除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同之含義，該術語在上下文中用於闡述本發明。說明書中所用之術語僅用於闡述特定實施例且不意欲限制本發明。 倘若提供值之範圍，則應理解本發明涵蓋介於該範圍之上限與下限之間之每一中間值及該所述範圍內之任一其他所述或中間值，除非上下文另外明確指示，否則精確至下限單位之十分之一(例如，在含有若干個碳原子之基團之情形下，在此情形下提供落在該範圍內之每一碳原子數)。可獨立地包括在較小範圍內之該等較小範圍之上限及下限亦涵蓋在本發明內，受製於所述範圍內任何明確排除之限值。倘若所述範圍包括限值中之一者或兩者，則排除彼等所包括限值之任兩者之範圍亦包括在本發明中。 除非上下文另外明確指示，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用之冠詞「一(a及an)」在本文中使用係指一個或一個以上(即，至少一個)該冠詞之文法受詞。舉例而言，「要素」意指一個要素或一個以上要素。 如本文在說明書及申請專利範圍中所用之片語「及/或」應理解為意指如此結合之要素中之「任一者或兩者」，即在一些情形下以結合方式存在且在其他情形下以分離方式存在之要素。以「及/或」列示之多個要素應以相同方式解釋，即如此結合之要素中之「一或多者」。可視情況存在除由「及/或」子句特別識別之要素以外之其他要素，無論與特別識別之彼等要素相關或不相關。 如本文所用之術語「鹵基」及「鹵素」係指選自氟、氯、溴及碘之原子。 術語「烷基」係指直鏈或具支鏈烴鏈基團，其僅由碳及氫原子組成，不含不飽和現象，具有1至15個碳原子(例如C
1
-C
15
烷基)。在某些實施例中，烷基包含1至13個碳原子(例如C
1
-C
13
烷基)。在某些實施例中，烷基包含1至8個碳原子(例如C
1
-C
8
烷基)。在其他實施例中，烷基包含1至5個碳原子(例如C
1
-C
5
烷基)。在其他實施例中，烷基包括1至4個碳原子(例如C
1
-C
4
烷基)。在其他實施例中，烷基包含1至3個碳原子(例如C
1
-C
3
烷基)。在其他實施例中，烷基包含1至2個碳原子(例如C
1
-C
2
烷基)。在其他實施例中，烷基包含1個碳原子(例如C
1
烷基)。在其他實施例中，烷基包含5至15個碳原子(例如C
5
-C
15
烷基)。在其他實施例中，烷基包含5至8個碳原子(例如C
5
-C
8
烷基)。在其他實施例中，烷基包含2至5個碳原子(例如C
2
-C
5
烷基)。在其他實施例中，烷基包含3至5個碳原子(例如C
3
-C
5
烷基)。在其他實施例中，烷基選自甲基、乙基、1-丙基(正丙基)、1-甲基乙基(異丙基)、1-丁基(正丁基)、1-甲基丙基(第二丁基)、2-甲基丙基(異丁基)、1,1-二甲基乙基(第三丁基)、1-戊基(正戊基)。烷基藉由單鍵連接至分子之剩餘部分。除非在本說明書中另外明確陳述，否則烷基視情況經一或多個取代基取代。如本文所用之術語「烯基」表示衍生自含有(在某些實施例中) 2至6個或2至8個碳原子之烴部分之單價基團，其具有至少一個碳-碳雙鍵。雙鍵可或可不為另一基團之連接點。烯基包括(但不限於)例如乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、庚烯基、辛烯基及諸如此類。 術語「烷氧基」係指藉助式-O-烷基之氧原子鍵結之基團，其中烷基係如上文所定義之烷基鏈。 術語「醫藥上可接受之鹽」係指自醫藥上可接受之無毒鹼或酸(包括無機或有機鹼及有機或有機酸)製備之鹽。術語「醫藥上可接受之鹽」內所涵蓋鹼性化合物之鹽係指本發明化合物之無毒鹽，其通常係藉由游離鹼與適宜有機或無機酸之反應製得。本發明鹼性化合物之代表性鹽包括(但不限於)以下各項：乙酸鹽、抗壞血酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、硼酸鹽、溴化物、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、右旋樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯化物、克拉維酸鹽(clavulanate)、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二乙基乙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、二鹽酸鹽、十二烷基硫酸鹽(dodecylsulfanate)、依地酸鹽(edetate)、乙二磺酸鹽、依託酸鹽(estolate)、乙磺酸鹽(esylate、ethanesulfonate)、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate、glucoheptanoate)、葡萄糖酸鹽、麩胺酸鹽、甘油磷酸鹽、苷苯砷鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、己基間苯二酚鹽、氫溴酸鹽(hydrobromate)、溴化物、氯化物、2-羥基乙磺酸鹽、羥基萘酸鹽、碘化物、異菸鹼酸鹽、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、苦杏仁酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硝酸鹽、甲基硫酸鹽、甲烷磺酸鹽、黏液酸鹽、2-萘磺酸鹽、萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽(恩波酸鹽(embonate))、棕櫚酸鹽、泛酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽、庚二酸鹽、苯丙酸鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、柳酸鹽、硬脂酸鹽、硫酸鹽、次乙酸鹽、琥珀酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸鹽、茶氯酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、三乙碘化物、三氟乙酸鹽、十一酸鹽、戊酸鹽及諸如此類。此外，倘若本發明之化合物具有酸性部分，則其適宜醫藥上可接受之鹽包括(但不限於)衍生自包括以下之無機鹼之鹽：鋁、銨、鈣、銅、三價鐵、二價鐵、鋰、鎂、錳、二價錳、鉀、鈉、鋅及諸如此類。