 위해, pNPP 기질을 사용하였을 때 ALP 활성을 측정하여 비교한 그래프로, 이에 따르면 메트포민이 처리된(2.5, 5, 10 μM) U2OS 세포와 MG63 세포에서 ALP 활성이 대조군에 비해 현저히 증가되었음을 확인하였다.

칼슘침전은 생체외에서 조골세포의 분화를 나타내는 대표적인 지표 중 하나로, 칼슘 염색을 통해 확인할 수 있다. 본 실험에서 칼슘 염색을 위해 Alizarin red S를 사용하였고, 이는 일반적으로 세포 외 기질에서 칼슘 기반의 미네랄을 염색한다. 구체적으로 U2OS 및 MG63 세포를 96 웰 플레이트에서 컨플루언스(confluence)까지 성장시키고, 여기에 다양한 농도의 페트포민(2.5, 5 및 10 μM)(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1 %)(대조군)을 처기한 후, 20 일 동안 배양하였다. 배양 20 일 동안, 적절한 양의 메트포민을 함유 한 세포 배양 배지를 격일로 교체해주었다. 이후 상기 세포를 회수하고, 고정하여 Alizarin Red S로 염색하였다. 정량적 비교를 위해 염색된 세포를 추출하고 흡광도를 마이크로플레이트 리더기로 측정하였다. 메트포민 실험군과 DMSO 대조군간에 유의한 차이가 나타났다(*는 P <0.05를 의미 함). 실험은 3 회 수행하였고, 오차 막대는 표준편차를 나타내며, 통계적 분석은 paired t-test로 하였다. 여기서 구체적인 검출과정은 실험방법에서 8) Alizarin Red S 염색분석을 참조한다.

도 4c, d는 U2OS(c), MG63(d) 세포에서 메트포민에 의한 조골세포(osteoblast) 분화를 확인하기 위해, 칼슘침전을 Alizarin Red S 염색법으로 분석하여 측정된 흡광도를 나타낸 그래프로, 이에 따르면 메트포민이 처리된 세포에서는 뼈 형성에 필수적이라 여겨지는 세포외 칼슘이 함량이 증가하였음을 알 수 있다. 정량적인 Alizarin Red S 염색분석을 수행한 결과, 5 μM 농도의 메트포민을 처리한 실험군부터 유의적 범위로 칼슘침전이 증가하였음을 확인할 수 있고, DMSO를 처리한 대조군에 비해서 2 배 이상 향상된 수치를 가지고 있었다. 이러한 결과를 통해 메트포민이 생체 외 실험에서, 조골세포의 분화와 미분화를 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

실험예 5. 메트포민의 조골세포 분화와 관련된 단백질 마커의 발현조절 효과

앞선 수많은 연구들에서 ALP33, COL1A113, OC14, BSP17, Dlx520, Runx221 및 OSX22 발현을 통해 조골세포 분화를 확인하였다. 이에 본 발명에서도 조골세포 분화에 대한 메트포민의 영향을 확인하고자, U2OS, MG63 세포에서 상기 단백질 마커의 발현조절 경향을 분석하고자 하였다. 조골세포 분화의 단백질 마커의 발현을 분석하기 위해, 웨스턴 블롯을 수행하였다. 구체적으로, U2OS 및 MG63 세포를 6 웰 플레이트에 분주하고, 여기에 5 μM 메트로민(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1 %)(대조군)을 처리하고 1 시간 동안 배양했다. 세포를 수확하고 단백질을 용해한 후, 이를 SDS-PAGE 겔에서 분리하고, Ang1, COL1A1, ALP, Runx2, OC, BSP, Dlx5 및 OSX에 대한 특이 항체로 면역블롯을 수행하였다. β-actin 블롯을 로딩 대조군으로 사용하였다. Ang1은 angiopoetin1이고, COL1A1은 I 형 콜라겐이며, ALP은 알칼라인 포스파타제이며, Runx2은 runt 관련 전사 인자 2이며, OC은 오스테오칼신이고, BSP은 뼈 시알 로테이트이며, Dlx5는 distal-less homeobox 5이며, OSX는 Osterix이다.

도 5는 U2OS 및 MG63 세포에서 메트포민에 의한 조골세포 분화의 단백질 마커 발현을 분석하여 나타낸 웨스턴 블롯 결과로, 이에 따르면 DMSO 대조군과 메트포민 5 μM을 첨가한 실험군에서, COL1A1, OC, BSP, Dlx5, Runx2, 및 OSX 발현수준은, 실험예 4의 ALP 발현 수준 변화경향과 극적으로 일치한다는 것을 확인하였다.

