KR102049496B1

KR102049496B1 - 항암제에 의한 부작용 및 위장 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물

Info

Publication number: KR102049496B1
Application number: KR1020120124197A
Authority: KR
Inventors: 소홍섭; 박래길; 오기수; 곽태환
Original assignee: (주)나디안바이오
Priority date: 2012-11-05
Filing date: 2012-11-05
Publication date: 2019-11-28
Also published as: KR20140058734A

Abstract

본 발명은 약리학적 유효량의 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 프로드럭, 용매화물 또는 이성질체, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하며, 항암제 부작용 질환 및/또는 위장 질환의 치료 및 예방을 위한 약제 조성물을 제공한다:

상기 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ 및 n 은 명세서에 정의된 바와 같다.

Description

항암제에 의한 부작용 및 위장 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제 조성물 {Pharmaceutical Composition for Treatment or Prevention of Side-effect of Anticancer drug and Stomach Disease}

본 발명은 항암제에 의한 부작용 및 위장 질환의 치료 및 예방에 우수한 약리학적 효능을 가지는 약제 조성물에 관한 것으로서, 상기 약제 조성물은 시스플라틴에 의해 유발된 신장 손상, 장관 손상, 구토 및 위산 분비를 동반한 위궤양, 에탄올 유도 위궤양의 치료 및 예방에 우수한 효과를 나타낸다.

항암치료를 위한 대부분의 화학요법제(chemotherapeutics)는 빠르게 분열, 증식하는 암세포를 사멸시키지만, 분열하는 세포의 DNA 합성과정에 영향을 미치기 때문에 암세포는 물론 골수, 면역세포 및 장상피에 독성을 나타낸다(Basinger et al., 1990; CvItkovic, 1998; Farrell et al., 1998; Gibson et al., 2002; ba다 et al., 2003). 따라서 골수독성은 조혈기능 소실로 빈혈의 원인이 되며, 면역세포 독성은 면역력 감퇴를, 그리고 장관손상은 영양결핍, 탈수 및 감염에 대한 이환율 상승으로 사망의 주요 원인이 된다(Cascinu, 1995). 특히 시스플라틴(Cisplatin)은 심한 구토와 장관손상을 유발함은 물론(Gupta and Sharma, 1996; Ueda et al., 1998; Yamakuni et a;., 2002, 2006; Jeong et al., 2005; Nakayama et al., 2005; Rudd et al., 2006; Warr, 2008), 신장독성, 간독성 및 면역계독성을 유발하는 것으로 잘 알려져 있다(Talmadge et al., 1994; Sugiyama et al., 1995a, 1995b; Ueda et al., 1998, Kobayashi et al., Lee et al., 2008).

이러한 신장의 손상으로 인한 기능의 저하는 신장 및 관련 구조의 증대, 신장의 위축, 체액량의 변화, 전해질 불균형, 대사성 산증, 가스교환장애, 항감염 기능 손상, 요독성 독소의 축적 등을 초래한다.

최근, 항암제의 부작용을 억제하기 위해, 시스플라틴에 의해 유도된 신장 손상의 예방 및 치료에 효과적인 물질을 찾기 위한 여러 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 신장 손상의 예방 및 치료와 관련하여 승인된 약물은 없다.

항암제 투여로 인한 오심과 구토는 위장관과 중추신경계에 분포해있는 serotonin type 3(5-hydroxytryptamine 3, 5-HTC) 수용체의 활성화가 주요 기전 중의 하나로 알려져왔다(Andrews et al;., 1998; Kilpatrick et al., 1990; Tyers, 1991; Andrews and Davis, 1993). 일반적으로 항암제는 장점막 손상을 유발함으로써(Minami et al., 1997) 장크롬친화성세포(enterochromaffin cells)로부터 세로토닌 유리를 유도한다(Andrews and Davis, 1993). 세로토닌은 미주신경(vagus) 및 교감신경 구심뉴런(afferent neurons)은 물론 postrema의 chemoreceptor trigger zone을 활성화시켜(Clarke and Davision, 1978; Andrews et al., 1990) 연수의 구토중추 반응을 유도한다

따라서 선택적인 5-HT3 수용체 길항제는 동물(Andrews and Bhandari, 1993; Rudd and Naylor, 1996)과 사람(Andrews et el., 1990; Einhorn et al., 1990; Aapro, 1991; Morrow et al., 1995)에서 효과적으로 오심과 구토를 예방하는 것으로 보고되었다. Tropisetron과 같은 5-HTC 수용체 길항제는 시스플라틴, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 독소루비신(doxorubicin) 등의 화학요법제에 의한 구토 억제에 사용되어 왔다(Bleiberg et al., 1992, 1993; Bruntsch et al., 1992; Dogliotti et al., 1992; De Brujin, 1993; Jantunen et al., 1993; Lee et al., 1993; Mantovani et al., 1996). 5-HTC 수용체 길항제 외에도 H1 수용체 길항제(Bergman and Spealman, 1988; Tonato et al., 1994), D2 수용체 길항제(Jovanovic-Micic et al., 1995; Nystakidou et al., 1998), cannabinoids (Abrahamov et al., 1995; Mechoulam and Hanu, 2001) 및 neukinin 1 (NK 1) 수용체 길항제(Bountra et al., 1993; Tattersall et al., 1994; Beattie et al., 1995; Gardner et al., 1995, 1996; Watson et al., 1995; Harrison et al., 2001) 역시 효과적인 항구토제로 알려져 있다(Jordan et al., 2007). 그러나 tropisetron 등의 5-HTC 수용체 길항제는 상대적으로 초기의 구토반응에 효과적이며, 짧은 지속시간으로 인해 빈번한 재투여가 요구된다(Aapro, 1991; Andrews 1994; Jeong et al., 2005).

항구토 효능 평가를 위해서는 ferret, dog, suncus, monkey 등 다양한 동물이 이용되어왔다(Rudd et al., 1994; Rudd and Naylor, 1996; Nakayama et al., 2005). 그러나 설치류, 중치류, 말 반추류 등은 분문부 괄약근이 강하여 구토를 하지 못한다(Jeong et al., 2005). 더욱이 개는 사료의 과식만으로도 쉽게 토하기 때문에 항암제 투여에 따른 구토반응의 재현에 혼란이 초래되기도 하며, 원숭이와 suncus는 고가에다 관리상의 어려움으로 인해 항구토제의 평가를 위해서는 ferret이 가장 널리 이용되고 있다.

소화성 위궤양(ulcers)은 점막이 염산(HCl)과 펩신(pepsin)에 잠겨있는 부위의 손상을 의미하는 것으로, 이 부위는 정상적으로 점액세포(mucus cells)이 분비하는 뮤신(mucin)에 의해 덮여 있다(Wallace and Granger, 1996; Neal, 2003). 따라서 위산분비를 촉진시키는 요인, 펩신의 침습에 대항하는 뮤신층을 약화시키거나 고갈시키는 요인, 국소 혈액순환장애를 일으키는 요인, 세포손상 및 염증반응 등 다양한 원인에 의해 위점막의 미란(erosions)과 궤양이 유발된다(Wallace and Granger, 1996; Neal, 2003; Isobe at al., 2004; Byun et al., 2007). 그러므로 위궤양을 일으키는 원인물질로는 뮤신층을 강화시키고 국소 혈액을 원활하게 해주는 프로스타글란딘(prostaglandins; PGs)의 생성 효소인 cyclooxygenase (COX)를 억제하는 non-steroidal anti-inflammatory drugs(NSAIDs) 등의 약물(Slominary et al., 1997; Filaretova et al., 2002; Cao et al., 2004; Rao et al., 2004; Kim et al., 2005), 알코올(alcohol) (Cao et al., 2004; Rao et al., 2004 Raffin et al., 2007), 위산 과다분비 및 저류(Cao et al., 2004; Rao et al., 2004)등을 들 수 있다.

위궤양 치료제로는 위벽세포(parietal cells)로부터의 산 분비를 차단하는 proton-pump inhibitors, 제산제(antacids), 산 분비를 촉진시키는 히스타민의 수용체 차단제(H₂ antagonists), 뮤신층 강화제인 PGs과 그 유도체, 그리고 H. pylori를 근절할 수 있는 항생제류가 대표적이다(Wallace and Ganger, 1996; Neal, 2003). 대부분의 위궤양이 위산분비 차단 시 억제되는 것으로 나타나, 위산분비가 궤양 유발에 매우 중요한 요인임이 밝혀졌다(Cao et al., 2004).

한편, 예로부터 단삼은 동북 아시아권에서 중요한 한약제로 널리 사용되고 있는데, 이들은 각종 심혈관계 질환의 예방과 치료에 탁월한 효과가 있는 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 단삼의 약효에 착안하여, 본 출원의 발명자들은 대한민국특허 제2003-0099556호, 제2003-0099557호, 제2003-0099657호, 제2003-0099658호, 제2004-0036195호, 제2004-0036197호, 제2004-0050200호 등에서 단삼의 주요 성분들이 비만, 당뇨, 대사성 질환 등을 치료할 수 있는 훌륭한 약제임을 제시한 바 있다. 특히, 단삼의 핵심 성분인 크립토탄신온(Cryptotanshinone), 15,16-디히드로탄신온(15,16-Dihydrotanshinone), 탄신온 IIA(Tanshinone II-A), 탄신온 I(Tanshinone I) 등이 대사증후군 질환을 치료할 수 있는 핵심 성분임을 밝힌 바 있다.

본 출원의 발명자들은 다양한 연구와 실험을 거듭한 끝에, β-lapachone {7,8-dihydro-2,2-dimethyl-2H-naphtho(2,3-b)dihydropyran-7,8-dione}, dunnione {2,3,3-tirmethyl-2,3,4,5-tetrahydro-naphtho(2,3-b) dihydrofuran-6,7-dione}, α-dunnione {2,3,3-tirmethyl-2,3,4,5-tetrahydro-naphtho(2,3-b)dihydrofuran-6,7-dione}, nocardinone A, nocardinone B, lantalucratin A, lantalucratin B, lantalucratin C 등과 같은 나프토퀴논계 화합물 또한 항암제 부작용 질환 및/또는 위장 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있음을 새롭게 확인하였다.

β-lapachone은 남미에서 자생하는 라파초(laphacho) 나무(Tabebuia avellanedae)에서, dunnione과 α-dunnione 또한 남미에서 자생하는 Streptocarpus dunnii의 잎에서 얻어진다. 이들 천연의 tricyclic naphthoquinone 유도체들은 남미 지역에서는 오래전부터 항암제를 비롯하여 남미 지역의 대표적인 풍토병인 샤가스병(Chagas disease)을 치료하기 위한 약으로 널리 사용되었고, 그 효과 또한 뛰어난 것으로 알려져 있다. 특히, 이들의 항암제로서의 약리 작용이 서방세계에 알려지기 시작하면서 사람들의 주목을 받기 시작했고, 미국특허(US) 5,969,163에 개시되고 있듯이 이들 tricyclic naphtoquinone 유도체들은 실제로 다양한 연구 집단에 의해서 각종 항암제로 개발되고 있다.

그러나, 각종 연구에도 불구하고 이들 나프토퀴논계 화합물들이 항암제 부작용 질환 및/또는 위장 질환의 치료 또는 예방을 위한 약리학적 효능을 가진다는 사실은 전혀 알려져 있지 않다.

본 출원의 발명자들은 상기의 β-lapachone, dunnione,α-dunnione, nocardinone A, nocardinone B, lantalucratin A, lantalucratin B, lantalucratin C 등과 같은 나프토퀴논계 화합물들이 단삼에서 추출한 탄신온(Tanshinone) 유도체와 화학적 기본 구조가 서로 유사한 점을 바탕으로 하여, 이들의 항암제 부작용 ,위장 질환 치료 및 예방제로서의 약리작용을 조사하게 되었다.

따라서, 본 발명은 항암제 부작용 질환 및/또는 위장 질환의 치료 및 예방에 효과가 있는 나프토퀴논계 화합물을 유효성분으로 포함하는 약제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 항암제 부작용 질환 및/또는 위장 질환의 치료 및 예방을 위한 약제 조성물은, (a) 약리학적 유효량의 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 프로드럭, 용매화물 또는 이성질체, 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것으로 구성되어 있다.

(1)

상기 식에서,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 알콕시, 히드록시 또는 탄소수 1 ~ 6의 저급알킬이며;

R₃, R₄, R₅, R₆, R₇ 및 R₈는 각각 독립적으로 수소, 히드록시, 탄소수 1 ~ 20의 알킬, 알켄 또는 알콕시, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴이고, 또는 이들 중 두 개의 치환기가 상호 결합에 의해 환형 구조를 이룰 수 있으며, 여기서 환형 구조는 포화 구조 또는 부분적 또는 전체적 불포화 구조일 수 있고;

n 은 0 또는 1이고, n 이 0인 경우에 그것의 인접 탄소원자들은 직접결합에 의해 환형 구조를 이룬다.

상기 화학식 1의 화합물에 의한 항암제 부작용 및/또는 위장 질환의 치료 및 예방 효과를 확인하기 위하여, 이하 실험예에서 보는 바와 같이, 다양한 실험을 진행하였으며, 그 결과 상기 화학식 1의 화합물은 시스플라틴에 의해 유발된 신장 손상, 장관 손상 및 구토에 탁월한 효과가 있음을 보여주었으며, 위액 분비 억제 효과 및 에탄올에 의한 위점막 출혈에 탁월한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 하는 본 발명의 약제 조성물은 항암제 유발 질환에 대한 효과적인 억제 기능과 더불어 위산 분비를 동반하는 다양한 위궤양 및 에탄올에 의한 위궤양을 치료 및 예방할 수 있을 것으로 기대된다.

용어 “약제학적으로 허용되는 염”이란 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는, 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약제학적 염은, 약제학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수고산, 요드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다. 본 발명에 따른 화학식1의 화합물은 통상적인 방법에 의해 그것의 염으로 전환시킬 수도 있다.

용어 “프로드럭(prodrug)”이란 생체내에서 모 약제(parent drug)로 변형되는 물질을 의미한다. 프로드럭은 모 약제보다 투여하기 쉽기 때문에 종종 사용된다. 예를 들어, 이들은 구강 투여에 의해 생 활성을 얻을 수 있음에 반하여, 모 약제는 그렇지 못할 수 있다. 프로드럭은 또한 모 약제보다 제약 조성물에서 향상된 용해도를 가질 수도 있다. 예를 들어, 프로드럭은, 수용해도가 이동성에 해가 되지만, 일단 수용해도가 이로운 세포에서는, 물질대사에 의해 활성체인 카르복실산으로 가수분해되는, 세포막의 통과를 용이하게 하는 에스테르(“프로드럭”)로서 투여되는 화합물일 것이다. 프로드럭의 또 다른 예는 펩티드가 활성 부위를 드러내도록 물질대사에 의해 변환되는 산기에 결합되어 있는 짧은 펩티드(폴리아미노 산)일 수 있다.

용어 “용매화물(solvate)”이란 비공유적 분자 사이의 힘(non-covalent intermolecular force)에 의해 결합된 화학양론적(stoichiometric) 또는 비화학양론적(non-stoichiometric)인 양의 용매를 포함하고 있는 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다. 그에 관한 바람직한 용매들로는 휘발성, 비독성, 및/또는 인간에게 투여되기에 적합한 용매들이 있으며, 상기 용매가 물인 경우 이는 수화물(hydrate)을 의미한다.

