KR20240004506A - B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 rna억제제 및 그 응용 - Google Patents

B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 rna억제제 및 그 응용 Download PDF

Info

Publication number
KR20240004506A
KR20240004506A KR1020237038959A KR20237038959A KR20240004506A KR 20240004506 A KR20240004506 A KR 20240004506A KR 1020237038959 A KR1020237038959 A KR 1020237038959A KR 20237038959 A KR20237038959 A KR 20237038959A KR 20240004506 A KR20240004506 A KR 20240004506A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
chain
mvip
seq
group
sense
Prior art date
Application number
KR1020237038959A
Other languages
English (en)
Inventor
주어 무
성쥔 왕
Original Assignee
키로노바 (시아먼) 바이오파마 컴퍼니 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 키로노바 (시아먼) 바이오파마 컴퍼니 리미티드 filed Critical 키로노바 (시아먼) 바이오파마 컴퍼니 리미티드
Publication of KR20240004506A publication Critical patent/KR20240004506A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/548—Phosphates or phosphonates, e.g. bone-seeking
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)

Abstract

본 발명은 생물 화학 분야에 속하고 구체적으로 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 및 이의 응용에 관한 것이다. 상기 RNA억제제는 센스 사슬과 안티 센스 사슬이 염기쌍을 통해 형성되고 센스 사슬과 안티 센스 사슬이 서로 적어도 85%염기 상보적이며 뉴클레오티드 글리코실2’위치의 -OH의 일부 또는 전부가 불소 또는 메톡시기로 치환되고 말단에서 적어도 3개의 연속적인 뉴클레오티드 사이의 인산 에스테르가 황으로 치환된다. 본 발명의 RNA억제제의 구조에는 또한 상기 RNA억제제가 간 표적 특이성을 갖도록 하는 구조인 5’MVIP 및 3'MVIP가 더 포함되어 있다. 본 발명에서 제공하는 RNA억제제는 현재 임상 1차 B형 간염 치료제에 없는 효능을 가지고 있으며 HBV표면항원 HBsAg의 합성을 효율적이고 지속적으로 억제할 수 있으며 표면항체HBsAb를 생성한다. 본 발명의 RNA억제제는 HBV 흔히 보는 A, B, C 및 D형 모두에 대해 현저한 억제작용이 있다. 본 발명의 RNA억제제를 뉴클레오사이드 유사체 또는 인터페론과 연합사용할 경우 기능적으로 B형 간염을 치료할 수 있다.