衍生自醫藥上可接受之有機鹼之鹽包括以下之鹽：一級、二級及三級胺，環胺、二環己基胺及鹼性離子交換樹脂，例如精胺酸、甜菜鹼、咖啡因、膽鹼、N,N-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙胺基乙醇、2-二甲基胺基乙醇、乙醇胺、乙胺、乙二胺、N-乙基嗎啉、N-乙基六氫吡啶、還原葡萄糖胺、葡萄糖胺、組胺酸、海巴明哈胺(hydrabamine)、異丙胺、離胺酸、甲基葡萄糖胺、嗎啉、六氫吡嗪、六氫吡啶、聚胺樹脂、普魯卡因(procaine)、嘌呤、可可鹼、三乙胺、三甲胺、三丙胺、胺丁三醇及諸如此類。另外，包括可用諸如以下試劑四級銨化之鹼性含氮基團：低碳烷基鹵化物，例如甲基、乙基、丙基及丁基氯化物、溴化物及碘化物；硫酸二烷基酯，例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯及硫酸二戊酯；長鏈鹵化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基及硬脂基氯化物、溴化物及碘化物；芳烷基鹵化物，如苯甲基溴化物及苯乙基溴化物及其他。 術語「個體」包括活的有機體，例如人類、猴、母牛、綿羊、馬、豬、牛、山羊、狗、貓、小鼠、大鼠、培養細胞及其轉基因物種。在較佳實施例中，個體係人類。 術語「投與」包括容許本發明活性成分執行其預期功能之投與途徑。 術語「治療(treat或treatment)」係指降低疾病或病況之效應之方法。治療亦可指降低疾病或病況本身之根本病因而非僅症狀之方法。治療可為自原來水準之任何降低且可為(但不限於)疾病、病況或疾病或病況之症狀之完全消除。 術語「抑制(inhibit、inhibition、inhibiting)」、「預防(prevent、prevention或preventing)」意指改善、抑制或避免與目標疾病相關或由其目標生物機制引起之症狀。 術語「癌症」或「癌細胞」係指其中異常細胞不受控制地分裂且可侵入附近組織之疾病，包括癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤及多發性骨髓瘤等。癌症之實施例包括(但不限於)侵入性乳房癌、腺癌、肺癌(非小細胞肺癌、鱗狀細胞癌、腺癌及大細胞肺癌)、肝癌、結腸直腸癌、腦癌、頭頸癌(例如神經/膠母細胞瘤)、乳癌、卵巢癌或癌瘤、膀胱移行細胞癌、前列腺癌、口腔鱗狀細胞癌、骨肉瘤、腎上腺皮質癌、胃腸腫瘤(包括結腸直腸癌)、膽道癌(例如膽囊癌(GBC))、膀胱癌、食道癌、胃癌、子宮頸癌、唾液腺癌、腹瀉良性贅瘤、導管原位癌、甲溝炎、膽道癌、腎癌、胰臟癌、髓母細胞瘤、神經膠母細胞瘤、管腔、HER2陽性及三陰性乳房腫瘤、惡性血液病或白血病(急性骨髓性白血病(AML)、B-前體細胞急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、T細胞ALL之一部分及慢性骨髓性白血病(CML)。 片語「治療有效量」係指在適用於任一醫學治療之合理益處/風險比下，有效產生期望治療效應之化合物、材料或包含本發明化合物之組合物之量。 如本文所用，無論是否明確定義特定縮寫，該等製程、方案及實例中所用之符號及慣例與當代科學文獻(例如Journal of the American Chemical Society或the Journal of Biological Chemistry)中所用之彼等一致。具體而言，但無限制，以下縮寫可用於實例及說明書通篇中：g (克)；mg (毫克)；mL (毫升)；μL (微升)；mM (毫莫耳濃度)；M (微莫耳濃度)；Hz (赫茲)；MHz (兆赫)；mmol (毫莫耳)；hr或hrs (小時)；min (分鐘)；MS (質譜)；ESI (電噴霧離子化)；TLC (薄層層析)；及HPLC (高壓液相層析)。對於所有以下實例，可利用熟習此項技術者已知之標準後處理及純化方法。除非另外指示，否則所有溫度皆以℃(攝氏度)表示。除非另外註明，否則所有反應皆在室溫下進行。本文所說明之合成方法意欲藉助使用具體實例來例示可用化學品且不欲指示本發明之範圍。 具體而言，本發明提供式(I)化合物：
其中R代表H或甲氧基； R
1
及R
2
各自獨立地選自H、羥基、鹵素、C
1-3
烷基及C
1-3
烷氧基； R
3
至R
5
各自獨立地選自H、羥基、氟、C
1-3
烷基及C
1-3
烷氧基； 或其溶劑合物、前藥、立體異構物、鏡像異構物或醫藥上可接受之鹽。 在一個實施例中，在式(I)中，R係甲氧基。在另一實施例中，R
3
至R
5
各自係H。在另一實施例中，R
1
及R
2
各自係H。 在一個實施例中，在式(I)中，R係H。在另一實施例中，R
3
至R
5
各自係H。在另一實施例中，R
1
及R
2
各自係H。 在具體實施例中，在式(I)中，R係甲氧基，R
1
至R
5
各自係H，即化合物10-氟-2,3-二甲氧基吳茱萸次鹼。在另一具體實施例中，在式(I)中，R及R
1
至R
5
各自係H，即化合物10-氟-2-甲氧基吳茱萸次鹼(F-RUT)。 本發明之式(I)化合物係根據一般化學合成程序製備。本發明化合物之實施例之製備闡釋於下文中。本發明化合物之適宜合成可參見以下實例。 在一態樣中，式(I)化合物係經由以下方案合成：
其中條件(i)代表在NaNO
2
/HCl之存在下且在0℃下，條件(ii)代表在乙酸之存在下且在0℃下，條件(iii)代表在甲酸之存在下且在回流下且條件(iv)代表在SOCl
2
/甲苯之存在下。 在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含式(I)化合物或其醫藥上可接受之酯、鹽或前藥，以及連同醫藥上可接受之載劑。 為製備本發明之醫藥組合物，根據習用醫藥複合技術將作為活性成分之一或多種本發明化合物與醫藥載劑充分混合，該載劑可端視投與(例如，經口或非經腸(例如肌內))所期望之製劑形式而採用眾多種形式。在製備呈口服劑型之組合物時，可採用任一常用醫藥介質。因此，對於液體口服製劑(例如，懸浮液、酏劑及溶液)而言，適宜載劑及添加劑包括水、二醇、油、醇、矯味劑、防腐劑、著色劑及諸如此類；對於固體口服製劑(例如，粉末、膠囊、囊片、凝膠膠囊及錠劑)而言，適宜載劑及添加劑包括澱粉、糖、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、黏合劑、崩解劑及諸如此類。因錠劑及膠囊易於投與，故其代表最有利的口服劑量單位形式，在該情形下，顯然採用固體醫藥載劑。若期望，則可藉由標準技術對錠劑進行糖包衣或腸溶包衣。對於非經腸，載劑將通常包含無菌水，且例如出於諸如輔助溶解度或用於防腐之目的可包括其他成分。亦可製備可注射懸浮液，在該情形下可採用適當液體載劑、懸浮劑及諸如此類。本文之醫藥組合物將每劑量單位(例如，錠劑、膠囊、粉末、注射劑、茶匙量及諸如此類)含有遞送如上所述之有效劑量所必需之量之活性成分。 