구체적으로 본 발명의 메트포민은 Runx221과 OSX22, Runx234과 OSX35, Ang1, Dlx5, BSP 등등 발현을 증가시키고 있음을 확인하였다.

이중에서 조골세포 분화를 담당하는 대표적인 전사인자인 Runx221과 OSX22 발현은 뼈형성과 관련된 다른 단백질 발현을 제어하는 중추적인 역할을 하며, p38 MAP kinase는 조골세포 분화 과정에서 전사활성을 나타내는 Runx234과 OSX35를 활성화시키는데, U2OS, MG63 세포에서 메트포민이 p38의 인산화(phosphorylation(activation))에도 영향을 미치는지 후술하는 실험을 통해 확인하고자 하였다.

우선, 세포를 6 웰 플레이트에 접종하고, 여기에 다양한 농도의 메트포민(2.5, 5, 10 μM)(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1 %)(대조군)을 처리하여 1 시간동안 배양하였다. 세포를 회수하고, 용균시킨 뒤, 단백질을 SDS-PAGE 겔로 분리하고, p-p38 및 p38에 대한 특이 항체로 웨스턴 블롯을 수행하여, 그 결과를 도 6a에 나타내었다.

도 6a에 따르면, p38의 인산화된 형태(p-p38)는 메트포민의 용량에 비례하여 증가하였음을 확인하였다.

앞선 실험을 통해 U2OS, MG63 세포에 메트로민을 처리한 후, p38과 Runx2 또는 OSx사이의 단백질 상호관계를 조사하고자 하였다. 이를 위해, 우선 U2OS, MG63 세포를 각각 10 ㎝ 접시에 접종하고, 여기에 메트포민 5 μM(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1 %)(대조군)을 처리하여 1 시간 동안 배양하였다. 세포를 회수하고, 용균한 다음, 단백질을 p38에 대한 항체로 면역 침전시켰다. 면역침전된 단백질을 SDS-PAGE 겔상에서 분석하고 Runx2, OSX, p-p38 및 p38에 대한 특이 항체로 웨스턴 블롯을 수행하였다. IgG heavy chain 블롯을 로딩 대조군으로 사용하였다. Runx2은 runt 관련 전사 인자 2이고, OSX은 osterix를 의미한다.

도 6b는 U2OS와 MG63 세포에서 메트포민에 의해 p38 및 Runx2 또는 OSX 사이의 단백질 상호작용의 관계를 웨스턴 블롯을 통해 분석한 결과로, 이를 참고하면 본 발명의 메트포민은 RunX2 또는 OSX의 양을 증가시켰다.

도 6a, b를 종합하면 메트포민은 COL1A1, OC, BSP 및 Dlx5와 같은 조골세포 분화를 위한 다른 단백질의 높은 발현을 이끌며, 이는 p38 키나아제의 발현에 따른 Runx2와 OSX 단백질의 전사활성을 상향조절할 수 있음을 통해 달성할 수 있다.

실험예 6. Raw264 .7에서 파골세포 분화 억제 효과

파골세포의 전달과 분화를 조절하여 골 재생에 영향을 끼치는 중요한 요소로 IL-6이 가장 대표적이다. 이를 기반으로 본 발명에 다른 메트포민이 파골세포의 모델 세포주인 Raw264.7 세포에서 IL-6 발현을 어떻게 조절하는지를 파악하고자 하였다. 구체적으로 Raw264.7세포를 6 웰 플레이트에 분주하고, 각각의 웰에 메트포민(5 μM)(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1%)(대조군)을 처리한 후, 1 시간동안 배양하였다. 세포로부터 배양액을 회수하고, 웨스턴 블롯을 위해 Microcon으로 농축하였다. 이를 로딩하여 SDS-PAGE 겔을 사용하여 Coomassie blue로 염색하였다. 즉 메트포민을 처리한 실험군이나 대조군의 Raw264.7세포로부터 IL-6 발현 양상을 비교하였고, 그 결과는 도 7a에 나타내었다.

도 7a에 따르면 대조군보다 메트포민을 처리한 실험군에서 상대적으로 IL-6 발현이 감소하였음을 확인하였다.