Description

B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 및 그 응용
본 발명은 생물 화학 분야에 속하고, 구체적으로 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA 억제제 및 그 응용에 관한 것이다. 상기 RNA 억제제는 센스 사슬과 안티 센스 사슬이 염기쌍을 통해 형성되고 센스 사슬과 안티 센스 사슬이 서로 적어도 85% 염기 상보적이며, 뉴클레오티드 글리코실 2’위치의 -OH의 일부 또는 전부가 불소 또는 메톡시기로 치환되고, 말단에서 적어도 3개의 연속적인 뉴클레오티드 사이의 인산 에스테르가 황으로 치환된다. 본 발명의 RNA 억제제의 구조에는 또한 상기 RNA 억제제가 간 표적 특이성을 갖도록 하는 구조인 5’MVIP 및 3'MVIP가 포함되어 있으며, 여기서 5’MVIP는 RNA 억제제 센스 사슬 및/또는 안티 센스 사슬의 5’말단에 커플링되고, 3’MVIP는 상기 RNA억제제 안티 센스 사슬 및/또는 센스 사슬의 3’말단에 커플링되고, 5’MVIP 및 3’MVIP는 모두 간 표적 특정 리간드 X, 분지쇄 L, 링커 B 및 연결 사슬 D를 포함하고, 5’MVIP는 또한 상기 RNA억제제 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 5’말단에 연결된 트랜스포존 R1을 포함한다. 3’MVIP는 또한 상기 RNA억제제 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 3’말단에 연결된 트랜스포존 R2를 포함한다. 상기 간 표적 특이적 리간드 X, 분지쇄 L 또는 링커 B는 5’MVIP와 3’MVIP 각각의 내부 또는 5’MVIP 및 3’MVIP 사이에서 동일하거나 다를수 있다. 본 발명에서 제공하는 RNA억제제는 현재 임상 1차 B형 간염 치료제에는 없는 효능을 가지고 있으며, 번역 주형으로 HBV mRNA의 기능을 직접 파괴하고 HBV표면 항원 HBsAg 합성을 방지할 수 있다. 또한, 본 발명의 RNA억제제는 HBV에서 흔히 보이는 A, B, C 및 D 에 대해 현저한 억제 작용이 있으며 뉴클레오사이드 유사체 및 인터페론과 함께 사용할 수 있으며 HBV 마우스의 HBsAg 발현 수준을 지속적으로 효율적으로 감소시킬 수 있으며 표면 항체 HBsAb를 생성하여 B형 간염을 기능적으로 치료할 수 있다.
RNAi
RNAi(RNA간섭)는 1998년 앤드루 파이어 (Andrew Z. Fire) 등이 예쁜꼬마선충에서 안티 센스 RNA억제 실험을 수행하면서 발견되었으며 이 과정을 RNAi라고 한다. 이 발견은 《Science》잡지로부터 2001년의 10대 과학적 발전 중 하나로 선정되었으며 2002년 10대 과학 발전 중 1위로 선정되었다. 그 이후로 RNAi를 메커니즘으로 한 siRNA는 잠재적인 유전자 치료 약물로 사용되어 광범위한 관심을 받고 있다. 2006년 앤드루 파이어와 크레이그 멜로(Craig C. Mello)는 RNAi메커니즘 연구에 기여에 대한 생리학 또는 의학 노벨상을 수상하였다. RNAi는 동물, 식물 및 진균을 포함한 많은 유기체에서 이중 사슬RNA (dsRNA)에 의해 트리거 될수 있으며 RNAi 과정에서 “Dicer”라는 제한 내부핵산 가수분해 효소는 긴 사슬 dsRNA를 21~25개의 뉴클레오티드 길이의 작은 조각으로 절단하거나 “토막”낸다. 이러한 조각은 작은 간섭 RNA (siRNA)로 알려져 있으며 여기서 안티 센스 사슬(Guide strand)은 Argonaute 단백질(AGO2)에 로드된다.AGO2 로딩은 Argonaute 단백질, Dicer 및 dsRNA 결합 단백질(TRBP라고 함)으로 구성된 삼차 복합체인 RISC-loading 복합체에서 발생한다. 로딩 과정에서 센스 사슬(Passenger strand)은 AGO2에 의해 분해되어 배출된다. 그런 다음 AGO2는 안티 센스 사슬을 사용하여 완전히 상보적인 서열을 포함하는 mRNA에 결합한 다음 이러한 mRNA의 절단을 촉매하여 mRNA분열이 번역 템플릿의 역할을 상실하게 하여 관련 단백질의 합성을 방지한다. 절단후 절단된 mRNA가 방출되고 안티 센스 사슬을 로딩하는 RISC-loading복합체는 다른 절단 라운드로 재활용된다.
B형 간염은 B형 간염 바이러스가 6개월 이상 지속적으로 감염되어 간에 다양한 정도의 염증성 괴사(또는) 섬유화가 발생하는 질환이다. 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계적으로 약 20억 명이 감염되었으며 그 중 매년 약 400만명이 급성 감염되고 약 3.5-4억 명의 B형 간염 감염자가 있으며 아프리카와 서태평양이 68%를 차지한다. 매년 전 세계적으로 약 100만명이 B형 간염 감염과 관련된 질환으로 사망하며 그 중 간경화가 30％, 원발성 간세포암이 45％를 차지한다. 중국의 간경화 및 원발성 간 세포암 환자 중 B형 간염 바이러스에 의한 환자는 각각 77％, 84％이다. 현재 임상 1차 약물에는 뉴클레오사이드(NUC)와 인터페론류 약물이 포함되며, 가장 중요한 약물은 여전히 라미부딘(Lamivudine), 엔테카비르(Entecavir), 아데포비르(Adefovir), 텔비부딘(telbivudine)과 같은 뉴클레오사이드 약물이다. 테노포비어 알라페나미드(Tenofovir Alafenamide,TAF,)는 최근에 출시된 새로운 NUC류 약물이지만 신장 기능 손상을 유발할 수 있기 때문에 사용이 어느 정도 제한된다. 뉴클레오사이드 약물은 생체 이용율이 높고 경구투여가 안전하다는 장점이 있다. 그러나 뉴클레오사이드 약물은 질환을 효과적으로 제어할 수 있지만 장기간 사용하면 약물 내성이 나타날 수 있으며 약물 중단 후 HBV DNA, ALT 및 간 조직학의 다양한 정도의 반등이 나타날 수 있으며 장기간 사용후 신장 손상 및 유아 기형 유발과 같은 명백한 부작용이 나타난다. 바이러스 내성 균주의 출현은 뉴클레오사이드 약물의 장기적 사용에서 반드시 직면해야 하는 또 다른 부작용이며 내성 균주의 출현은 치료율을 크게 감소시키거나 심지어 효과가 없다. 뉴클레오사이드약물이 바이러스에 대한 복제는 가역적이기때문에 대부분의 환자에게 최대 치료 효과를 얻으려면 치료과정이 1년 이상이어야 하며 내성이 나타나 기대한 효과를 얻지 못한다. 뉴클레오사이드(NUC)약물은 매일 복용해야 하며 환자는 약물 순응도가 낮다.
B형 간염 표면 항원(HBsAg)은 B형 간염 바이러스 (HBV)의 단백질 외피이며 첫번째 바이러스 시사가능한 마커이다. HBsAg 양성은 HBV감염을 판단하는 최적표준이다. B형 간염 환자의 경우 간경화 전에 HBsAg가 제거되면 간경화 및 간세포암 발병율이 60배 감소한다. HBsAg혈청 제거는 미국 간 질환 연구협회 AASLD, 아시아 태평양 간 연구협회 APASL 및 유럽 간 연구협회 EASL의 지침에서 치료 종말점 판단 기준 중 하나로 간주된다. 또한 높은 수준의 항원은 면역 내성을 유도하고 항원 HBsAg 수준의 감소는 HBV 감염의 면역학적 제어를 회복할 수 있다. 현재 뉴클레오사이드(NUC) 및 인터페론과 같은 임상 1차약물은 모두 항원 HBsAg 수준을 감소시키는 효과가 없으며 따라서 HBsAg를 제거할수도 없다.
B형 간염의 치료는 여전히 세계적인 건강 도전 과제이다. 따라서 당해 분야는 항원HBsAg 수준을 효율적이고 지속적으로 감소시켜 B형 간염 환자가 HBsAb 항체를 재생성할 수 있도록 하여 최종적으로 치료될 수 있는 항HBV 약물 개발이 시급하다.
본 발명은 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 및 이의 응용에 관한것이다. 상기 RNA억제제는 센스 사슬 및 안티 센스 사슬이 염기쌍을 통해 형성되고 센스 사슬 및 안티 센스 사슬 사이에 적어도 85% 염기 상보적이며 뉴클레오티드 글리코실2’위치의 -OH의 일부 또는 전부가 불소 또는 메톡시기로 치환된다. 말단에서 적어도 3개의 연속적인 뉴클레오티드 사이의 인산 에스테르가 황으로 치환되어 생체내의 안정성을 향상시킨다. 본 발명의 RNA억제제의 구조에는 또한 상기 RNA억제제가 간 표적 특이성을 갖도록 하는 구조인 5’MVIP 및 3'MVIP가 포함되어 있으며, 여기서 5’MVIP는 상기 RNA억제제 센스 사슬 및/또는 안티 센스 사슬 5’말단에 커플링되고, 3’MVIP는 상기 RNA억제제 안티 센스 사슬 및/또는 센스 사슬 3’말단에 커플링되고, 5’MVIP 및 3’MVIP는 모두 간 표적 특이적 리간드 X, 분지쇄 L, 링커 B 및 연결 사슬 D를 포함하고, 5’MVIP는 또한 상기 RNA억제제 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 5’말단에 연결된 트랜스포존 R1을 포함한다. 3’MVIP는 또한 상기 RNA억제제 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 3’말단에 연결된 트랜스포존 R2를 포함한다. 상기 간 표적 특이적 리간드 X, 분지쇄 L 또는 링커 B는 5’MVIP와 3’MVIP 각각의 내부 또는 5’MVIP 및 3’MVIP 사이에서 동일하거나 다를수 있다. 본 발명에서 제공하는 RNA억제제는 현재 임상 1차 B형 간염 치료제에 없는 효능을 가지고 있으며 번역 주형으로 HBV mRNA의 기능을 직접 파괴하고 HBV 표면 항원 HBsAg 합성을 방지할 수 있다. 또한 본 발명의 RNA억제제는 HBV에서 흔히 보이는 A, B, C 및 D에 대해 현저한 억제효과가 있으며 뉴클레오사이드 유사체 및 인터페론과 함께 사용할수 있으며 HBV마우스의 HBsAg 발현 수준을 지속적이고 효율적으로 감소시킬수 있으며 표면 항체 HBsAb를 생성하여 B형 간염을 기능적으로 치료할수 있다. 이미 공개된 유사기술과 비교할 때 본 발명의 RNA억제제의 가장 중요한 특징은 생체내에서 표면항체 HBsAb를 생성할 수 있고 이는 생체내에서 HBV에 대한 면역력을 다시 자극하고 B형 간염의 기능적 치료를 실현한다.
일 양태에 있어서, 본 발명은 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며,
여기서, 상기 RNA억제제는 길이가 15-30인 센스 사슬 및 안티 센스 사슬이 염기쌍을 통해 형성되고 사슬 길이는 바람직하게 19-23이다.
상기 기술방안에서 바람직하게는 상기 센스 사슬 및 안티 센스 사슬 사이에 적어도 85% 염기 상보적이며;
상기 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬의 뉴클레오티드 글리코실 2'위치의 -OH의 부분 또는 전부가 치환될수 있으며 상기 치환기는 불소 또는 메톡시기이며;
또한 상기 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬의 말단에서 적어도 3개의 인접한 뉴클레오티드 사이의 인산 에스테르 결합이 황화될수 있다.
더 바람직하게는, 상기 센스 사슬은 아래에 표시된 바와 같이 SEQ ID NO. 1 또는 SEQ ID NO. 1과 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이고, 상기 안티 센스 사슬은 아래에 표시된 바와 같이 SEQ ID NO. 58 또는 SEQ ID NO. 58과 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이다.
센스 사슬: 5' ggguuuuucucguugacaa 3' SEQ ID NO. 1
안티 센스 사슬: 5' uugucaacgagaaaaacccuu 3' SEQ ID NO. 58
여기서 g=구아노신(guanosine), a=아데노신(adenosine), u=우리딘(uridine), c=시티딘(cytidine).
또는 더 바람직하게는, 상기 센스 사슬은 아래에 표시된 바와 같이 SEQ ID NO. 140 또는 SEQ ID NO. 140과 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이고, 상기 안티 센스 사슬은 아래에 표시된 바와 같이 SEQ ID NO. 141 또는 SEQ ID NO. 141과 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이다.
센스 사슬: 5'ggguuuuucuuguugacaa 3' SEQ ID NO. 140
안티 센스 사슬: 5' uugucaacaagaaaaacccuu 3' SEQ ID NO. 141
여기서, g=구아노신, a=아데노신, u=우리딘, c=시티딘.
상기 RNA억제제의 생체내에서의 안정성을 향상시키기 위해 그 활성에 영향주지 않고 심지어 활성을 향상시키는 상황에서 상기 RNA억제제의 센스 사슬 및 안티 센스 사슬에 대해 변형할수 있으며 그 중 뉴클레오티드는 변형치환기가 있을 수 있고 전체 사슬 또는 부분 사슬을 변형할 수 있다.
바람직한 기술방안에서 상기 RNA억제제 변형후의 센스 사슬은 아래에 표시된 바와 같이 SEQ ID NO. 2 또는 SEQ ID NO. 2와 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이고, 그 변형후의 안티 센스 사슬은 아래에 표시된 바와 같이 SEQ ID NO. 59 또는 SEQ ID NO. 59와 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이다.
센스 사슬: 5' Gs fGs G U fU U fU fU fC U C G U U G A Cs As A 3' SEQ ID NO. 2
안티 센스 사슬: 5' Us Us G U C A fA C G A G fA A fA fA A C C Cs Us U 3' SEQ ID NO. 59
여기서, G=2'-O-메틸구아노신, A=2'-O-메틸아데노신, U=2'-O-메틸우리딘, C=2'-O-메틸시티딘; Gs=2'-O-메틸구아노신-3’-포스포로티오에이트(phosphorothioate) ，As=2'-O-메틸아데노신-3'-포스포로티오에이트, Us=2'-O-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트, Cs=2'-O-메틸시티딘-3'-포스포로티오에이트;fG=2'-플루오로구아노신 ，fA=2'-플루오로아데노신, fU=2'-플루오로우리딘， fC=2'-플루오로시티딘;fGs=2'-플루오로구아노신-3'-포스포로티오에이트 ，fAs=2'-플루오로아데노신-3'-포스포로티오에이트, fUs=2'-플루오로우리딘-3'-포스포로티오에이트， fCs=2'-플루오로시티딘-3'-포스포로티오에이트.
다른 바람직한 기술방안에 있어서 상기 RNA억제제 변형후의 센스 사슬은 아래에 표시된 바와 같이 SEQ ID NO. 142 또는 SEQ ID NO. 142와 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이고 그 변형 후의 안티 센스 사슬은 아래에 표시된 바와 같이 SEQ ID NO. 143 또는 SEQ ID NO. 143와 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 서열이다.
센스 사슬: 5' Gs Gs G U fU U fU fU fC U U G U U G A Cs As A 3' SEQ ID NO. 142
안티 센스 사슬: 5' Us Us G U C A fA C A A G fA A fA A A C C Cs Us U 3' SEQ ID NO. 143
여기서, G=2'-O-메틸구아노신, A=2'-O-메틸아데노신, U=2'-O-메틸우리딘, C=2'-O-메틸시티딘; Gs=2'-O-메틸구아노신-3’-포스포로티오에이트, As=2'-O-메틸아데노신-3'-포스포로티오에이트, Us=2'-O-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트, Cs=2'-O-메틸시티딘-3'-포스포로티오에이트; fG=2'-플루오로구아노신 ，fA=2'-플루오로아데노신, fU=2'-플루오로우리딘, fC=2'-플루오로시티딘; fGs=2'-플루오로구아노신-3'-포스포로티오에이트, fAs=2'-플루오로아데노신-3'-포스포로티오에이트, fUs=2'-플루오로우리딘-3'-포스포로티오에이트, fCs=2'-플루오로시티딘-3'-포스포로티오에이트.
상기 기술방안에 있어서 바람직하게는 상기 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염은 5'MVIP 및 3'MVIP의 조합을 더 포함하며, 여기서,
상기 5'MVIP 및 3'MVIP는 간 표적 특이적 리간드 X의 리간드 구조를 가지며 또한 분지쇄 L, 링커 B 및 연결 사슬 D를 포함한다.
상기 5'MVIP는 상기 센스 사슬 및/또는 안티 센스 사슬 5'말단에 커플링 되고 상기 센스 사슬 및 안티 센스 사슬 5'말단에 연결된 트랜스포존 R1을 더 포함한다.
상기 3’MVIP는 상기 안티 센스 사슬 및/또는 센스 사슬 3’말단에 커플링 되고 상기 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 3’말단에 연결된 트랜스포존 R2를 포함한다.
상기 5’MVIP의 구조는 일반식 I에 나타낸 바와 같고 상기 3’MVIP 구조는 일반식 II에 나타낸 바와 같다.
여기서,
n 및 m은 각각 0-4인 정수이고, 바람직하게 1-3인 정수이며, n+m=2-6인 정수이며, 바람직하게 n+m=2, 3 또는 4이다.
상기 트랜스포존 R1 및 R2 구조에는 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자를 가지고 있고, 일반 구조에는 적어도 하나의 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자가 있으며, R1 및 R2 는 구조 중 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자가 각각 5'MVIP 및 3'MVIP의 연결 사슬 D 및 센스 사슬 및/또는 안티 센스 사슬 5’말단 및 3'말단과 연결되어 간 표적 특이적 리간드 X를 도입하며, 상기 트랜스포존 R1 및 R2는 직쇄일 수 있고; 분지쇄를 가진 직쇄 또는 여러가지 고리형 구조이며,고리형 구조는 포화 또는 불포화된 지방족 탄소 고리기, 혹은 황, 산소 또는 질소 원자를 포함한 5원 또는 6원 헤테로고리기 또는 방향족 탄화수소기 등일 수 있다.
R1는 바람직하게 -NH(CH2)xCH2O-이며, 여기서 x는 3-12인 정수이고, 바람직하게 4-6인 정수이며;
R2는 바람직하게 -NH(CH2)x1CH(OH)(CH2)x2CH2O-이며, 여기서 x1은 1-4인 정수이고, x2는 0-4인 정수이며;
상기 간 표적 특이적 리간드 X는 갈락토스(galactose), 갈락토사민(galactosamine), N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine) 및 그 유도체에서 선택되며, 바람직하게 N-아세틸갈락토사민 및 그 유도체에서 선택되며, 상기 간 표적 특이적 리간드 X는 5’MVIP 및 3’MVIP 각각의 내부 또는 5’MVIP와 3’MVIP 사이에서 동일하거나 부동할 수 있다.
상기 분지쇄 L는 -NH-， C=O，O，S，아미드기, 포스포릴기，티오포스포릴기， C4-C10 지방족 탄소 고리기，페닐기 또는 이러한 치환기의 조합을 포함하는 C4-C18직쇄이며, 상기 직쇄는 에틸 알코올 또는 카르복실산 등 측쇄를 가질 수 있고, 상기 분지쇄 L는 바람직하게 아미드기 또는 6원 지방족 탄소 고리기를 포함하는 C7-C18직쇄이며, 상기 분지쇄 L는 5’MVIP와 3’MVIP 각각의 내부 또는 5’MVIP와 3’MVIP사이에서 동일하거나 부동하다.
상기 링커 B는 아래의 구조에서 선택된다.
여기서, A1 및 A2는 각각 독립적으로 C, O, S, -NH-, 카르보닐기, 아미드기, 포스포릴기 또는 티오포스포릴기이며， r은 0-4인 정수이고, 상기 링커 B는 5’MVIP와 3’MVIP사이에서 같거나 부동할수 있다.
상기 연결 사슬 D는 -NH-, C=O, O, S, 아미드기, 포스포릴기, 티오포스포릴기, 방향족 탄화수소기, C4-C10 지방족 탄소 고리기, 1-3개 질소를 포함한 5원 또는 6원 헤테로고리기 또는 이러한 치환기의 조합을 포함하는 C3-C18직쇄이고, 상기 C3-C18 직쇄는 메틸 알코올, 메틸 t-부틸기, 메틸 페놀기, C5-C6 지방족고리기의 측쇄를 가질수 있으며, 상기 연결 사슬 D는 바람직하게 2개의 C=O, 6원 지방족 탄소 고리기 또는 페닐기를 포함하는 C3-C10 직쇄이다.
구체적으로, 일부 실시방안에 있어서 n=0(즉 5’MVIP가 존재하지 않을)인 경우 상기 MVIP의 구조는 아래와 같을수 있다.
일부 실시방안에 있어서 n=1인 경우 상기 MVIP의 구조는 아래와 같을 수 있다.
일부 실시방안에 있어서 n=2인 경우 상기 MVIP의 구조는 아래와 같을 수 있다.
일부 실시방안에 있어서 n=3인 경우 상기 MVIP의 구조는 아래와 같을 수 있다.
일부 실시방안에 있어서 n=4인 경우 상기 MVIP의 구조는 아래와 같을 수 있다.
일부 실시방안에 있어서 상기 n는 상기 RNA억제제의 센스 사슬 및 안티 센스 사슬 5’말단에 동시에 위치한 5'MVIP 중 n의 합을 의미하며 상기 m은 상기 RNA억제제의 센스 사슬 및 안티 센스 사슬 3’말단에 동시에 위치한 3'MVIP 중 m의 합을 의미한다.
상기 간 표적 특이적 리간드 X는 간세포가 RNA억제제를 섭취하는 것을 향상시키기 위한 구조에서 선택되며 지질, 스테로이드, 비타민, 당류(carbohydrate), 단백질, 펩타이드, 폴리아민 및 펩타이드 모방 구조일 수 있다. 본 발명에서 제공한 RNA억제제에 있어서, 상기 RNA억제제 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 말단에 도입된 간 표적 특이적 리간드 X는 동일하거나 부동할 수 있다. 예를 들어 특성 상 일부는 간 표적성을 향상시킬 수 있고 일부는 생체 내 상기 RNA억제제의 약동학적 조절 구조일수 있으며 일부는 생체 내 용해 활성을 갖는 구조일 수 있다. 일부 실시방안에 있어서 상기 간 표적 특이적 리간드 X는 아래의 구조 중 하나 이상의 단당류 및 그 유도체에서 선택된다.
상기 단당류는 만노오스, 갈락토스, D-아라비노스, 포도당, 과당, 자일로오스, 글루코사민, 리보오스 등 구조에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 만노오스는 D-만노피라노스, L-만노피라노스, α-D-만노푸라노스, β-D-만노푸라노스, α-D-만노피라노스, β-D-만노피라노스에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 갈락토스는 L-갈락토스, D-갈락토스, α-D-갈락토피라노스, β-D-갈락토피라노스, α-D-갈락토푸라노오스, β-D-갈락토푸라노오스 에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 포도당은 D-글루코스, L-글루코스, α-D-글루코피라노스, β-D-글루코피라노스, α-D-글루코푸라노스, β-D-글루코푸라노스 에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 과당은 α-D-프럭토푸라노스, α-D-프럭토피라노스 에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 자일로오스는 D-자일로푸라노스, L-자일로푸라노스 에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 리보오스는 리보오스, D-리보오스, L-리보오스 에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 단당류 유도체는 만노오스 유도체, 갈락토스유도체, 포도당 유도체, 리보오스 유도체 및 기타 유도체 에서 선택된다. 갈락토스 유도체는 α-D-갈락토사민, N-아세틸갈락토사민, 4-티오-β-D-갈락토피라노스 에서 선택된다. 포도당 유도체는 2-아미노-3-O-[(R)-1-카르복시에틸]-2-데옥시-β-D-글루코피라노스, 2-데옥시-2-메틸 아미노-L-글루코피라노스, 2-데옥시-2-설포아미노-D-글루코피라노스, 5-티오-β-D-글루코피라노스, 메틸-2,3,4-트리스-O-아세틸-1-티오-6-O-트리페닐메틸-α-D-글루코피라노시드 에서 선택될 수 있다. 리보오스 유도체는 D-4-티오리보오스, L-4-티오리보오스 에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
일부 바람직한 실시방안에 있어서 상기 간 표적 특이적 리간드 X는 갈락토스, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민 및 그 유도체에서 선택되며 그 구조 일반식은 아래와 같다.
여기서, W1은 수소 또는 히드록실기 보호기이며 동일하거나 부동할 수 있다. W는 -OH, -NHCOOH 또는 -NHCO(CH2)qCH3이며, 여기서 q는 0-4인 정수이고;W2는 -NH-, O, S 또는 C이다.
일부 실시방안에 있어서 ，상기 간 표적 특이적 리간드 X는 바람직하게 아래의 구조에서 선택되는 하나 이상이다.
여기서, W는 -OH, -NHCOOH 또는 -NHCO(CH2)qCH3에서 선택되는 하나 이상이며, 여기서 q는 0-4인 정수이다.
일부 실시방안에 있어서，상기 간 표적 특이적 리간드 X는 동일한 5'MVIP 또는 3'MVIP구조에서 동일하거나 부동할 수 있다.
일부 실시방안에 있어서， 5'MVIP와 3'MVIP 서로간의 X는 동일하거나 부동할 수 있다.
상기 분지쇄 L는 -NH-, C=O, O, S, 아미드기, 포스포릴기, 티오포스포릴기, C4-C10지방족 탄소 고리기, 페닐기 또는 이러한 치환기의 조합을 포함하는 C4-C18의 직쇄이며，상기 직쇄는 에틸 알코올 또는 카르복실산류의 측쇄를 포함할 수 있으며，상기 분지쇄 L는 바람직하게 아미드기 또는 6원 지방족 탄소 고리기를 포함하는 C7-C18직쇄이며， 그 길이 또는 구조는 본 발명의 RNA억제제의 활성에 영향줄 수 있다.
일부 실시방안에 있어서，상기 분지쇄 L는 동일한 5'MVIP 또는 3'MVIP구조에서 동일하거나 부동할 수 있다.
일부 실시방안에 있어서， 5'MVIP와 3'MVIP 서로 간의 분지쇄 L는 동일하거나 부동할 수 있다.