可納入本發明之新穎組合物用於經口或藉由注射投與之液體形式包括水溶液、環糊精、適當矯味之糖漿、水性或油性懸浮液及利用可食用油(例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)矯味之乳液以及酏劑及類似醫藥媒劑。用於水性懸浮液之適宜分散劑或懸浮劑包括合成及天然樹膠，例如黃蓍膠、阿拉伯膠、海藻酸鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮或明膠。 用於經口投與之錠劑及膠囊通常以單位劑量形式存在並含有習用賦形劑，例如黏合劑、填充劑(包括纖維素、甘露醇、乳糖)、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑(包括硬脂酸鎂)、清潔劑、崩解劑(例如聚乙烯基吡咯啶酮及澱粉衍生物(例如乙醇酸鈉澱粉))、著色劑、矯味劑及潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉)。 經口固體組合物可藉由摻和、填充或壓片之習用方法來製備。可重複摻和操作以使活性成分遍及含有大量填充劑之組合物分佈。此等操作係習用的。 對於非經腸投與而言，可製備含有化合物及無菌媒劑之流體單位劑量。端視媒劑及濃度，可使化合物懸浮或溶解。通常藉由將化合物溶解於媒劑中，藉由過濾滅菌，填充適宜小瓶及密封來製備非經腸溶液。有利地，諸如局部麻醉劑、防腐劑及緩衝劑之佐劑亦可溶解於媒劑中。為增加穩定性，在填充小瓶並在真空下去除水後可將組合物凍乾。以實質上相同之方式製備非經腸懸浮液，但化合物可懸浮於媒劑中代替溶解，並在懸浮於無菌媒劑中之前藉由暴露於環氧乙烷滅菌。有利地，可將表面活性劑或潤濕劑納入組合物中，以促進本申請案化合物之均勻分佈。 藉由吸入投與之醫藥製劑可自吹入器或霧化器加壓包遞送。 在一態樣中，本發明提供改善個體之發炎之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供阻抑個體之氮氧化物(NO)釋放之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供阻抑個體之TNF-α釋放之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供抑制個體之細胞遷移、細胞侵入或二者之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供改善個體之由上皮與內皮之間之重塑所致損傷之方法，其包含將本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供降低個體之Snail蛋白質含量之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供改善個體中心臟、血管舒張及/或肺功能之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。較佳地，該改善包含抑制心臟、血管及/或肺之纖維化。 化合物或其醫藥上可接受之鹽係以如下方式投與：經口、經鼻、經皮、經肺、吸入、經頰、舌下、腹腔內、皮下、肌內、靜脈內、經直腸、胸腔內、鞘內及非經腸。在一個實施例中，化合物係經口投與。熟習此項技術者將認識到某些投與途徑之優點。 根據多種因素選擇利用化合物之劑量方案，該等因素包括患者之類型、物種、年齡、體重、性別及醫學病況；欲治療病況之嚴重程度；投與途徑；患者之腎及肝功能；及所採用之特定化合物或其鹽。一般熟練醫師或獸醫可容易地確定預防、對抗或阻止病況進展所需藥物之有效量並開出處方。 本發明現已藉助書面說明書進行闡述，熟習此項技術者將認識到本發明可以多種實施例實踐，且上述說明書及下文實例係用於闡釋目的且並非限制隨後的申請專利範圍。
實例
所有關鍵原材料皆係購自多種商業來源，且不經進一步純化即使用。一些關鍵原材料及試劑係內部自製。
合成實例 1
化合物10-氟-2-甲氧基吳茱萸次鹼(F-RUT)及10-氟-2,3-二甲氧基吳茱萸次鹼係經由以下方案合成：
苯胺(
1
)經受山德邁耳反應(Sandmeyer reaction)以得到重氮鹽，然後其偶聯至羧酸(
3
)以產生腙(
4
)，且在酸性條件下處理腙(
4
)得到哢啉(
5
)，產率為58% (三個步驟)。然後使哢啉(
5
)與在甲苯之存在下且在70-80℃下經亞硫醯氯預處理之原位活化取代之鄰胺基苯甲酸衍生物(
6a
,
b
)偶聯，以提供10-氟-2-甲氧基吳茱萸次鹼(F-RUT)及10-氟-2,3-二甲氧基吳茱萸次鹼，總產率分別為35%及40% (四個步驟)。 藉由
1
H及
13
C核磁共振(NMR)、紅外(IR)及質譜(MS)鑑別合成產物。對於F-RUT，FT-IR (KBr, cm
-1
)：3347 (N-H)及1652 (羰基)。
1
H-NMR (CDCl
3
, ppm)：δ 3.18 (t,
J
= 6.9 Hz, 2H, 2H-8), 4.57 (t,
J
= 6.9 Hz, 2H, H-7), 3.93 (s, 3H, 2-OMe), 7.02 (dd,
J
= 8.9, 2.4, 1H, H-3), 7.05 (d,
J
= 2.4, 1H, H-1), 8.21 (d,
J
= 8.9, 1H, H-4), 7.11 (d,
J
= 8.8, 1H, H-12), 7.38 (d,
J
= 8.8, 1H, H-11), 8.99 (s, 1H, H-9), 12.04 (s, 1H, N-H)。MS-ESI (
m/z
) ([M - H]
-
)：計算值 335.3；試驗值334.4。對於10-氟-2,3-二甲氧基吳茱萸次鹼(F
2MO
-RUT)，FT-IR (KBr, cm
-1
)：3398 (N-H)及1641 (羰基)。
1
H-NMR (CDCl
3
, ppm)：δ 3.18 (t,
J
= 6.8 Hz, 2H, H-8), 4.57 (t,
J
= 6.8 Hz, 2H, H-7), 3.92 (s, 3H, O-Me), 3.88 (s, 3H, O-Me), 7.04 (s, 1H, H-1), 7.11 (d,
J
= 8.9, 1H, H-12), 7.37 (d,
J
= 8.9, 1H, H-11), 7.66 (s, 1H, H-4), 8.94 (s, 1H, H-9), 11.87 (s, 1H, N-H)。MS-ESI (
m/z
) ([M - H]
-
)：計算值 365.3；試驗值364.4。
生物分析 製備實例 2 - 細胞培養
使RAW264.7巨噬細胞細胞系及A2780卵巢癌細胞在37℃下且在具有5% CO
2