용어 “이성질체(isomer)”이란 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 광학적 또는 입체적으로 다른 본 발명의 화합물 또는 그것의 염을 의미한다.

이하에서 별도의 설명이 없는 한, 용어 “화학식 1의 화합물”은, 화합물 그 자체, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 프로드럭, 용매화물 및 이성질체를 모두 포함하는 개념으로 사용되고 있다.

용어 “알킬(alkyl)”은 지방족 탄화수소 그룹을 의미한다. 본 발명에서 알킬은 어떠한 알켄이나 알킨 부위를 포함하고 있지 않음을 의미하는 “포화 알킬(saturated alkyl)”과, 적어도 하나의 알켄 또는 알킨 부위를 포함하고 있음을 의미하는 “불포화 알킬(unsaturated alkyl)”을 모두 포함하는 개념으로 사용되고 있다. “알켄(alkene)” 부위는 적어도 두 개의 탄소원자가 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합으로 이루어진 그룹을 의미하며, “알킨(alkyne)”은 부위는 적어도 두 개의 탄소원자가 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합으로 이루어진 그룹을 의미한다. 상기 알킬은 분지형, 직쇄형 또는 환형일 수 있으며, 치환 또는 비치환 구조일 수 있다.

용어 “헤테로시클로알킬(heterocycloalky)”은 환 탄소가 산소, 질소, 황 등으로 치환되어 있는 치환체로서, 예를 들어, 퓨란, 티오펜, 피롤, 피롤린, 피롤리딘, 옥사졸, 티아졸, 이미다졸, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 피라졸, 피라졸린, 피라졸리딘, 이소티아졸, 트리아졸, 티아디아졸, 피란, 피리딘, 피퍼리딘, 모르포린, 티오모르포린, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 피퍼라진, 트리아진 등을 들 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

용어 “아릴(aryl)”은 공유 파이 전자계를 가지고 있는 적어도 하나의 링을 가지고 있고 카르보시클릭 아릴(예를 들어, 페닐)과 헤테로시클릭 아릴기(예를 들어, 피리딘)를 포함하는 방향족치환체를 의미한다. 상기 용어는 모노시클릭 또는 융합 링 폴리시클릭(즉, 탄소원자들의 인접한 쌍들을 나눠 가지는 링들) 그룹들을 포함한다.

용어 “헤테로아릴(heteroaryl)”은 적어도 하나의 헤테로시클릭 환을 포함하고 있는 방향족 그룹을 의미한다.

상기 아릴 또는 헤테로아릴의 예로는 페닐, 퓨란, 피란, 피리딜, 피리미딜, 트리아질 등을 들 수 있지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 화학식 1에서 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇ 및 R₈ 는 임의적으로 치환된 구조일 수 있으며, 그러한 치환체들의 예로는 시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리시클릭, 히드록시, 알콕시, 아릴옥시, 메르켑토, 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 할로겐, 카르보닐, 티오카르보닐, O-카르바밀, N-카르바밀, O-티오카르바밀, N-티오카르바밀, C-아미도, N-아미도, S-술폰아미도, N-술폰아미도, C-카르복시, O-카르복시, 이소시아네이토, 티오시아네이토, 이소티오시아네이토, 니트로, 시릴, 트리할로메탄술포닐, 모노- 및 디-치환 아미노 그룹들을 포함한 아미노, 및 이들의 보호 유도체들로부터 개별적으로 그리고 독립적으로 선택된 하나 또는 그 이상의 치환체 등을 들 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물들 중 바람직한 예로는 하기 화학식 2와 3의 화합물일 수 있다. 하기 식에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇ 및 R₈ 는 화학식 1에서 정의된 바와 동일하다.

하기 화학식 2의 화합물은 n이 0이면서 인접 탄소원자들이 직접 결합에 의해 환형 구조(furan 고리)를 형성하는 화합물로서, 이하에서는 때때로 '퓨란 화합물' 또는 'furano-o-naphthoquinone 유도체'로 칭하기도 한다.

(2)

하기 화학식 3의 화합물은 n이 1인 화합물로서, 이하에서는 때때로 '피란(pyran) 화합물' 또는 'pyrano-o-naphthoquinone'로 칭하기도 한다.

(3)

상기 화학식 1에서 R₁ 및 R₂ 는 특히 바람직하게는 각각 수소일 수 있다.

상기 화학식 2의 퓨란 화합물들 중에서 특히 바람직한 예로는, R₁, R₂ 및 R₄가 각각 수소인 하기 화학식 2a의 화합물, 또는 R₁, R₂ 및 R₆가 각각 수소인 하기 화학식 2b의 화합물을 들 수 있다.

(2a)

(2b)

또한, 상기 화학식 3의 피란 화합물들 중 특히 바람직한 예로는 R₁, R₂, R₅, R₆, R₇및 R₈이 각각 수소인 하기 화학식 3a의 화합물을 들 수 있다.

(3a)

상기 “약제 조성물(pharmaceutical composition)”은 상기 화학식 1의 화합물과 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다. 약제 조성물은 생물체내로 화합물의 투여를 용이하게 한다. 화합물을 투여하는 다양한 기술들이 존재하며, 여기에는 경구, 주사, 에어로졸, 비경구, 및 국소 투여 등이 포함되지만, 이들만으로 한정되는 것은 아니다. 약제 조성물은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등과 같은 산 화합물들을 반응시켜서 얻어질 수도 있다.

상기 “약리학적 유효량(therapeutically effective amount)”은 투여되는 화합물의 양이 치료하는 장애의 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감 또는 줄이거나, 예방을 요하는 질병의 임상학적 마커 또는 증상의 개시를 지연시키는데 유효한 활성성분의 량을 의미한다. 따라서, 약리학적 유효량은, (1) 질환의 진행 속도를 역전시키는 효과, (2) 질환의 그 이상의 진행을 어느 정도 금지시키는 효과, 및/또는 (3) 질환과 관련된 하나 또는 그 이상의 증상을 어느 정도 경감(바람직하게는, 제거)하는 효과를 가지는 양을 의미한다. 약리학적 유효량은 치료를 요하는 질병에 대한 공지된 생채 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro) 모델 시스템에서 화합물을 실험함으로써 경험적으로 결정될 수 있다.

상기 “담체(carrier)”는 세포 또는 조직 내부로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸 술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내부로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

상기 “희석제(diluent)”는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다.

여기에 사용된 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 활성 성분들과 함께 또는 적당한 담체나부형제와 함께 혼합된 약제 조성물로서 투여될 수 있다. 본 응용에서의 화합물의 제형 및 투여에 관한 기술은 “Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition, 1990”에서 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 경구 투여용 약제 조성물에서 상기 활물질은 높은 결정화도의 결정구조를 가질 수도 있고 또는 낮은 결정화도의 결정구조를 가질 수도 있다. 바람직하게는, 낮은 결정화도의 결정구조로 이루어져 있어서, 화학식 1 또는 2의 화합물의 난용성 문제를 해결하고, 용출률 및 체내 흡수율을 더욱 높일 수 있다.

상기 “결정화도”는 결정성 화합물 전체에 대한 결정 부분의 무게 분율로서, 결정화도의 측정은 공지의 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 결정 부분과 비결정 부분 각각의 밀도에서 가감한 정도의 설정치를 미리 가정하여 구하는 밀도법 또는 정침법에 의해 수행될 수 있고, 융해열에 의한 측정 방법에 의해 결정화도를 정할 수 있으며, X선 회절상의 강도 분포를 비결정 부분에 의한 회절과 결정 부분에 의한 회절로 분리하여 구하는 X선법, 또는 적외선 흡수 스펙트럼의 결정성 띠간 폭의 피크로부터 구하는 적외선법에 의해 결정화도를 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 경구 투여용 약제 조성물에서 활물질의 결정화도는 바람직하게는 50% 이하이며, 더욱 바람직하게는 물질 고유의 결정성이 완전히 소실된 상태의 무정형의 결정구조일 수 있다. 상기 무정형의 화합물은 결정성의 화합물에 비해 상대적으로 높은 용해도를 나타내고, 용출률 및 체내 흡수율을 유의적으로 향상시킬 수 있다.

하나의 바람직한 예에서, 상기 무정형의 구조는 활물질을 미세입자로 제조하는 과정에서 만들어질 수 있다. 상기 미세입자는, 예를 들어, 활물질의 분무건조법, 고분자와 용융물을 형성시키는 용융법, 용매에 녹여 고분자 등과 공침물을 형성시키는 공침법, 포접체 형성법, 용매 휘발에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 분무건조법이 사용될 수 있다. 반면에, 기계적 분쇄법에 의한 활물질의 미세입자화는 무정형의 구조가 아니더라도, 즉, 결정성 결정구조나 반결정성 결정구조라 하더라도, 큰 비표면적에 의해 용해도 향상에 기여하여 결과적으로 용출률과 체내 흡수율의 향상을 도모할 수 있다.

상기 분무건조법은 활물질을 소정의 용매에 용해시킨 후 분무하면서 건조하여 미세입자를 제조하는 방법으로서, 분무건조 과정에서 나프토퀴논계 화합물 자체의 결정성이 상당량 소실되어 무정형이 되면서 미세분말의 분무건조물이 얻어진다.

상기 기계적 분쇄법은 활물질 입자에 강한 물리력을 가하여 미세입자로 분쇄하는 방법으로서, 제트 밀, 볼 밀, 진동 밀, 햄머 밀 등의 분쇄 공정이 사용될 수 있으며, 공기압을 사용하여 40℃ 이하의 조건에서 분쇄를 수행할 수 있는 제트 밀이 특히 바람직하다.

한편, 결정구조에 관계없이 미세입자 형태의 활물질은 그것의 입경이 감소할수록 비표면적 증가로 인해 용출률, 용해도 등이 증가하지만, 너무 작은 입경은 그러한 크기의 미세입자를 제조하기가 용이하지 않을 뿐만 아니라 입자간 응집현상(agglomeration or aggregation)으로 인해 오히려 용해도를 저하시킬 수 있으므로, 하나의 바람직한 예에서 활물질의 입경은 5 nm 내지 500 ㎛의 범위 내일 수 있다. 이러한 범위에서 상기 응집현상을 최대한 억제하고, 높은 비표면적에 의해 용출률 및 용해도가 최대화된다고 할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물은 항암제에 의한 부작용, 특히 시스플라틴에 의한 신장 독성, 장관 손상, 구토의 치료 또는 예방에 유용하다. 구체적으로 시스플라틴 투여로 인한 심한 장관 손상을 탁월하게 완화시키며, 신장 손상 바람직하게는 시스플라틴에 의한 염증 반응 매개인자의 vicious cycle에 의한 손상 및 신장 조직으로 침유되는 면역세포 유도 염증반응에 의한 손상의 새로운 치료 및 간독성 또한 억제한다. 또한 골수와 비장의 세포소실을 완화시키고, T 및 B-림프구의 기능을 회복시킨다.

또한 위산 분비 및 에탄올 유도 위궤양에서 우수한 억제 효과를 나타낸다.

따라서 본 발명에 따른 화합물은 항암제 유발 구토에 대한 억제 기능과 더불어 장관을 비롯한 신장, 간, 면역 및 조혈 기능보호 및 회복에 효과적일 것으로 판단되며, 위산과다 및 숙취와 같은 특정 원인에 의한 위궤양 개선에 유효할 것으로 기대된다.

도 1은 헤마톡실린-에오진 염색(hematoxylin-eosin stain, H＆E stain)을 이용하여 시스플라틴의 처리 시간에 따른 신장 손상 정도를 관찰한 도면이다.
도 2는 시스플라틴 유도 신장손상에 대한 화합물 1(β-Lapachone, βL)의 보호효과를 H＆E 염색을 통하여 관찰한 도면이다.
도 3은 시스플라틴 유도 신장 관류조직의 변화에 대한 화합물 1의 억제효과를 PAS 염색(periodic-acid-Schiff stain)을 이용하여 관찰한 도면이다.
도 4는 시스플라틴에 의해 유도된 혈청내 크레아티닌(creatinine) 및 요소(urea)의 증가에 대한 화합물 1의 조절효과를 비교 분석한 그래프이다. *p<0.05.
도 5는 시스플라틴과 화합물 1 처리군의 신장조직에서 NAD+/NADH 비율의 변화를 나타내는 그래프이다. *p<0.05.
도 6은 시스플라틴 처리군과 화합물 1 처리군의 신장 조직내 Sirt1 발현을 관찰한 도면이다.
도 7은 시스플라틴 처리군과 화합물 1 처리군에서 신장 조직내 Sirt1의 표적단백질인 p65의 아세틸화 정도를 관찰한 도면이다.
도 8은 시스플라틴 처리군과 화합물 1 처리군의 신장 조직내 Sirt3의 발현을 관찰한 도면이다.
도 9는 시스플라틴 처리군과 화합물 1 처리군의 신장 조직내 Sirt3의 표적 단백질인 p53의 아세틸화 정도를 관찰한 도면이다.
도 10은 시스플라틴 처리군과 화합물 1 처리군에서 혈청 및 소변 내 TNF-α의 농도를 분석한 도면이다. *p<0.05.
도 11은 시스플라틴 처리군과 화합물 1 처리군의 신장 조직내 염증 유발 사이토카인들의 발현을 관찰한 도면이다.
도 12는 시스플라틴 처리군과 화합물 1 처리군의 신장 조직내 NF-kB p65 단백질 발현을 관찰한 도면이다.
도 13은 시스플라틴 처리군과 화합물 1 처리군의 신장 조직내 NOX 1의 발현을 관찰한 도면이다.
도 14는 시스플라틴 처리군과 화합물 1 처리군의 신장 조직내 NOX 4의 발현을 나타내는 도면이다.
도 15는 시스플라틴 처리군과 화합물 1 처리군의 신장 조직내 TLR4 단백질 발현을 나타내는 도면이다.
도 16은 시스플라틴 처리군과 화합물 1 처리군의 신장 조직내 MCP-1 단백질 발현을 나타내는 도면이다.
도 17은 4일 내지 7일 경과 동안 시스플라틴(3.5 mg/kg) 복강 투여 및 10일 동안 화합물 2의 경구 투여후 쥐의 몸무게 변화를 나타내는 도면이다 (● 대조군; ○ 시스플라틴 단독군; ▼ 시스플라틴 + 5 mg/kg 화합물 2; ■ 시스플라틴 + 10 mg/kg 화합물 2; ◆ 시스플라틴 + 25 mg/kg 화합물 2; ▲ 시스플라틴 + 50 mg/kg 화합물 2).
도 18은 4일 내지 7일 경과 동안 쥐의 복강내로 시스플라틴 3.5mg/kg 투여 및 화합물 2를 경구 투여 한 후 소장의 관찰 결과를 나타내는 도면이다.
도 19는 4일 내지 7일 경과 동안 쥐의 복강 내로 시스플라틴 3.5mg/kg 투여 및 화합물 2를 경구 투여 한 후 소장의 관찰 결과를 나타내는 도면이다.
도 20은 4일 내지 7일 경과 동안 쥐의 복강 내로 시스플라틴 3.5mg/kg 투여 및 화합물 2를 경구 투여 한 후 골수의 관찰 결과를 나타내는 도면이다.
도 21은 4일 내지 7일 경과 동안 쥐의 복강 내로 시스플라틴 3.5mg/kg 투여 및 10일 동안 화합물 2(5-50 mg/kg)를 경구 투여 한 후 지라세포의 수를 나타내는 도면이다.
도 22는 10일 동안 복강 내 시스플라틴(3.5 mg/kg)을 투여한 쥐에 화합물 2 (5-50mg/kg)를 경구 투여한 후 T림프구의 concanavalin A (ConA) 반응을 나타내는 도면이다.
도 23은 10일 동안 복강 내 시스플라틴(3.5 mg/kg)을 투여한 쥐에 화합물 2 (5-50mg/kg)를 경구 투여한 후 T림프구의 lipopolysaccharide (LPS) 반응을 나타내는 도면이다
도 24는 시스플라틴 (10 mg/kg) 피하 투여에 의해 유도된 구역질 및 구토반응에 화합물 2 (150 mg/kg)를 7일 동안 반복적으로 경구 투여한 효과를 나타내는 도면이다.
도 25는 7일간 시스플라틴 (5mg/kg) 복강 내 투여 및 화합물 2 경구투여에 따른 ferrets의 몸무게 변화를 나타내는 도면이다(○, 시스플라틴 단독투여군; ▼, 시스플라틴 + 25 mg/kg 화합물 2; ■, 시스플라틴 + 50 mg/kg 화합물 2; ◆, 시스플라틴 + 100 mg/kg 화합물 2).
도 26은 ferrets의 구역질 및 구토반응으로서 대표적으로 캡쳐한 결과이다(좌측은 구역질, 우측은 구토 반응을 나타낸다)
도 27은 시스플라틴 복강내 투여에 의해 유도된 구역질 및 구토반응에서 화합물 2(25-100mg/kg)의 7일간 경구 투여의 결과이다.
도 28은 6시간 유문 결찰에 따른 화합물 1의 위액 분비량 효과를 나타내는 도면이다.
도 29는 6시간 유문 결찰에 따른 화합물 1의 위액의 pH 효과를 나타내는 도면이다,
도 30은 6시간 유문 결찰에 따른 화합물 1의 위액의 유리염산량 효과를 나타내는 도면이다.
도 31은 6시간 유문 결찰에 따른 화합물 1의 위액의 총산도 효과를 효과를 나타내는 도면이다.
도 32는 6시간 유문 결찰에 따른 화합물 2의 위액 분비량 효과를 나타내는 도면이다.
도 33은 6시간 유문 결찰에 따른 화합물 2의 위액의 pH 효과를 나타내는 도면이다,
도 34는 6시간 유문 결찰에 따른 화합물 2의 위액의 유리염산량 효과를 나타내는 도면이다.
도 35는 6시간 유문 결찰에 따른 화합물 2의 위액의 총산도 효과를 효과를 나타내는 도면이다.
도 36은 에탄올(3ml/kg)에 의해 유도된 위궤양의 결과를 나타낸 도면이다(좌측상단은 vehicle, 우측상단은 10mg/kg의 화합물 2, 좌측하단은 30mg/kg의 화합물 2, 우측하단은 10mg/kg의 pantoprazole을 나타낸다).
도 37은 에탄올(3ml/kg)에 의해 유도된 위궤양의 화합물 2(검정) 및 pantoprazole(회색) 효과를 나타낸 도면이다.