일부 실시방안에 있어서， 상기 분지쇄 L는 아래 구조 중 하나 이상에서 선택될 수 있다.
여기서, r1은 1-12인 자연수이고， r2는 0-20인 정수이며， Z는 H 또는 알킬기 또는 아미드기이며， 예를 들어 C1-C5알킬기, C1-C5인 아미드기, 예를 들어 포름아미드 등이다.
상기 링커 B의 구조는 도입될 수 있는 특이적 리간드 X의 수와 관련되고, 링커 B에는 -NH-, C, O, S, 아미드기, 포스포릴기, 티오포스포릴기를 포함하며，n 또는 m가 1일 경우 직쇄이고，n 또는 m가 2, 3 또는 4일 경우, 분기 회수는 각각 2, 3 또는 4이다. 상기 링커 B는 아래의 구조식에서 선택될 수 있다.
여기서, A1 및 A2는 각각 독립적으로 C, O, S, -NH-, 카르보닐기, 아미드기, 포스포릴기 또는 티오포스포릴기이고， r는 0-4인 정수이다.
일부 실시방안에 있어서，n 또는 m가 1, 2, 3 또는 4일 경우，상기 링커 B는 아래의 구조식에서 선택된다.
여기서, r는 0-4인 정수이다.
일부 실시방안에 있어서，n 또는 m가 1, 2, 3 또는 4일 경우 상기 링커 B는 아래의 구조식에서 선택된다.
일부 실시예에 있어서，상기 링커 B는 바람직하게 아래의 구조 중 하나 이상에서 선택될 수 있다.
상기 연결 사슬 D는 -NH-, C=O, O, S, 아미드기, 포스포릴기, 티오포스포릴기, 방향족 탄화수소기, C4-C10지방족 탄소 고리기, 1-3개 질소를 포함하는 5원 또는 6원 헤테로고리기 또는 이러한 치환기의 조합을 포함하는 C3-C18직쇄이며，상기 C3-C18 직쇄는 메틸 알코올, 메틸 t-부틸기, 메틸 페놀기, C5-C6지방족고리기의 측쇄를 포함할 수도 있으며 상기 연결 사슬 D는 바람직하게 두개의 C=O, 6원 지방족 탄소 고리기 또는 페닐기를 포함하는 C3-C10직쇄이다.
일부 실시방안에 있어서， 상기 연결 사슬 D는 아래의 구조 중 하나 이상에서 선택된다.
여기서, 매개 n은 1-20인 자연수이고， 매개 n은 동일하거나 부동한 정수이며; s는 2-13인 정수이고; Z1 및 Z2는 동일하거나 부동한 치환기이며, 예를 들어 C3-C10 알킬기이다.
일부 실시방안에 있어서 ，상기 연결 사슬 D는 바람직하게 아래의 구조 중 하나에서 선택된다.
일부 실시방안에 있어서，상기 연결 사슬 D는 바람직하게 아래의 구조 중 하나 이상에서 선택된다.
일부 가장 바람직한 실시방안에 있어서, 상기 연결 사슬 D는 두개의 C=O를 포함하는 C3-C10직쇄이다.
일부 실시방안에 있어서，상기 5’MVIP 구조 중 및 3’MVIP 구조 중 는 아래의 구조 중 하나 이상에서 선택된다.
일부 바람직한 실시방안에 있어서，상기 5’MVIP 구조 중 는 표 1에 나타낸 구조에서 선택된다.
표 1: 5’MVIP의 구조
일부 실시방안에 있어서，5’MVIP는 존재하지 않을수도 있고, 이때 m는 2-4인 정수이다.
일부 바람직한 실시방안에 있어서，상기 3’MVIP 구조 중 는 표 2에 나타낸 구조에서 선택된다.
표 2: 3’MVIP의 구조
본 발명에서 제공한 RNA억제제에 있어서， 상기 5’MVIP는 상기 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 5’말단에 연결 또는 커플링된 트랜스포존 R1을 더 포함한다. 상기 트랜스포존 R1 구조는 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자를 가지고 일반구조에는 적어도 하나의 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자가 있다. R1은 그 구조 중 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자에 의해 5'MVIP의 연결 사슬 D 및 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 5’말단에 연결되어 간 표적 특이적 리간드 X를 도입한다. 상기 트랜스포존 R1은 직쇄일수 있으며; 아미드기, 카르복실기, 알킬기의 분지쇄를 가진 직쇄 또는 여러가지 고리형 구조일 수 있다. 고리형 구조는 예를 들어 포화 또는 불포화된 지방족 탄소 고리기， 또는 예를 들어 황, 산소 또는 질소 원자를 포함한 5원 또는 6원 헤테로고리기 또는 방향족 탄화수소기 등일 수 있다.
일부 실시방안에 있어서， R1은 -B1(CH2)xCH2B2-이고, 여기서 x는 3-10인 정수이고, 바람직하게 4-6인 정수이며, 치환기 B1 및 B2는 각각 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자일 수 있다.
일부 실시방안에 있어서, R1은 -B1(CH2)xCH(B3CH3)B2-이고, 여기서 x는 3-10인 정수이고, B1 및 B2는 각각 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자일 수 있고, 치환기B3은 질소, 황, 산소 또는 카르복실기 또는 메틸류 알킬기를 포함한 치환기이다.
일부 바람직한 실시방안에 있어서, R1은 -NH(CH2)xCH2O-이고, 여기서 x는 3-10인 정수이고, 바람직하게 4-6인 정수이며, 다음 두개 포스포라미다이트 단량체(phosphoramidite monomer)에 의해 도입될 수 있다.
i. 여기서 하나의 산소 원자 또는 황 원자는 R1 포스포라미다이트 단량체의 합성에 사용되고, 고체상 합성의 방법을 통해 RNA억제제 단일 사슬의 5’말단에 연결된다. 구조 중 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자는 5'MVIP 중 연결 사슬 D와 연결되어 RNA억제제의 5’말단에 간 표적 특이적 리간드 X를 도입한다. RNA억제제 5’말단에 도입된 단량체의 예시 구조는 아래와 같다.
일부 실시방안에 있어서 바람직하게 아래의 구조를 선택한다.
ii. R1구조에서 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자는 먼저 연결 사슬 D와 연결되고 다른 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자는 5'MVIP 포스포라미다이트 단량체의 합성과정에서 포스포라미다이트와 에스테르를 합성하고 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 5’MVIP 포스포라미다이트 단량체 구조 예시는 아래와 같다.
일부 실시방안에 있어서 ，R1은 질소, 황 또는 산소 원자를 포함한 헤테로고리 또는 탄소 고리 구조이다.
일부 바람직한 실시방안에 있어서, 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 5’MVIP 포스포라미다이트 단량체는 바람직하게 아래의 구조를 선택한다.
일반식에서 n이 1-4인 경우, 상기 단량체 링커 B 부분을 각각 1~4회 분지화 하여 상응하는 단량체 화합물을 얻고, 상기 단량체 화합물의 도움으로 간 표적 특이적 리간드 X는 고체상 합성을 통해 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 5’말단에 도입된다.
일부 바람직한 실시방안에 있어서 트랜스포존 R1은 바람직하게 -NH(CH2)xCH2O-이고, 여기서 x는 3-10인 정수일 수 있으며, 바람직하게 4-6인 정수이며, 5'MVIP포스포라미다이트 단량체 구조는 아래의 구조에서 선택된다.
본 발명에서 제공한 RNA억제제에 있어서, 상기 3’MVIP는 상기 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 3’말단에 연결 또는 커플링된 트랜스포존 R2를 더 포함한다. 상기 트랜스포존 R2구조는 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자를 가지고 일반구조에는 적어도 하나의 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자가 있다. R2는 구조 중 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자에 의해 3'MVIP의 연결 사슬 D 및 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 3’말단에 연결되어 간 표적 특이적 리간드 X를 도입한다. 상기 트랜스포존 R2는 직쇄일 수 있으며; 아미드기, 카르복실기 또는 알킬기의 분지쇄를 가진 직쇄 또는 여러가지 고리형 구조일 수 있다. 고리형 구조는 예를 들어 포화 또는 불포화된 지방족 탄소 고리기, 또는 예를 들어 황, 산소 또는 질소 원자를 포함한 5원 또는 6원 헤테로고리기 또는 방향족 탄화수소기 등일 수 있다.
일부 실시방안에 있어서, 예를 들어 피페리딘기, 피롤기, 티아졸기 또는 벤젠 고리 등 헤테로고리 구조를 포함한 트랜스포존 R2의 구조는 아래와 같다.
본 발명의 R2는 숙신산 무수물에 의해 R2구조 중 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자와 에스테르 또는 아실아미드를 합성하는 동시에 대조 Solid Support의 -NH-와 커플링하여 3'MVIP Solid Support를 형성하며，또한 포스포라미다이트 고체상 합성법을 통해 3’MVIP를 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬의 3’말단에 도입한다.
일부 실시방안에 있어서, R2 구조 중 헤테로고리는 피롤 고리 또는 피페리딘 고리이고, 고리 중 질소 헤테로 원자에 의해 3'MVIP의 연결 사슬 D에 연결되며, 3'MVIP Solid Support의 예시적 구조는 아래와 같다.
일반식에서, m이 1-4인 경우 상기 단량체 중 링커 B부분을 각각 1~4회 분지화 하여 해당하는 Solid Support를 얻는다.
일부 실시방안에 있어서, R2는 -B4(CH2)x1CH(OH)(CH2)x2CH2B5-이고, 여기서 x1은 1-4인 정수이고, x2는 0-4인 정수이며, B4 및 B5는 각각 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자이다.
일반식에서 m이 1-4인 경우, 상기 단량체 중 링커 B부분을 각각 1~4회 분지화 하여 상응하는 Solid Support를 얻는다.
일부 바람직한 실시방안에 있어서, R2는 -NHCH2CH(OH)CH2O-이다. 3’MVIP Solid Support를 도입하는 예시적 구조는 아래와 같다.
일반식에서 m이 1-4인 경우, 상기 단량체의 링커 B 부분을 각각 1~4회 분지화 하여 해당하는 Solid Support를 얻는다.
일부 실시방안에 있어서, 3’MVIP solid support 구조는 아래와 같다.
일부 바람직한 실시방안에 있어서, 5’MVIP 리간드 구조 중 와 R1의 조합은 표 3에 나타낸 바와 같다.
표 3: 5’MVIP 중 와 R1의 조합
일부 실시방안에 있어서, 3’MVIP는 존재하지 않을수 있고, 이때 n은 2-4일 수 있다.
일부 실시방안에 있어서, 3’MVIP 리간드 구조 중 와 R2의 조합은 표 4에 나타낸 바와 같다.
표 4: 3’MVIP의 와 R2조합
본 발명에서 제공한 RNA억제제 구조 중 센스 사슬 및 안티 센스 사슬 사슬 길이는 15-30이고, 바람직하게 19-23이며, 서로간 적어도85%염기 상보적이다. 생체 내에서의 센스 사슬 및 안티 센스 사슬의 안정성을 향상시키기 위해 활성에 영향주지 않고 심지어 활성을 향상시키는 상황에서 RNA억제제의 센스 사슬 및 안티 센스 사슬에 대해 변형할 수 있으며 그 중 뉴클레오티드는 변형치환기가 있을 수 있고 전체 사슬 또는 부분 사슬을 변형할 수 있으며 전체 변형하는 것이 바람직하다. 상기 변형은 당업자가 쉽게 이해할 수 있는 기술이고 글리코실기 부분에 대해 아래의 임의의 하나 이상에서 선택할 수 있다. 예를 들어, 데옥시리보오스 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모사체, 탈염기 뉴클레오티드， 2’-변형 뉴클레오티드， 3’ 내지 3’ 연결(인버터,inverted)뉴클레오티드, 비천연 염기 함유 뉴클레오티드, 브리지 뉴클레오티드, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 해제된 핵염기 유사물, 잠금 뉴클레오티드, 3’-O-메톡시기 (2’뉴클레오티드 간 연결)뉴클레오티드, 2’-F-아라비노스 뉴클레오티드, 5’-Me/2’-플루오로뉴클레오티드, 모르폴리노뉴클레오티드(morpholinonucleotides), 비닐포스포네이트데옥시리보뉴클레오티드(vinylphosphonate deoxyribonucleotides), 비닐 함유 포스포네이트의 뉴클레오티드 및 시클로프로필포스포네이트 함유 뉴클레오티드이다. 여기서, 2’-변형 뉴클레오티드는 2’-O-메틸 뉴클레오티드, 2’-데옥시-2’-플루오로뉴클레오티드, 2’-데옥시뉴클레오티드, 2’-메톡시에틸뉴클레오티드, 2’-아미노뉴클레오티드 및 2’-알킬뉴클레오티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 제공한 RNA억제제에 있어서, 상기 RNA억제제의 센스 사슬 및 안티 센스 사슬은 모두 균일한 변형이 필요하지 않으며 단일 뉴클레오티드에 하나 이상의 변형이 통합될 수 있다. 상기 변형도 염기 부분에서 발생할 수 있고 변형된 핵염기는 합성 및 천연적인 핵염기，예를 들어 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2/N-6 및 O-6치환 퓨린, 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸시토신, 크산틴，하이포크산틴，2-아미노아데닌，아데닌 및 구아닌의 6-알킬기, 아데닌 및 구아닌의 2-알킬기 및 기타 알킬기 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민(2-thiothymine)，2-티오시토신(thiocytosine)，5-할로우라실，시토신，5-프로피닐우라실，5-프로피닐시토신，6-아조우라실，6-아조시토신，6-아조티민，5-우라실，4-티오우라실，8-할로겐, 8-아미노, 8-머캅토(8-mercapto), 8-티오알킬기, 8-히드록실기 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌， 5-할로, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신，7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌， 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌，7-데아자구아닌，7-데아자아데닌， 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
본 발명의 RNA억제제의 센스 사슬 및 안티 센스 사슬의 부분 또는 전부는 2’-O-메틸뉴클레오티드 및/또는 2’-데옥시-2’-플루오로뉴클레오티드이며, 그 센스 사슬의 5’말단과 안티센스 사슬의 3’말단 뉴클레오티드 사이에 적어도 2개의 연속적인 티오포스페이트 결합이 존재하며 바람직하게는 말단의 3개 연속적인 뉴클레오티드 사이의 포스페이트 결합이 황원소에 의해 치환된다.
본 발명에서 제공한 RNA억제제에서, 하나의 단일 사슬에 3’MVIP가 있는 경우, 이 단일 사슬과 상보적인 다른 하나의 단일 사슬에 해당하는 5’MVIP 또는 3’MVIP가 있거나 없다. 상기 RNA억제제의 하나의 단일 사슬에 5’MVIP가 있을 경우, 이와 상보적인 다른 하나의 단일 사슬에 해당하는 3’MVIP 또는 5’MVIP가 있거나 없다. 5’MVIP 및 3’MVIP도 동시에 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬의 해당되는 말단에 연결될 수 있으며, 즉 센스 사슬의 5’말단에 5’MVIP가 있는 경우, 그 3'말단에 3'MVIP가 있을 수도 있다. 안티 센스 사슬의 5’말단에 5’MVIP가 있는 경우, 그 3'말단에 3'MVIP가 있을 수도 있다. 또는 5’MVIP를 센스 사슬 및 안티 센스 사슬의 5’말단에 동시에 배치한다. 또는 3’MVIP를 센스 사슬 및 안티 센스 사슬의 3’말단에 동시에 배치한다.
일부 실시방안에 있어서, 바람직하게 아래 표 5에서 서로 다른 5'MVIP 및 3'MVIP조합은 RNA억제제의 센스 사슬 및 또는 안티 센스 사슬의 서로 다른 위치에 연결되어 HBV의 HBsAg 수준에 대한 영향을 조사한다.
표 5: 5'MVIP 및 3'MVIP의 조합
일부 실시방안에 있어서, 본 발명의 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염은 카르복실산염, 나트륨염, 트리에틸아민염 또는 기타 약용 염의 형태로 제조되거나 합성되는 것이 바람직하다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염은 그 나트륨염 또는 트리에틸아민염인 것이 더 바람직하다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 RNA억제제의 센스 사슬은 아래의 표 6에서 선택된다.
표 6: RNA억제제의 센스 사슬
일부 실시방안에 있어서, 본 발명의 RNA억제제의 센스 사슬은 표 6의 각 서열과 하나, 둘 또는 세 개의 뉴클레오티드가 다르다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 RNA억제제의 안티 센스 사슬은 아래 표 7에서 선택된다.
표 7: RNA억제제의 안티 센스 사슬
일부 실시방안에 있어서, 본 발명의 RNA억제제의 안티 센스 사슬은 표 7의 각 서열과 하나, 둘 또는 세 개의 뉴클레오티드가 다르다.
일부 생체 내외 효과 조사 실시방안에 있어서, 상기 RNA억제제의 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬은 다음 표 8에서 선택된다.
표 8: RNA억제제의 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬
일부 실시방안에 있어서, 본 발명의 RNA억제제의 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬은 표 8의 각 서열과 하나, 둘 또는 세 개의 뉴클레오티드가 다르다.
일부 실시방안에 있어서, 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 5'MVIP 및 3'MVIP를 센스 사슬 (SEQ ID NO. 2) 및/또는 안티 센스 사슬 (SEQ ID NO. 59)의 해당하는 말단에 배치하고, 생성된 RNA억제제가 HBV의 HBsAg 수준 감소 효과에 미치는 영향을 평가한다. RNA억제제 코드, 포함된 단일 사슬 및 SEQ ID NO.는 아래의 표 9과 같다.
표 9
일부 실시방안에 있어서, 5’MVIP01/3'MVIP01, 5’MVIP01/3'MVIP17, 5’MVIP09/3'MVIP09를 조합하여 센스 사슬의 5’말단 및 안티 센스 사슬의 3’말단에 배치하는 것이 바람직하다.
일부 실시방안에 있어서, 바람직하게 5’MVIP01/3'MVIP09, 5’MVIP09/3'MVIP01를 조합하여 센스 사슬의 5’말단 및 3’말단에 배치하는 것이 바람직하다.
다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 간원성 질환을 치료하는 약물 제조에 있어서 상기 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 용도를 더 제공한다. 여기서, 상기 간원성 질환은 간염, 간종양, 간경화, 황달, 제2형 당뇨병, 지방간, 혈액계 응고 질환, 혈액 알부민 및 글로불린 관련 질환, 고지혈증, 죽상 동맥 경화증 및 원발성 고혈압을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또 다른 일 양태에 있어서, 본 발명은 약물 조성물을 제공하며 당해 약물 조성물은 상기 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하며 그 제형은 경구, 정맥 주사 또는 피하 또는 근육내 주사제이며 바람직하게는 피하 주사제이다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 약물 조성물을 제공하며 당해 약물 조성물은 상기 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 기타 B형 간염을 치료하는 약물을 포함한다. 기타 B형 간염을 치료하는 약물은 임상에서 사용된 뉴클레오사이드 유사체 또는 인터페론을 포함하지만 이에 제한되지 않으며 연구 중인 일부 B형 간염 치료 약물 후보도 포함한다. 예를 들어, 면역 조절제는 일 실시방안에 있어서 유전자변형마우스 모델에서 본 발명의 RNA억제제와 현재 만성 B형 간염 치료에 사용되는 1차 약물 테노포비르(tenofovir)의 HBV의 HBsAg에 대한 억제효과를 대조하였다. 시험 결과 항-B형 간염 약물 뉴클레오사이드 유사물은 HBV HBsAg에 대해 억제 효과가 없음을 확인했으며 연합 사용시 본 발명의 RNA억제제의 HBsAg에 대한 억제효과에도 영향을 미치지 않음을 증명하였다.
일부 실시방안에 있어서, 본 발명의 RNA억제제를 현재 만성 B형 간염 치료에 사용되는 1차 약물 엔티카비르(entecavir) 또는 인터페론와 연합 사용하여 HBV에 대한 억제효과 및 상호 간섭 작용이 있는지를 조사하였다. 시험은 널리 사용되는 HepG2.2.15세포주에서 본 발명의 RNA억제제를 서로 다른 농도의 엔티카비르 또는 인터페론과 연합 투여시 HBV에 대한 억제효과를 평가하였다.
일부 실시방안에 있어서, 음성 대조군 siRNA가 사용되며 센스 사슬은 SEQ ID NO. 146이고 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 147이다. HBV의 4가지 일반적인 아형 A, B, C 및 D형에 대한 본 발명의 RNA 억제제의 억제효과를 조사하였다.
일부 실시방안에 있어서, 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 5'MVIP 및/또는 3'MVIP 구조에서 X, L, B, D, R1 및 R2가 부동할 때 상기 RNA억제제 센스 사슬(SEQ ID NO. 2), 안티 센스 사슬(SEQ ID NO. 59)에 해당하는 말단을 조사하였으며 생성된 RNA억제제의 HBV의 HBsAg 수준감소효과에 대한 영향을 평가하였다. X, L, B, D, R1 및 R2 중 하나가 부동할 때 해당되는 5'MVIP 및/또는 3'MVIP 중 다른 부분은 5’MVIP09/3’MVIP09와 동일하다.
일부 실시방안에 있어서, 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 상기 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소시키는 효과에 대한 부동한 간 표적 특이적 리간드 X의 영향을 조사하였다.
표 10
일부 실시방안에 있어서, 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 상기 RNA억제제 작용효과에 대한 서로 다른 분지쇄 L의 영향을 조사하였다.
표 11
비고: *로 표기된 RNA억제제는 동일한 5'MVIP 또는 3'MVIP 구조 중 또는 5'MVIP와 3'MVIP 는 L구조가 서로 부동하다는 것을 의미한다.
일부 실시방안에 있어서, 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 상기 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소시키는 효과에 대한 링커 B의 영향을 조사하였다.
표 12
비고: *로 표기된 RNA억제제는 5'MVIP와 3'MVIP 서로간의 링커 B구조가 부동하다는 것을 의미한다.
일부 실시방안에 있어서, 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 RNA억제제가 HBV의 HBsAg 수준을 감소하는 효과에 대한 연결 사슬 D의 영향을 조사하였다.
표 13
비고: *로 표기된 RNA억제제는 5'MVIP와 3'MVIP 서로 간의 연결 사슬 D구조가 부동하다는 것을 의미한다.
일부 실시방안에 있어서, 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 상기 RNA억제제가 HBV의 HBsAg 수준을 감소시키는 효과에 대한 서로 다른 트랜스포존 R1의 영향을 조사하였다.
표 14
일부 실시방안에 있어서, 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 상기 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소시키는 효과에 대한 서로 다른 트랜스포존 R2의 영향을 조사하였다.
표 15
일부 실시방안에 있어서, 서열 mer수, 허용되는 뉴클레오티드 차이수, 불소화 및 말단 티오화수 등을 포함하여 본 발명의 RNA억제제 Ky-22의 서열을 더욱 최적화하였다. 이러한 조절이 상기 RNA억제제의 HBsAg수준 감소 효과 및 효과의 지속성에 대한 영향을 조사하였고 서열은 표 16를 참고한다.
표 16: Ky-22의 서열 조절표
실시방안 결과에 의하면, Ky-22와 비교할 경우 센스 사슬 길이가 21-mer인 Ky-2201은 HBsAg수준 감소 및 효과 지속성에 있어서 현저한 향상이 없으며 심지어 조금 감소되었다. 따라서 본 발명에서 제공한 RNA억제제 센스 사슬의 길이는 가장 바람직하게 19-mer이다. Ky-22와 비교할 경우 센스 사슬 및 안티 센스 사슬은 각각 하나의 뉴클레오티드가 변화된 Ky-2203이 있으며 그 HBsAg수준 감소 및 효과 지속성은 현저한 영향이 없다. Ky-2203 설계를 기초로 센스 사슬 길이가 21-mer인 Ky-2204와 Ky-2203의 작용효과는 현저한 차이가 없다. Ky-2203를 기초로 불소화 개수를 조절하면 불소화 개수가 상대적으로 적은 Ky-2208의 작용효과가 Ky-2203보다 조금 우수하다. Ky-2204센스 사슬 3'말단의 두개 드리운 뉴클레오티드를 조절하여 얻은 RNA억제제 Ky-2205, Ky-22안티 센스 사슬 3'말단의 두개 뉴클레오티드를 조절하여 얻은 RNA억제제 Ky-2206 및 Ky-2201센스 사슬 3'말단의 두 개 드리운 뉴클레오티드를 조절하여 얻은 RNA억제제 Ky-2202는 조절전 작용 효과에 비해 현저한 차이가 없으므로 본 발명의 RNA억제제는 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 중 각각 1~3개의 뉴클레오티드의 차이를 허용함을 설명한다. Ky-22와 비교할 경우 센스 사슬의 5'말단 및 안티 센스 사슬 3'말단의 연속된 3개의 뉴클레오티드 사이의 인산 에스테르 결합의 황 원자 치환이 취소되어 얻은 Ky-2207은 HBsAg수준 감소 효과 및 효과 지속 시간상 영향이 현저하다.