之加濕氣氛中，於含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青黴素、100 μg/mL鏈黴素、1 mM丙酮酸鈉、4.5 g/L葡萄糖、4 mM l-麩醯胺酸及1.5 g/L碳酸氫鈉之杜爾貝寇改良之伊格爾培養基(DMEM)中生長。使原代人主動脈EC (HAEC)在37℃下且在具有5%CO
2
之加濕氣氛中，於懸浮有10% FBS之MesoEndo內皮細胞生長培養基套組(Cell Applications, San Diego, CA, USA)中生長。
實例 3 - 經 LPS 處理之細胞之 NO 及 TNF-α 釋放之阻抑
藉由量測經培養RAW264.7巨噬細胞之上清液中之亞硝酸鹽濃度來評估NO產生。首先將細胞以2 × 10
5
個細胞/mL之密度接種於24孔板中達24小時，隨後用不同濃度之F-RUT與脂多醣(LPS) (40 ng/mL)再共處理24小時。使用格利斯試劑(於5%磷酸中之1%磺胺及於水中之0.1%萘基乙二胺二鹽酸鹽)來檢測細胞培養上清液中亞硝酸鹽之量。數據報告係以三次獨立測定之平均值±平均值之標準誤差(SEM)紀錄。 與未經處理細胞之NO產生相比，經LPS處理之RAW264.7巨噬細胞之NO產生增加。與合成之F-RUT共處理以濃度依賴性(0-20 μM)方式阻抑NO產生(*
p
＜ 0.05，**
p
＜ 0.01，與經LPS處理之組相比) (圖1(a))。亦顯示釋放至介質中之TNF-α之一致濃度依賴性強效(*
p
＜ 0.05，與經LPS處理之組相比) (圖1(b))阻抑性效應。阻抑性效應並非由細胞毒活性所致，此乃因F-RUT在0-20 μM之濃度下顯示對RAW264.7、H460及CL1-3細胞實質上無細胞毒性(*
p
＜ 0.05，**
p
＜ 0.01，與經RUT處理之組相比) (圖1(c))。
實例 4 - 可誘導 (i) NOS 及 COX-2 表現之 阻抑
基於黃色四唑鎓鹽轉化成紫色甲䐶產物，實施測試細胞存活率之MTT分析。將細胞(10
4
個細胞/孔)培養在補充有標準培養基之96孔板中。利用RUT及F-RUT (0-20 μM)處理細胞24小時。將MTT原液(5 mg MTT/mL磷酸鹽緩衝鹽水；PBS)添加至生長培養基達2小時。利用分光光度計以560 nm量測吸光度。測量僅含DMSO作為分析對照。數據報告係將五次獨立測定以平均值± SEM值紀錄。 藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質試樣分離並解析，並將其電轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜與一級抗體一起在4℃下一起培育過夜，且然後與經辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之二級免疫球蛋白G (IgG)抗體一起培育；利用PerkinElmer增強之化學發光試劑使免疫反應性條帶可視化。 將RAW264.7巨噬細胞接種於具有DMEM之96孔板中。然後，使用TurboFect轉染試劑(Fermentas, Glen Burnie, MD, USA)，利用pGL4.32 [luc2P/NF-κB-RE/Hygro] (Promega, Madison, WI, USA)質體報導基因轉染細胞。在轉染後24小時時，利用LPS (40 ng/mL)及F-RUT將細胞在無血清培養基中處理24小時。然後，使用ONE-Glo螢光素酶分析套組(Promega)，藉由在發光微板讀數儀(Thermo Varioskan Flash, Waltham, MA, USA)中量測之發光檢測螢光素酶活性。將螢光素酶活性正規化成蛋白質濃度。 發明者觀測到，經LPS處理之RAW264.7巨噬細胞展現iNOS及COX-2顯著升高之蛋白質之量，而F-RUT以濃度依賴性方式阻抑其表現(圖2(a))。加載對照之β-肌動蛋白含量保持恆定。在發炎反應中，NF-κB活化觸發COX-2及iNOS之誘導。測定F-RUT是否阻抑經LPS活化之巨噬細胞中之NF-κB活化。在經LPS誘導之巨噬細胞中瞬時轉染NF-κB依賴性螢光素酶報導基因質體，以確認F-RUT是否抑制NF-κB-結合活性。F-RUT在0 μM -2.5 μM下抑制經LPS誘導之NF-κB轉錄活性(*
p
＜ 0.05，**
p
＜ 0.01，與經LPS處理之組相比) (圖2(b))。結果表明，藉由F-RUT抑制iNOS及COX-2表現與阻抑NF-κB活化相關。發明者亦觀測到，除COX-2阻抑以外亦抑制酶活性。與RUT相比，F-RUT顯示較少細胞毒性，但保留抗發炎活性。
實例 5- 細胞 遷移 / 侵襲之 抑制
以2 × 10
5
個細胞/孔之密度在6孔板中培養A2780細胞並在37℃下培育24 小時。使用200-μL吸量管尖端刮擦細胞中之中線並用PBS洗滌。然後，添加新的完全培養基並用或不用1 μM及2.5 μM F-RUT處理24 小時。在培育終點，檢查細胞並用光學顯微鏡拍照。量測並計算刮擦區域邊緣之間之距離以估計細胞之移動能力。 使用個別地經Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA)塗佈之24孔transwell插入物(8-μm孔過濾器，Merck Millipore)評估A2780細胞侵襲。將A2780細胞(2 × 10
4
個細胞/孔)與無血清最低必需培養基(MEM)一起培養24 小時，且然後利用F-RUT (1.25 μM或2.5 μM)在transwell之上室中再處理24小時。將含有10% FBS之培養基置於下室中。在培育結束時，使用棉花棒去除未移動之細胞；利用4%甲醛固定滲透至過濾器之相對表面之細胞並利用2%結晶紫染色。將染色細胞計數並在相位差光學顯微鏡下以200 ×放大率拍照。實施三次獨立實驗，如別處所述。 如圖3(a)中所圖解說明，創傷癒合分析在F-RUT (0-5 μM)之存在下使用卵巢癌A2780細胞系保持0-24小時。使用成像軟體量測移動率，並使用學生
t
-測試進行統計學分析。F-RUT顯示抵抗細胞遷移之顯著效應。F-RUT (0 μM -2.5 μM)處理24小時在transwell分析中亦展現侵入抑制活性(圖3(b))。
實例 6 - TRPV1 及 eNOS 之活化
報導TRPV1存在於動脈之EC中。為證實TRPV1在內皮中之表現，使用免疫墨點術檢測人主動脈EC (HAEC)之TRPV1蛋白質；實例4中已陳述西方墨點分析之方法。在利用α-微管蛋白含量正規化後，F-RUT處理(20 μM) 15分鐘與對照組相比使TRPV1蛋白之量增加兩倍(圖4)。另外檢查F-RUT對HAEC中eNOS之磷酸化之效應，此乃因NO產生因此受eNOS之磷酸化調節。在利用總eNOS正規化後，F-RUT處理(20 μM) 15分鐘與對照組相比使eNOS之磷酸化顯著增加1.4倍(下部圖)。F-RUT上調TRPV1之表現並活化EC中之eNOS磷酸化。