본 발명에 따른 약제 조성물에서 상기 화학식 1의 화합물들은, 이후 설명하는 바와 같이, 공지된 방법 및/또는 유기합성 분야의 기술에 근간한 다양한 방법들에 의해 제조될 수 있으며, 하기의 제조방법들은 일부 예시에 지나지 않으며, 그 이외의 방법들도 존재할 수 있음은 물론이다.

제조방법 1: lapachol 유도체의 합성 및 산 촉매 고리화 반응

β-lapachone은 lapacho 나무에서 비교적 적은 양으로 얻어지는 반면에 β-lapachone 합성의 원료가 되는 lapachol은 lapacho 나무에서 상당히 많은 양으로 얻어지기 때문에 이미 오래전에 lapachol을 사용하여 β-lapachone을 합성하는 방법이 개발되었다. 즉, L. F. Fieser는 {J. Am. Chem. Scoc. 49 (1927), 857}에서 고지하는 것처럼, lapachol과 황산을 함께 혼합하여 상온에서 격렬하게 교반시키면 비교적 좋은 수율로 β-lapachone이 얻어진다. 이처럼 일반적으로 비교적 간단한 구조의 tricyclic naphthoquinone (pyrano-o-naphthoquinone 과 furano-o-naphthoquinone) 유도체들은 하기의 반응식처럼 황산을 촉매로 사용하는 고리화 반응을 통해서 비교적 좋은 수율로 합성되는데, 이 방법에 기초하여 화학식 1의 다양한 화합물들을 합성할 수 있다.

Lapachol β-lapachone

이들 과정을 보다 일반적인 화학 반응식으로 정리하면 다음과 같다.

즉, 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone을 염기 존재 하에서 다양한 allylic bromide 또는 그 등가물과 반응시키면 C-alkylation(C-알킬화)과 O-alkylation(O-알킬화) 반응이 일어난 물질이 함께 얻어지는데, 반응 조건에 따라서는 한쪽 유도체만 합성하는 것도 가능하다. 여기서 O-알킬화된 유도체는 톨루엔이나 자일렌과 같은 용매를 사용하여 환류시킴으로써 Claisen Rearrangement 반응을 통해서 또 다른 유형의 C-알킬화된 유도체로 전환되기 때문에 다양한 유형의 3-substituted-2-hydroxy-1,4-naphthoquinone 유도체를 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 다양한 형태의 C-알킬화 유도체들은 황산을 촉매로 사용하여 고리화 반응을 유도함으로써, 상기 화학식 1의 화합물들 중 pyrano-o-naphthoquinone 또는 furano-o-naphthoquinone 유도체들을 합성할 수 있다.

제조방법 2: 3-methylene-1,2,4-[3H]naphthalenetrione을 사용한 Diels-Alder 반응

V. Nair 등{Tetrahedron Lett. 42 (2001), 4549 ~ 4551}이 고지하고 있듯이, 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone을 포름알데히드와 함께 가열할 때 생성되는 3-methylene-1,2,4-[3H]naphthalenetrione을 다양한 올레핀 화합물과의 Diels-Alder 반응을 유도함으로써 비교적 쉽게 다양한 pyrano-o-naphthoquinone 유도체를 합성할 수 있음을 보고하고 있다. 이 방법은 황산 촉매 조건에서 lapachol 유도체의 고리화 반응을 유도하는 반응에 비해서 비교적 간단하게 다양한 형태의 pyrano-o-naphtho-quinone 유도체를 합성할 수 있는 장점이 있다.

제조방법 3: Radical 반응에 의한 Haloakylation 및 고리화 반응

크립토탄신온(Cryptotanshinone), 15,16-디히드로탄신온(15,16-Dihydro- tanshinone) 등의 합성에 이용되었던 방법 또한 furano-o-naphthoquinone 유도체를 합성하는데 편리하게 사용할 수 있다. 즉, A. C. Baillie 등(J. Chem. Soc. (C) 1968, 48 ~ 52)이 고지하고 있듯이, 3-halopropanoic acid 또는4-halobutanoic acid 유도체로부터 유도한 2-haloethyl 또는 3-haloethyl radical 화학종을? 2-hydroxy-1,4-naphthoquinone과 반응시킴으로 3-(2-haloethyl 또는 3-halopropyl)-2-hydroxy-1,4-naphthoquinone을 합성할 수 있는데, 이를 적절한 산성 촉매 조건에서 고리화 반응을 유도함으로써 다양한 pyrano-o-naphthoquinone 또는 furano-o-naphthoquinone 유도체를 합성할 수 있다.

제조방법 4: 4,5-Benzofurandione의 Diels-Alder 반응에 의한 고리화 반응

크립토탄신온(Cryptotanshinone), 15,16-디히드로탄신온(15,16-Dihydro- tanshinone) 등의 합성에 이용되었던 또 다른 방법으로는 J. K. Snyder 등(Tetrahedron Letters 28 (1987), 3427 ~ 3430)이 고지하고 있는 방법이 있다. 이 방법은 4,5-Benzofurandione 유도체와 다양한 디엔(diene) 유도체와의 Diels-Alder 반응에 의한 Cycloaddition을 유도함으로써 furano-o-naphthoquinone 유도체를 합성할 수 있다.

또한, 상기 방법들을 기초로 치환체의 종류에 따라 적절한 합성방법을 사용하여 다양한 유도체를 합성할 수 있는 바, 이들의 구체적인 예는 하기 표 1에서와 같다. 이들에 대한 구체적인 제조방법들은 이하 실시예에 기재되어 있다.

1	C₁₅H₁₄O₃	242.27	방법 1
2	C₁₅H₁₄O₃	242.27	방법 1
3	C₁₅H₁₄O₃	242.27	방법 1
4	C₁₄H₁₂O₃	228.24	방법 1
5	C₁₃H₁₀O₃	214.22	방법 1
6	C₁₂H₈O₃	200.19	방법 2
7	C₁₉H₁₄O₃	290.31	방법 1
8	C₁₉H₁₄O₃	290.31	방법 1
9	C₁₅H₁₂O₃	240.25	방법 1
10	C₁₆H₁₆O₄	272.30	방법 1
11	C₁₅H₁₂O₃	240.25	방법 1
12	C₁₆H₁₄O₃	254.28	방법 2
13	C₁₈H₁₈O₃	282.33	방법 2
14	C₂₁H₂₂O₃	322.40	방법 2
15	C₂₁H₂₂O₃	322.40	방법 2
16	C₁₄H₁₂O₃	228.24	방법 1
17	C₁₄H₁₂O₃	228.24	방법 1
18	C₁₄H₁₂O₃	228.24	방법 1
19	C₁₄H₁₂O₃	228.24	방법 1
20	C₂₀H₂₂O₃	310.39	방법 1
21	C₁₅H₁₃ClO₃	276.71	방법 1
22	C₁₆H₁₆O₃	256.30	방법 1
23	C₁₇H₁₈O₅	302.32	방법 1
24	C₁₆H₁₆O₃	256.30	방법 1
25	C₁₇H₁₈O₃	270.32	방법 1
26	C₂₀H₁₆O₃	304.34	방법 1
27	C₁₈H₁₈O₃	282.33	방법 1
28	C₁₇H₁₆O₃	268.31	방법 1
29	C₁₃H₈O₃	212.20	방법 1
30	C₁₃H₈O₃	212.20	방법 4
31	C₁₄H₁₀O₃	226.23	방법 4
32	C₁₄H₁₀O₃	226.23	방법 4

본 발명의 약제 조성물은, 예를 들어, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당제-제조, 분말화, 에멀젼화, 캡슐화, 트래핑과 또는 동결건조 과정들의 수단에 의해, 공지 방식으로 제조될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 사용을 위한 약제 조성물은, 약제학적으로 사용될 수 있는 제형으로의 활성 화합물의 처리를 용이하게 하는 부형제들 또는 보조제들을 포함하는 것으로 구성되어 있는 하나 또는 그 이상의 약리학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방법으로 제조될 수도 있다. 적합한 제형은 선택된 투여 루트에 따라 좌우된다. 공지 기술들, 담체 및 부형제들 중의 어느 것이라도 적합하게, 그리고 당해 분야, 예를 들어, 앞서 설명한 Remingston's Pharmaceutical Sciences에서 이해되는 바와 같이 사용될 수 있다. 본 발명에서는 화학식 1의 화합물을 목적하는 바에 따라 주사용 제제 및 경구용 제제 등으로 제형화될 수 있다.

주사를 위해서, 본 발명의 성분들은 액상 용액으로, 바람직하게는 Hank 용액, Ringer 용액, 또는 생리 식염수와 같은 약리학적으로 적합한 버퍼로 제형화 할 수 있다. 점막 투과 투여를 위해서, 통과할 배리어에 적합한 비침투성제가 제형에 사용된다. 그러한 비침투성제들은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.

경구 투여를 위해서, 화합물들은 당업계에 공지된 약리학적으로 허용되는 담체들을 활성 화합물들과 조합함으로써 용이하게 제형화할 수 있다. 이러한 담체들은 본 발명의 화합물들이 정제, 알약, 산제, 입제, 당제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화될 수 있도록 하여 준다. 바람직하게는 캅셀제, 정제, 환제, 산제 및 입제가 가능하고, 특히 캅셀제와 정제가 유용하다. 정제 및 환제는 장피제로 제조하는 것이 바람직하다. 경구 사용을 위한 약제 준비는 본 발명의 하나 또는 둘 이상의 화합물들과 하나 또는 둘 이상의 부형제를 혼합하고, 경우에 따라서는 이러한 혼합물을 분쇄하고, 필요하다면 적절한 보조제를 투과한 이후 과립의 혼합물을 처리하여 정제 또는 당체 코어를 얻을 수 있다. 적절한 부형제들은 락토스, 수크로즈, 만니톨, 또는 소르비톨과 같은 필러 옥수수 녹말, 밀 녹말, 쌀 녹말, 감자 녹말, 겔라틴, 검 트래거켄스, 메틸 셀룰로우즈, 히드록시프로필메틸-셀룰로우즈, 소듐 카르복시메틸 셀룰로우즈, 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)와 같은 셀룰루오즈계 물질 등이다. 필요하다면, 가교 폴리비닐 피롤리돈, 우뭇가사리, 또는 알긴산 또는 알긴산 나트륨과 같은 그것의 염 등의 디스인터그레이팅 에이전트와 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 결합제 등과 같은 담체가 첨가될 수도 있다.

경구에 사용될 수 있는 제약 준비물은, 젤라틴 및 글리콜 또는 소르비톨과 같은 가소제로 만들어진 부드러운 밀봉 캡슐뿐만 아니라, 겔라틴으로 만들어진 밀어 고정하는 캡슐을 포함할 수도 있다. 밀어 고정하는 캡슐은 락토오스와 같은 필러, 녹말과 같은 바인더, 및/또는 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 활제와의 혼합물로서, 활성 성분들을 포함할 수도 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물들은 지방산, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 용체에 용해 또는 분산될 수도 있다. 또한, 안정화제가 포함될 수도 있다. 경구 투여를 위한 모든 조제들은 그러한 투여에 적합한 함량으로 되어 있어야 한다.

화합물들은 주사에 의해, 예를 들어, 큰 환약 주사나 연속적인 주입에 의해 비경구 투입용으로도 제형화할 수 있다. 또한, 주사용 제형은 방부제를 부가한 앰플 또는 멀티-도스 용기로서 단위 용량 형태로 제공될 수도 있다. 조성물은 유성 또는 액상 비히클상의 현탁액, 용액, 에멀션과 같은 형태를 취할 수도 있으며, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형용 성분들을 포함할 수도 있다.

또한, 활성 성분은, 사용 전에 멸균 무 발열물질의 물과 같은 적절한 비히클와 구성을 위해 분말의 형태일 수도 있다.