본 발명은 센스 사슬의 사슬 길이가 19-mer이고 안티 센스 사슬의 사슬 길이가 21-mer인 서열이 바람직하며 여기서 1~3개 뉴클레오티드의 차이를 허용한다.
일부 실시방안에 있어서, 상기 RNA억제제 Ky-2208와 뉴클레오사이드 유사물 테노포비르(tenofovir)(TDF)를 유전자변형마우스 모델에서 항 B형 간염 바이러스 약효대조 및 연합용 약물의 연구를 수행하였다. 실시결과, 테노포비르(TDF)는 HBsAg를 감소시키는 효과가 없으며 Ky-2208는 HBsAg의 수준을 효율적으로 감소시킬 수 있으며 최고로 99.98% 감소시킬 수 있으며 테노포비르(TDF)와 연합 사용시 본 발명의 RNA억제제의 효과는 영향을 받지 않음을 나타낸다.
일부 실시방안에 있어서, 본 발명에서 제공하는 RNA억제제 중 Ky-08, Ky-10, Ky-19, Ky-13, Ky-21, Ky-22, Ky-23, Ky-26, Ky-27, Ky-29, Ky-37 및 Ky-39의 HBV유전자변형마우스모델의 HBsAg에 대한 억제 효과를 조사하였다. 실시결과, 여기서 RNA억제제 Ky-19, Ky-26, Ky-37 및 Ky-39는 HBV유전자변형마우스 생체내에서 적어도 연속 4주간 HBsAg의 발현수준을 93.0%-99.5%이상 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
일부 실시방안에 있어서, 본 발명에서 제공하는 RNA억제제 Ky-2208은 AAV-HBV마우스 생체 내에서 140일좌우 HBsAg수준을 98.2-99.6% 감소시킬 수 있으며 그 생체내에 표면항체 HBsAb가 생성되도록 하며 기능적으로 B형 간염을 치료할 가능성을 나타낸다.
본 발명의 목적, 기술방안 및 유익효과를 더욱 명확하게 하기 위해 본 발명은 아래의 도면을 제공한다.
도 1은 실시예1 1.1.5에 있어서 합성된 ERCd-01-c2의 고해상도 질량 스펙트럼이다.
도 2는 실시예1 1.2.6에 있어서 합성된 3’MVIP17-c1의 고해상도 질량 스펙트럼이다.
도 3은 실시예1 2.1.2에 있어서 합성된 5’MVIP09-ERCd-PFP-c2의 고해상도 질량 스펙트럼이다.
도 4는 실시예2 실시예(1)에 있어서 Ky-00~ Ky-26의 세포주 HepG2.2.15 중 HBsAg수준에 대한 억제 효과도이다.
도 5는 실시예2 실시예(2)에 있어서 Ky-27~ Ky-44의 세포주 HepG2.2.15 중 HBsAg수준에 대한 억제 효과도이다.
도 6은 실시예2 실시예(3), (4) 및 (6)에 있어서 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소시키는 효과에 대한 서로 다른 X/L/D에 따른 영향이다.
도 7은 실시예2 실시예(5)에 있어서 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소시키는 효과에 대한 링커 B에 따른 영향도이다.
도 8은 실시예2 실시예(7) 및 (8)에 있어서 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소시키는 효과에 대한 서로 다른 트랜스포존 R1/R2에 따른 영향도이다.
도 9는 실시예2 실시예(9)에 있어서 HepG2.2.15 세포에서 Ky-22와 엔티카비르 또는 인터페론의 연합 사용에 따른 HBsAg에 대한 억제 효과도이다.
도 10은 실시예2 실시예(9)에 있어서 HepG2.2.15세포에서 Ky-22와 엔티카비르 또는 인터페론 연합 사용이 HBeAg에 대한 억제 효과도이다.
도 11은 실시예2 실시예(9)에 있어서 HepG2.2.15세포에서 Ky-22와 엔티카비르 또는 인터페론 연합 사용이 HBV DNA에 대한 억제 효과도이다.
도 12는 실시예2 실시예(10)에 있어서 4가지 서로 다른 유전자형 (A, B, C, D)HBV세포주에서 Ky-22의 억제 효과도이다.
도 13은 실시예3 실시예(1)에 있어서 RNA억제제의 HBV유전자변형마우스 모델 HBsAg에 대한 억제 효과도이다.
도 14는 실시예3 실시예(2)에 있어서 Ky-22서열의 조절이 HBV유전자변형마우스 HBsAg에 대한 억제 효과도이다.
도 15는 실시예3 실시예(3)에 있어서 AAV-HBV마우스 모델에서 Ky-2208의 투여효과를 조사한 결과도이다.
도 16은 실시예3 실시예(3)에 있어서 AAV-HBV마우스 모델에서의 Ky-2208의 HBsAb 히스토그램이다.
도 17은 실시예3 실시예(4)에 있어서 HBV-Tg마우스에서 Ky-2208과 TDF를 대조 및 연합 사용한 연구의 결과도이다.
아래의 실시예는 본 발명에서 공개한 일부 실시방안을 설명하나 이에 한정되지 않는다. 또한 구체적인 실시방안을 제공할 때, 본 발명자는 그러한 구체적인 실시방안의 응용을 예기하였다. 예를 들어 구체적인 동일한 유형 또는 비슷한 화학 구조를 가진 RNA억제제는 서로 다른 간원성 질환의 치료에 사용된다.
설명:
DMSO는 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide);
DMF는 N,N-디메틸포름아미드(N,N-dimethylformamide);
HOBt는 1-하이드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole);
HBTU는 O-벤조트리아졸-테트라메틸우레아 헥사플루오로 포스페이트(O-benzotriazole-tetramethyluronium hexafluorophosphate);
DIPEA(DIEA)는 N,N-디이소프로필에틸아민(N,N-diisopropylethylamine);
DCM는 디클로로메탄(dichloromethane);
DMAP는 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine);
DMT-CL는 4,4'-디메톡시트리페닐클로로메탄(4,4'-dimethoxytriphenylchloromethane);
MEOH는 메탄올(methanol);
TBTU는 O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우레아테트라플루오로보레이트(O-benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroboric acid);
는 고체상 벡터이고 예를 들어 거대 다공성 아미노메틸수지(macroporous aminomethyl resin)이다.
실시예 1. RNA억제제 Ky-19, Ky-22, Ky-2208, Ky-26, Ky-37 및 Ky-39의 합성
본 발명의 RNA억제제는 고체상 포스포라미다이트법(phosphoramidite method)을 통해 각각의 센스 사슬 및 안티 센스 사슬, 센스 사슬에 해당하는 안티 센스 사슬을 상보적 퀀칭에 의해 얻은 최종 생성물이다. 고체상 포스포라미다이트법의 기본절차는 다음 단계를 포함한다. 1) 탈보호: 초기 단량체 Solid Support 히드록실 보호기(DMTr)를 제거하고. 2) 커플링: 첫번째 포스포라미다이트 단량체를 추가하여 3’에서 5’방향으로 커플링 반응한다. 3) 산화: 생성된 뉴클레오티드 포스포라미다이트를 보다 안정적인 뉴클레오티드 인산 에스테르(즉 3가 인을 5가 인으로 산화)로 산화. 4) 폐쇄: 반응하지 않은 이전 단계의 뉴클레오티드 단량체 5’-OH를 캡핑(capping) 봉인하여 더 이상 반응에 참여하지 않도록 하고; 마지막 포스포라미다이트 단량체가 연결될 때까지 상기 단계를 반복한다. 그런 다음 Solid Support와 초기 단량체 사이의 에스테르 결합을 메틸아민 수용액과 암모니아수로 절단하고 생성된 올리고 뉴클레오티드의 각 염기를 인산의 보호기 시아노에틸(P), 벤조일기(mA, fA), 아세틸(mC)과 함께 제거한다. HPLC로 분리 및 정제한 후 여과 및 멸균하고 동결 건조하여 해당되는 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬을 얻는다.
퀀칭 센스 사슬 및 안티 센스 사슬 재구성 용액의 농도를 정확하게 측정하고 등몰 농도로 혼합한 후 해당 부피의 1/20인 1 MPBS 용액을 추가하고 다시 혼합하고 혼합 시스템을 95℃로 가열하고 5min 동안 지속한 다음 자연 냉각 후 40℃ 또는 실온에서 3h시간 HPLC 검출을 수행하고 단일 사슬 잔류물＜5% 이면 반응이 완료된 것으로 간주한다.
본 발명의 RNA억제제의 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬의 3'말단에 3'MVIP가 있는 경우, 3'MVIP의 solid support를 고체상 합성의 초기 단량체로 하고 3’MVIP의 Solid Support 일반식은 다음과 같다.
m이 1-4일 때, 일반식에서 링커 B 부분을 각각 1~4회 분지화 하여 해당하는 3’MVIP의 Solid Support를 얻는다.
m이 1일 때, 얻은 Solid Support는 RNA억제제 Ky-26의 안티 센스 사슬 및 Ky-39센스 사슬 고체상 합성의 초기 단량체로 사용되며; m이 2일 때, 얻은 Solid Support는 RNA억제제 Ky-37의 센스 사슬, Ky-22 및 Ky-2208의 안티 센스 사슬의 고체상 합성 초기 단량체로 사용되며; m이 3일 때, 얻은 Solid Support는 RNA억제제 Ky-19의 안티 센스 사슬의 고체상 합성 초기 단량체로 사용된다.
본 발명의 RNA억제제의 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬의 5'말단에 5’MVIP가 있을 경우, 5’MVIP 포스포라미다이트 단량체를 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 고체상 합성의 마지막 포스포라미다이트 단량체로 한다. 5’MVIP포스포라미다이트 단량체 일반식은 다음과 같다.
n이 1-4일 때, 일반식에서 링커 B부분은 각각 1~4회 분지화 되어 해당하는 5’MVIP포스포라미다이트 단량체를 얻는다.
n이 1일 때, 얻은 5’MVIP포스포라미다이트 단량체를 RNA억제제 Ky-19, Ky-26 및 Ky-37의 센스 사슬 고체상 합성의 마지막 단량체로 한다. n이 2일 때, 얻은 5’MVIP포스포라미다이트 단량체를 Ky-39, Ky-22 및 Ky-2208의 센스 사슬 고체상 합성의 마지막 단량체로 한다.
본 발명의 이러한 RNA억제제의 센스 사슬 및 안티 센스 사슬은 포스포라미다이트 고체상 합성 전에 해당하는 3’MVIP의 Solid Support와 5’MVIP포스포라미다이트 단량체를 먼저 화학 합성 하여야 한다. 화학 합성 과정은 아래와 같다.
1. 3’MVIP의 Solid Support의 합성
1.1 RNA억제제 Ky-37의 센스 사슬, Ky-22 및 Ky-2208의 안티 센스 사슬의 3'MVIP09의 Solid Support의 합성
3'MVIP09의 Solid Support
합성 과정 설명:
1.1.1. ERC-01-c1의 합성
2-아미노-1,3-프로판디올(2-amino-1,3-propanediol)(5.0g，54.9mmol)을 측량하고 DMSO 50mL, 수산화나트륨용액(1g/mL) 5mL을 넣고 0℃로 식힌 후 tert-부틸아크릴레이트(tert-butyl acrylate)(20mL，137.8mol)를 2시간 적가하여 실온에서 48h 반응시킨 후 석유에테르(100mL), 포화식염수로 2회 세척하고 유기층을 건조시키고 크로마토그래피 컬럼(용리액: 에틸 아세테이트: 석유에테르=25%-75%)을 통과하고 상부 컬럼에 0.05% 트리에틸아민을 추가하여 무색 오일 6.2g을 얻는다.
1.1.2. ERC-01-c2의 합성
ERC-01-c1(6.2g，17.9mmol)를 측량하고 디클로로메탄 50mL, 탄산나트륨용액(25%) 23mL을 추가하고，실온에서 벤질 클로로포메이트(benzyl chloroformate)(8.2mL，57.4mmol)를 2시간 적가한 후 실온에서 하루밤 반응하였다. 포화식염수로 3회 세척하고 무수황산나트륨으로 건조시키고 용매를 증발 건조시킨 후 크로마토그래피 컬럼(에틸 아세테이트:석유에테르=5%-30%)을 통과하여 오일 4.0g을 얻는다.
1.1.3. ERC-01-c3의 합성
ERC-01-c2(4.0g，8.3mmol)를 취하여 포름산12mL을 추가하고 실온에서 하루밤 반응하며 용매를 감압 증발 건조하여 제품2.8g을 얻는다.
1.1.4. ERCd-01-c1의 합성
화합물 ERC-01-c3(1.11g，3.0mmol)과 dlSANC-c4(3.6g，8.04mmol)를 DMF(60 mL)에 넣고 HOBt(2.24g)와 HBTU(3.36g)를 추가한 다음 DIEA(4.16mL)를 천천히 추가한다. 반응액을 실온에서 3시간 교반하며 반응시킨다. 다음 물을 추가하고 물층을 디클로로메탄으로 추출(2x10mL)한다. 유기층을 합병한 후 포화 중탄산 나트륨(80 mL), 물(2x60 mL), 포화식염수(60mL)로 차례로 세척한다. 무수황산나트륨으로 건조하고 감압 증발 건조하며 실리콘 컬럼 크로마토그래피로 정제(용리액: 3-15 % MeOH in DCM)하여 담황색 고체 3.24g을 얻는다.
1.1.5. ERCd-01-c2의 합성
ERCd-01-c1(3.24g，2.6mmol)을 메탄올(60mL)로 용해하고 10% 팔라듐 탄소(Pd-C)(0.3g), 아세트산(2.0mL)을 추가한 다음 상압에서 수소를 추가하고 하루밤 반응한다. 반응액을 규조토로 여과하고 여액을 감압 증발 건조하여 유성물 ERCd-01-c2 2.9g을 얻으며 이의 고해상도 질량 스펙트럼은 도 1을 참조한다.
1.1.6. 3'MVIP09-c1의 합성
반응 플라스크에 SANCd-01-c0(0.824g，1.5mmol)과 ERCd-01-c2(1.09g，1.0mmol)를 차례로 넣고 10mL 의 DCM을 추가하고 교반하면서 용해시킨다. 다음 TBTU(0.963g)와 DIPEA(0.517g)를 차례로 추가하고 하루밤 반응시킨다. 물을 추가하고 DCM으로 추출하며 유기상을 포화식염수로 세척한다. 건조, 여과, 농축한 후 마지막으로 실리카겔 컬럼을 통과시켜 정제하여 제품 1.3g을 얻는다.
1.1.7. 3'MVIP09-c2의 합성
반응 플라스크에 3’MVIP09-c1(1.62g，1μmol)과 10mL의 DCM을 차례로 추가하고 실온에서 교반하면서 용해시킨다. 또한 DMAP(0.366g)와 숙신산 무수물(succinic anhydride)(0.2g，3μmol)을 차례로 추가하고 실온에서 교반하면서 반응시킨다. TLC 분석을 통해 반응이 합격이면 농축하여 DCM을 제거하고 물을 추가하며 DCM으로 추출하고 유기상을 포화식염수로 세척한다. 유기상을 무수황산나트륨으로 건조, 여과, 농축하며 마지막으로 실리카겔 컬럼을 통과하여 정제하여 제품 1.55g을 얻는다.
1.1.8. 3'MVIP09의 Solid Support합성
반응 플라스크에 3’MVIP09-c2(0.86g，0.5μmol)와 10mL DMF를 차례로 추가하여 용해시키고 HBTU(0.19g), DIPEA(0.194g) 및 거대 다공성 아미노메틸수지(2.0g)를 차례로 추가한다. 24h동안 흔들어 여과한 후 10%메탄올/DCM으로 수지를 세척한 후 25%아세트산/피리딘으로 캡핑하며 치환도는 150μmol/g이다.
1.2 RNA억제제 Ky-19 중 안티 센스 사슬의 3'MVIP17의 Solid Support의 합성
3'MVIP17 Solid Support
1.2.1. SANC-01-c1의 합성
합성 절차는 실시예1 중 1.1.1. ERC-01-c1의 합성을 참조한다.
1.2.2 . SANC-01-c2의 합성
합성절차는 실시예1 중 1.1.2. ERC-01-c2의 합성을 참조한다.
1.2.3. SANC-01-c3의 합성
합성절차는 실시예1 중 1.1.3. ERC-01-c3의 합성을 참조한다.
1.2.4. SANCd-01-c1의 합성
합성절차는 실시예1 중 1.1.4. ERCd-01-c1의 합성을 참조한다.
1.2.5. SANCd-01-c2의 합성
합성절차는 실시예1 중 1.1.5. ERCd-01-c2의 합성절차를 참조한다.
1.2.6. 3’MVIP17-c1의 합성
합성절차는 실시예1 중 1.1.6. 3’MVIP09-c1의 합성을 참조하고 합성하여 얻은 3’MVIP17-c1의 고해상도 질량 스펙트럼은 도 2를 참조한다.
1.2.7. 3'MVIP17-c2의 합성
합성절차는 실시예1 중 1.1.7. 3’MVIP09-c2의 합성을 참조한다.
1.2.8. 3’MVIP17의 Solid Support합성
합성절차는 실시예1 중 1.1.8 3’MVIP09의 Solid Support합성을 참조한다.
1.3 RNA억제제 Ky-26의 안티 센스 사슬과 Ky-39센스 사슬의 3'MVIP01의 Solid Support의 합성:
3'MVIP01 Solid Support
합성과정 설명:
1.3.1. 3'MVIP01-c1의 합성
합성절차는 실시예1 중 1.1.6. 3’MVIP09-c1의 합성을 참조한다.
1.3.2. 3'MVIP01-c2의 합성
합성절차는 실시예1 중 1.1.7. 3’MVIP09-c2의 합성을 참조한다.
1.3.3. 3’MVIP01의 Solid Support합성
합성 절차는 실시예1 중 1.1.8. 3’MVIP09의 Solid Support합성을 참조한다.
2. 5'MVIP포스포라미다이트 단량체의 합성
2.1 n이 2일 경우 얻은 5’MVIP포스포라미다이트 단량체를 Ky-22, Ky-2208, Ky-39센스 사슬 고체상 합성의 마지막 단량체
5’MVIP09포스포라미다이트 단량체로 하는 합성:
5'MVIP09포스포라미다이트 단량체
2.1.1. 5’MVIP09-ERCd-PFP-c1의 합성
ERCd-01-c2 (2.18g，2.0mmol)를 측량하여 DMF(50mL)에 용해시키고 모노벤질글루타레이트(monobenzyl glutarate)(0.53g，2.4mmol), DIPEA(0.78g) 및 TBTU(0.84g)를 추가하고 실온에서 교반하면서 하루밤 반응시킨다. 물을 추가하여 퀀칭(50mL)하고, DCM(30mL*3)으로 추출한다. 10% 시트르산(50mL*3), 포화 중탄산 나트륨50mL 및 피리딘100mL으로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조，여과, 회전 증발시킨 후 컬럼을 통과하여 정제하여 제품 5’MVIP09-ERCd-PFP-c1 (2.15g)을 얻는다.
2.1.2. 5’MVIP09-ERCd-PFP-c2의 합성
5’MVIP09-ERCd-PFP-c1 (2.15g，1.66mmol)과 10%팔라듐 탄소(0.21g)를 측량하고 메탄올(50mL)을 추가한 후 실온에서 교반하면서 수소를 추가하여 하루밤 반응한다. 반응이 끝난 후 규조토로 여과하여 팔라듐 탄소를 제거하고 회전 증발시켜 5’MVIP09-ERCd-PFP-c2 조제품 (1.9g)을 얻는다. 그 고해상도 질량 스펙트럼은 도 3에 도시된 바와 같다.
2.1.3. 5'MVIP09-ERCd-PFP의 합성
5’MVIP09-ERCd-PFP-c2 조제품 (1.9g，1.58mmol)을 측량하여 DCM(60mL)에 용해시키고 DIPEA(1.33g)를 추가하여 냉각한 후 펜타플루오로페놀 트리플루오로아세테이트(pentafluorophenol trifluoroacetate)(2.21g，7.9mmol)을 추가하며 실온에서 교반하면서 2h 반응한다. 회전 증발시킨 후 다시 DCM(60mL)에 용해시키고 포화 중탄산 나트륨(30mL*3), 10% 시트르산(30mL*1), 포화식염수(50mL*1)로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조, 여과, 회전 증발시켜 5’MVIP09-ERCd-PFP조제품(2.35g)을 얻는다. 흡입 건조한 후 정제절차 없이 다음 반응에 직접 사용한다.
2.1.4. 5’MVIP09포스포라미다이트 단량체 -c1의 합성
5’MVIP09-ERCd-PFP 조제품 (2.35g，1.58mmol)을 DCM(60mL)에 용해시키고 DIPEA(0.82g，6.32mmol), 6-아미노-1-헥사놀(6-amino-1-hexanol)(0.37g，3.16mmol)을 추가하고 실온에서 교반하면서 하루밤 반응한다. 10%시트르산(30mL)을 추가하고 DCM(30mL*3)로 추출하며 포화식염수(50mL)로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조하며 여과, 회전 증발, 컬럼을 통과하여 정제하여 제품5’MVIP09단량체 -c1 (1.73g)를 얻는다.
2.1.5. 5'MVIP09포스포라미다이트 단량체
5’MVIP09포스포라미다이트 단량체 -c1(1.3g、1.0mmol)을 측량하여 아세토니트릴(30mL)에 용해시키고 디이소프로필아민트리아졸(0.22g)을 추가하며 아이스 배스에서 비스-(디이소프로필아미노)(2-시아노에톡시)포스핀(bis-(diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)phosphine)(0.36g，1.2mmol)을 추가하고 실온에서 4h동안 반응하며 HPLC 컨트롤 하여 반응이 합격된 후 농축시키고 컬럼을 통과하여 정제하여 제품5’MVIP09단량체(1.2g)를 얻는다.
2.2 n이 1일 경우 얻은 5’MVIP 포스포라미다이트 단량체를 Ky-19, Ky-26, Ky-37의 센스 사슬 고체상 합성의 마지막 단량체 5'MVIP01의 포스포라미다이트 단량체로 하는 합성:
5'MVIP01포스포라미다이트 단량체
5'MVIP01의 포스포라미다이트 단량체를 YICd-01-c2 (1.12g，2.0mmol) 측량하고 나머지 작업은 2.1.1.~ 2.1.5.를 참조한다.
실시예 2: 체외시험
실시예 (1): 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 5'MVIP 및 3'MVIP가 센스 사슬 및 안티 센스 사슬이 서로 다른 말단에 커플링 되어 얻은 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소시키는 효과를 평가한다.
시험 과정 설명: 실시예1의 방법에 따라 해당하는 RNA억제제 Ky-00~Ky-26을 준비하고 10% 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM배지를 준비한다. 배양액으로 0.05, 0.5, 5nM RNA억제제 샘플을 포함하는 배지를 준비한다. 105세포 밀도로 HepG2.2.15세포를 접종한다. 10%소 태아 혈청 DMEM배지，37℃，5%CO2에서 24h 배양후 서로 다른 농도의 상기 RNA억제제 샘플을 첨가하여 간섭하고 72h 배양후 상층액을 취하여 HBsAg검출 키트(상하이 커화()，ELISA법)와 간섭하지 않은 HepG2.2.15세포 상층액을 대조하여 샘플 간섭군의 HBsAg 상대 백분율을 보정한다.
얻은 시험 데이터는 도4를 참조한다. 도4에 도시된 바와 같이 Ky-19, Ky-22 및 Ky-26은 다른 화합물보다 HBsAg에 대한 억제 효과가 더 우수하다.
실시예(2): 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 5'MVIP및 3'MVIP가 RNA억제제의 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬의 두개의 말단에 동시에 배치 또는 5'MVIP 또는 3'MVIP가 안티 센스 사슬 및 센스 사슬의 동일한 말단 예를 들어 3’말단 또는 5’말단에 동시에 배치될 경우 얻은 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소시키는 효과를 조사한다.
시험 과정 설명: 실시예1의 방법에 따라 해당하는 RNA억제제 Ky-27~Ky-44를 준비하고 10%소 태아 혈청을 포함하는 DMEM배지를 준비한다. 배양액으로 0.05, 0.5, 5nM RNA억제제 샘플을 포함하는 배지를 준비한다. 105세포 밀도로 HepG2.2.15세포를 접종한다. 10%소 태아 혈청DMEM배지，37℃，5%CO2에서 24h 배양후 서로 다른 농도의 상기 RNA억제제 샘플을 첨가하여 간섭하고 72h 배양후 상층액을 취하여 HBsAg검출 키트(상하이 커화，ELISA법)와 간섭하지 않은 HepG2.2.15세포 상층액을 대조하여 샘플 간섭군의 HBsAg상대 백분율을 보정한다. 얻은 시험 데이터는 도 5를 참조한다.
도 5에 도시된 바와 같이 Ky-37과 Ky-39는 다른 화합물보다 HBsAg에 대한 억제 효과가 우수하다.
실시예(3) 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 서로 다른 간 표적 특이적 리간드 X의 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 평가한다.
서로 다른 간 표적 특이적 리간드 X의 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 조사하여 얻은 RNA억제제 Ky-22, Ky-22-X2~Ky-22-X6 중 X 구조가 개변되는 외 L, B, D 및 R1/R2는 조합5’MVIP09 /3’MVIP09에서와 일치한다.
시험과 관련된 RNA억제제 중 센스 사슬은 SEQ ID NO. 2이고 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 59이며 센스 사슬 5'말단은 5'MVIP와 커플링 되고 안티 센스 사슬 3'말단은 3'MVIP와 커플링 된다.
시험 과정 설명: 실시예 1의 방법에 따라 해당하는 RNA억제제를 준비하고 10%소 태아 혈청을 포함하는 DMEM배지를 준비한다. 배양액으로 10nM RNA억제제 샘플을 포함하는 배지를 준비한다. 105세포 밀도로 HepG2.2.15세포를 접종한다. 10%소 태아 혈청DMEM배지，37℃，5%CO2에서 24h 배양후 약물을 추가하여 간섭하고 72h 배양후 상층액을 취하여 HBsAg검출 키트(상하이 커화，ELISA법)와 간섭하지 않은 HepG2.2.15세포 상층액을 대조하여 샘플 간섭군의 HBsAg상대 백분율을 보정한다.