動物實驗 實例 7 - 經 OVA/ 明礬攻擊之小鼠中之發炎之改善
自國立台灣大學醫學院之動物中心(Animal Center of the College of Medicine, National Taiwan University) (Taipei, Taiwan)獲得BALB/c小鼠(六週齡)，並在第0天利用腹膜內注射於總體積為200 μL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之2 mg氫氧化鋁中乳化之20 μg卵白蛋白(OVA)使其致敏，並在第14天及第28天利用於4 mg氫氧化鋁中乳化之50 μg OVA加強。在第30天、第32天、第34天、第36天及第38天，藉由經口投與給予RUT或F-RUT。對於攻擊後而言，在第40天、第41天、第42天及第43天利用OVA (100 μg於總體積為40 μL之PBS中)以鼻內方式處理所有小鼠。在最後一次OVA攻擊後24小時時處死小鼠並收集其器官。所有實驗程序皆由實驗動物照護及使用委員會或小組審查並核凖。將肺組織固定在4%多聚甲醛(sc-281692；Santa Biotechnology)中並包埋於石蠟中。以5-μm之厚度製得組織切片並利用蘇木素及伊紅(H&E)溶液染色用於檢查發炎。 小鼠經OVA/明礬攻擊44天後，肺中存在由增加之浸潤嗜中性球導致之主要發炎。隔日經口投與RUT或F-RUT改善OVA/明礬誘導之肺發炎並顯示與未經處理之對照組類似之圖案(圖5(a))。 藉由轉型生長因子(TGF)-β/Smad來調節KLF10基因。小鼠中Klf10之缺失與經OVA/明礬攻擊44天之肺中之顯著發炎相關。在另一實驗中使用KLF-10 KO小鼠。在經OVA/明礬攻擊44天後，小鼠肺中存在主要發炎，此係由增加之浸潤嗜中性球實現。隔日經口投與F-RUT改善OVA/明礬誘導之肺發炎(圖5(b))。支氣管周圍之膠原形成在經口投與F-RUT後減少(OVA/明礬組中25%，F-RUT組中18%) (圖5(c))。該等結果表明F-RUT對發炎誘導之纖維化之有益效應。
實例 8 - 發炎刺激之 KLF10 KO 小鼠中呼吸界面之改善
量測血氣障壁(肺泡-微血管膜，肺之氣體交換區域)以執行肺功能。利用OVA/明礬攻擊KLF-10 KO小鼠並經口投與RUT或F-RUT後，收穫肺以藉由TEM量測血氣障壁之厚度。血氣障壁之平均厚度在OVA/明礬組中顯著增加(586 nm，與對照組中之348 nm相比)，並由RUT或F-RUT逆轉(分別為418 nm及393 nm)，參見圖6。該等數據探索F-RUT防止肺發炎之潛在生物學功能。
實例 9 - 斑馬魚中 ROS 活性之抑制
圖7顯示F-RUT不僅在細胞中而且在斑馬魚模型中之抗發炎效應。LPS在10 ng/ml及20 ng/ml下顯著誘導斑馬魚中之ROS含量(*** p ＜ 0.001，與對照組相比)。5 ng/ml之F-RUT阻抑經LPS誘導之ROS，與僅經F-RUT處理之組程度相似(*** p ＜ 0.001，與LPS組相比)。 發明者發現以下現象以證明所主張之效應。 首先，RUT誘導CGRP合成及釋放之血管舒張效應係經由TRPV1之活化。因此，設計並合成RUT之類似物用於更好的血管舒張效應。設計RUT之結構修飾以增強其生物活性。然而，增加之細胞毒性妨礙其在血管病症中之應用。本文所提供之氟化RUT新穎類似物具有極低細胞毒性，顯示抗發炎活性(實例7至9)及遷移/侵襲阻抑活性(實例5)，此有益於在用於醫藥時降低副作用。另外，eNOS及iNOS係具有驅動相似生物效應之相同啟動子元件之同種型。關於氟化RUT對本文所述eNOS及iNOS之不同效應，其可自巨噬細胞及EC中之不同信號傳導路徑產生。氟化RUT阻抑巨噬細胞中之iNOS，然而其活化Ec中之eNOS (實例4及6)。結果支持衍生自RUT之氟化RUT具有增強之有益效應及減少之不良效應。 OVA/明礬致敏之小鼠係眾所周知之誘導肺發炎之動物模型。在氣道中存在增加之顆粒球(例如嗜中性球)及組織間隙(微血管內皮、肺泡上皮、基膜及血管週組織)之重塑。在此，實例顯示氟化RUT在經OVA/明礬攻擊之小鼠中減少浸潤嗜中性球並維持氣囊結構(實例7)。該等結果可暗指其益處不僅在於抗發炎效應，而且亦在於抵抗由上皮與內皮之間之重塑所致之損傷。 高血壓活化促氧化酶從而導致增加之ROS形成，此與Ang-II及機械力以及對血管系統之損傷相關。發炎、移動及纖維化係促進內皮功能障礙及心血管重塑之重要因素。氧化性應激在控制內皮功能方面發揮生理作用並且發揮病理生理作用。許多心臟損傷導致纖維化伴隨過量膠原或其他基質蛋白質之沈積，從而引起罹患心臟衰竭。發炎係心區不適之起始且主要的觸發因素，並涉及組織中發炎細胞介素及趨化介素升高之含量。纖維化之特徵在於過量產生由成肌纖維細胞產生之ECM。心肌成纖維細胞起源於EC之內皮-間質轉化(EndMT)，其對於形成心臟纖維母細胞甚為重要。EndMT受由發炎相關之細胞介素介導之信號傳導路徑調節。與血流之直接接觸使得內皮成為有前景之用於藥物治療之靶點。導致心肌纖維化之缺血/再灌注損傷主要由成肌纖維細胞所致之膠原沈積介導。Snail誘導在經歷EndMT時參與纖維化。Snail抑制劑顯著阻抑小鼠中之膠原沈積及心肌纖維化。氟化RUT處理A2780細胞產生降低之Snail蛋白質含量，此表明藉由氟化-RUT抑制EndMT可為對抗血管疾病之新策略(圖未顯示)。 先前研究說明，發炎及成肌纖維細胞形成促進肺纖維化之罹患。發炎細胞介素藉助EMT誘導EC轉變為成肌纖維細胞，且然後產生過量ECM從而引起纖維化。氟化-RUT (一類RUT衍生物)具有低細胞毒性但保持其抵抗發炎及遷移/侵襲之活性。利用氟化RUT治療增強TRPV1並活化eNOS活性。根據上文所提供之實例，氟化RUT將提供在改善心臟、血管舒張及肺功能方面之應用。
其中條件(i)代表在NaNO2
/HCl之存在下且在0℃下，條件(ii)代表在乙酸之存在下且在0℃下，條件(iii)代表在甲酸之存在下且在回流下且條件(iv)代表在SOCl2