본 발명에서 사용에 적합한 약제 조성물은 유효량의 활성성분들을 함유한 조성물을 포함한다. 더욱 구체적으로, 치료적 유효량은 치료될 객체의 생존을 연장하거나, 질환의 증상을 방지, 경감 또는 완화시키는데 유효한 화합물의 량을 의미한다. 치료적 유효량의 결정은, 특히, 여기에 제공된 상세한 개시 내용 측면에서, 당업자의 능력 범위 내에 있다.

단위 용량 형태로 제형화하는 경우, 활성성분으로서 화학식 1의 화합물은 약 0.1 내지 1,000 mg의 단위 용량으로 함유되는 것이 바람직하다. 화학식 1의 화합물의 투여량은 환자의 체중, 나이 및 질병의 특수한 성질과 심각성과 같은 요인에 따라 의사의 처방에 따른다. 그러나 성인 치료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 1 내지 1000 mg 범위 가 보통이다. 성인에게 근육내 또는 정맥내 투여시 일회 투여량으로 분리하여 하루에 보통 약 1 내지 500 mg의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다.

본 발명은 또한 항암제 부작용 질환 및/또는 위장 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 화학식 1의 화합물을 사용하는 방법을 제공한다. 상기 질환은 항암제 투여로 인한 신장 손상, 장관 손상 및 구토, 위산 분비를 동반하는 위궤양 및 에탄올에 의해 유발된 위궤양 등을 의미하며, 상기 질환 증후군의 “치료”란 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질환의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미하며, 상기 “예방”이란 발병 증상을 보이지는 않지만 그러한 위험성이 높은 객체에 사용될 때 발병 징후를 중단 또는 지연시키는 것을 의미한다.

본 발명을 이하 실시예 및 실험예들을 참조하여 상세히 설명하지만, 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 베타 라파촌(β-Lapachone)의 합성 (화합물 1)

2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone (17.4 g, 0.10M)을 DMSO (120 ㎖)에 녹이고, LiH (0.88 g, 0.11M)을 천천히 가한다. 이때, 수소가 발생하므로 주의를 요한다. 반응용액을 교반하면서 더 이상 수소가 발생하지 않는 것을 확인한 상태에서 30 분 더 교반시킨 다음, Prenyl bromide (1-Bromo-3-methyl-2-butene) (15.9 g, 0.10M)과 LiI (3.35 g, 0.025M)을 천천히 가하였다. 반응용액을 45℃까지 가열한 상태에서 12 시간 세차게 교반시켰다. 반응용액을 10℃ 이하로 냉각시킨 상태에서 먼저 얼음 (76 g)을 가하고 이어서 물(250 ㎖)을 가한 다음, 진한염산 (25 ㎖)을 천천히 가함으로써 용액을 PH>1의 산성으로 유지하였다. 반응 혼합물로 EtOAc (200 ㎖)을 가한 상태에서 세차게 교반시키면 EtOAc에 녹지 않는 하얀색 고체가 생성된다. 이들 고체는 여과하여 걸러낸 다음, EtOAc 층을 분리하였다. 물 층은 EtOAc (100 ㎖)을 사용하여 한 번 더 추출하여 앞서 추출한 유기층과 합쳤다. 유기층은 5% NaHCO₃(150 ㎖)로 씻은 다음, 유기층을 농축하였다. 농축물을 CH₂Cl₂(200 ㎖)에 녹이고 2N NaOH 수용액 (70 ㎖)로 세차게 흔들어서 분리하였다. CH₂Cl₂ 층을 2N NaOH 수용액(70 ㎖ x 2)으로 처리하여 두 번 더 분리하였다. 분리한 수용액을 합친 다음, 진한 염산을 사용하여 PH>2 이상의 산성으로 조정하면 고체가 생성된다. 이를 여과하여 분리함으로써 Lapachol을 얻었다. 여기서 얻은 Lapachol은 75% EtOH을 사용하여 재결정하였다. 이렇게 얻은 Lapachol을 황산 (80 ㎖)과 혼합한 상태에서 상온에서 10 분간 세차게 교반한 다음, 얼음 (200 g)을 가함으로써 반응을 종결하였다. 반응물로 CH₂Cl₂(60 ㎖)을 가한 다음 세차게 흔들어준 후에 CH₂Cl₂ 층을 분리하여 5% NaHCO₃으로 씻어 주었다. 물 층은 CH₂Cl₂(30 ㎖)를 사용하여 한번 더 추출하여 5% NaHCO₃으로 씻어 준 다음, 앞서 추출한 유기층과 합쳤다. 유기층을 MgSO₄를 사용하여 말린 다음, 농축함으로써 불순한 상태의 β-Lapachone을 얻었다. 이를 다시 이소프로판올을 사용하여 재결정함으로써 순수한 상태의 β-Lapachone (8.37 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.05 (1H, dd, J=1, 8Hz), 7.82 (1H, dd, J=1, 8 Hz), 7.64 (1H, dt, J=1, 8 Hz), 7.50 (1H, dt, J=1, 8 Hz), 2.57 (2H, t, J=6.5 Hz), 1.86 (2H, t, J=6.5 Hz) 1.47 (6H, s)

실시예 2: 듀니온(Dunnione)의 합성 (화합물 2)

실시예 1에서 Lapachol을 얻는 과정에서 EtOAc에서 녹지 않고 분리된 고체는 C-Alylation 물질인 Lapachol과는 달리 O-Akylation 된2-Prenyloxy-1,4-maphthoquinone이다. 이를 먼저 EtOAc를 사용하여 한번 더 재결정함으로써 깨끗이 정제하였다. 이렇게 정제한 고체 (3.65 g, 0.015M)를 톨루엔에 녹이고 5 시간 동안 톨루엔을 환류시킴으로써 Claisen Rearrangement를 유도하였다. 톨루엔을 감압 증류함으로써 농축시키고, 이를 더 이상의 정제 과정 없이 황산(15 ㎖)와 혼합한 상태에서 상온에서 10 분간 세차게 교반한 다음, 얼음 (100 g)을 가함으로써 반응을 종결하였다. 반응물로 CH₂Cl₂(50 ㎖)을 가한 다음 세차게 흔들어준 후에 CH₂Cl₂ 층을 분리하여 5% NaHCO₃으로 씻어 주었다. 물 층은 CH₂Cl₂(20 ㎖)를 사용하여 한번 더 추출하여 5% NaHCO₃으로 씻어 준 다음, 앞서 추출한 유기층과 합쳤다. 유기층을 MgSO₄를 사용하여 건조하여 농축한 다음, 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피함으로써 순순한 상태의 Dunnione (2.32 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.05 (1H, d, J=8Hz), 7.64 (2H, d, J=8Hz), 7.56 (1H, m), 4.67 (1H, q, J=7Hz), 1.47 (3H, d, J=7Hz), 1.45(3H, s) 1.27 (3H, s)

실시예 3: 알파 듀니온(α-Dunnione)의 합성 (화합물 3)

실시예 2에서 정제한 2-Prenyloxy-1,4-maphthoquinone (4.8 g, 0.020M)을 자일렌(Xylene)에 녹이고 15 시간 동안 자일렌을 환류시킴으로써 실시예 2 보다 훨씬 높은 온도 조건과 장시간 반응 조건에서 Claisen Rearrangement를 유도하였다. 이 과정에서 Claisen Rearrangement는 물론 두 개의 Methyl 기 중에서 하나가 이동한 Lapachol 유도체와 함께 고리화 반응까지 진행된 상태의 알파 듀니온(α-Dunnione)이 얻어진다. 자일렌을 감압 증류함으로써 농축한 다음 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피함으로써 순순한 상태의 알파 듀니욘 (α-Dunnione) (1.65 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ):? 8.06 (1H, d, J=8Hz), 7.64 (2H, m), 7.57 (1H, m), 3.21 (1H, q, J=7Hz), 1.53 (3H, s), 1.51(3H, s) 1.28 (3H, d, J=7Hz)

실시예 4: 화합물 4의 합성

2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone(17.4 g, 0.10M)을 DMSO(120 ㎖)에 녹이고, LiH(0.88 g, 0.11M)을 천천히 가하였다. 이때, 수소가 발생하므로 주의를 요하였다. 반응용액을 교반하면서 더 이상 수소가 발생하지 않는 것을 확인한 상태에서 30 분간 더 교반시킨 다음, Methallyl bromide(1-Bromo-2-methylpropene) (14.8 g, 0.11M)과 LiI (3.35 g, 0.025M)을 천천히 가하였다. 반응용액을 45℃까지 가열한 상태에서 12 시간 세차게 교반시켰다. 반응용액을 10℃ 이하로 냉각시킨 상태에서 먼저 얼음 (80 g)을 가하고 이어서 물 (250 ㎖)을 가한 다음, 진한염산 (25 ㎖)을 천천히 가함으로써 용액을 PH>1의 산성으로 유지하였다. 반응 혼합물로 CH₂Cl₂(200 ㎖)을 가하고 세차게 흔들어서 분리하였다. 물 층으로 CH₂Cl₂(70 ㎖)을 가하여 한 번 더 추출하여 앞서 분리한 유기층과 합쳤다. 이때, TLC에서 두 개의 물질이 새로 형성되어 있음을 확인할 수 있는데, 이들은 특별히 분리하지 않고 그대로 사용하였다. 유기층을 갑압 증류함으로써 농축한 다음, 이를 다시 자일렌에 녹인 상태에서 8 시간 환류시켰다. 이 과정에서 TLC 상에서의 두 물질은 하나로 합쳐져서 비교적 순수한 Lapachol 유도체를 얻었다. 이렇게 얻은 Lapachol 유도체를 황산 (80 ㎖)과 혼합한 상태에서 상온에서 10 분간 세차게 교반한 다음, 얼음 (200 g)을 가함으로써 반응을 종결하였다. 반응물로 CH₂Cl₂(80 ㎖)을 가한 다음 세차게 흔들어준 후에 CH₂Cl₂ 층을 분리하여 5% NaHCO₃으로 씻어 주었다. 물 층은 CH₂Cl₂(50 ㎖)를 사용하여 한번 더 추출하여 5% NaHCO₃으로 씻어 준 다음, 앞서 추출한 유기층과 합쳤다. 유기층을 MgSO₄를 사용하여 말린 다음, 농축함으로써 불순한 상태의 Lapachone 유도체(화합물 4)를 얻었다. 이를 다시 이소프로판올을 사용하여 재결정함으로써 순순한 상태의 화합물 4 (12.21 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.08 (1H, d, J=8Hz), 7.64 (2H, m), 7.57 (1H, m), 2.95 (2H, s), 1.61 (6H, s)

실시예 5: 화합물 5의 합성

실시예 4와 동일한 방법에 준하여 반응시키되 Methallyl bromide 대신에 Allyl bromide를 사용하여 화합물 5를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.07 (1H, d, J=7Hz), 7.65 (2H, m), 7.58 (1H, m), 5.27 (1H, m), 3.29 (1H, dd, J=10, 15Hz), 2.75(1H, dd, J=7, 15Hz), 1.59 (3H, d, J=6Hz)

실시예 6: 화합물 6의 합성

3-Chloropropionyl chloride (5.08 g, 40mM)을 에테르 (20 ㎖)에 녹이고 -78℃로 냉각시킨 상태에서 반응용액을 세차게 교반하면서 Sodium peroxide (Na₂O₂) (1.95 g, 25mM)을 천천히 가한 다음, 30 분간 더 세차게 교반시켰다. 반응용액을 0℃까지 가열한 상태에서 얼음 (7 g)을 가하고 10분간 더 교반시켰다. 유기층을 분리한 다음, 0℃의 차가운 물 (10 ㎖)로 한 번 더 씻어주고, 다시 0℃의 NaHCO₃ 수용액으로 씻어 주었다. 유기층을 분리하여 MgSO₄로 건조한 후에 0℃ 이하에서 감압 증류함으로써 농축함으로써 3-Chloropropionic peracid를 준비하였다.

2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone (1.74 g, 10mM)을 아세트산 (20 ㎖)에 녹이고, 앞서 준비한 3-Chloropropionic peracid를 상온에서 천천히 가하였다. 반응 혼합물을 교반하면서 2 시간 동안 환류시킨 후, 감압 증류함으로써 아세트산을 제거하였다. 이 농축물을 CH₂Cl₂(20 ㎖)에 녹이고 5% NaHCO₃ (20 ㎖)로 씻어 주었다. 물 층은 CH₂Cl₂(20 ㎖)를 사용하여 한번 더 추출하여 앞서 추출한 유기층과 합쳤다. 유기층을 MgSO₄를 사용하여 말린 다음, 농축함으로써 2-(2-Chloroethyl)-3-hydroxy-1,4-naphthoquinone과의 혼합물 상태로 화합물 6을 얻었다. 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피함으로써 순순한 상태의 Lapachone 유도체(화합물 6) (0.172 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.07 (1H, d, J=7.6Hz), 7.56 ~ 7.68 (3H, m), 4.89 (2H, t, J=9.2Hz), 3.17 (2H, t, J=9.2Hz)

실시예 7: 화합물 7의 합성

2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone (17.4 g, 0.10M)을 DMSO (120 ㎖)에 녹이고, LiH (0.88 g, 0.11M)을 천천히 가하였다. 이때, 수소가 발생하므로 주의를 요하였다. 반응용액을 교반하면서 더 이상 수소가 발생하지 않는 것을 확인한 상태에서 30 분간 더 교반시킨 다음, Cinnamyl bromide (3-phenylallyl bromide) (19.7 g, 0.10M)과 LiI (3.35 g, 0.025M)을 천천히 가하였다. 반응용액을 45℃까지 가열한 상태에서 12 시간 동안 세차게 교반시켰다. 반응용액을 10℃ 이하로 냉각시킨 상태에서 먼저 얼음 (80 g)을 가하고 이어서 물 (250 ㎖)을 가한 다음, 진한염산 (25 ㎖)을 천천히 가함으로써 용액을 PH>1의 산성으로 유지하였다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(200 ㎖)에 녹여서 세차게 흔들어서 분리하였다. 물 층은 폐수처리하고, CH₂Cl₂ 층은 2N NaOH 수용액 (100 ㎖× 2)으로 처리하여 물 층을 두 번 분리하였다. 이때, 2N NaOH 수용액으로 추출하고 남은 CH₂Cl₂ 층은 실시예 8에서 다시 사용하였다. 여기서 분리한 수용액을 합친 다음, 진한 염산을 사용하여 PH>2 이상의 산성으로 조정하면 고체가 생성된다. 이를 여과하여 분리함으로써 Lapachol 유도체를 얻었다. 여기서 얻은 Lapachol 유도체는 75% EtOH을 사용하여 재결정하였다. 이렇게 얻은 Lapachol 유도체를 황산 (50 ㎖)과 혼합한 상태에서 상온에서 10 분간 세차게 교반한 다음, 얼음 (150 g)을 가함으로써 반응을 종결하였다. 반응물로 CH₂Cl₂(60 ㎖)을 가한 다음 세차게 흔들어준 후에 CH₂Cl₂ 층을 분리하여 5% NaHCO₃으로 씻어 주었다. 물 층은 CH₂Cl₂(30 ㎖)를 사용하여 한번 더 추출하여 5% NaHCO₃으로 씻어 준 다음, 앞서 추출한 유기층과 합쳤다. 유기층을 농축한 다음, 이를 실리카겔에서 크로마토그래피함으로써 순수한 화합물 7 (2.31 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.09(1H, dd, J=1.2, 7.6Hz), 7.83 (1H, d, J=7.6Hz), 7.64 (1H, dt, J=1.2, 7.6Hz), 7.52 (1H, dt, J=1.2, 7.6Hz), 7.41 (5H, m), 5.27 (1H, dd, J=2.5, 6.0Hz), 2.77 (1H, m) 2.61 (1H, m), 2.34 (1H, m), 2.08 (1H, m), 0.87 (1H, m)