얻은 시험 데이터는 도 6을 참조한다. 결과에 따르면, X가 각각 갈락토스, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민 및 그 유도체일 경우 얻은 RNA억제제는 N-아세틸갈락토사민 및 그 유도체를 리간드로 하는 것이 바람직하다.
실시예(4) 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 서로 다른 분지쇄 L의 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 평가한다.
서로 다른 분지쇄 L의 RNA억제제가 HBV HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 조사하여 얻은 RNA억제제 Ky-22, Ky-22-L2~Ky-22-L14 중 L구조가 개변되는 외에 X, B, D 및 R1/R2는 조합5’MVIP09 /3’MVIP09에서와 일치한다.
시험과 관련된 RNA억제제 중 센스 사슬은 SEQ ID NO. 2이고 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 59이며 센스 사슬 5'말단은 5'MVIP와 커플링 되고 안티 센스 사슬 3'말단은 3'MVIP와 커플링 된다.
시험 과정 설명: 실시예 1의 방법에 따라 해당하는 RNA억제제를 준비하고 10%소 태아 혈청을 포함하는 DMEM배지를 준비한다. 배양액으로 10nM RNA억제제 샘플을 포함하는 배지를 준비한다. 105세포 밀도로 HepG2.2.15세포를 접종한다. 10%소 태아 혈청DMEM배지，37℃，5%CO2에서 24h 배양후 약물을 추가하여 간섭하고 72h 배양후 상층액을 취하여 HBsAg검출 키트(상하이 커화，ELISA법)와 간섭하지 않은 HepG2.2.15세포 상층액을 대조하여 샘플 간섭군의 HBsAg상대 백분율을 보정한다.
얻은 시험 데이터는 도 6을 참조한다. 결과에 따르면, L의 길이가 RNA억제제의 작용 효과에 대한 영향이 비교적 크고 L 사슬은 너무 짧거나 너무 길지 않아야 한다. -NH-, C=O, O, S, 아미드기, 포스포릴기, 티오포스포릴기, 지방족 탄소 고리기 예를 들면 사이클로헥산 또는 이러한 치환기의 조합을 포함할 경우 또는 동일한 5'MVIP, 3'MVIP구조 중 또는 5'MVIP와 3'MVIP의 L구조가 서로 다르고 사슬이 C7-C18범위일 때 얻은 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과는 차이가 크지 않다.
실시예(5) 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 링커 B의 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 평가한다.
서로 다른 링커 B의 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 조사하여 얻은 RNA억제제 Ky-22, Ky-22-B2~ Ky-22-B7, Ky-19, Ky-19-B2~ Ky-19-B12, Ky-26, Ky-26-B2~ Ky-26-B7, Ky-37, Ky-37-B2~ Ky-37-B6, Ky-39, Ky-39-B2~ Ky-39-B6 중 B구조가 개변되는 외에 X, L, D 및 R1/R2는 조합5’MVIP09/3’MVIP09에서와 일치한다.
시험과 관련된 RNA억제제 중 센스 사슬은 SEQ ID NO. 2이고 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 59이며 센스 사슬 5'말단은 5'MVIP와 커플링 되고 안티 센스 사슬 3'말단은 3'MVIP와 커플링 된다.
시험 과정 설명: 실시예 1의 방법에 따라 해당하는 RNA억제제를 준비하고 10%소 태아 혈청을 포함하는 DMEM배지를 준비한다. 배양액으로 10nM RNA억제제 샘플을 포함하는 배지를 준비한다. 105세포 밀도로 HepG2.2.15세포를 접종한다. 10%소 태아 혈청DMEM배지，37℃，5%CO2，에서 24h 배양후 약물을 추가하여 간섭하고 72h 배양후 상층액을 취하여 HBsAg검출 키트(상하이 커화，ELISA법)와 간섭하지 않은 HepG2.2.15세포 상층액을 대조하여 샘플 간섭군의 HBsAg상대 백분율을 보정한다.
얻은 시험 데이터는 도 7을 참조한다. 결과에 따르면 링커 B구조가 개변되는 외에 X, L, D 및 R1/R2는 조합5’MVIP09/3’MVIP09에서와 일치한다. 링커 B 중 일반식에서 A1 및 A2는 각각 독립적으로 C, O, S, -NH-, 카르보닐기, 아미드기, 포스포릴기 또는 티오포스포릴기이고 r는 0-4의 정수이고 링커 B가 5’MVIP와 3’MVIP사이에 동일하거나 다를 때 HBsAg수준 감소에 대한 효과는 크게 다르지 않다.
실시예(6) 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 연결 사슬 D의 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 평가한다.
서로 다른 연결 사슬 D의 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 조사하여 얻은 RNA억제제 Ky-22, Ky-22-D2~ Ky-22-D5 중 D구조가 개변되는 외에 X, L, B 및 R1/R2는 MVIP조합5’MVIP09/3’MVIP09에서와 일치하는 것이 가장 바람직하다.
시험과 관련된 RNA억제제 중 센스 사슬은 SEQ ID NO. 2이고 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 59이며 센스 사슬 5'말단은 5'MVIP와 커플링 되고 안티 센스 사슬 3'말단은 3'MVIP와 커플링 된다.
시험 과정 설명: 실시예 1의 방법에 따라 해당하는 RNA억제제를 준비하고 10%소 태아 혈청을 포함하는 DMEM배지를 준비한다. 배양액으로 10nM RNA억제제 샘플을 포함하는 배지를 준비한다. 105세포 밀도로 HepG2.2.15세포를 접종한다. 10%소 태아 혈청DMEM배지，37℃，5%CO2에서 24h 배양후 약물을 추가하여 간섭하고 72h 배양후 상층액을 취하여 HBsAg검출 키트(상하이 커화，ELISA법)와 간섭하지 않은 HepG2.2.15세포 상층액을 대조하여 샘플 간섭군의 HBsAg상대 백분율을 보정한다.
얻은 시험 데이터는 도 6을 참조한다. 결과에 따르면 MVIP구조와 RNA억제제가 동일할 경우 서로 다른 연결 사슬 D은 RNA억제제의 HBsAg에 대한 억제효과에 영향을 주며 여기서 D1, D2, D4의 효과가 D3과 비슷하거나 더 우수하다.
실시예(7): 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 서로 다른 R 1 의 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 평가한다.
서로 다른 트랜스포존 R1의 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 조사하여 얻은 RNA억제제 Ky-22, Ky-22-R1-1~Ky-22-R1-5는 R1구조가 개변되는 외에 X, L, B, D 및 R2는 MVIP조합5’MVIP09/ 3’MVIP09에서와 일치하는 것이 가장 바람직하다.
시험과 관련된 RNA억제제 중 센스 사슬은 SEQ ID NO. 2이고 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 59이며 센스 사슬 5'말단은 5'MVIP와 커플링 되고 안티 센스 사슬 3'말단은 3'MVIP와 커플링 된다.
시험 과정 설명: 실시예 1의 방법에 따라 해당하는 RNA억제제를 준비하고 10%소 태아 혈청을 포함하는 DMEM배지를 준비한다. 배양액으로 10nM RNA억제제 샘플을 포함하는 배지를 준비한다. 105세포 밀도로 HepG2.2.15세포를 접종한다. 10%소 태아 혈청DMEM배지，37℃，5%CO2에서 24h 배양후 약물을 추가하여 간섭하고 72h 배양후 상층액을 취하여 HBsAg검출 키트(상하이 커화，ELISA법)와 간섭하지 않은 HepG2.2.15세포 상층액을 대조하여 샘플 간섭군의 HBsAg상대 백분율을 보정한다.
얻은 시험 데이터는 도 8을 참조한다. 결과에 따르면 서로 다른 트랜스포존 R1은 RNA억제제의 HBsAg에 대한 억제효과에 영향을 주며 여기서 R1-1를 트랜스포존으로 하는 경우 HBsAg수준을 감소하는 효과가 가장 우수하다.
실시예(8): 세포주 HepG2.2.15를 사용하여 서로 다른 R 2 의 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 평가한다.
서로 다른 트랜스포존 R2의 RNA억제제가 HBV의 HBsAg수준을 감소하는 효과에 대한 영향을 조사하여 얻은 RNA억제제 Ky-22、Ky-22-R2-1~Ky-22-R2-11 중 R2구조가 개변되는 외에 X, L, B, D 및 R1은 MVIP조합5’MVIP09/3’MVIP09에서와 일치하는 것이 가장 바람직하다. 실시예 1의 방법에 따라 준비하여 해당하는 RNA억제제를 얻는다.
시험과 관련된 RNA억제제 중 센스 사슬은 SEQ ID NO. 2이고 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 59이며 센스 사슬 5'말단은 5'MVIP와 커플링 되고 안티 센스 사슬 3'말단은 3'MVIP와 커플링 된다.
시험 과정 설명: 실시예 1의 방법에 따라 해당하는 RNA억제제를 준비하고 10%소 태아 혈청을 포함하는 DMEM배지를 준비한다. 배양액으로 10nM RNA억제제 샘플을 포함하는 배지를 준비한다. 105세포 밀도로 HepG2.2.15세포를 접종한다. 10%소 태아 혈청DMEM배지，37℃，5%CO2에서 24h 배양후 약물을 추가하여 간섭하고 72h 배양후 상층액을 취하여 HBsAg검출 키트(상하이 커화，ELISA법)와 간섭하지 않은 HepG2.2.15세포 상층액을 대조하여 샘플 간섭군의 HBsAg상대 백분율을 보정한다.
얻은 시험 데이터는 도 8을 참조한다. 결과에 따르면 서로 다른 트랜스포존 R2는 RNA억제제가 HBsAg수준을 감소하는 효과에 영향을 주며 여기서 R2-1을 트랜스포존으로 할 경우 HBsAg수준 감소효과가 가장 우수하다.
실시예(9) Ky-22와 현재 만성 B형 간염 치료용 1차 약물 엔티카비르 또는 인터페론을 연합 사용하여 HBV의 억제 효과에 상호 간섭 작용이 있는지를 조사한다.
시험은 널리 사용되는 HepG2.2.15세포주에서 본 발명의 RNA와 서로 다른 농도의 엔티카비르 (ETV) 또는 인터페론(IFN-a)을 연합 투여할 경우 HBV에 대한 억제 효과를 평가하엿다.
시험과 관련된 RNA억제제 Ky-22 중 센스 사슬은 SEQ ID NO. 2이고 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 59이며 센스 사슬 5'말단은 5'MVIP와 커플링 되고 안티 센스 사슬 3'말단은 3'MVIP와 커플링 된다.
시험 과정 설명: 10%소 태아 혈청을 포함하는 DMEM배지를 준비한다. 배양액으로 10nM RNA억제제 Ky-22샘플을 포함하는 배지를 준비한다. 105세포 밀도로 HepG2.2.15세포를 접종한다. 10%소 태아 혈청DMEM배지，37℃，5%CO2에서 24h 배양 후 약물을 추가하여 간섭하고 72h 배양후 상층액을 취하여 HBsAg, HBeAg, HBV DNA를 검출하여 간섭하지 않은 HepG2.2.15세포 상층액과 대조하여 샘플 간섭군의 HBsAg, HBeAg, HBV DNA상대 백분율을 보정한다.
약물 추가 농도는:
ETV: 10μM, 1μM, 0.1μM;
IFN-a: 1000IU/mL, 100IU/mL, 10IU/mL;
Ky-22: 0.125μg/mL;
ETV+Ky-22: 10μM+0.125μg/mL, 1μM+0.125μg/mL, 0.1μM+0.125μg/mL;
IFN-a +Ky-22: 1000IU/mL+0.125μg/mL, 100IU/mL+0.125μg/mL, 10IU/mL+0.125μg/mL
RNA억제제 Ky-22가 HepG2.2.15세포 중 HBsAg 및 HBeAg수준에 대한 영향을 각각 도 9 및 도 10에 표시한다. 결과에 따르면 엔티카비르 또는 인터페론을 단독 사용시 HBsAg 및 HBeAg에 대해 현저한 억제 효과가 없으며 엔티카비르 또는 인터페론을 Ky-22와 연합사용시 HBsAg 및 HBeAg에 대해 현저한 억제 효과를 나타내며 또한 억제 정도는 엔티카비르 또는 인터페론의 농도와 관련성이 없다. 엔티카비르 또는 인터페론은 본 발명 RNA억제제의 HBsAg 및 HBeAg에 대한 억제효과에 영향이 없다. RNA억제제 Ky-22와 엔티카비르 또는 인터페론을 연합 사용시에도 엔티카비르 또는 인터페론의 HBV DNA에 대한 억제 효과에 영향주지 않으며 심지어 인터페론의 HBV DNA에 대한 작용 효과를 더 강화하며 데이터 결과는 도 11을 참조한다. 본 발명의 RNA억제제는 엔티카비르 및 인터페론과 연합 사용할수 있다.
실시예(10) Ky-22가 4가지 서로 다른 유전자형 (A, B, C, D)HBV세포주에 대한 억제 효과를 연구한다.
시험 과정 설명:
세포주 구축: HepG2세포를 기반으로 sleeping beauty의 트랜스포존 시스템으로 HBV유전자 통합을 진행한다. 세포 배양조건: DMEM+10%FBS，37℃, 5% CO2. 4가지 서로 다른 유전자형(A, B, C, D)의 HBV1.3배체 유전자를 Gibson Assembly® Master Mix를 통해 PT2/HB 벡터에 연결하고 적색 형광 단백질과 퓨로마이신 내성 유전자를 동시에 연결하여 세포주 스크리닝시 마커로 사용한다. 구축된 플라스미드를 각각 pCMV(CAT)T7-SB100과 형질 감염 시약 X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent를 사용하여 HepG2세포에 공동 형질감염 시키며 형질 감염 방법은 다음과 같다. 명세서에 따라 10cm 배양접시의 세포 형질 감염에 필요한 형질 감염 시스템을 준비하고 20min 정지하고 합류도가 70%에 달하는 HepG2세포를 세포 현탁액으로 분해하고 준비된 형질 감염 시스템을 추가하고 균일하게 혼합한 다음 인큐베이터에 넣어 배양한다. 형질 감염 48h후 2μg/mL퓨로마이신 내성으로 선별하였으며 퓨로마이신 내성을 발현하지 않는 세포 즉 HBV와 통합되지 않은 세포는 사망되고 HBV와 통합된 세포를 증폭시키고 적색 형광 강도가 높은 세포，즉 HBV통합 복사수가 높은 세포를 유세포분석으로 선별하여 4가지 서로 다른 유전자형의 HBV 안정 통합 세포주를 얻었다.
로그 성장 단계의 A, B, C, D 4가지 유전자형 HBV안정 통합 세포를 세포 현탁액으로 소화시키고 48웰 플레이트(300μl/웰)에 추가하였다. 웰당 약 300,000개 세포를 세포 합류도가 70%(도금후 약 24h후)에 도달한 후 하기 농도의 Ky-22 또는 음성 대조군siRNA(센스 사슬 SEQ ID NO. 146，안티 센스 사슬 SEQ ID NO. 147)을 추가하였다.
4.1μg/mL, 2.2μg/mL, 1.1μg/mL, 0.6μg/mL, 0.3μg/mL, 0.15μg/mL, 0.0725μg/mL, 0.03625μg/mL, 0.018125μg/mL, 0.0090625μg/mL, 0.00453125μg/mL, 0.00226563μg/mL, 0.00113281μg/mL, 0.000566406μg/mL, 0.000283203μg/mL
또는 약물을 추가하지 않고 각각 24h，48h，72h에서 상층액을 수집하여 -20℃에서 보관후 약물 없는 신선한 배지로 대체하였다. 세포 상층액에서 HBsAg의 함량을 검출하였다.
시험 데이터는 도 12를 참조한다. 결과에 따르면, 음성 대조군siRNA 처리군(Control)에 비해 Ky-22는 A, B, C및 D유전자형의 HBV에 대해 모두 현저한 억제 효과가 있으며 EC50 (ng/mL)은 각각 22.72, 25.45, 29.06 및 23.35이다.
실시예 3 생체내 약효 연구
실시예(1): RNA억제제가 HBV유전자변형마우스 모델에서의 HBsAg 감소효과에 미치는 영향을 연구한다.
실시예 1의 방법에 따라 해당하는 RNA억제제 Ky-08, Ky-10, Ky-13, Ky-19, Ky-21, Ky-22, Ky-23, Ky-26, Ky-27, Ky-29, Ky-37 및 Ky-39를 준비하고 65마리, 수컷, 체중 25~35g, 주령 8-10w의 HBV유전자변형마우스를 선택하여 SPF등급 표준 동물실에서 사육하며 습도 16~26℃, 온도 40~70%, 순환광(명암 각 12시간)에서 자유롭게 먹고 마시게 한다.
동물을 그룹화전 HBV HBsAg를 검출하고 HBV HBsAg발현량에 따라 무작위로 그룹화 하여 각 군의 HBV HBsAg의 평균 수준이 최대한 일치하도록 하였다. 마우스를 대조군(생리적 시염수), 투여군 1-12을 포함하여 각군 5마리씩 13개 군으로 나눈다. 투여 용량은 모두 3mg/kg이고 1회 투여 하였으며 투여일은 d0으로 설정하였다. 각군의 마우스를 대상으로 d0에서 0.04mL/10g 피하주사로 해당 시험 용액을 투여하였다. 동물을 약 4-6주간 관찰하였고 채혈시점d0, d7, d14, d21, d28, d35 및 d42에 채혈하였다. 각군 채혈시간마다 마우스 안와정맥총을 통하여 전혈을 채취하여 3000×g에서 5min 원심분리하고 상층액을 취하여 HBV HBsAg발현량을 검출하였다.
각 투여군 동물의 HBsAg 수준은 투여전과 대조군으로 정규화 하였고 시험 데이터는 도 13에 나타낸다.
연구 결과에 따르면 본 발명의 RNA억제제는 첫 3주동안 HBV HBsAg수준을 현저히 감소시키는 효과를 보였으며 가장 우수한 감소율은 99.8%에 달한다. 5'MVIP와/또는 3'MVIP 와의 커플링 위치가 서로 다르므로 각 RNA억제제의 HBsAg 감소 효과의 지속 시간은 일치하지 않으며 여기서 Ky-19, Ky-22, Ky-26, Ky-29, Ky-37 및 Ky-39는 d28에서 HBV HBsAg수준이 여전히 93%이상 감소되는 효과를 보여주고 Ky-22효과의 지속성이 제일 우수하고 d35에서 HBV HBsAg수준이 91%이상 감소되는 효과를 유지하였다.
실시예(2): Ky-22서열 조정이 HBV유전자변형마우스 HBsAg에 대한 억제 효과에 대한 영향을 조사한다.
실시예 1의 방법에 따라 해당하는 RNA억제제 Ky-22, Ky-2201~Ky-2208를 준비하고 50마리, 수컷, 체중 25~35g, 주령8-13w인 HBV유전자변형마우스를 선택하여 SPF등급 표준 동물실에서 사육하며 습도 16~26℃，온도 40~70%，순환광(명암 각 12시간)에서 자유롭게 먹고 마시게 한다.
동물을 그룹화전 HBV HBsAg를 검출하고 HBV HBsAg발현량에 따라 무작위로 그룹화하여 각군의 HBV HBsAg의 평균 수준이 최대한 일치하도록 하였다. 마우스를 대조군(생리적 식염수), 투여군 (9군)을 포함하여 각군 5마리씩 10개 군으로 나눈다. 투여 용량은 모두 3mg/kg이고 1회 투여 하였으며 투여일은 d0으로 설정하였다. 각군의 마우스를 대상으로 d0에서 0.04mL/10g피하주사로 해당 시험 용액을 투여하였다. 동물을 약 6주간 관찰하였고 채혈시점 d0, d7, d14, d21, d28, d35 및 d42에 채혈하였다. 각군 채혈시간마다 마우스 안와정맥총을 통하여 전혈을 채취하여 3000×g에서 5min원심분리하고 상층액을 취하여 HBV HBsAg발현량을 검출하였다.
각 투여군 동물의 HBsAg수준은 투여전과 대조군으로 정규화 하였다.
시험 데이터는 도 14를 참조한다. 실험 결과에 따르면, Ky-22와 대조할 경우 센스 사슬 길이가 21-mer인 Ky-2201은 HBsAg수준 감소 및 효과 지속성에 있어서 현저한 향상이 없으며 심지어 조금 감소하였다. 따라서 본 발명에서 제공한 RNA억제제 센스 사슬 길이는 가장 바람직하게 19-mer이다. Ky-22와 대조할 경우 센스 사슬 및 안티 센스 사슬 중 각각 하나의 뉴클레오티드가 변화된 Ky-2203는 HBsAg수준 감소 및 효과 지속성에 있어서 선명한 영향이 없다. Ky-2203 설계를 기초로 센스 사슬 길이가 21-mer인 Ky-2204와 Ky-2203의 작용 효과는 현저한 차이가 없다. Ky-2203를 기초로 불소화수를 조절하면 불소화수가 상대적으로 적은 Ky-2208의 작용 효과는 Ky-2203보다 조금 우수하다. 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 3'말단의 두개 드리운 뉴클레오티드를 변환하여 얻은 RNA억제제 Ky-2205 및 Ky-2206은 변환전 작용 효과와 현저한 차이가 없다. 이로부터 본 발명의 RNA억제제는 센스 사슬 및 안티 센스 사슬의 각각 1~3개 뉴클레오티드의 차이를 허용한다는 것을 알수 있다. Ky-22와 대조할 경우 센스 사슬의 5'말단 및 안티 센스 사슬 3'말단의 연속된 3개 뉴클레오티드 사이의 인산 에스테르 결합의 티오닐을 제거하여 얻은 Ky-2207은 HBsAg수준 감소 효과 및 효과 지속시간에 있어서 현저한 영향을 미친다.
본 발명에 있어서 센스 사슬의 사슬은 19-mer이고 안티 센스 사슬의 사슬은 21-mer인 서열이 바람직하며 여기서 1 내지 3개의 뉴클레오티드의 차이를 허용한다.
실시예(3): AAV-HBV마우스 모델에서 Ky-2208의 제제효과 반응, 단일 용량 반복 투여에 의한 HBsAg감소 효과 및 표면 항체 HBsAb 생성 여부를 조사한다.
시험 과정 설명: 적정 연령의 마우스 36마리를 장벽 시설에서 약 7일간 사육하여 매일 관찰하였고 뚜렷한 이상이 발견되지 않은 상황에서 실험을 진행하였다. HBV바이러스를 4℃에서 차례로 해동하고 rAAV8-1.3HBV(Fiveplus Gene Technology Co. Ltd., ayw，바이러스 번호: A2020051801)를 인슐린 주사기로 마우스 꼬리정맥을 통해 각 마우스에 1×1011 v.g.를 주입하였다. 모델링 후 4번째 주에 동물의 혈액을 취하여 원심분리후 혈청을 채취하여 HBsAg지수를 검출하였다. 모델링 후 6번째 주에 혈청의 HBsAg를 검출하고 HBsAg의 검출 결과에 따라 30마리 마우스를 선별하여 5개 군으로 무작위로 나누어 최대한 각군 HBsAg의 평균 수준이 일치하도록 하였다. 그룹화 후 2번째 주에 약물 투여를 시작하고 투여 당일 채혈하여 HBsAg를 검출하였으며 d0일로 설정하였다. 각군의 투여 정보 및 채혈시점은 하기 표와 같다.
각 투여군 동물의 HBsAg수준은 투여전과 대조군으로 정규화 하였고 얻은 시험 데이터 HBsAg 및 HBsAb는 각각 도 15와 도 16을 참조한다.
시험 결과에 따르면, 140일의 전체 조사 기간동안 Ky-2208의 9mg/kg군은 AAV-HBV마우스 모델 체내 HBsAg수준을 93.1%-99.6% 범위로 줄일 수 있었다. 투여군 조사를 반복하여 112일째 되었을 때 억제 효과는 여전히 95%이상 유지되었다. 98일째 단일 투여량은 HBV모델 마우스 체내에서 표면항체 HBsAb가 검출되었으며 마우스 체내에서 새로운 항HBV면역이 생성되었다.
실시예(4): Ky-2208과 현재 만성 B형 간염 치료에 사용되는 1차 약물 테노포비르(TDF)의 대조연구 및 연합사용, HBV유전자변형마우스모델에서 HBV의 HBsAg에 대한 억제 효과 및 간섭작용 유무를 조사한다.
시험 과정 설명: HBV-Tg 수컷, 체중 25~35g，주령 8-13w의 마우스 48마리를 SPF등급 표준 동물실에서 사육하며 습도 16~26℃，온도 40~70%，순환광(명암 각 12시간)에서 자유롭게 먹고 마시게 한다. 화합물로 제조한 용매는 생리 식염수이고 작업액 농도는 0.75mg/mL이다. 동물을 그룹화 하기전에 HBV HBsAg를 검출하고 HBV HBsAg발현량에 따라 48마리 수컷 마우스를 매군 8마리씩 6개 그룹으로 나누고 최대한 각군 HBV HBsAg의 평균 수준이 일치하도록 한다. 실험은 총 6개 그룹을 설정하고 1개 대조군 (0.9%생리 식염수)및 5개 투여군으로 나눈다. d0일에 1회 투여하고 각군 마우스 d0에 해당하는 시험용액을 0.04mL/10g 피하주사 하였다. 투여전 d0， 투여후 d7, d14, d21, d28일에 마우스 안와 정맥총으로 전혈을 채취하여 3000×g에서 5min 원심분리하고 상층액을 채취하여 d0, d7, d14, d21, d28일에 샘플을 보내 HBV HBsAg를 검출한다.
구체적인 투여방법은 하기 표를 참조한다.
비고: sc는 피하주사，po는 위관투여.
얻은 시험 데이터는 도 17을 참조한다. 시험결과에 따르면 뉴클레오사이드 유사형 항B형 간염 약물 TDF는 HBV HBsAg에 대한 억제 효과가 없으며 연합 사용할 경우 본 발명의 RNA억제제의 HBsAg에 대한 억제 효과에 영향을 미치지 않는다. Ky-2208 단독 사용 또는 Ky-2208과 TDF를 연합 사용할 경우 HBsAg 수준을 각각 최고로 99.95% 및 99.98% 감소시킬 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> KYLONOVA (XIAMEN) BIOPHARMA CO., LTD. <120> RNA Inhibitor for Inhibiting Hepatitis B Virus Gene Expression and Application Thereof <130> WP22-0025-LY06 <150> CN202110394458.X <151> 2021-04-13 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand <400> 1 ggguuuuucu cguugacaa 19 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand <400> 2 uugucaacga gaaaaacccu u 21 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sense strand <400> 3 ggguuuuucu uguugacaa 19 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense strand <400> 4 uugucaacaa gaaaaacccu u 21