/甲苯之存在下。 在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含式(I)化合物或其醫藥上可接受之酯、鹽或前藥，以及連同醫藥上可接受之載劑。 為製備本發明之醫藥組合物，根據習用醫藥複合技術將作為活性成分之一或多種本發明化合物與醫藥載劑充分混合，該載劑可端視投與(例如，經口或非經腸(例如肌內))所期望之製劑形式而採用眾多種形式。在製備呈口服劑型之組合物時，可採用任一常用醫藥介質。因此，對於液體口服製劑(例如，懸浮液、酏劑及溶液)而言，適宜載劑及添加劑包括水、二醇、油、醇、矯味劑、防腐劑、著色劑及諸如此類；對於固體口服製劑(例如，粉末、膠囊、囊片、凝膠膠囊及錠劑)而言，適宜載劑及添加劑包括澱粉、糖、稀釋劑、造粒劑、潤滑劑、黏合劑、崩解劑及諸如此類。因錠劑及膠囊易於投與，故其代表最有利的口服劑量單位形式，在該情形下，顯然採用固體醫藥載劑。若期望，則可藉由標準技術對錠劑進行糖包衣或腸溶包衣。對於非經腸，載劑將通常包含無菌水，且例如出於諸如輔助溶解度或用於防腐之目的可包括其他成分。亦可製備可注射懸浮液，在該情形下可採用適當液體載劑、懸浮劑及諸如此類。本文之醫藥組合物將每劑量單位(例如，錠劑、膠囊、粉末、注射劑、茶匙量及諸如此類)含有遞送如上所述之有效劑量所必需之量之活性成分。 可納入本發明之新穎組合物用於經口或藉由注射投與之液體形式包括水溶液、環糊精、適當矯味之糖漿、水性或油性懸浮液及利用可食用油(例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)矯味之乳液以及酏劑及類似醫藥媒劑。用於水性懸浮液之適宜分散劑或懸浮劑包括合成及天然樹膠，例如黃蓍膠、阿拉伯膠、海藻酸鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮或明膠。 用於經口投與之錠劑及膠囊通常以單位劑量形式存在並含有習用賦形劑，例如黏合劑、填充劑(包括纖維素、甘露醇、乳糖)、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑(包括硬脂酸鎂)、清潔劑、崩解劑(例如聚乙烯基吡咯啶酮及澱粉衍生物(例如乙醇酸鈉澱粉))、著色劑、矯味劑及潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉)。 經口固體組合物可藉由摻和、填充或壓片之習用方法來製備。可重複摻和操作以使活性成分遍及含有大量填充劑之組合物分佈。此等操作係習用的。 對於非經腸投與而言，可製備含有化合物及無菌媒劑之流體單位劑量。端視媒劑及濃度，可使化合物懸浮或溶解。通常藉由將化合物溶解於媒劑中，藉由過濾滅菌，填充適宜小瓶及密封來製備非經腸溶液。有利地，諸如局部麻醉劑、防腐劑及緩衝劑之佐劑亦可溶解於媒劑中。為增加穩定性，在填充小瓶並在真空下去除水後可將組合物凍乾。以實質上相同之方式製備非經腸懸浮液，但化合物可懸浮於媒劑中代替溶解，並在懸浮於無菌媒劑中之前藉由暴露於環氧乙烷滅菌。有利地，可將表面活性劑或潤濕劑納入組合物中，以促進本申請案化合物之均勻分佈。 藉由吸入投與之醫藥製劑可自吹入器或霧化器加壓包遞送。 在一態樣中，本發明提供改善個體之發炎之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供阻抑個體之氮氧化物(NO)釋放之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供阻抑個體之TNF-α釋放之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供抑制個體之細胞遷移、細胞侵入或二者之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供改善個體之由上皮與內皮之間之重塑所致損傷之方法，其包含將本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供降低個體之Snail蛋白質含量之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。 在另一態樣中，本發明提供改善個體中心臟、血管舒張及/或肺功能之方法，其包含將如本文所揭示之化合物投與個體之步驟。較佳地，該改善包含抑制心臟、血管及/或肺之纖維化。 化合物或其醫藥上可接受之鹽係以如下方式投與：經口、經鼻、經皮、經肺、吸入、經頰、舌下、腹腔內、皮下、肌內、靜脈內、經直腸、胸腔內、鞘內及非經腸。在一個實施例中，化合物係經口投與。熟習此項技術者將認識到某些投與途徑之優點。 根據多種因素選擇利用化合物之劑量方案，該等因素包括患者之類型、物種、年齡、體重、性別及醫學病況；欲治療病況之嚴重程度；投與途徑；患者之腎及肝功能；及所採用之特定化合物或其鹽。一般熟練醫師或獸醫可容易地確定預防、對抗或阻止病況進展所需藥物之有效量並開出處方。 本發明現已藉助書面說明書進行闡述，熟習此項技術者將認識到本發明可以多種實施例實踐，且上述說明書及下文實例係用於闡釋目的且並非限制隨後的申請專利範圍。實例
所有關鍵原材料皆係購自多種商業來源，且不經進一步純化即使用。一些關鍵原材料及試劑係內部自製。 合成實例 1
化合物10-氟-2-甲氧基吳茱萸次鹼(F-RUT)及10-氟-2,3-二甲氧基吳茱萸次鹼係經由以下方案合成：
苯胺(1
)經受山德邁耳反應(Sandmeyer reaction)以得到重氮鹽，然後其偶聯至羧酸(3
)以產生腙(4
)，且在酸性條件下處理腙(4
)得到哢啉(5
)，產率為58% (三個步驟)。然後使哢啉(5
)與在甲苯之存在下且在70-80℃下經亞硫醯氯預處理之原位活化取代之鄰胺基苯甲酸衍生物(6a
,b
)偶聯，以提供10-氟-2-甲氧基吳茱萸次鹼(F-RUT)及10-氟-2,3-二甲氧基吳茱萸次鹼，總產率分別為35%及40% (四個步驟)。 藉由1
H及13
C核磁共振(NMR)、紅外(IR)及質譜(MS)鑑別合成產物。對於F-RUT，FT-IR (KBr, cm-1
)：3347 (N-H)及1652 (羰基)。1
H-NMR (CDCl3
, ppm)：δ 3.18 (t,J
= 6.9 Hz, 2H, 2H-8), 4.57 (t,J
= 6.9 Hz, 2H, H-7), 3.93 (s, 3H, 2-OMe), 7.02 (dd,J
= 8.9, 2.4, 1H, H-3), 7.05 (d,J
= 2.4, 1H, H-1), 8.21 (d,J
= 8.9, 1H, H-4), 7.11 (d,J
= 8.8, 1H, H-12), 7.38 (d,J
= 8.8, 1H, H-11), 8.99 (s, 1H, H-9), 12.04 (s, 1H, N-H)。MS-ESI (m/z
) ([M - H]-
)：計算值 335.3；試驗值334.4。對於10-氟-2,3-二甲氧基吳茱萸次鹼(F2MO
-RUT)，FT-IR (KBr, cm-1
)：3398 (N-H)及1641 (羰基)。1
H-NMR (CDCl3
, ppm)：δ 3.18 (t,J
= 6.8 Hz, 2H, H-8), 4.57 (t,J