실시예 8: 화합물 8의 합성

실시예 7에서 2N NaOH 수용액으로 추출하고 남은 CH₂Cl₂ 층을 감압 증류하여 농축하였다. 이를 자일렌 (30 ㎖)에 녹인 다음, 10 시간 동안 환류시킴으로써 Claisen Rearrangement를 유도하였다. 자일렌을 감압 증류함으로써 농축시키고, 이를 더 이상의 정제 과정 없이 황산 (15 ㎖)와 혼합한 상태에서 상온에서 10 분간 세차게 교반한 다음, 얼음 (100 g)을 가함으로써 반응을 종결하였다. 반응물로 CH₂Cl₂(50 ㎖)을 가한 다음 세차게 흔들어준 후에 CH₂Cl₂층을 분리하여 5% NaHCO₃으로 씻어 주었다. 물 층은 CH₂Cl₂(20 ㎖)를 사용하여 한번 더 추출하여 5% NaHCO₃으로 씻어 준 다음, 앞서 추출한 유기층과 합쳤다. 유기층을 MgSO₄를 사용하여 건조하여 농축한 다음, 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피함으로써 순수한 화합물 8 (1.26 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ):? 8.12 (1H, dd, J=0.8, 8.0Hz), 7.74 (1H, dd, J=1.2, 7.6Hz), 7.70 (1H, dt, J=1.2, 7.6Hz), 7.62 (1H, dt, J=1.6, 7.6Hz), 7.27 (3H, m), 7.10 (2H, td, J=1.2, 6.4Hz), 5.38 (1H, qd, J=6.4, 9.2Hz), 4.61 (1H, d, J=9.2Hz), 1.17 (3H, d, J=6.4Hz)

실시예 9: 화합물 9의 합성

1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene (3.4 g, 22mM)과 2-Methyl-3-butyn-2-ol (1.26 g, 15mM)과 을 아세토니트릴 (10 ㎖)에 녹이고 0℃로 냉각시켰다. 반응용액을 교반시키면서 Trifluoroacetic anhydride (3.2 g, 15mM)을 천천히 가한 다음, 0℃에서 계속해서 교반시켰다. 또 다른 플라스크에 2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone (1.74 g, 10mM)과 Cupric chloride (CuCl₂) (135 mg, 1.0mM)을 아세토니트릴 (10 ㎖)에 녹이고 교반시켰다. 앞서 정제한 용액을 이 반응용액으로 천천히 가한 다음, 반응용액을 20 시간 동안 환류시켰다. 반응용액을 감압 증류하여 농축한 다음, 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피함으로써 순수한 화합물 9 (0.22 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.11 (1H, dd, J=1.2, 7.6Hz), 7.73 (1H, dd, J=1.2, 7.6Hz), 7.69 (1H, dt, J=1.2, 7.6Hz), 7.60 (1H, dt, J=1.6, 7.6Hz), 4.95 (1H, d, J=3.2Hz), 4.52 (1H, d, J=3.2Hz), 1.56 (6H, s)

실시예 10: 화합물 10의 합성

화합물 9 (0.12 g)를 MeOH (5 ㎖)에 녹인 다음, 5% 팔라듐 (5% Pd/C) (10㎎)을 넣고 상온에서 3 시간 동안 세차게 교반시켰다. 반응용액을 실리카겔을 사용하여 여과함으로써 5% 팔라듐 (5% Pd/C)을 제거한 다음, 감압 증류하여 농축함으로써 화합물 10을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.05 (1H, td, J=1.2, 7.6Hz), 7.64 (2H, m), 7.54 (1H, m), 3.48 (3H, s), 1.64 (3H, s), 1.42 (3H, s), 1.29 (3H, s)

실시예 11: 화합물 11의 합성

β-Lapachone (화합물 1) (1.21 g, 50mM)과 DDQ (2,3-Dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoqinone) (1.14 g, 50mM)을 사염화탄소 (50 ㎖)에 녹이고 72 시간 동안 환류시켰다. 반응용액을 감압 증류하여 농축한 다음, 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피함으로써 순수한 화합물 11 (1.18 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.08 (1H, dd, J=1.2, 7.6Hz), 7.85 (1H, dd, J=0.8, 7.6Hz), 7.68 (1H, dt, J=1.2, 7.6Hz), 7.55 (1H, dt, J=1.2, 7.6Hz), 6.63 (1H, d, J=10.0Hz), 5.56 (1H, d, J=10.0Hz), 1.57 (6H, s)

실시예 12: 화합물 12의 합성

2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone (1.74 g, 10mM), 2-Methyl-1,3-butadiene (Isoprene) (3.4 g, 50mM), paraformaldehyde (3.0 g, 100 mM)을 1,4-dioxane (20 ㎖)을 압력용기에 넣고 100℃에서 48 시간 동안 교반하면서 가열하였다. 반응용기를 상온으로 냉각시킨 다음, 압력 용기를 열고 내용물을 여과하였다. 여과액을 감압 증류하여 농축시킨 다음, 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피함으로써 β-Lapachone의 2-Vinyl 유도체인 화합물 12 (238㎎)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.07 (1H, dd, J=1.2, 7.6Hz), 7.88 (1H, dd, J=0.8, 7.6Hz), 7.66 (1H, dt, J=1.2, 7.6Hz), 7.52 (1H, dt, J=0.8, 7.6Hz), 5.87 (1H, dd, J=10.8, 17.2Hz), 5.18 (1H, d, J=10.8Hz), 5.17 (1H, 17.2Hz), 2.62 (1H, m), 2.38 (1H, m), 2.17 (3H, s), 2.00 (1H, m), 1.84 (1H, m)

실시예 13: 화합물 13의 합성

2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone (1.74 g, 10mM), 2,4-Dimethyl-1,3-pentadiene (4.8 g, 50mM), paraformaldehyde (3.0 g, 100mM)을 1,4-dioxane (20 ㎖)에 녹이고 10 시간 동안 세차게 교반하면서 환류 시켰다. 반응용기를 상온으로 냉각시킨 다음, 내용물을 여과함으로써 고체의 파라포름알데히드(paraformaldehyde)를 제거하였다. 여과액을 감압 증류하여 농축시킨 다음, 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피함으로써 β-Lapachone 유도체인 화합물 13 (428㎎)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.06 (1H, dd,J=1.2, 7.6Hz), 7.83 (1H, dd, J=0.8, 7.6Hz), 7.65 (1H, dt, J=1.2, 7.6Hz), 7.50 (1H, dt, J=0.8, 7.6Hz), 5.22 (1H, bs), 2.61 (1H, m), 2.48 (1H, m), 2.04 (1H, m), 1.80 (3H, d, J=1.0Hz), 1.75 (1H, m), 1.72 (1H, d, J=1.0Hz), 1.64 (3H, s)

실시예 14: 화합물 14의 합성

2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone (5.3 g, 30mM), 2,6-Dimethyl-2,4,6-octatriene (20.4 g, 150mM), paraformaldehyde (9.0 g, 300mM)을 1,4-dioxane (50 ㎖)에 녹이고 10 시간 동안 세차게 교반하면서 환류 시켰다. 반응용기를 상온으로 냉각시킨 다음, 내용물을 여과함으로써 고체의 paraformaldehyde를 제거하였다. 여과액을 감압 증류하여 농축시킨 다음, 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피함으로써 β-Lapachone 유도체인 화합물 14 (1.18 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.07 (1H, dd, J=1.2, 7.6Hz), 7.87 (1H, dd, J=0.8, 7.6Hz), 7.66 (1H, dt, J=1.2, 7.6Hz), 7.51 (1H, dt, J=0.8, 7.6Hz), 6.37 (1H, dd, J=11.2, 15.2Hz), 5.80 (1H, broad d, J=11.2Hz), 5.59 (1H, d, J=15.2Hz), 2.67 (1H, dd, J=4.8, 17.2Hz), 2.10 (1H, dd, J=6.0, 17.2Hz), 1.97 (1H, m), 1.75 (3H, bs), 1.64 (3H, bs), 1.63 (3H, s), 1.08 (3H, d, J=6.8Hz)

실시예 15: 화합물 15의 합성

2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone (5.3 g, 30mM), Terpinen (20.4 g, 50mM), paraformaldehyde (9.0 g, 300mM)을 1,4-dioxane (50 ㎖)에 녹이고 10 시간 동안 세차게 교반하면서 환류 시켰다. 반응용기를 상온으로 냉각시킨 다음, 내용물을 여과함으로써 고체의 paraformaldehyde를 제거하였다. 여과액을 감압 증류하여 농축시킨 다음, 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피함으로써 Tetracyclic o-quinone 유도체인 화합물 15 (1.12 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.06 (1H, d, J=7.6Hz), 7.85 (1H, d, J=7.6Hz), 7.65 (1H, t, J=7.6Hz), 7.51 (1H, t, J=7.6Hz), 5.48 (1H, broad s), 4.60 (1H, broad s), 2.45 (1H, d, J=16.8Hz), 2.21 (1H, m), 2.20 (1H, d, J=16.8Hz), 2.09 (1H, m), 1.77 (1H, m), 1.57 (1H, m), 1.07 (3H, s), 1.03 (3H, d, J=0.8Hz), 1.01 (3H, d, J=0.8Hz), 0.96 (1H, m)

실시예 16: 화합물 16과 화합물 17의 합성

2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone (17.4 g, 0.10M)을 DMSO(120 ㎖)에 녹이고, LiH (0.88 g, 0.11M)을 천천히 가하였다. 이때, 수소가 발생하므로 주의를 요한다. 반응용액을 교반하면서 더 이상 수소가 발생하지 않는 것을 확인한 상태에서 30분간 더 교반시킨 다음, Crotyl bromide (16.3 g, 0.12M)과 LiI (3.35 g, 0.025M)을 천천히 가하였다. 반응용액을 45℃까지 가열한 상태에서 12 시간 세차게 교반시켰다. 반응용액을 10℃ 이하로 냉각시킨 상태에서 먼저 얼음 (80 g)을 가하고 이어서 물 (250 ㎖)을 가한 다음, 진한염산 (25 ㎖)을 천천히 가함으로써 용액을 PH>1의 산성으로 유지하였다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂(200 ㎖)에 녹여서 세차게 흔들어서 분리하였다. 물 층은 폐수처리하고, CH₂Cl₂ 층은 2N NaOH 수용액 (100 ㎖× 2)으로 처리하여 물 층을 두 번 분리하였다. 이때, 2N NaOH 수용액으로 추출하고 남은 CH₂Cl₂ 층은 실시예 17에서 사용하였다. 여기서 분리한 수용액을 합친 다음, 진한 염산을 사용하여 PH>2 이상의 산성으로 조정하면 고체가 생성된다. 이를 여과하여 분리함으로써 Lapachol 유도체를 얻었다. 여기서 얻은 Lapachol 유도체는 75% EtOH을 사용하여 재결정하였다. 이렇게 얻은 Lapachol 유도체를 황산 (50 ㎖)과 혼합한 상태에서 상온에서 10 분간 세차게 교반한 다음, 얼음 (150 g)을 가함으로써 반응을 종결하였다. 반응물로 CH₂Cl₂ (60 ㎖)을 가한 다음 세차게 흔들어준 후에 CH₂Cl₂ 층을 분리하여 5% NaHCO₃으로 씻어 주었다. 물 층은 CH₂Cl₂(30 ㎖)를 사용하여 한번 더 추출하여 5% NaHCO₃으로 씻어 준 다음, 앞서 추출한 유기층과 합쳤다. 유기층을 농축한 다음, 이를 실리카겔에서 크로마토그래피함으로써 순수한 화합물 16 (1.78 g)과 화합물 17 (0.43 g)을 얻었다.

화합물 16의 ¹H-NMR (CDCl₃, δ): δ8.07 (1H, dd, J=0.8, 6.8Hz), 7.64 (2H, broad d, J=3.6Hz), 7.57 (1H, m), 5.17 (1H, qd, J=6.0, 8.8Hz), 3.53 (1H, qd, J=6.8, 8.8Hz), 1.54 (3H, d, 6.8Hz), 1.23 (3H, d, 6.8Hz)

화합물 17의 ¹H-NMR (CDCl₃, δ): δ8.06 (1H, d, J=0.8, 7.2Hz), 7.65 (2H, broad d, J=3.6Hz), 7.57 (1H, m), 4.71 (1H, quintet, J=6.4Hz), 3.16 (1H, quintet, J=6.4Hz), 1.54 (3H, d, 6.4Hz), 1.38 (3H, d, 6.4Hz)

실시예 17: 화합물 18과 화합물 19의 합성

실시예 16에서 2N NaOH 수용액으로 추출하고 남은 CH₂Cl₂ 층을 감압 증류하여 농축하였다. 이를 자일렌 (30 ㎖)에 녹인 다음, 10 시간 동안 환류시킴으로써 Claisen Rearrangement를 유도하였다. 자일렌을 감압 증류함으로써 농축시키고, 이를 더 이상의 정제 과정 없이 황산(15 ㎖)와 혼합한 상태에서 상온에서 10 분간 세차게 교반한 다음, 얼음 (100 g)을 가함으로써 반응을 종결하였다. 반응물로 CH₂Cl₂ (50 ㎖)을 가한 다음 세차게 흔들어준 후에 CH₂Cl₂ 층을 분리하여 5% NaHCO₃으로 씻어 주었다. 물 층은 CH₂Cl₂(20 ㎖)를 사용하여 한번 더 추출하여 5% NaHCO₃으로 씻어 준 다음, 앞서 추출한 유기층과 합쳤다. 유기층을 MgSO₄를 사용하여 건조하여 농축한 다음, 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피함으로써 순수한 화합물 18 (0.62 g)과 화합물 19 (0.43 g)을 얻었다.