Claims (12)

  1. B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염에 있어서,
    상기 RNA억제제는 사슬이 15-30인 센스 사슬 및 안티 센스 사슬이 염기쌍을 통해 형성되고 사슬은 바람직하게 19-23인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 센스 사슬 및 안티 센스 사슬 사이의 적어도 85% 염기 상보적이며;
    상기 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬의 뉴클레오티드 글리코실2’위치의 -OH의 부분 또는 전부가 치환될수 있으며 상기 치환기는 불소 또는 메톡시기이며;
    상기 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬의 말단에서 적어도 3개의 인접한 뉴클레오티드 사이의 인산 에스테르 결합이 황화될수 있는 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 센스 사슬은 SEQ ID NO. 1 또는 SEQ ID NO. 1과 뉴클레오티드의 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이고; 상기 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 58 또는 SEQ ID NO. 58과 뉴클레오티드의 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이며,
    센스 사슬: 5' ggguuuuucucguugacaa 3' SEQ ID NO. 1
    안티 센스 사슬: 5' uugucaacgagaaaaacccuu 3' SEQ ID NO. 58
    여기서, g=구아노신，a=아데노신，u=우리딘，c=시티딘인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 센스 사슬은 SEQ ID NO. 2 또는 SEQ ID NO. 2와 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이며; 상기 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 59 또는 SEQ ID NO. 59와 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이며,
    센스 사슬: 5' Gs fGs G U fU U fU fU fC U C G U U G A Cs As A 3' SEQ ID NO. 2
    안티 센스 사슬: 5' Us Us G U C A fA C G A G fA A fA fA A C C Cs Us U 3' SEQ ID NO. 59
    여기서, G=2'-O-메틸구아노신， A=2'-O-메틸아데노신， U=2'-O-메틸우리딘， C=2'-O-메틸시티딘; Gs=2'-O-메틸구아노신-3’-포스포로티오에이트， As=2'-O-메틸아데노신-3'-포스포로티오에이트， Us=2'-O-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트， Cs=2'-O-메틸시티딘-3'-포스포로티오에이트; fG=2'-플루오로구아노신， fA=2'-플루오로아데노신， fU=2'-플루오로우리딘， fC=2'-플루오로시티딘; fGs=2'-플루오로구아노신-3'-포스포로티오에이트， fAs=2'-플루오로아데노신-3'-포스포로티오에이트， fUs=2'-플루오로우리딘-3'-포스포로티오에이트， fCs=2'-플루오로시티딘-3'-포스포로티오에이트인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서,
    상기 센스 사슬은 SEQ ID NO. 140 또는 SEQ ID NO. 140과 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 사슬이고; 상기 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 141 또는 SEQ ID NO. 141과 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 서열이며
    센스 사슬: 5' ggguuuuucuuguugacaa 3' SEQ ID NO. 140
    안티 센스 사슬: 5' uugucaacaagaaaaacccuu 3' SEQ ID NO. 141
    여기서, g=구아노신， a=아데노신， u=우리딘， c=시티딘인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 센스 사슬은 SEQ ID NO. 142 또는 SEQ ID NO. 142와 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 서열이며; 상기 안티 센스 사슬은 SEQ ID NO. 143 또는 SEQ ID NO. 143와 뉴클레오티드 서열이 하나, 둘 또는 세 개가 다른 서열이며,
    센스 사슬: 5' Gs Gs G U fU U fU fU fC U U G U U G A Cs As A 3' SEQ ID NO. 142
    안티 센스 사슬: 5' Us Us G U C A fA C A A G fA A fA A A C C Cs Us U 3' SEQ ID NO. 143
    여기서, G=2'-O-메틸구아노신， A=2'-O-메틸아데노신， U=2'-O-메틸우리딘， C=2'-O-메틸시티딘; Gs=2'-O-메틸구아노신-3’-포스포로티오에이트， As=2'-O-메틸아데노신-3'-포스포로티오에이트， Us=2'-O-메틸우리딘-3'-포스포로티오에이트， Cs=2'-O-메틸시티딘-3'-포스포로티오에이트; fG=2'-플루오로구아노신， fA=2'-플루오로아데노신， fU=2'-플루오로우리딘， fC=2'-플루오로시티딘; fGs=2'-플루오로구아노신-3'-포스포로티오에이트， fAs=2'-플루오로아데노신-3'-포스포로티오에이트， fUs=2'-플루오로우리딘-3'-포스포로티오에이트， fCs=2'-플루오로시티딘-3'-포스포로티오에이트인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA억제제는 5’MVIP 및 3’MVIP의 조합을 더 포함하며,
    상기 5’MVIP 및 3’MVIP는 간 표적 특이적 리간드 X의 리간드 구조를 가지며 또한 분지쇄 L, 링커 B 및 연결 사슬 D를 포함하며;
    상기 5’MVIP는 상기 센스 사슬 및/또는 안티 센스 사슬 5’말단에 커플링 되고 상기 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 5’말단에 연결된 트랜스포존 R1 을 더 포함하며;
    상기 3’MVIP는 상기 안티 센스 사슬 및/또는 센스 사슬 3’말단에 커플링 되고 상기 센스 사슬 또는 안티 센스 사슬 3’말단에 연결된 트랜스포존 R2를 포함하며;
    상기 5’MVIP의 구조는 일반식 I에 나타낸 바와 같고 상기 3’MVIP구조는 일반식 II에 나타낸 바와 같으며,