= 6.8 Hz, 2H, H-7), 3.92 (s, 3H, O-Me), 3.88 (s, 3H, O-Me), 7.04 (s, 1H, H-1), 7.11 (d,J
= 8.9, 1H, H-12), 7.37 (d,J
= 8.9, 1H, H-11), 7.66 (s, 1H, H-4), 8.94 (s, 1H, H-9), 11.87 (s, 1H, N-H)。MS-ESI (m/z
) ([M - H]-
)：計算值 365.3；試驗值364.4。 生物分析 製備實例 2 - 細胞培養
使RAW264.7巨噬細胞細胞系及A2780卵巢癌細胞在37℃下且在具有5% CO2
之加濕氣氛中，於含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青黴素、100 μg/mL鏈黴素、1 mM丙酮酸鈉、4.5 g/L葡萄糖、4 mM l-麩醯胺酸及1.5 g/L碳酸氫鈉之杜爾貝寇改良之伊格爾培養基(DMEM)中生長。使原代人主動脈EC (HAEC)在37℃下且在具有5%CO2
之加濕氣氛中，於懸浮有10% FBS之MesoEndo內皮細胞生長培養基套組(Cell Applications, San Diego, CA, USA)中生長。 實例 3 - 經 LPS 處理之細胞之 NO 及 TNF-α 釋放之阻抑
藉由量測經培養RAW264.7巨噬細胞之上清液中之亞硝酸鹽濃度來評估NO產生。首先將細胞以2 × 105
個細胞/mL之密度接種於24孔板中達24小時，隨後用不同濃度之F-RUT與脂多醣(LPS) (40 ng/mL)再共處理24小時。使用格利斯試劑(於5%磷酸中之1%磺胺及於水中之0.1%萘基乙二胺二鹽酸鹽)來檢測細胞培養上清液中亞硝酸鹽之量。數據報告係以三次獨立測定之平均值±平均值之標準誤差(SEM)紀錄。 與未經處理細胞之NO產生相比，經LPS處理之RAW264.7巨噬細胞之NO產生增加。與合成之F-RUT共處理以濃度依賴性(0-20 μM)方式阻抑NO產生(*p
＜ 0.05，**p
＜ 0.01，與經LPS處理之組相比) (圖1(a))。亦顯示釋放至介質中之TNF-α之一致濃度依賴性強效(*p
＜ 0.05，與經LPS處理之組相比) (圖1(b))阻抑性效應。阻抑性效應並非由細胞毒活性所致，此乃因F-RUT在0-20 μM之濃度下顯示對RAW264.7、H460及CL1-3細胞實質上無細胞毒性(*p
＜ 0.05，**p
＜ 0.01，與經RUT處理之組相比) (圖1(c))。 實例 4 - 可誘導 (i) NOS 及 COX-2 表現之 阻抑
基於黃色四唑鎓鹽轉化成紫色甲䐶產物，實施測試細胞存活率之MTT分析。將細胞(104
個細胞/孔)培養在補充有標準培養基之96孔板中。利用RUT及F-RUT (0-20 μM)處理細胞24小時。將MTT原液(5 mg MTT/mL磷酸鹽緩衝鹽水；PBS)添加至生長培養基達2小時。利用分光光度計以560 nm量測吸光度。測量僅含DMSO作為分析對照。數據報告係將五次獨立測定以平均值± SEM值紀錄。 藉由十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質試樣分離並解析，並將其電轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將膜與一級抗體一起在4℃下一起培育過夜，且然後與經辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之二級免疫球蛋白G (IgG)抗體一起培育；利用PerkinElmer增強之化學發光試劑使免疫反應性條帶可視化。 將RAW264.7巨噬細胞接種於具有DMEM之96孔板中。然後，使用TurboFect轉染試劑(Fermentas, Glen Burnie, MD, USA)，利用pGL4.32 [luc2P/NF-κB-RE/Hygro] (Promega, Madison, WI, USA)質體報導基因轉染細胞。在轉染後24小時時，利用LPS (40 ng/mL)及F-RUT將細胞在無血清培養基中處理24小時。然後，使用ONE-Glo螢光素酶分析套組(Promega)，藉由在發光微板讀數儀(Thermo Varioskan Flash, Waltham, MA, USA)中量測之發光檢測螢光素酶活性。將螢光素酶活性正規化成蛋白質濃度。 發明者觀測到，經LPS處理之RAW264.7巨噬細胞展現iNOS及COX-2顯著升高之蛋白質之量，而F-RUT以濃度依賴性方式阻抑其表現(圖2(a))。加載對照之β-肌動蛋白含量保持恆定。在發炎反應中，NF-κB活化觸發COX-2及iNOS之誘導。測定F-RUT是否阻抑經LPS活化之巨噬細胞中之NF-κB活化。在經LPS誘導之巨噬細胞中瞬時轉染NF-κB依賴性螢光素酶報導基因質體，以確認F-RUT是否抑制NF-κB-結合活性。F-RUT在0 μM -2.5 μM下抑制經LPS誘導之NF-κB轉錄活性(*p
＜ 0.05，**p
＜ 0.01，與經LPS處理之組相比) (圖2(b))。結果表明，藉由F-RUT抑制iNOS及COX-2表現與阻抑NF-κB活化相關。發明者亦觀測到，除COX-2阻抑以外亦抑制酶活性。與RUT相比，F-RUT顯示較少細胞毒性，但保留抗發炎活性。 實例 5- 細胞 遷移 / 侵襲之 抑制
以2 × 105
個細胞/孔之密度在6孔板中培養A2780細胞並在37℃下培育24 小時。使用200-μL吸量管尖端刮擦細胞中之中線並用PBS洗滌。然後，添加新的完全培養基並用或不用1 μM及2.5 μM F-RUT處理24 小時。在培育終點，檢查細胞並用光學顯微鏡拍照。量測並計算刮擦區域邊緣之間之距離以估計細胞之移動能力。 使用個別地經Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA)塗佈之24孔transwell插入物(8-μm孔過濾器，Merck Millipore)評估A2780細胞侵襲。將A2780細胞(2 × 104
個細胞/孔)與無血清最低必需培養基(MEM)一起培養24 小時，且然後利用F-RUT (1.25 μM或2.5 μM)在transwell之上室中再處理24小時。將含有10% FBS之培養基置於下室中。在培育結束時，使用棉花棒去除未移動之細胞；利用4%甲醛固定滲透至過濾器之相對表面之細胞並利用2%結晶紫染色。將染色細胞計數並在相位差光學顯微鏡下以200 ×放大率拍照。實施三次獨立實驗，如別處所述。 如圖3(a)中所圖解說明，創傷癒合分析在F-RUT (0-5 μM)之存在下使用卵巢癌A2780細胞系保持0-24小時。使用成像軟體量測移動率，並使用學生t