화합물 18의 ¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.06 (1H, dd, J=0.8, 7.2Hz), 7.81 (1H, dd, J=0.8, 7.6Hz), 7.65 (1H, dt, J=0.8, 7.6Hz), 7.51 (1H, dt, J=0.8, 7.2Hz), 4.40 (1H, m), 2.71 (1H, m), 2.46 (1H, m), 2.11 (1H, m), 1.71 (1H, m), 1.54 (3H, d, 6.4Hz), 1.52 (1H, m)

화합물 19의 ¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.08 (1H, d, J=0.8, 7.2Hz), 7.66 (2H, broad d, J=4.0Hz), 7.58 (1H, m), 5.08 (1H, m), 3.23 (1H, dd, J=9.6, 15.2Hz), 2.80 (1H, dd, J=7.2, 15.2Hz), 1.92 (1H, m), 1.82 (1H, m), 1.09 (3H, t, 7.6Hz)

실시예 18: 화합물 20의 합성

2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone (17.4 g, 0.10M)을 DMSO (120 ㎖)에 녹이고, LiH (0.88 g, 0.11M)을 천천히 가하였다. 이때, 수소가 발생하므로 주의를 요한다. 반응용액을 교반하면서 더 이상 수소가 발생하지 않는 것을 확인한 상태에서 30분간 더 교반시킨 다음, Geranyl bromide (21.8 g, 0.10M)과 LiI (3.35 g, 0.025M)을 천천히 가하였다. 반응용액을 45℃까지 가열한 상태에서 12 시간 세차게 교반시켰다. 반응용액을 10℃ 이하로 냉각시킨 상태에서 먼저 얼음 (80 g)을 가하고 이어서 물 (250 ㎖)을 가한 다음, 진한염산 (25 ㎖)을 천천히 가함으로써 용액을 PH>1의 산성으로 유지하였다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂ (200 ㎖)에 녹여서 세차게 흔들어서 분리하였다. 물 층은 폐수처리하고, CH₂Cl₂ 층은 2N NaOH 수용액 (100 ㎖× 2)으로 처리하여 물 층을 두 번 분리하였다. 여기서 분리한 수용액을 합친 다음, 진한 염산을 사용하여 PH>2 이상의 산성으로 조정하면 고체가 생성된다. 이를 여과하여 분리함으로써 2-Geranyl-3-hydroxy-1,4-naphthoquinone을 얻었다. 이를 더 이상 정제 과정 없이 황산(50 ㎖)과 혼합한 상태에서 상온에서 10 분간 세차게 교반한 다음, 얼음 (150 g)을 가함으로써 반응을 종결하였다. 반응물로 CH₂Cl₂ (60 ㎖)을 가한 다음 세차게 흔들어준 후에 CH₂Cl₂ 층을 분리하여 5% NaHCO₃으로 씻어 주었다. 물 층은 CH₂Cl₂(30 ㎖)를 사용하여 한번 더 추출하여 5% NaHCO₃으로 씻어 준 다음, 앞서 추출한 유기층과 합쳤다. 유기층을 농축한 다음, 이를 실리카겔에서 크로마토그래피함으로써 순수한 화합물 20 (3.62 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.05 (1H, d, J=7.6Hz), 7.77 (1H, d, J=7.6Hz), 7.63 (1H, t, J=7.6Hz), 7.49 (1H, t, J=7.6Hz), 2.71 (1H, dd, J=6.0, 17.2Hz), 2.19 (1H, dd, J=12.8, 17.2Hz), 2.13 (1H, m), 1.73 (2H, m), 1.63 (1H, dd, J=6.0, 12.8Hz), 1.59 (1H, m), 1.57 (1H, m), 1.52 (1H, m), 1.33 (3H, s), 1.04 (3H, s), 0.93 (3H, s)

실시예 19: 화합물 21의 합성

실시예 1와 같은 방법에 준하여 2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone 대신 6-Chloro-2-hydroxy-1,4-naphthoquinone 을 사용하여 화합물 21를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.02 (1H, d, J=8Hz), 7.77 (1H, d, J=2Hz), 7.50 (1H, dd, J=2, 8Hz), 2.60 (2H, t, J=7Hz), 1.87(2H, t, J=7Hz) 1.53 (6H, s)

실시예 20: 화합물 22의 합성

실시예 1와 같은 방법에 준하여 2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone 대신 2-Hydroxy-6-methyl-1,4-naphthoquinone 을 사용하여 화합물 22를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7.98 (1H, d, J=8Hz), 7.61 (1H, d, J=2Hz), 7.31 (1H, dd, J=2, 8Hz), 2.58 (2H, t, J=7Hz), 1.84(2H, t, J=7Hz) 1.48 (6H, s)

실시예 21: 화합물 23의 합성

실시예 1와 같은 방법에 준하여 2-Hydroxy-1,4-naphthoquinone 대신 6,7-Dimethoxy-2-hydroxy-1,4-naphthoquinone 을 사용하여 화합물 23를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7.56 (1H, s), 7.25 (1H, s), 3.98 (6H, s), 2.53 (2H, t, J=7Hz), 1.83(2H, t, J=7Hz) 1.48 (6H, s)

실시예 22: 화합물 24의 합성

실시예 1와 같은 방법에 준하여 1-Bromo-3-methyl-2-butene 대신 1-Bromo-3-methyl-2-pentene 을 사용하여 화합물 24를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7.30~8.15 (4H, m), 2.55 (2H, t, J=7Hz), 1.83(2H, t, J=7Hz), 1.80(2H, q, 7Hz) 1.40 (3H, s), 1.03(3H, t, J=7Hz)

실시예 23: 화합물 25의 합성

실시예 1와 같은 방법에 준하여 1-Bromo-3-methyl-2-butene 대신 1-Bromo-3-ethyl-2-pentene 을 사용하여 화합물 25를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7.30~8.15 (4H, m), 2.53 (2H, t, J=7Hz), 1.83(2H, t, J=7Hz), 1.80(4H, q, 7Hz) 0.97(6H, t, J=7Hz)

실시예 24: 화합물 26의 합성

실시예 1와 같은 방법에 준하여 1-Bromo-3-methyl-2-butene 대신 1-Bromo-3-phenyl-2-butene 을 사용하여 화합물 26을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7.15~8.15 (9H, m), 1.90~2.75 (4H, m), 1.77 (3H, s)

실시예 25: 화합물 27의 합성

실시예 1와 같은 방법에 준하여 1-Bromo-3-methyl-2-butene 대신 2-Bromo-ethylidenecyclohexane 을 사용하여 화합물 27을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7.30~8.25 (4H, m), 2.59 (2H, t, J=7Hz), 1.35~2.15 (12H, m)

실시예 26: 화합물 28의 합성

실시예 1와 동일한 방법에 준하여 반응시키되 1-Bromo-3-methyl-2-butene 대신에 2-Bromo-ethylidenecyclopentane을 사용하여 화합물 28를 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7.28~8.20 (4H, m), 2.59 (2H, t, J=7Hz), 1.40~2.20 (10H, m)

실시예 27: 화합물 29의 합성

실시예 5에서 합성한 화합물 5 (8.58 g, 20mM)을 사염화탄소 (1000 ㎖)에 녹이고 2,3-Dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoqinone (11.4 g, 50mM)을 놓고 96 시간 동안 환류시켰다. 반응용액을 감압 증류하여 농축한 다음, 붉은 색의 고체를 이소프로판올을 사용하여 재결정하여 순수한 화합물 29(7.18 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.05 (1H, dd, J=1.2, 7.6Hz), 7.66 (1H, dd, J=1.2, 7.6Hz), 7.62 (1H, dt, J=1.2, 7.6Hz), 7.42 (1H, dt, J=1.2, 7.6Hz), 6.45 (1H, q, J=1.2Hz), 2.43 (3H, d, J=1.2Hz)

실시예 28: 화합물 30의 합성

{J. Org. Chem., 55 (1990) 4995~5008}에서 제시하고 있는 합성방법에 준하여 p-Benzoquinone과 1-(N-morpholine)propene을 사용하여 4,5-Dihydro-3-methylbenzo[1,2-b]furan-4,5-dione {Benzofuran-4,5-dione}을 합성하였다. 이렇게 준비한 Benzofuran-4,5-dione (1.5 g, 9.3mM)과 1-Acetoxy-1,3-butadiene (3.15 g, 28.2mM)을 벤젠(200 ㎖)에 녹이고 12 시간 동안 환류 시켰다. 반응 용액을 상온으로 냉각시킨 다음 감압 증류함으로써 농축시켰다. 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피하여 순수한 화합물 30 (1.13 g)을 얻었다.

¹H-NMR (CDCl₃, δ): 8.05 (1H, dd, J=1.2, 7.6Hz), 7.68 (1H, dd, J=1.2, 7.6Hz), 7.64 (1H, td, J=1.2, 7.6Hz), 7.43 (1H, td, J=1.2, 7.6Hz), 7.26 (1H, q, J=1.2Hz), 2.28 (3H, d, J=1.2Hz)

실시예 29: 화합물 31과 화합물 32의 합성

실시예 28의 4,5-Dihydro-3-methylbenzo[1,2-b]furan-4,5-dione {Benzofuran-4,5-dione} (1.5 g, 9.3mM)과 2-Methyl-1,3-butadiene (45 g, 0.6M)을 벤젠 (200 ㎖)에 녹이고 5 시간 동안 환류 시켰다. 반응 용액을 냉각시킨 다음 감암 증류함으로써 철저하게 농축시켰다. 이를 다시 사염화탄소 (150 ㎖)에 녹이고, 2,3-Dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzoqinone (2.3 g, 10mM)을 추가한 후에 15 시간 더 환류 시켰다. 반응 용액을 냉각시킨 상태에서 감압 증류하여 농축시켰다. 이를 실리카겔을 사용하여 크로마토그래피하여 순수한 화합물 23 (0.13 g)과 화합물 24 (0.11 g)을 얻었다.

화합물 31의 ¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7.86 (1H, s), 7.57 (1H, d, J=8.1Hz), 7.42 (1H, d, J=8.1Hz), 7.21 (1H, q, J=1.2Hz), 2.40 (3H, s), 2.28 (1H, d, J=1.2Hz)

화합물 32의 ¹H-NMR (CDCl₃, δ): δ7.96 (1H, d, J=8.0Hz), 7.48 (1H, s), 7.23 (2H, m), 2.46 (3H, s), 2.28 (1H, d, J=1.2Hz)

실험예 1: 실험동물의 준비(I)

본 실험에는 8주령의 C57BL/6 쥐를 사용하였다. 실험에 사용한 모든 쥐들은 항온(22 ~ 26℃) 및 항습(55 ~ 60%)이 되는 무균 동물실에서 사육하였다. 실험군은 3일 동안 사육한 마우스에 인산완충식염수(phosphate-buffered saline; PBS)만을 주사한 군(control), 시스플라틴을 20 mg/kg mouse weight(이하 mg/kg)의 농도로 복강에 주사한 군(CDDP)과 시스플라틴과 화합물 1을 10, 20, 40 mg/kg로 구강투여한 군(CDDP+βL) 및 화합물 1만을 단독으로 구강투여한 군(βL)으로하여 실험을 진행하였다.

실험예 2: 시스플라틴 처리 시간에 따른 조직 손상 변화

시스플라틴을 20mg/kg의 농도로 복강 주사 후 H＆E 염색을 통하여 날짜 변화에 따른 신장손상 정도를 관찰하였다.

도 1을 참조하면, 시스플라틴 주사후 2일째 까지는 사구체 및 관류조직에 어떠한 변화나 손상이 나타나지 않았다.

그러나, 3일째 되는 조직에서는 사구체는 정상적으로 보이는 반면, 관류조직에서 세포들의 사멸에 의한 특이적인 손상을 확인하였다(CDDP-D3의 화살표 참조)

실험예 3: 화합물 1(β-lapachone, βL)의 신장 손상 보호 효과

화합물 매일 복강투여를 하였고, 시스플라틴은 20 mg/kg으로 복강주사후 3일 후에 신장 조직을 적출하여 조직 분석을 수행하였다.

도 2에서 시스플라틴 단독군은 관류조직을 구성하는 세포들의 사멸로 확연한 손상을 보였다. 반면에, 화합물 1을 함께 처리한 군에서는 거의 손상을 확인할 수 없었으며, 단독군은 무처리군과 같은 정상적인 조직이 관찰되었다.

실험예 4: 신장 관류조직의 구조적 변화 조사

조직 내에 존재하는 글리코겐(glycogen)과 같은 다당체나 당단백질 및 당지질을 검출하여 조직의 정상유무를 확인하는 PAS 분석법으로 신장 조직 손상 정도를 비교하였다.

도 3을 참조하면, 무처리군이나 약물 단독군은 정상적인 관류조직이 관찰되었으나, 시스플라틴이 처리된 조직은 조직세포의 사멸에 의해 파괴된 구조가 관찰되었으며, 이러한 손상 조직은 화합물 1을 함께 처리시 억제되는 효과를 발휘함을 알 수 있었다.

실험예 5: 생화학적 표적분자에 대한 화합물 1의 영향 조사

시스플라틴에 의해서 유도되는 다양한 생화학적 표적분자의 변화에 대한 화합물 1의 영향을 조사하기 위하여 혈액의 혈청내 크레아티닌과 요소를 분석하여 비교하였다.

도 4를 참조하면, 시스플라틴 단독 처리시, 크레아티닌과 요소의 농도가 증가하는 반면에, 화합물 1과 함께 처리 시, 농도의 감소를 확인할 수 있었다.

실험예 6: 화합물 1에 의한 NAD+/NADH 비율의 변화(I)

화합물 1은 NQO1 (NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1) 효소의 활성을 증가시켜 세포내 NAD+/NADH 비율을 높이는 물질로 알려져 있으며, 고혈압, 당뇨, 혈관재협착, 고염식 유도 신장독성 등 다양한 질환모델에서 효과적인 물질로 밝혀지고 있다. 본 발명에서도 시스플라틴 신장 손상 동물모델에서 화합물 1에 의한 NQO1효소 활성의 증가를 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하면, 시스플라틴은 신장조직 내 전체적인 NAD+/NADH ratio를 감소시키고, 상기 변화는 화합물 1에 의해 어느 정도 회복되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7: 화합물 1 처리에 의한 NAD+/NADH ratio의 변화(II)

NAD+는 다양한 효소들의 기질로 이용되는 것으로 알려져 있으며, 특히, 노화 및 장수와 관련된 Sirt 단백질들의 기질로 세포내 다양한 단백질들의 posttranslational modification (번역 후 변형) 중의 하나인 아세틸화 반응을 조절하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 핵에서 Sirt1 효소의 표적 단백질인 p65 및 미토콘드리아에서 Sirt3 효소의 표적 단백질인 p53의 아세틸화를 조사하여 도 6 내지 도 9에 나타내었다.

도 6 내지 도 9를 참조하면, 시스플라틴에 의해 Sirt1 및 Sirt3 단백질의 발현이 증가하였으며, 이것은 adaptive response로서 세포가 시스플라틴에 의해 손상을 극복하기 위한 반응의 하나로 판단된다. 이러한 발현 변화는 시스플라틴에 의해 활성화 될 수 있는 다양한 전사 인자의 영향에 의한 것으로 보이며, 이러한 발현의 증가는 화합물 1에 의해 완전하게 조절되는 것을 확인할 수 있다.

또한, 각각 Sirt1 및 Sirt3의 표적 단백질인 p65 및 p53의 아세틸화는 시스플라틴 처리군에서 현저하게 증가하였다가 화합물 1 처리군에서는 현저한 감소가 확인된 바, 이러한 변화의 원인은 화합물 1에 의한 NQO1의 활성화로 세포내 NAD+/NADH 비율이 증가하고, 기질의 증가로 활성이 높아진 Sirt1 및 Sirt3의 작용으로 아세틸화 반응이 조절된 것으로 판단되며, 시스플라틴 처리군에서 p65 및 p53 단백질의 아세틸화 원인은, 탈아세틸화 효소의 발현은 증가하였지만, 기질은 NAD+의 양이 작기 때문인 것으로 사료된다.

실험예 8: 화합물 1 처리에 의한 염증 반응 매개인자의 vicious cycle의 변화(I)

시스플라틴에 의한 신장 손장의 대표적 매개인자인 염증반응에 의한 염증성 사이토카인, TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1β(interleukim-1β) 및 IL-6(interleukim-6)의 혈청과 urine에 존재하는 양을 ELISA 방법으로 분석하였으며, 그 결과는 도 10에 나타내었다.