또한 Raw264.7 세포에서 메트포민에 의한 IL-6 발현 조절의 메커니즘을 확인하고자 하였고, 웨스턴 블롯으로 IL-6, pIκbα, Iκbα, IKKβ 및 NFκB p65의 발현양상을 분석하였다. 구체적으로 Raw264.7 세포를 6 웰 플레이트에 분주하고, 각각의 웰에 메트포민(5 μM)(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1%)(대조군)을 처리한 후, 1 시간동안 배양하였다. 세포를 회수하고, 단백질을 용해한 후, SDS-PAGE 겔로 분리하여, IL-6, pIκbα, Iκbα, IKKβ, NFκB p65, c-Src, TRAP 및 Cathepsin K의 특이 항체를 사용하여 웨스턴 블롯하였다. β-actin 블롯을 로딩 대조군으로 사용하였고, 그 결과를 도 7b에 나타내었다.

도 7b는 Raw264.7 세포에서 메트포민에 의해 IL-6, pIκbα, Iκbα, IKKβ 및 NFκB p65의 발현양상을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과로, 메트포민에 의하여 IL-6, pIκbα, IKKβ 및 NFκB p65는 감소하였으나, Iκbα는 변하지 않았다. 여기서 NFκB p65는 파골세포에서 IL-6 발현을 조절하기 위한 전사인자로, 일반적으로 IKKβ kinase 활성을 증가시킴으로써 NFκB p65의 내인성 억제제인 Iκbα의 인산화에 의하여 전사 활성을 나타내도록 활성화하는 역할을 수행하는 것이다. 따라서, 메트포민은 NFκB p65 전사활성을 IKKβ의 억제제를 통해 감소함으로써, IL-6 발현 감소를 이끌었음을 알 수 있다.

또한, 도 7b를 통해 Raw264.7 세포에서 파골세포 분화과 관련되어 있다고 잘 알려진 단백질 마커 c-Src, TRAP 및 Cathepsin K에 대한 메트포민의 효과를 분석한 결과, c-Src, TRAP 및 Cathepsin K 발현이 Raw264.7 세포에서 메트포민에 의해 감소하였음을 알 수 있다. 이는 파골세포로 분화하는 것으로부터 Raw264.7 세포를 보호하고 있음을 의미하는 것으로, 앞선 IL-6, pIκbα, Iκbα, IKKβ, NFκB p65 발현 양상과 결과가 일치한다.

실험예 7. Raw264 .7 분화에 대한 메트포민 영향

Raw264.7 단핵 세포(monocytes)는 핵인자 kappa-B ligand(RANKL)의 수용체 활성제가 적절한 농도로 존재할 때 TRAP-양성 다핵 파골세포로 분화한다. 따라서, TRAP-양성 다핵세포인 Raw264.7 세포를 측정하여 파골세포 분화 억제 활성을 분석하고자 하였다. 구체적으로 Raw264.7 세포를 6 웰 플레이트에 분주하고, 각각의 웰에 다양한 농도의 메트포민(2.5, 5, 10 μM)(실험군) 또는 동량의 DMSO(0.1%)(대조군)을 처리한 후, 2 일이나 7 일동안 배양하였다. 배양되는 동안 매일매일 새로운 배양액으로 교환해주었다. 그리고 상기 세포를 고정하고 TRAP 염색으로 염색한 다음, 다핵형성된 Raw264.7 세포만 카운팅하였다. 메트포민 실험군과 DMSO 대조군간에 유의한 차이가 나타났다(*는 P <0.05를 의미함). 실험은 3 회 수행하였고, 오차 막대는 표준편차를 나타내며, 통계적 분석은 paired t-test로 하였다. 그 결과를 도 8a, b에 도시하였다.

도 8은 Raw264.7 세포에서 메트포민에 의한 파골세포 분화의 억제 활성을 확인한 것으로, 도 8a는 단핵 세포에서 RANKL로 유도된 Raw264.7 다핵세포를 TRAP 염색법으로 염색한 후, 측정한 사진이고, 도 8b는 단핵 세포로부터 분화된 Raw264.7 다핵세포의 수를 카운팅하여 나타낸 그래프이다.

도 8a, b에 도시된 바와 같이, 메트포민은 TRAP-양성 다핵세포로의 분화를 용량에 비례하여 현저히 감소시키고 있음을 확인하였다.