-測試進行統計學分析。F-RUT顯示抵抗細胞遷移之顯著效應。F-RUT (0 μM -2.5 μM)處理24小時在transwell分析中亦展現侵入抑制活性(圖3(b))。 實例 6 - TRPV1 及 eNOS 之活化
報導TRPV1存在於動脈之EC中。為證實TRPV1在內皮中之表現，使用免疫墨點術檢測人主動脈EC (HAEC)之TRPV1蛋白質；實例4中已陳述西方墨點分析之方法。在利用α-微管蛋白含量正規化後，F-RUT處理(20 μM) 15分鐘與對照組相比使TRPV1蛋白之量增加兩倍(圖4)。另外檢查F-RUT對HAEC中eNOS之磷酸化之效應，此乃因NO產生因此受eNOS之磷酸化調節。在利用總eNOS正規化後，F-RUT處理(20 μM) 15分鐘與對照組相比使eNOS之磷酸化顯著增加1.4倍(下部圖)。F-RUT上調TRPV1之表現並活化EC中之eNOS磷酸化。 動物實驗 實例 7 - 經 OVA/ 明礬攻擊之小鼠中之發炎之改善
自國立台灣大學醫學院之動物中心(Animal Center of the College of Medicine, National Taiwan University) (Taipei, Taiwan)獲得BALB/c小鼠(六週齡)，並在第0天利用腹膜內注射於總體積為200 μL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之2 mg氫氧化鋁中乳化之20 μg卵白蛋白(OVA)使其致敏，並在第14天及第28天利用於4 mg氫氧化鋁中乳化之50 μg OVA加強。在第30天、第32天、第34天、第36天及第38天，藉由經口投與給予RUT或F-RUT。對於攻擊後而言，在第40天、第41天、第42天及第43天利用OVA (100 μg於總體積為40 μL之PBS中)以鼻內方式處理所有小鼠。在最後一次OVA攻擊後24小時時處死小鼠並收集其器官。所有實驗程序皆由實驗動物照護及使用委員會或小組審查並核凖。將肺組織固定在4%多聚甲醛(sc-281692；Santa Biotechnology)中並包埋於石蠟中。以5-μm之厚度製得組織切片並利用蘇木素及伊紅(H&E)溶液染色用於檢查發炎。 小鼠經OVA/明礬攻擊44天後，肺中存在由增加之浸潤嗜中性球導致之主要發炎。隔日經口投與RUT或F-RUT改善OVA/明礬誘導之肺發炎並顯示與未經處理之對照組類似之圖案(圖5(a))。 藉由轉型生長因子(TGF)-β/Smad來調節KLF10基因。小鼠中Klf10之缺失與經OVA/明礬攻擊44天之肺中之顯著發炎相關。在另一實驗中使用KLF-10 KO小鼠。在經OVA/明礬攻擊44天後，小鼠肺中存在主要發炎，此係由增加之浸潤嗜中性球實現。隔日經口投與F-RUT改善OVA/明礬誘導之肺發炎(圖5(b))。支氣管周圍之膠原形成在經口投與F-RUT後減少(OVA/明礬組中25%，F-RUT組中18%) (圖5(c))。該等結果表明F-RUT對發炎誘導之纖維化之有益效應。 實例 8 - 發炎刺激之 KLF10 KO 小鼠中呼吸界面之改善
量測血氣障壁(肺泡-微血管膜，肺之氣體交換區域)以執行肺功能。利用OVA/明礬攻擊KLF-10 KO小鼠並經口投與RUT或F-RUT後，收穫肺以藉由TEM量測血氣障壁之厚度。血氣障壁之平均厚度在OVA/明礬組中顯著增加(586 nm，與對照組中之348 nm相比)，並由RUT或F-RUT逆轉(分別為418 nm及393 nm)，參見圖6。該等數據探索F-RUT防止肺發炎之潛在生物學功能。 實例 9 - 斑馬魚中 ROS 活性之抑制
圖7顯示F-RUT不僅在細胞中而且在斑馬魚模型中之抗發炎效應。LPS在10 ng/ml及20 ng/ml下顯著誘導斑馬魚中之ROS含量(*** p ＜ 0.001，與對照組相比)。5 ng/ml之F-RUT阻抑經LPS誘導之ROS，與僅經F-RUT處理之組程度相似(*** p ＜ 0.001，與LPS組相比)。 發明者發現以下現象以證明所主張之效應。 首先，RUT誘導CGRP合成及釋放之血管舒張效應係經由TRPV1之活化。因此，設計並合成RUT之類似物用於更好的血管舒張效應。設計RUT之結構修飾以增強其生物活性。然而，增加之細胞毒性妨礙其在血管病症中之應用。本文所提供之氟化RUT新穎類似物具有極低細胞毒性，顯示抗發炎活性(實例7至9)及遷移/侵襲阻抑活性(實例5)，此有益於在用於醫藥時降低副作用。另外，eNOS及iNOS係具有驅動相似生物效應之相同啟動子元件之同種型。關於氟化RUT對本文所述eNOS及iNOS之不同效應，其可自巨噬細胞及EC中之不同信號傳導路徑產生。氟化RUT阻抑巨噬細胞中之iNOS，然而其活化Ec中之eNOS (實例4及6)。結果支持衍生自RUT之氟化RUT具有增強之有益效應及減少之不良效應。 OVA/明礬致敏之小鼠係眾所周知之誘導肺發炎之動物模型。在氣道中存在增加之顆粒球(例如嗜中性球)及組織間隙(微血管內皮、肺泡上皮、基膜及血管週組織)之重塑。在此，實例顯示氟化RUT在經OVA/明礬攻擊之小鼠中減少浸潤嗜中性球並維持氣囊結構(實例7)。該等結果可暗指其益處不僅在於抗發炎效應，而且亦在於抵抗由上皮與內皮之間之重塑所致之損傷。 高血壓活化促氧化酶從而導致增加之ROS形成，此與Ang-II及機械力以及對血管系統之損傷相關。發炎、移動及纖維化係促進內皮功能障礙及心血管重塑之重要因素。氧化性應激在控制內皮功能方面發揮生理作用並且發揮病理生理作用。許多心臟損傷導致纖維化伴隨過量膠原或其他基質蛋白質之沈積，從而引起罹患心臟衰竭。發炎係心區不適之起始且主要的觸發因素，並涉及組織中發炎細胞介素及趨化介素升高之含量。纖維化之特徵在於過量產生由成肌纖維細胞產生之ECM。心肌成纖維細胞起源於EC之內皮-間質轉化(EndMT)，其對於形成心臟纖維母細胞甚為重要。EndMT受由發炎相關之細胞介素介導之信號傳導路徑調節。與血流之直接接觸使得內皮成為有前景之用於藥物治療之靶點。導致心肌纖維化之缺血/再灌注損傷主要由成肌纖維細胞所致之膠原沈積介導。Snail誘導在經歷EndMT時參與纖維化。Snail抑制劑顯著阻抑小鼠中之膠原沈積及心肌纖維化。氟化RUT處理A2780細胞產生降低之Snail蛋白質含量，此表明藉由氟化-RUT抑制EndMT可為對抗血管疾病之新策略(圖未顯示)。 先前研究說明，發炎及成肌纖維細胞形成促進肺纖維化之罹患。發炎細胞介素藉助EMT誘導EC轉變為成肌纖維細胞，且然後產生過量ECM從而引起纖維化。氟化-RUT (一類RUT衍生物)具有低細胞毒性但保持其抵抗發炎及遷移/侵襲之活性。利用氟化RUT治療增強TRPV1並活化eNOS活性。根據上文所提供之實例，氟化RUT將提供在改善心臟、血管舒張及肺功能方面之應用。