도 10을 참조하면, 시스플라틴은 혈청과 urine에 존재하는 염증성 사이토카인의 증가를 유도하고, 화합물 1은 이러한 사이토카인의 증가를 농도 의존적으로 억제시키는 효과를 확인할 수 있다.

또한, 도 11을 참조하면, 신장조직 내에서도 동일하게 다양한 염증성 사이토카인들의 발현이 화합물 1에 의하여 현저하게 억제되는 현상을 확인할 수 있다.

실험예 9: 화합물 1 처리에 의한 염증 반응 매개인자의 vicious cycle의 변화(II)

시스플라틴에 의해 유도된 신장 독성은 활성산소종의 증가, DNA adduct 생성, 미토콘드리아 기능이상 및 염증반응의 경로를 통하여 나타나는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 대표적인 염증 반응 유도 전사인자인 NF-kB의 활성화와 관련 있는 NF-kB subunit인 p65의 발현을 관찰하였으며, 그 결과는 도 12에 나타낸 바와 같이 시스플라틴에 의해 p65의 신장 조직내 발현 증가가 화합물 1에 의해 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있다.

실험예 10: 화합물 1 처리에 의한 염증 반응 매개인자의 vicious cycle의 변화(III)

상기에 언급한대로, 시스플라틴 독성에 의한 매개인자의 하나로 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이 잘 알려져 있으며, 활성산소종의 생성 메커니즘가운데 미토콘드리아 및 세포막에서 NADPH oxidase (NOX)의 관련 단백질이 대표적이다. 실제적으로 시스플라틴에 의해 생성되는 활성산소종의 양은 디클로로 플루오렛신디아 디아세테이트 (dichlorofluroescein diacetate, DCFH-DA) 등과 같은 활성산소종 반응 형광물질로 분석할 수 있으며, 본 발명에서는 활성산소종 생성에 대표적인 관련 단백질 NOX 1 및 NOX 4단백질의 발현을 신장 조직에서 면역조직화학법으로 분석한 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.

도 13 및 도 14를 참조하면, 시스플라틴 처리에 의하여 신장의 여러 조직, 특히 손상된 관류 조직 부분에서 NOX 1 및 NOX 4 단백질 발현의 현저한 증가를 확인할 수 있었으며, 상기 증가효과는 화합물 1에 의해 유효하게 억제됨을 알 수 있다.

실험예 11: 화합물 1 처리에 의한 염증 반응 매개인자의 vicious cycle의 변화(IV)

면역 반응에서 중요한 외부 항원 물질들(pathogen-associated molecular patterns : PAMPs)의 수용체 중의 하나인 TLRs (toll-like receptors)는 세포 손상시 발생되는 여러 손상 유도 세포내 물질(damage-associated molecular patterns : DAMPs)을 인식하는 수용체 중의 하나이다.

따라서, 본 발명에서는 시스플라틴과 화합물 1에 의한 TLR4분자의 발현 패턴을 관찰하여 도 15에 나타내었다.

도 15를 참조하면, 시스플라틴에 의해 조직내 TLR4발현이 증가됨이 관찰되었으며, 상기 변화는 화합물 1에 의해 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.

실험예 12: 화합물 1 처리에 의한 신장 조직으로 침유되는 면역세포 유도 염증반응 변화

시스플라틴에 의해 유도된 신장 독성은 염증반응 과정에서 생성되는 다양한 케모카인(chemokines), MCP-1 (monocyte chemoattractant pretein-1) 및 ICAM-1 (intracellular adhesion molecule 1) 등에 의해 신장 조직으로 침유되는 다양한 면역세포 유도 염증 반응에 의해 조직 손상이 증가된다. 이러한 면역세포들의 침윤은 다양한 세포 특이적 인자들 (CD11b, F4/80 등)과 신장조직세포에서 발현되는 MCP-1 및 ICAM-1 등의 발현 분석으로부터 확인할 수 있으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16을 참조하면, 시스플라틴이 처리된 신장 조직은 조직에서 전체적으로 MCP-1 단백질의 발현이 증가됨이 관찰되었으며, 상기 변화는 화합물 1 전처리에 의해 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.

실험예 13: 시스플라틴에 의해 유발된 화합물 2의 장관 독성 억제 효능

a)체중변화

매일 5ml/kg의 용매(1% CMC)를 경구로 투여하면서 4일간(4 내지 7일) 3.5 mg/kg의 시스플라틴을 복강 내로 투여한 후 동물의 체중은 10일(시스플라틴 마지막 투여 후 3일)째에 23.9%의 감소를 보임을 도 17에 나타내었다. 하지만 이때 정상동물의 체중이 시험개시 시점(24.17g)에 비해 약 26.97g 증가했기 때문에 실제로 대조군에 비해 31.8% 낮은 체중을 나타내었다. 이에 비해 항암제 투여 전 3일간의 화합물 2 (10-59 mg/kg)의 투여는 동물의 체중을 약간 증가시키는 경향을 나타내었으며, 이러한 효과가 시스플라틴 투여 후에는 더 증가하여 10일째 부검 전에는 시스플라틴 단독투여군에 비해 1.8 - 3g의 높은 체중을 보였다.

b)장기중량

표 2를 참조하면, 3.5 mg/kg의 시스플라틴을 4일간 투여하고 3일이 지난 후의 장기 중량에 있어서 콩팥의 절대 중량이 정상동물에 비해 약간 감소하였지만, 체중이 대조군에 비해 31.8 % 감소함으로써 상대 중량은 오히려 증가함을 표 2에서 확인할 수 있다. 반면에, 간의 절대 중량은 정상동물의 61.0% 수준으로 감소하였으며, 체중이 크게 감소했음에도 의미있게 낮은 상대 중량을 나타내었다. 특히 면역 장기의 중량 감소가 뚜렸했는데, 흉선 및 비장의 절대 중량은 각각 정상동물의 18.5 %와 36.1 % 수준으로 크게 감소하였다. 특히 이들 장기의 상대중량 역시 체중감소를 감안하더라도 흉선은 약 1/4, 비장은 약 1/2 수준을 나타내었다.

시스플라틴에 의한 신장 상대중량의 증가는 모든 용량(5-50mg/kg)의 화합물 2 투여에 의해 개선되는 경향을 나타내었으며, 감소한 흉선과 비장의 중량은 화합물 2에 의해 상당히 개선되었다.

[표 2]

c)조직병리학적 검사

도 18을 참조하면, 소장에 대한 조직병리학적 검사결과, 정상동물에서는 융모와 선와에 이상소견이 관찰되지 않음을 알 수 있다. 반면, 시스플라틴 단독투여군에서는 소장 융모의 변성 및 심한 위축 소견이 관찰되었다. 그럼에도 불구하고 선와에 대한 영향은 크지 않은 것으로 확인되었다. 이에 비해 화합물 2를 투여한 군에서는 소장 융모의 변성과 위축이 용량의존적으로 개선되었는 바, 5 및 10mg/kg에서는 상대적으로 효과가 적었지만 25mg/kg에서는 상당한 효과가 발휘되었으며, 특히 50mg/kg에서는 거의 정상조직에 가까운 정도로 회복되었다.

이러한 소장의 손상 정도를 정량하기 위해 융모 길이와 선와 깊이를 측정한 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3을 참조하면 정상대조군의 융모 길이는 604.0 ± 11.40 μm, 선와 깊이는 117.4 ± 2.30 μm로 융모/선와 비율이 5.14 ± 0.22μm로 관찰되었다. 반면에, 3.5 mg/kg의 시스플라틴만을 투여한 군에서의 선와 길이는 115.6 ± 1.34 μm로 정상대조군에 비해 약간 감소한 반면 융모 길이가 306.0 ± 27.02 μm로 유의하게 감소함으로써 융모/선와 비율이 2.65 ± 0.20 μm로 대조군에 비해 48.4 % 줄어들었다. 이에 비해 화합물 2를 투여했을 때는 시스플라틴 투여로 인해 감소했던 선와 깊이가 회복되었으며, 특히 위축되었던 융모가 효과적으로 보호됨으로써 융모/선와 비율이 모든 용량에서 유의하게 개선되었다. 즉, 융모/선와 비율이 화합물 2에 의해 용량의존적으로 증가하였으며, 25 mg/kg에서는 정상대조군의 약 80% 수준으로 개선되었으며, 50 mg/kg의 고용량에서는 정상수준으로 회복되었다.

[표 3]

(* 및 ^# 는 대조군과 상당한 차이를 보임(P<0.05))

또한, 간에 대한 조직병리학적 검사결과 정상대조군에서는 도 19에 나타낸 바와 같이 특이병변이 관찰되지 않았다. 반면, 시스플라틴만을 단독 투여한 군에서는 일부의 동물에서 간세포의 변성이 관찰되거나, 염증세포의 침윤이 확인되었다. 이에 비해 모든 용량(5-50 mg/kg)의 화합물 2를 투여한 군에서는 이상 소견이 관찰되지 않았다.

또한, 흉선 및 비장으로 림프구를 공급함은 물론 모든 혈액 내 세포를 생산하는 골수에 대한 조직병리학적 검사결과, 도 20에서와 같이 정상대조군에서는 골수조직에 적혈구(erythroid), 골수(myeloid) 및 림프 전구세포(progenitor cells)가 치밀하게 들어 차 있었다. 반면, 시스플라틴만을 투여한 군에서는 상당부분의 전구세포가 소실되어 세포밀도(cellularity)가 감소함으로써 골수조직이 엉성하게 구성되어 있었다. 화합물 2 투여군에서는 고용량(50 mg/kg)에서 다수의 세포밀도 개선효과가 인정되었다.

실험예 14: 비장 세포수 및 기능에 대해 화합물2가 미치는 영향

시스플라틴 및 화합물 2 투여에 따른 면역세포의 영향을 분석하기 위해 비장으로부터 지라세포(splenocyte)의 수를 측정한 결과를 도 21에 나타내었다.

도 21을 참조하면, 정상동물에서는 평균 1,104±220 (×10,000)개 였으나, 시스플라틴만을 투여한 군에서는 302±62 개로 27.4 % 수준으로 급격히 감소하였다. 시스플라틴에 의한 이러한 지라세포의 감소는 화합물 2의 투여로 다소 방어되는 것으로 나타났으며, 5, 10, 25 및 50mg/kg의 용량에서 각각 422 ± 82, 375 ± 75, 476 ± 86 및 677 ± 118 개로 회복하였고, 50 mg/kg의 고용량에서는 정상대조군의 61.3 % 수준까지 회복하였다

또한, 시스플라틴 및 화합물 2 투여에 따른 비장 내 림프구(lymphocyte)의 기능변화를 확인하기위해 ConA에 대한 증식반응을 검사하여 도 22에 나타내었다.

도 22를 참조하면, 정상동물에서 채취한 지라세포에 산화반응성 세포독성물질인 과산화수소(H₂O₂, 1nM)를 처리한 결과 conA (1 μg/mL)에 의한 증식반응이 55-60% 수준으로 감소하였다. 반면 정상세포는 ConA 처리에 의해 20.3 % 높은 증식반응을 보여 주었다.

10일간 용매 CMC (1%)만을 투여한 동물에서도 정상동물과 유사한 증식반응이 나타난 반면, 시스플라틴만을 투여한 군에서는 ConA 처리에도 불구하고 ConA를 처리하지 않은 정상세포보다 낮은 증식을 보임으로써 일부 시스플라틴에 의한 T-세포 기능의 저하가 확인되었다. 이러한 시스플라틴의 독성에 대해 화합물 2의 투여(25mg/kg)가 정상으로 회복하는 것이 관찰되었다.

한편, 시스프라틴 및 화합물 2 투여에 따른 비장 내 B 림프구의 기능변화를 확인하기 위해 LPS에 대한 증식반응을 검사하여 도 23에 나타내었다. 도 23을 참조하면, 정상동물에서 채취한 지라세포에 과산화수소(H₂O₂, 1nM)를 처리한 결과 LPS 처리에 의해 26.3 % 높은 증식반응을 보여주었다.

10일 간 용매만을 투여한 동물에서도 정상동물에서와 마찬가지로 높은 증식반응이 나타난 반면에, 시스플라틴을 투여한 군에서는 증식반응을 관찰되지 않은 것으로 보아 시스플라틴에 의한 B세포 기능의 저하가 확인되었다. 시스플라틴의 이러한 독성에 대해 화합물 2의 투여(5 및 25 mg/kg)군에서 정상으로 회복되는 것이 관찰되었다.

실험예 15: 시스플라틴 용량에 따른 화합물 2의 구토 반응 방어 효과

a)실험동물의 준비(II)

Marshall Co. (North Rose, USA)로부터 6개월 수컷 ferret을 공급받아 약 1주간 실험실 순화과정을 거친 후 체중 1.5-1.6kg이 되는 시점에 사용하였다. 시스플라틴만 단독으로 피하 주사 한 군과 화합물 2를 경구 투여한 군을 정하였고, 참고문헌을 통해 시스플라틴의 용량을 10 mg/kg으로 설정하였다. 시험물질인 화합물 2(150 mg/kg)를 1% CMC에 현탁하여 5 ml/kg의 투여액량으로 매일 오전 10시경에 7일간 경구투여하였다. 마지막 시험물질 투여 직후 10 mg/kg의 시스플라틴을 피하로 주사하여 구역질 및 구토반응을 유도하였으며, CCTV를 60도 각도로 설치하여 구역질 및 구토반응을 녹화하여 4시간 및 12시간까지의 횟수를 계수하였다. 용매만을 투여했을 때의 구역질 및 구토반응 횟수에 대한 시험물질 투여에 따른 반응의 횟수변화를 제시하였다. 또한 시스플라틴 투여 후 동물이 사망할 때까지 시간을 측정하였다.

항구토 효과에만 주안점을 두던 수용체 차단제의 개념에서 벗어나 시스플라틴에 의한 장관손상 보호효능의 개념을 추가하기 위해 시스플라틴의 용량을 고용량(10 mg/kg) 및 저용량(5 mg/kg)으로 설정하였다. 즉, 고용량의 시스플라틴에 대해서는 높은 용량(150 mg/kg)의 화합물 2를 투여하여 항구토 효과는 물론 동물의 사망시간의 연장효과를 측정하였으며, 저용량의 시스플라틴에 대해서는 화합물 2의 용량을 다양화하여 항구토, 생존율 상승 및 신장과 간손상 보호효과를 확인하였다.

b)고용량 (10 mg/kg) 시스플라틴에 대한 방어효과

도 24를 참조하면, Ferrets에 10 mg/kg의 시스플라틴을 피하로 투여했을 ? 초기 4시간까지 평균 557.4회, 12시간까지는 1,248.5회의 구역질 및 구토증상을 보였다. 이에 비해 1주일간 150 mg/kg의 화합물 2를 경구 투여했을 때는 시스플라틴 투여로 인한 구역질 및 구토증상을 4시간까지는 438.2회로, 12시간까지는 673.7회로 감소시켜 각각 78.6 %와 54.0 %의 수준으로 경감시켰다.