    여기서,
    n 및 m은 각각 0-4인 정수이고 바람직하게 1-3인 정수이며 n+m=2-6인 정수이며 바람직하게 n+m=2, 3또는 4이며 더욱 바람직하게 4이며;
    상기 트랜스포존 R1 및 R2구조에는 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자를 가지고 있고 일반 구조에는 적어도 하나의 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자가 있으며 R1 및 R2는 구조 중 -NH-, 황 원자 또는 산소 원자가 각각 5'MVIP 및 3'MVIP의 연결 사슬 D 및 센스 사슬 및/또는 안티 센스 사슬 5’말단 및 3'말단과 연결되며 상기 트랜스포존 R1 및 R2는 직쇄일수 있고; 아미드기, 카르복실기 또는 알킬기 등 분지쇄를 가진 직쇄 또는 여러가지 고리형 구조이며， 고리형 구조는 예를 들어 포화 또는 불포화된 지방족 탄소 고리기 혹은 황, 산소 또는 질소 원자를 포함한 5원 또는 6원 헤테로고리기 또는 방향족 탄화수소기이며;
    R1은 바람직하게 -NH(CH2)xCH2O-이며， 여기서 x는 3-12인 정수이고，바람직하게 4-6인 정수이며;
    R2는 바람직하게 -NH(CH2)x1CH(OH)(CH2)x2CH2O이며, 여기서 x1은 1-4인 정수이고， x2는 0-4인 정수이며;
    상기 간 표적 특이적 리간드 X는 갈락토스, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민 및 그 유도체에서 선택되며 바람직하게 N-아세틸갈락토사민 및 그 유도체에서 선택되며 상기 간 표적 특이적 리간드 X는 5’MVIP 및 3’MVIP 각각의 내부 또는 5’MVIP와 3’MVIP사이에서 동일하거나 부동할 수 있고;
    상기 분지쇄 L는 -NH-, C=O, O, S, 아미드기, 포스포릴기, 티오포스포릴기, C4-C10지방족 탄소 고리기, 페닐기 또는 이러한 치환기의 조합을 포함하는 C4-C18직쇄이며，상기 C4-C18직쇄는 에틸 알코올 또는 카르복실산 등 측쇄를 가질수 있고 상기 분지쇄 L는 바람직하게 아미드기 또는 6원 지방족 탄소 고리기를 포함하는 C7-C18직쇄이며 상기 분지쇄 L는 5’MVIP와 3’MVIP 각각의 내부 또는 5’MVIP와 3’MVIP 사이에서 동일하거나 부동할 수 있고;
    상기 링커 B는 아래의 구조에서 선택되며,