Raw264.7 세포를 6웰 플레이트에 분주하고, 각각의 웰에 다양한 농도의 메트포민(2.5, 5, 10 μM)(실험군)이나 DMSO(0.1%)(대조군)을 처리한 후, 1 시간동안 배양한 후, 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 회수한 결과(실험방법 12) 참조), 대조군과 메트로핀 실험군은 상당한 사이가 있음을 확인하였다(*은 P < 0.05를 의미함). 실험은 총 세 번 수행하였고, 상기 error bars는 표준편차를 나타내며, 상기 통계학적 분석은 paired t-test로 수행하였다. 그 결과는 도 8c에 나타내었다.

도 8c는 RANKL 처리된 Raw264.7 세포의 분화에서 메트로민에 대한 TRAP(Acid phosphatase) 활성을 분석하여 도시한 그래프이다.

도 8c에 나타난 바와 같이, 메트포민이 RANKL로 처리된 Raw264.7 세포로부터 파골세포로의 분화를 억제하고 있음을 확인할 수 있다. 유의적 효과는 메트포민이 2.5 μM 이상으로 첨가되었을 때, 구체적으로 5 μM 이상으로 첨가되었을 때임을 확인하였다.

실험예 8. 메트포민에 대한 in vivo 치료 또는 예방효과

1) 허혈성 골괴사 ( SVN ) 동물모델 제작

본 발명은 전북대학교 동물 관리 및 윤리 위원회에 의하여 승인되었다(Ethics number: CBNU2016-28). Sprague-Dawley 랫트(수컷, 10 주령, 320-350 g)를 사용하였고, 모든 랫트는 표준사료를 제공하였고, 일정한 환경 조건의 동물시설에서 사육하였다(사육장 온도 22 ℃, 50% 상대습도, 12시간 명암 사이클). 마취를 위해, Zoletil(150 mg/kg)을 복막내 주사하였고, 대퇴두 수술을 통해 허혈성 골괴사(SVN)가 유도된 동물모델을 제조하였다.

수술 후, 1 주일 동안에 매일매일 메트포민(25 mg/kg)을 복강 내로 주사하였고, 수술 후 4주째 소듐 펜토바르비탈(sodium pentobarbital)을 사용하여 안락사시켰다.

2) 메트포민 투여후 치료효과 검증

형태학적 특성 분석:마이크로 CT

허혈성 괴사에서 메트포민의 효과를 분석하기 위하여, 본 발명에서 대퇴골두의 허혈성 괴사를 유도하는 수술을 수행한 동물모델에, 메트포민을 1주간 복강 내로 주사한 후, 3주 뒤(수술 후 4주차) 대퇴골두를 마이크로 컴퓨터 단층촬영법(Micro-computed tomography)를 통해 형태학적 특성을 분석하였다.

구체적으로 수술 후, 4주째의 랫트를 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-cimputed tomography)로 촬영하고, CTAn 소프트웨어(Skyscan)으로 분석하였다. 모든 시료는 일정한 역치(threshold)(~45 %)로 적영되었고, 대퇴골두는 대퇴골두의 골단(epiphysis)의 가장자리(margin)에서부터 대퇴골 경부의 중심부를 분석하였다.

도 9는 AVN 랫트(rat) 동물모델에서 메트포민의 효과를 확인한 것으로, 도 9a는 BSA를 모의 쥐 모델에 주사한 정상대조군(sham BSA), 메트포민을 모의 랫트 동물모델에 주사한 제1실험군(sham Met), BSA를 AVN 랫트 동물모델에 주입한 음성대조군(AVN BSA) 및 메트포민을 AVN 랫트 동물모델에 주입한 제2실험군(AVN Met)에 대한 μCT의 이미지이다. 상기 영상은 대퇴골두 영역, 대퇴골두의 중앙, 두정(coronal), 시상하부(sagittal)의 3D μCT 재구성 이미지이다.

도 9a에 나타난 바와 같이 허혈성 괴사(AVN) 랫트 동물모델에 주입한 음성대조군(AVN BSA)에서, 대퇴골두의 골단이 부분적으로 흡수된 것을 확인하였고, 메트포민이 주사된 제2실험군(AVN Met)에서 대퇴골두의 골단은 정상대조군(Sham BSA)와 동일한 대퇴골두를 가지고 있는 것으로 확인되었다.

도 9b는 4개의 군에서 대퇴골두의 형태학적 지표를 확인한 것으로, 수치는 평균ㅁ표준편차(n = 5)로 표기하였고, **은 정상대조군(sham BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, p<0.001임을 의미한다. #, ##는 음성대조군(AVN BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, #는 p<0.01, ##은 p<0.001임을 의미한다.

도 9b를 살펴보면 음성대조군(AVN BSA)에 비해 제2실험군이, 조직 부피 당 뼈의 부피, 조직 부피당 골소주(trabecular) 수(number)가 현저히 감소하였음을 확인하였다. 또한 제2실험군에서 총 공극율과 골소주 간의 평균거리(trabecular separation)도 상당히 감소하였음을 확인하였다.

조직분석:H&E, Safranin -O staining

도 9c는 BSA를 모의 랫트 동물모델에 주사한 정상대조군(sham BSA), 메트포민을 모의 랫트 동물모델에 주사한 제1실험군(sham Met), BSA를 AVN 랫트 동물모델에 주입한 음성대조군(AVN BSA) 및 메트포민을 AVN 랫트 동물모델에 주입한 제2실험군(AVN Met)에 대한 H&E, Safranin-O 염색법으로 분석한 이미지이다. 도면에서 검은색 바는 500 μm를 의미하고, 흰색 바는 50 μm를 의미한다. 본 도면에서 BV는 뼈의 부피, Tb. N은 골소주(trabecular) 수, Tb.Sp는 골소주 간의 평균거리, Tb.Th는 골소주의 두께, TV는 조직 부피, Po는 공극률을 의미한다.

도 9c에 나타난 바와 같이 H&E 염색과 Safranin-O 염색 결과를 통해, 음성대조군(AVN BSA)에서는 대퇴골두의 중심부가 파손되고, 염증성 세포의 침착이 관찰되었는데 반해, 제2실험군(AVN Met)의 대퇴골두는 정상대조군(Sham BSA)과 별다른 차이가 관찰되지 않았다. 이러한 결과를 통해, 본 발명에 따른 메트포민은 허혈성 골괴사가 유도된 랫트 동물모델에서 예방 또는 치료효과를 가지고 있음을 알 수 있다.

면역조직화학 염색 분석: ALPL , DMP1 , vWF 및 TRAP staining

AVN 랫트 동물모델에서 메트포민에 의한 보호 효과를 확인하기 위하여, 대퇴골두의 조직절편에서 면역조직화학염색을 수행하였다.

도 10은 ANV 쥐 모델에서 메트포민의 메커니즘을 확인하고자 한 것으로, 도 10a는 ALPL, DMP1, vWF 및 TRAP에 대하여 대퇴골두의 골단(epiphysis)을 면역조직화학적 염색으로 나타낸 이미지이다. 검은 화살표로 표기된 영역은 vWF가 발현된 곳을 나타낸 것이다.

도 10b는 BSA를 모의 쥐 모델에 주사한 정상대조군(sham BSA), 메트포민을 모의 쥐 모델에 주사한 제1실험군(sham Met), BSA를 AVN 쥐 모델에 주입한 음성대조군(AVN BSA) 및 메트포민을 AVN 쥐 모델에 주입한 제2실험군(AVN Met)에서 혈관밀도를 퍼센트로 나타낸 것이다. 수치는 평균ㅁ표준편차(n = 4)로 나타내었고, *은 정상대조군(sham BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, p<0.01임을 의미한다. #는 음성대조군(AVN BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, #는 p<0.01임을 의미한다.

도 10c는 0.16 ㎟당 TRAP 양성세포(파골세포)의 수를 나타낸 그래프이다. 수치는 평균ㅁ표준편차(n = 4)로 나타내었고, **은 정상대조군(sham BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, p<0.001임을 의미한다. ##은 음성대조군(AVN BSA) 대비 통계적으로 유의미하다는 것으로, #는 p<0.001임을 의미한다.

도 10a에 나타난 바와 같이 음성대조군(AVN BSA)에서는 조기-조골세포 마커인 ALPL과 성숙한 조골세포 마커인 DMP1 발현이 감소하였다. 그러나 제2실험군(AVN Met)에서의 ALPL과 DMP1 발현 수준은 정상대조군(Sham BSA)와 유사하였다.

도 10b를 살펴보면 제2실험군(AVN Met)가 음성대조군(AVN BSA)에 비해 혈관밀도가 상당히 증가하였음을 확인하였다. 이를 통해 메트포민이 허혈성 골괴사가 유도된 동물모델에서 조골세포의 기능과 혈관밀도를 유지하도록 함으로써, 허혈성 골괴사가 유도된 동물모델로부터 대퇴골두 괴사를 개선, 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서는 파골세포 활성으로 인한 허혈성 골괴사에서 발생하는 골 파괴에 대한 메트포민의 치료, 예방 효과를 확인하기 위해, TRAP 염색을 통해 메트포민이 in vivo 상에서 파골세포의 활성에 미치는 영향을 관찰하였다. 도 10c에서 확인한 바와 같이 음성대조군(AVN BSA)에서 TRAP 양성세포가 크게 증가하였는데 반해, 제2실험군(AVN Met)에서는 TRAP 양성세포가 현저히 감소하였음을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 메트로빈은 in vivo 상에서도 파골세포의 분화, 활성을 억제하고, 조골세포의 기능을 활성화하며 혈관밀도의 감소를 방지하므로, 골질환에 대하여 우수한 예방, 치료 효과를 가지고 있음을 다시 한번 알 수 있다.

<결론>

대퇴골두(femoral head)의 괴사는 대개 젊은 환자에서 발생하며, 이 질환의 발병률은 매년 2만 2천건에 달한다. 대퇴골두는 많은 복잡한 요인들에 의해 발명하는 것으로 알려져있으나, 가장 주요 원인은 대퇴골두의 허혈과 관련이 있다. 이러한 허혈성 질환은 조골세포의 전구세포 괴사를 촉진하고 조골세포 분화를 방지함으로써, 대퇴골두의 구조가 붕괴되도록 하는 것이다. 현재까지 많은 수술법과 약물 치료가 개발되어 왔으나, 이러한 약물 치료로는 근본적인 진행을 막을수 없어, 임시방편일 뿐 해결책이 되지는 못했다.

게다가 대퇴골두의 골 괴사가 후기 단계인 경우에는 골반 감염, 골 용해 및 탈구를 유발하는 고관절에까지 문제를 일으키며, 외과적 치료가 필요할 지경에 이르게 된다. 따라서 대퇴골두의 허혈 상태를 억제하고 혈관 형성을 동시에 촉진할 수 있는 효과적인 치료 방법을 개발하는 것이 가장 시급한 실정이다.

한편 당뇨병 환자가 골절의 위험이 높다는 증거가 축적되고 있고, 당뇨병과 골절과의 관계를 조사하고자 몇몇 연구가 진행되었으나, 당뇨병에서 골절을 일으키는 위험요인이 무엇인지에 대한 구체적인 결과는 밝혀진바 없다. 최근 임상적으로 사용되는 7 종의 항당뇨병 약물에 의하여 골절의 영향을 다루고자, 메타 분석 연구를 통해 티아졸리딘다이온(thiazolidinediones)이 노인 여성의 골절 위험을 유의하게 증가시키고 있음을 확인하여, 여성 노인에 대한 부작용을 확인한 바 있다. 그러나 제2형 당뇨병 치료제로 사용되던 메타포민에 대해서는 골절과의 아무런 영향을 없는 것으로 판명한 바 있다.

본 발명에서는 골 형성세포에서 Ang1 발현 유도 효과를 메트포민이 가지고 있음을 확인하였고, U2OS, MG63 세포에서 세포 이동성을 나타내는 것을 확인하였으며, 이는 Ang1에 의한 것이 아닌 메트포민에 의한 것임을 확인하였다.

메트포민은 주로 제2형 당뇨병에 대한 1차 약물로 사용되어 왔으나, 본 발명의 후술하는 다양한 실험들을 통해, 조골세포의 분화 및 형성을 촉진하고, ALP 활성 및 칼슘침착 형성 및 Runx2, OSX의 발현을 유의하게 향상시키는 것을 확인하였고, 또한, LKB1/AMPK 신호 전달 경로에서 세부적인 분자 작동 매커니즘을 확인하였다.

즉, 이러한 일련의 실험들을 통하여 본 발명에 따른 메트로민을 유효성분으로 하는 조성물은 뼈의 재형성에 대하여 조골세포를 촉진하고 파골세포 분화를 방지하며, 허혈을 방지하는 효과를 동시에 가지고 있기 때문에, 허혈성 골괴사 질환을 치료할 수 있음을 알 수 있다. 또한 생체 내 메트로민은 Ang1 발현을 증가시키고, 생체 외 실험을 통해 U2OS, MG63 세포에서 골형성과정 분화 및 미분화를 유도하며, 생체 내 실험에서 허혈성 대퇴골두의 혈관형성과 더불어 새로운 골을 증가시켜 허혈성 골괴증을 치료하였다.

Claims

화학식 1로 표시되는 메트포민(Metformin)을 유효성분으로 함유하는 인비트로(in vitro)에서 조골세포의 ang1 발현을 촉진하기 위한 조성물.
[화학식 1]
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