한편 10 mg/kg의 시스플라틴 투여 후 모든 ferrets는 사망하였는데, 용매만을 투여한 군에서는 평균 15.7 시간 만에 사망하였다. 이에 반해, 150 mg/kg의 화합물 2를 사전에 투여한 군에서는 시스플라틴 공격에 따른 사망시간이 47.9시간으로 유의하게 지연되었다.

c)저용량 (5 mg/kg) 시스플라틴에 대한 방어효과

시스플라틴만을 피하 주사한 군과 화합물 2의 1회 복용량을 각각 저용량(25mg/kg), 중간용량(50 mg/kg) 및 고용량(100 mg/kg)을 경구투여한 군으로 나누었다. 화합물 2 (25, 50, 또는 100 mg/kg)을 1% CMC에 현탁하여 5 mL/kg의 투여액량으로 매일 오전 10시경에 7일간 경구투여 하면서 체중을 특정하였따. 마지막 실험물질 투여 직후 5 mg/kg의 시스플라틴을 피하로 주사하여 구역질 및 구토반응을 유도한 뒤, 상기와 마찬가지로 CCTV를 설치하여 녹화하여 4시간 및 24시간 까지의 횟수를 계수하였다.

또한 시스플라틴 투여 후 24시간까지의 생존율을 기록하고, 혈액을 채취하여 원심분리하여 얻은 혈청으로부터 신장 및 간에대한 혈액생화학적 지표를 분석하였다. 신장독성의 지표로는 BUN(blood urea nitrogen)과 Creatinine을, 간독성의 지표로는 AST, ALT, LDH, ALP 및 TB를 혈액자동분석기(Hitachi 7080, Japan)를 이용하여 측정하였다.

도 25를 참조하면, 정상 ferrets에 5 mg/kg의 용매(1% CMC)만을 7일간 경구 투여했을 때 유의할 만한 임상증상을 나타내지 않았으며, 정상적인 체중증가를 보였다. 7일간의 용매 투여 후 5 mg/kg의 시스플라틴을 피하로 공격했을 때 24시간 동안 동물의 체중이 1.73 kg에서 1.36 kg으로 약 21.8 % 급격하게 감소하였다. 이러한 체중감소에 대해 50 mg/kg 및 100 mg/kg의 화합물 2에서 각각 10.9 %와 7.0 %만이 감소하여 상당한 방어 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

도 26 및 도 27을 참조하면, 용매만을 투여한 ferrets에 5 mg/kg의 시스플라틴을 피하로 투여했을 때 동물은 지속적인 구역질 및 구토반응을 보여주었는 바, 초기 4시간까지는 토물(vomitus)이 넘어오는 경우가 많았으나 그 이후에는 토물이 없는 구역질 회수가 훨씬 많았다. CCTV를 통해 이러한 구역질 및 구토증상을 관찰한 결과 초기 4시간까지 평균 190.2회, 24시간까지는 609.3회의 반응을 보였다. 이에 비해 1주일간 25, 50 및 100mg/kg의 화합물 2를 경구로 투여했을 때는 시스플라틴 투여로 인한 구역질 및 구토 증상을 4시간까지 각각 166.4, 156.0및 110.0회로 용량의존적으로 감소시켜 대조군의 87.5%, 82.0% 및 57.8% 수준으로 경감시켰다. 특히 24시간까지의 구역질 및 구토횟수에 있어서는 각 용량에서 469.2, 379.4 및 309.1회로 감소시켜 대조군에 비해 각각 77.0%, 62.3% 및 50.7%의 수준으로 낮추었다.

표 4를 참조하면, 용매만을 투여한 동물은 시스플라틴 (5mh/kg)공격 후 24시간 만에 5마리 중 2마리(40%)가 사망하였다. 이에 비해 25 mg/kg의 화합물 2를 투여했을 때는 20%만이 사망하였으며, 특히 50mg/kg 이상에서는 100%의 생존율을 보여 주었다.

[표 4]

표 5를 참조하면, 용매만을 7일간 투여하고 시스플라틴 (5 mg/kg)으로 공격한 후 24시간에 신장독성의 지표인 BUN (9.2배)과 크레아티닌(6.0배)은 정상수치에 비해 크세 상승함으로써 심한 신장독성이 추정되었다. 이에 비해 25-50 mg/kg의 화합물 2를 사전에 투여한 군에서는 BUN과 크레아티닌이 유의하게 감소하였으며, 특히 100 mg/kg 투여군에서는 거의 정상수준으로 회복되었다.

간손상 지표에 있어서도 시스플라틴 투여 후 AST(aspartate transaminase), ALT(alanine transaminase), LDH(lactate dehydrogenase)가 각각 정상동물의 14.2배, 12.6배 및 1.7배로 급격히 상승하여 심한 간세포손상을 보여주었다. 또한 담즙정체의 지표인 ALP(alkaline phospatase)와 TB(total bilirubin)역시 대조군의 5.0배와 8.7배로 크게 상승하였다. 이러한 지표상승에 대해 25-50 mg/kg의 화합물 2투여는 간세포 손상 및 담즙정체 지표를 유의하게 완화시켰다. 또한 100mg/kg의 고용량에서는 대부분의 간손상 지표를 정상수준으로 회복시켜 탁월한 간보호 효능을 확인할 수 있었다.

[표 5]

(* 및 ^# 는 대조군과 상당한 차이를 보임(P<0.05))

실험예 16. 화합물 1의 위산 분비 억제 효과

a)실험동물의 준비(III)

표 6과 같이 군당 8마리씩 동물을 배치하여 시험군을 정하였다. 38시간 질식시킨 후 동물을 ether로 마취시킨 후 복부 겸상돌기(xiphoid process) 아래 정중부를 절개하고 유문부를 suture용 기술로 결찰하였다(Shay et al., 1945). 유문부 결찰 직후 4단계 용량(30, 60, 100 도는 200 mg/kg)의 화합물 2, 3단계 용량(30, 60 또는 90 mg/kg)의 화합물 2 또는 비교물질인 pantoprazole (30 mg/kg)을 십이지장 내로 주사하였다. 대조군에는 동일량 (5 mg/kg)의 용매(40% HP βL-CD)만을 투여하였다. 투여 후 복부 절개창을 wound stapler로 봉합하고 동물을 회복시켰다.

6시간 후 동물을 ether로 과마취하여 희생시킨 다음 위를 적출하였다. 위의 대만곡부를 절개한 후 위액을 피펫으로 회수한 다음 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상동액을 채취하였다. 위액의 양과 pH를 측정하고, 각각 500 ㎕ 위액을 취하여 Topfel reagent (1% dimethylaminoazobenzene) 또는 1% phenolphthalein 지시약을 각가 10 ㎕ 가한 다음 0.1N NaOH 용액으로 적정하여 유리염산량(free HCl)과 총산도 (acidity)를 측정하였다(Faloni de Andrade et al., 2007; Qshida et al., 2007).

[표 6]

b)위액 분비량 측정

도 28을 참조하면, 정상동물에서 6시간 동안의 위액분비량은 평균 4.01ml이다. 이러한 위액 분비량은 화합물 1의 투여에 의해 용량의존적으로 억제되었는데, 30 mg/kg에서는 대조군의 69.1%, 60 mg/kg에서는 53.9%, 100 mg/kg에서는 42.9%, 그리고 200 mg/kg)에서는 40.9%로 감소하였다. 이에 비해 30 mg/kg0의 pantoprazole을 투여했을 때는 대조군의 53.0로 감소하였다.

c)위액 pH 측정

도 29 및 표 7을 참조하면, 위액분비량의 억제에 반하여 화합물 1의 투여는 위액의 pHfmf 효과적으로 상승시켰는 바, 대조군에서는 1.85 였으나 30, 60, 100 및 200 mg/kg에서 각각 2.66, 3.52, 6.70 및 5.12로 상승하여 100mg/kg에서 최고치에 이르렀으며, 200 mg/kg에서는 100 mg/kg 투여시에 비해 오히려 약간 낮았다.

[표 7]

(*는 대조군과 상당한 차이를 보임(P<0.05))

d)유리염산량 및 총 산도 측정

도 30 및 도 31을 참조하면, 화합물 1에 의한 pH상승과 비례하여 유리염산량과 총산도는 효과적으로 억제되었는데, 100 mg/kg에서 대조군에 비해 각각 최대 16.7% 와 12.0%까지 감소하였다. 이에 비해 30 mg/kg pantoprazole은 유리염산량과 총산도를 각각 대조군의 26.0%와 25%로 감소시킴으로써 100 mg/kg의 화합물 1을 투여했을 때보다 효과가 미약하였다. 위액 분비량, 유리염산량 및 총산도에 있어서 화합물 1의 ED₅₀(median effective dose; 50% 유효총량)은 72, 46 및 47 mg/kg으로, 위액량에 비해 위산분비 억제에 더 효과적이었다.

따라서 화합물1은 60 mg/kg에서 proton-pump inhibitor로 잘 알려져있는 pantoprazole (30mg/kg)과 유사한 위액분비 억제 효과를 보여 주었고, 100-200 mg/kg에서는 더 우수한 효능을 발휘하였다. 위산분비에 대해서도 100 mg/kg의 pantoprazole 에 비해 다소 우수하였다. 따라서, 적정 용량에서 화합물 1의 탁월한 효능은 위산분비를 동반하는 다양한 위궤양 개선에 효과적일 것으로 기대된다.

실험예 17: 화합물 2의 위산 분비 억제 효능 평가

a)위액 분비량 측정

표 8과 같이 시험군을 실시하여 화합물 2의 위산 분비 억제효능 결과를 도 32에 나타내었다.

도 32를 참조하면 정상동물에서 6시간 동안의 위액분비량은 평균 5.75mL였다. 이러한 위액분비량은 화합물 2 투여에 의해 유의하게 억제되었는데, 30mg/kg에서는 대조군의 83.1%, 60mg/kg에서는 47.3%, 그리고 90mg/kg에서는 65.2%로 감소하였다. 이에 비해 30mg/kg의 pantoprazole을 투여했을 때는 대조군의 53%로 감소하였다.

b)위액 pH측정

도 33 및 표 8을 참조하면, 위액분비량의 억제에 반하여 화합물 2의 투여는 위액의 pH를 효과적으로 상승시켰는 바, 대조군에서는 1.33이었으나 30, 60 및 90mg/kg에서는 60 mg/kg 투여시에 비해 약간 낮았다. 한편 30 mg/kg의 pantoprazole은 위액분비량을 대조군의 50.6%로 낮추고, pH를 6.36으로 상승시킴으로써, 화합물 2는 60 mg/kg에서 pantoprazole보다 더 높은 효능을 보여주었다.

c)유리염산량 및 총 산도 측정

도 34 및 35를 참조하면 화합물 2에 의한 pH상승과 비례하여 유리염산량과 총 산도는 효과적으로 억제되었는데, 60 mg/kg에서 대조군에 비해 각각 최대 44.5%와 59.0%까지 감소하였다. 따라서, 위액 분비량, 유리 염산량 및 총 산도에 있어서 화합물 2의 ED₅₀는 각각 56, 75 및 >90 mg/kg으로, 위산에 비해 위액분비 억제에 더 효과적이다.

[표 8]

(* 및 대조군과 상당한 차이를 보임(P<0.05))

실험예 18: 에탄올에 의한 화합물 2의 위궤양 개선 효과

동물을 48시간 질식시킨 후 5단계 용량(1, 3, 10, 30 또는 60 mg/kg)의 화합물 2 또는 pantoprazole을 경구로 투여하였다. 대조군에는 동일향 (5 mL/kg)의 용매(1% CMC)를 투여하였다. 30분후 원액의 에탄올 (3 mL/kg)을 경구로 투여하여 위궤양을 유발시켰다(Kim et al., 2008)

에탄올 투여 1시간 경과 후 동물을 ether로 과마취하여 희생시킨 다음 위를 적출하였다. 적출한 위를 1% formalin(10mL)으로 부풀린 후 formalin 용액에 넣어 15분간 고정하였다. 위를 대만곡부를 따라 종으로 절개하여 위 내용물을 Kim wipes로 가볍게 문질러 제거하고, 핀으로 cork board위에 펼친 다음 3배의 입체현미경 하에서 위점막의 손상 정도를 관찰하였다. 위궤양(출혈부위) 병변의 길이(mm)를 측정하되, 점상출혈인 경우에는 5개의 출혈부를 1mm로 하여 위궤양지수(ulcer index)를 산정하였다. 용량 별 위궤양지수를 기초로 50% 유효용량을 제시하였다.

도 36 및 표 9를 참조하면, 원액의 에탄올(3 mL/kg)을 경구투여한 후 1시간에 위점막은 아주 심한 출혈 반응을 보여 평균 55.2mm의 위궤양지수를 나타내었다. 이러한 알코올성 위궤양은 화합물 2투여로 탁월하게 완화되었는 바, 1 mg/kg에서는 27.3 mm(대조군의 49.5%), 3 mg/kg에서는 32.7mm(59.2%), 10 mg/kg에서는 5.6mm(10.1%)로 위궤양지수가 줄어들었으며, 30 mg/kg에서는 거의 완전한 개선 효과를 나타내었다.

[표 9]

(* 및 대조군과 상당한 차이를 보임(P<0.05))

도 37을 참조하면, pantoprazole은 10 mg/kg까지는 대조군의 51.4-69.4%로 상대적으로 약한 효과를 보여주었으며, 30 mg/kg에서는 대조군의 36.4%로 유의한 효능을 발휘하였으나, 화합물 2에 비해서는 매우 저조하였다. 다만, 60 mg/kg의 고용량에서는 위궤양지수 6.4mm(대조군의 11.6%)로 높은 효과를 나타내었다. 따라서 알코올성 위궤양에 대한 화합물 2와 pantoprazole의 용량-반응효과를 비교할 때, 화합물 2는 1.2 mg/kg, pantoprazole은 11.7 mg/kg의 ED₅₀을 보여 줌으로써 화합물 2가 pantoprazole에 비해 약 10배 강한 것을 알 수 있었다.

따라서, 화합물 2는 위산분비를 효과적으로 억제하고 에탄올에 의한 위궤양을 탁월하게 개선시켰다. 따라서 위산과다 및 숙취와 같은 특정 원인에 의한 위궤양 개선에 우수한 약물로서의 가능성이 기대된다.

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims

(a) 약리학적 유효량의 하기 화학식 2a로 표시되는 화합물, 약제학적으로 허용되는 그것의 염, 또는 용매화물, 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제, 또는 이들의 조합을 포함하며, 항암제 부작용 질환의 치료 및 예방을 위한 약제 조성물로서, 상기 항암제 부작용 질환은 항암제의 투여로 인한 장관 손상 및 구토로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 약제 조성물:

(2a)
상기 식에서,
R₃, R₅및 R₆은 각각 탄소수 1의 알킬이다.
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제 1 항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴인 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
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항암제 부작용 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 제 1 항에 정의된 화학식 2a의 화합물을 사용하는 방법으로서, 상기 항암제 부작용 질환은 항암제의 투여로 인한 장관 손상 및 구토로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2a의 화합물은 결정성 결정구조로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 경구 투여용 약제 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2a의 화합물은 무정형의 결정구조로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 2a의 화합물은 미세입자의 형태로 제형화 되는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.
제 13 항에 있어서, 상기 제형화는 제트 밀에 의한 기계적 분쇄법 및/또는 분무건조법에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는 약제 조성물.