    여기서, A1 및 A2는 각각 독립적으로 C, O, S, -NH-, 카르보닐기, 아미드기, 포스포릴기 또는 티오포스포릴기이며 r은 0-4인 정수이고 상기 링커 B는 5’MVIP와 3’MVIP 사이에서 동일하거나 부동할 수 있고;
    상기 연결 사슬 D는 -NH-, C=O, O, S, 아미드기, 포스포릴기, 티오포스포릴기, 방향족 탄화수소기, C4-C10지방족 탄소 고리기, 1-3개 질소를 포함한 5원 또는 6원 헤테로고리기 또는 이러한 치환기의 조합을 포함하는 C3-C18직쇄이고 상기 C3-C18직쇄는 메틸 알코올, 메틸 t-부틸기, 메틸 페놀기, C5-C6지방족고리기의 측쇄를 가질수 있으며 상기 연결 사슬 D는 바람직하게 2개의 C=O, 6원 지방족 탄소 고리기 또는 페닐기를 포함하는 C3-C10직쇄이며 가장 바람직하게 2개의 C=O를 포함하는 C3-C10직쇄인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 5’MVIP는 아래에 표시된 바와 같이5’MVIP01 또는 5’MVIP09이며 상기 3’MVIP는 아래에 표시된 바와 같이 3’MVIP01, 3’MVIP09 또는 3’MVIP17인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 센스 사슬 5’MVIP 및 안티 센스 사슬 3’MVIP의 조합은 5’MVIP01/3’MVIP01, 5’MVIP01/3’MVIP17 또는 5’MVIP09/3’MVIP09이고 또는 상기 센스 사슬 5’MVIP 및 센스 사슬 3’MVIP의 조합은 5’MVIP01/3'MVIP09 또는 5’MVIP09/3'MVIP01인 것을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염.
  10. 간원성 질환을 치료하는 약물 제조에서의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 응용에 있어서,
    상기 간원성 질환은 간염, 간종양, 간경화, 황달, 제2형 당뇨병, 지방간, 혈액계의 응고 질환, 혈액 알부민 및 글로불린 관련 질환, 고지혈증, 죽상동맥경화증, 본태성 고혈압을 포함하나 이에 한정되지 않는 것을 특징으로 하는 응용.
  11. 약물 조성물에 있어서，
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하고，
    상기 제형은 경구제, 정맥주사 또는 피하 또는 근육 주사제이고 바람직하게 피하 주사제인 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  12. 약물 조성물에 있어서，
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 RNA억제제 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 만성 B형 간염을 치료하는 약물 뉴클레오사이드 유사체 또는 인터페론을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
KR1020237038959A 2021-04-13 2022-03-31 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 rna억제제 및 그 응용 KR20240004506A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110394458.X 2021-04-13
CN202110394458.XA CN113171371B (zh) 2021-04-13 2021-04-13 一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的rna抑制剂及其应用
PCT/CN2022/084381 WO2022218163A1 (zh) 2021-04-13 2022-03-31 一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的rna抑制剂及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240004506A true KR20240004506A (ko) 2024-01-11

Family

ID=76923540

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237038959A KR20240004506A (ko) 2021-04-13 2022-03-31 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 rna억제제 및 그 응용

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240175029A1 (ko)
EP (1) EP4324923A1 (ko)
JP (1) JP2024511894A (ko)
KR (1) KR20240004506A (ko)
CN (4) CN113171371B (ko)
AU (1) AU2022256594A1 (ko)
TW (1) TWI835116B (ko)
WO (1) WO2022218163A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113171371B (zh) * 2021-04-13 2022-01-25 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的rna抑制剂及其应用
CN113862268A (zh) * 2021-10-20 2021-12-31 厦门甘宝利生物医药有限公司 Agt抑制剂及其用途
CN114703184B (zh) * 2022-03-11 2024-06-18 厦门甘宝利生物医药有限公司 Lpa抑制剂及其用途
CN116814621A (zh) * 2022-08-05 2023-09-29 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种抑制apoc3基因表达的rna抑制剂及其应用
CN117342983B (zh) * 2023-12-05 2024-02-06 康羽生命科学技术(苏州)有限公司 过乙酰化GalNAc-L96合成方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100494214C (zh) * 2004-12-07 2009-06-03 浙江大学 乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列及制备方法
CN101322847A (zh) * 2008-06-23 2008-12-17 淮安市第四人民医院 基于siRNA池干扰的复合载体介导的抗乙肝病毒基因药物
CN102140459B (zh) * 2010-01-29 2013-04-03 苏州瑞博生物技术有限公司 一种小干扰核酸和药物组合物及其制药应用
CN103333890B (zh) * 2012-12-21 2015-04-15 厦门成坤生物技术有限公司 治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰制剂
CN111372593B (zh) * 2017-10-20 2024-03-19 戴瑟纳制药公司 治疗乙型肝炎感染的方法
CN107929273A (zh) * 2017-12-01 2018-04-20 崔坤元 肝脏靶向药物
CN110218728A (zh) * 2019-06-28 2019-09-10 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种新化合物及其应用
CN113171371B (zh) * 2021-04-13 2022-01-25 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种抑制乙型肝炎病毒基因表达的rna抑制剂及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114621954A (zh) 2022-06-14
AU2022256594A1 (en) 2023-11-16
CN114621954B (zh) 2023-01-31
JP2024511894A (ja) 2024-03-15
CN113171371A (zh) 2021-07-27
CN113171371B (zh) 2022-01-25
CN117597443A (zh) 2024-02-23
WO2022218163A1 (zh) 2022-10-20
US20240175029A1 (en) 2024-05-30
TW202239962A (zh) 2022-10-16
CN114940991B (zh) 2023-02-03
CN114940991A (zh) 2022-08-26
TWI835116B (zh) 2024-03-11
EP4324923A1 (en) 2024-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20240004506A (ko) B형 간염 바이러스 유전자 발현을 억제하는 rna억제제 및 그 응용
TWI750712B (zh) 一種新化合物及其用途
KR102540359B1 (ko) B형 간염 바이러스 감염에 대한 RNAi 작용제
CN106535917A (zh) 用于抑制α‑1抗胰蛋白酶基因表达的组合物及方法
CN113234725B (zh) 一种抑制pcsk9基因表达的rna抑制剂及其应用
CN111511914B (zh) 减少PAPD5和PAPD7 mRNA的核酸分子用于治疗乙型肝炎感染
JP2022521155A (ja) Ｂ型肝炎ウイルス感染のためのＲＮＡｉ薬
WO2021037205A1 (zh) 化合物和药物缀合物及其制备方法和用途
WO2023134705A1 (zh) 抑制angptl3表达的rna干扰剂及其用途
TW202016302A (zh) 用於調節mir-122之微小rna化合物及方法
AU2022352779A1 (en) Oligonucleotide compositions and methods thereof
TW202137987A (zh) 用於治療ｈｂｖ之靶向ｈｂｖ的治療性寡核苷酸及ｔｌｒ７促效劑之醫藥組合
CA3234478A1 (en) Pharmaceutical combinations for treatment of hbv
CN118284695A (zh) 用于治疗hbv的药物组合
EP4396354A1 (en) Oligonucleotide compositions and methods thereof
CN117737057A (zh) 一种具有增强抗乙肝效果的小核酸序列以及其偶联物

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination