CN117737057A - 一种具有增强抗乙肝效果的小核酸序列以及其偶联物 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种新型的偶联物及其治疗用途。具体为一种具有增强抗乙肝效果的小核酸序列以及其偶联物，该偶联物由具有治疗作用的小核酸序列和小分子药物组成，将通过化学方法将具有修饰的一种或几种小分子偶联在小核酸序列的特定位置。该偶联物能够保持小核酸序列和小分子药物原有的治疗效果，并能起到协同作用。并且，该偶联物具有控释能力，能够长久地发挥小分子药物原有的治疗作用。
Description
技术领域
本发明涉及小核酸序列药物领域，特别涉及一种新型小核酸药物及其偶联物及其应用。
背景技术
目前临床上常用的抗病毒药物有干扰素类和核苷(酸)类似物两大类。干扰素则并不直接杀伤或抑制病毒，主要通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；核苷(酸)类似物通过抑制病毒DNA多聚酶和逆转录酶的活性，同时竞争性抑制核苷酸进入病毒DNA链，终止病毒DNA链的延长，干扰病毒DNA的合成，从而发挥抗病毒作用。
然而上述两大类药物均只能通过抑制病毒复制来延缓病情，治愈率非常有限，无法实现大范围的功能治愈，且多数使用口服药物的患者需要终生用药。部分患者在现有药物治疗过程中不少出现耐药。研究人员认为新型作用机制药物或成为唯一选择，因此，开发新型抗乙肝治疗方法毫无疑义成为当前迫切需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种新型小核酸偶联药物及其应用，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为
提供一种具有增强抗乙型肝炎病毒活性的小干扰核酸(siRNA)组，包括正义链和反义链组成的组，所述序列为ALN-1、GBL-1、ARO-X、ARO-S中至少一组
进一步的，本发明还涉及一种小核酸偶联物，偶联物包括上述小核酸siRNA序列的正义链或反义链中嵌入抗乙肝病毒的小分子片段，所述小分子片段选自恩替卡韦及其变体、替诺福韦等肝部疾病治疗的核苷类药物、具有核衣壳抑制功能的分子。
恩替卡韦单体通过磷酸二酯键或者硫代磷酸二酯键链接嵌入到核酸链中。进一步的，按照寡核苷酸固相合成方法，在正义链或者反义链的特定位置加入5’-保护的恩替卡韦亚磷酰胺中间体的乙腈溶液，单链合成完毕后再进行氨解切割步骤，得到RNAi双链体。
所述“特定位置”为嵌入核酸序列正义或反义链中鸟苷单体所在的位置；嵌入方式为替换序列中的鸟苷单体。
所述小分子片段的数量并不特别限定，可以在任一条或者两条核酸链上一共插入1-5个，但可优选为1-4个，1-3个，1-2个，或1个。
进一步的，所述siRNA双链体中可以包括开环结构的核苷单体Agn，结构如
所示；
进一步的，所述siRNA与靶向配体共价连接。
所述靶向配体为GalNac，结构如
所示。
进一步的，所述靶向配体连接于所述siRNA中的5’-端。
所述核衣壳抑制剂结构为
所示，通过磷酸键连接于所述siRNA中反义链的5’-端。
具体的，本发明所涉及的小核酸偶联物结构如表5-表11其中任意一组单独编号的siRNA组所示。
本发明还进一步涉及前述小核酸偶联物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用，以及包含前述小核酸或小核酸偶联物的药物组合物。
有益效果
本发明研究内容利用已知具有抗乙肝病毒的小分子，结合HBV序列信息，通过共价化学键偶联方式，成为具有多种功能的小干扰核酸序列，与现有技术相比本发明具有如下有益效果：
1)既能“破坏”乙肝病毒复制环节中产生的mRNA，阻止其继续表达为病毒蛋白；
2)将原来口服全身递送的小分子化合物，通过本技术靶向递送至肝部，继续并有组织选择性地发挥原有的抗乙肝病毒活性，降低小分子使用剂量，降低毒性；
3)得到靶向递送的小分子在肝部能够做到药物控释，均匀持久地释放药物，提高治疗效果。
通过以上技术，本方案能将大幅度降低机体病毒抗原的水平；给机体免疫力恢复以足够的空间，有望治疗HBV感染者，对于提高抗乙肝的功能性治愈具有现实意义。
附图说明
图1为本发明优选的siRNA序列的沉默效率测试结果；
图2为本发明优选的siRNA序列的细胞毒性试验测试结果；
图3-图5为本发明优选的siRNA序列的乙肝转基因小鼠试验测试结果。
图6为小分子偶联物偶联流程图
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1 5‘-DMT-3’-亚磷酰胺恩替卡韦的合成
1：中间体E-1的合成
(1)N2氛围下，恩替卡韦(3g，10.8mmol)和吡啶(50mL)加入到反应瓶中，冰水浴降温至0-5℃搅拌，滴加TMSCl(8.8g，81.1mmol)，撤去冰水浴升至20℃搅拌6h，再次冰水浴降温，加入BzCl(14.1g，100mmol)，然后室温搅拌过夜，LCMS检测原料基本消耗完毕。
(2)冰水浴下向反应液滴加氨水淬灭，搅拌2h，反应液浓缩，所得固体加入到100mL乙腈中，搅拌过滤得8.8g白色固体。将固体加入到250mL纯化水中，搅拌后过滤，滤饼用50mL水和50mL乙醚洗涤，干燥后得3.4g白色固体，LC：97.8％，Y：82.4％。MS(ESI):m/z[M+H]+理论值382.14，实测值381.93。
2：E-2的合成
(1)将E-1(3g，7.86mmol)，DMAP(0.1g，0.79mmol)和吡啶(40mL)加入到反应瓶中，N2置换，冰水浴下加入DMTr-Cl(5.2g，15.7mmol)固体，加毕撤去冰水浴，加热到90℃搅拌48h，LCMS检测仍有20％的E-1残留。
(2)反应液浓缩，加入100mL EtOAc和100mL水，分液，有机相用100mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品。
(3)柱层析：100g硅胶，湿法上样，DCM：MeOH＝100％～95％：5％得3.8g淡黄色固体。LC：91.4％，Y:70.6％。MS(ESI):m/z[M+H]+理论值684.27，实测值684.08。
3：E-PN的合成
(1)N2氛围下，将E-2(900mg，1.32mmol)和1048b(595mg，1.97mmol)溶于DCM(10mL)中，加入ETT(189mg，1.45mmol)，室温反应3h，TLC检测。原料基本消失，滴加10mL饱和NaHCO3溶液，用20mL DCM萃取，有机层用30mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品。
(2)柱层析：15g硅胶，湿法上样，DCM/MeOH＝100/1+1％TEA得1.0g淡黄色固体。LC：90％，Y:85.7％。MS(ESI):m/z[M+H]+理论值884.38，实测值884.27。
实施例2核衣壳抑制剂9945-亚磷酰胺的合成
本公开实施例中，核衣壳抑制剂9945通过磷酸键连接于所述siRNA中正义链的5‘-端。
核衣壳抑制剂9945-亚磷酰胺的合成：
N2氛围下，将9945(430mg，1mmol)和1048b(392mg，1.3mmol)溶于DCM(10mL)中，加入ETT(143mg，1.1mmol)，室温反应2h，TLC检测。原料基本消失，滴加10mL饱和NaHCO3溶液，用20mL DCM萃取，有机相经20mL饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗品。
柱层析纯化，DCM+1％TEA(300mL)得600mg淡黄色固体(收率：95％，纯度：96％)。MS(ESI):m/z[M+H]+理论值630.31，实测值629.91。
根据本公开的实施例，所述核衣壳抑制剂连接于所述siRNA中正义链的5’-端。
实施例3：缀合了抗HBV药物的RNAi剂双链体
定义：本发明所公开的核酸序列中，以不同英文字符代表修饰的核苷酸及连接键，aM表示2’-O-甲基腺嘌呤核苷，uM表示2’-O-甲基尿嘧啶核苷，gM表示2’-O-甲基鸟嘌呤核苷，cM表示2’-O-甲基胞嘧啶核苷，aF表示2’-氟代腺嘌呤核苷，uF表示2’-氟代尿嘧啶核苷，gF表示2’-氟代鸟嘌呤核苷，cF表示2’-氟代胞嘧啶核苷，A表示2’-脱氧腺嘌呤核苷，T表示2’-脱氧胸腺嘧啶核苷，G表示2’-脱氧鸟嘌呤核苷，C表示2’-脱氧胞嘧啶核苷，*表示以硫代磷酸酯键连接，直接相邻的核苷酸之间没有符号，表示以正常的磷酸酯键连接，E代表恩替卡韦，9945代表具有核衣壳抑制功能的小分子，Agn代表具有开环结构的核苷单体，L96代表GalNAc靶头。
以下RNAi剂双链体的反义链和正义链的寡核苷酸序列部分，均按照J.Org.Chem.2012,77,4566-4577；Curr.Protoc.Nucleic Acid Chem.,81,e107报道的亚磷酰胺偶联技术在用于寡核苷酸合成的固相上合成。
(1)寡核苷酸合成是以Universal-CPG为起始，使用3'-0-(2-氰乙基)亚磷酰胺/4,4'二甲氧基三苯甲基(二甲氧基三苯甲基，DMT)基团保护的方法，在固相载体(可控孔玻璃(CPG)上组装寡核苷酸链。每个合成循环都包括5'-羟基脱保护、偶联、盖帽封端和氧化(硫代)。每个偶联反应都是通过活化适当的亚磷酰胺单体并与载体固定的受保护的核苷酸或寡核苷酸的游离5'-羟基反应来进行的。按照序列信息循环合成得到相应的粗寡核苷酸单链CPG-Oligo，粗寡核苷酸单链从固相载体上裂解下来，并脱除相关保护基团。然后经过制备色谱纯化，超滤脱盐，退火，冷冻干燥步骤得到终产物。
(合成图参见图6)
合成程序包括如下单元：
1)脱保护(De-blocking)：5`-OH端带有DMT基团(二对甲氧三苯甲基)保护的核糖核苷酸，在合成的第一步使用三氯乙酸(TCA)将DMT保护基团从固相载体和核糖核苷酸上脱除，以便裸露核糖核苷酸的5`-OH偶联新的碱基。
2)偶联(Coupling)：核苷酸单体与活化试剂混合，与合成柱中CPG-Oligo进行反应，活化试剂提供一个质子给3’磷酸上二异丙酰胺的N原子，形成亚磷酰胺四唑活性中间体。亚磷酰胺四唑与CPG-Oligo接触时，与其5’羟基发生亲核反应，发生偶联并脱掉四唑，延伸一个核苷酸。
3)盖帽封端(Capping)：由于偶联效率无法达到100％，为了防止未偶联成功的CPG-Oligo继续进入下一步的偶联，使用Cap试剂将CPG-Oligo的5’羟基盖帽封端。
4)氧化(Oxidation)或者硫代：偶联反应后核苷酸通过亚磷酯键(三价磷)与CPG上的寡核苷酸相连，此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，通过氧化试剂将此处三价磷氧化为五价磷。硫代是指通过硫代试剂在弱碱性条件下，将亚磷酯键的三价磷反应形成磷硫键。
表1工艺步骤1物料名称
操作过程如下：
4umolCPG预装柱安装至oligo.Dr 48合成仪，根据表2序列按照如图1程序进行合成。
表2
缀合了恩替卡韦的RNAi剂双链体
所用恩替卡韦亚磷酰胺单体结构如下，
按照寡核苷酸固相合成方法，在正义链或者反义链的特定位置加入5’-保护的恩替卡韦亚磷酰胺中间体的乙腈溶液，单链合成完毕后再进行氨解切割步骤。
(2)氨解
将CPG-Oligo正义链和反义链从合成柱中取出，转移至可耐受压力的3ml离心管中，按照4umol CPG-Oligo加入1ml氨解液(AMA)比例配制，放置在55℃±3℃条件下氨解1h。氨解结束后，室温条件下放置至管内压力降低后，转移至真空离心机中离心抽干2h。
注：AMA裂解液甲胺：氨水＝50：50
(3)纯化
抽干后的样品，加入RNase free水5ml溶解样品，0.45um的滤膜过滤，制备样品离子色谱柱：Bondysil PS-15Q 30*250mm
流速：15ml/min
检测波长：260nm
离子柱制备纯化梯度程序：
流动相：A相：10mM PB(PH＝8.0)+1M NaCl B相：10mM PB(PH＝8.0)
表3
完成纯化后,正/反义链退火得到RNAi剂双链体。
表4
(SS代表正义链，AS代表反义链，后面数字代表序号，后续表格中编码规则同)
表5在ALN RNA链中不同位置缀合恩替卡韦的RNAi剂双链体为例
表6
表7
表8
表9
表10
表11
/>
实施例4生物评价实验
测试例1：siRNA沉默效率测试
实验方法：
利用荧光报告素酶系统，在HEK293细胞中评价序列对HBV X mRNA的沉默效率。针对受试序列，将HBV X mRNA全长序列插入psiCHECK2构建重组质粒。
HEK293(ATCC)细胞培养于添加10％FBS(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基中。转染前一天以每孔15000个细胞的密度接种于96孔板，贴壁后转染。转染过程参照lipofectemine2000(Thermofisher)说明书标准流程。转染体系包括0.4μllipofectemine2000/25ng质粒/孔，及选定剂量的siRNA受试物，每个转染条件设置3个平行孔。siRNA终浓度为0.01nM、0.04nM、0.15nM、0.625nM、2.5nM、10nM、40nM。转染24小时后，使用Dual-Glo@Luciferase Assay System(Promega E2940)按说明书标准流程检测双荧光素酶。检测结果，以无添加siRNA作为对照组，该组“海肾荧光发光值/萤火虫荧光发光值”设定为100％。其他各浓度组“海肾荧光发光值/萤火虫荧光发光值”与对照组数据比较得到相对的发光值。
实验结果如图1和表12所示：
表12
| 序列名称 | EC50(nM) | 序列名称 | EC50(nM) |
| NPD-E13 | 0.9832 | NPD-E17 | 1.408 |
| NPD-E14 | 1.664 | NPD-E18 | 0.8142 |
| NPD-E15 | 0.6407 | NPD-E19 | 0.5083 |
| NPD-E16 | 0.7763 | ALN-HBV02 | 0.6033 |
| ALN-HBV01 | 1.007 |
| 样品编号 | EC50(nM) | 最大敲除效率 | 样品编号 | EC50(nM) | 最大敲除效率 |
| E30 | 2.978 | 0.1639 | E37 | 0.3049 | 0.5735 |
| E31 | 1.958 | 0.2533 | E38 | 0.6791 | 0.4757 |
| E32 | 0.8121 | 0.265 | E39 | 2.039 | 0.2358 |
| E33 | 1.415 | 0.4063 | E40 | 0.6999 | 0.235 |
| E34 | 0.6312 | 0.4236 | E41 | 0.3652 | 0.1163 |
| E35 | 0.8778 | 0.5023 | 66810 | 1.142 | 0.1966 |
| E36 | 0.4072 | 0.4256 | 66810-GNA | 2.592 | 0.2595 |
结论：体外报告基因检测结果显示，嵌入恩替卡韦的序列对靶基因(HBV X ORF)的沉默效率(EC50)，与原序列(ALN-HBV01或ALN-HBV02)无显著性差异。其中，E41样品沉默效率最高。E33、E34、E35、E36、E37、E38受试物最大沉默效率偏低。
测试例2：细胞毒性试验
实验方法：
人肝癌Hep3B细胞(中国科学院上海细胞库)，培养于添加10％胎牛血清(FBS)(Gibco，US)的DMEM(Gibco，US)中，于37℃,5％CO2条件下培养(il60,Thermo Fisher)。转染实验进行当天，使用0.25％Trysin(Gibco，US)消化细胞，计数并以15000cells/孔的密度，体积90μL/孔接种于96孔板。以lipofectemine2000(Thermo Fisher)为载体按标准配置方法转染，lipofectemine2000 0.4μl/孔。siRNA终浓度为0nM、0.15nM、0.625nM、2.5nM、10nM、40nM、160nM。转染72小时后，移除上清液，加入10μL CCK8(索莱宝),孵育1-2h后使用全波长酶标仪(SYNERGY H1，BioTek)于450nm波长下检测吸光度。
实验结果如图2，以上数据表明受试物没有明显的体外毒性。
测试例3：乙肝转基因小鼠试验
实验方法：
选取6-8周雄性HBV转基因鼠(C57B/6N-Tg(1.28HBV)/Vst)，D-2天取血检测HBVDNA，HBsAg。选择30只合格动物入组(HBV DNA大于107)。将30只模型分为5组，每组6只。皮下给予3mg/kg的受试物，给药当天定义为Day 0。给药后在D7，D14，D21，D28天取血检测HBVDNA(QPCR，湖南圣湘生物科技有限公司)和HBsAg(直接化学发光发，迈克生物科技有限公司)。实验终点时安乐死动物，取肝脏检测肝脏总RNA，HBeAg与HBsAg，取血检测AST，ALT，TBIL，ALP，DBIL，TP，ALB，BUN。
实验结果：血清中HBsAg含量变化
3.1血清中HBsAg含量变化(E17-E19)
表13
给药后，所有受试物均能引起血清中HBsAg含量显著降低。给药后28天，各受试物组动物HBsAg含量开始恢复。(参见图4)
3.2血清中HBV DNA含量变化(E17-E19)
表14
给药后，所有受试物均能引起血清中HBV DNA含量降低。相对于阳性对照(ALN-HBV02)组，NPD-E17、NPD-E18及NPD-E19组动物HBV DNA含量降低更为显著。给药后各组动物血清中HBV DNA含量恢复时间点不同。其中，NPD-E17组动物于给药后7天血清中HBV DNA含量达到最低，随后逐渐恢复；NPD-E18与NPD-E19组动物血清中HBV DNA含量于第14天达到最低28天，随后逐渐恢复。相对于NPD-E17受试物组动物，NPD-E18与NPD-E19组动物血清中HBVDNA含量恢复较慢，给药后48天仍观察到1个log的DNA水平降低。(参见图4)
3.3血清中HBV DNA、HBeAg及HBsAg含量变化(E30-E41)
表15
/>
受试物E30-E41同时引起HBsAg、HBeAg和HBV DNA的显著降低。相对于原序列ALN-HBV02，恩替卡韦嵌入序列引起显著得DNA降低。给药后21天观察期内，受试物E30、E32、E35、E38组DNA水平未出现明显回升。相较于其他受试物，受试物E30对HBsAg、HBeAg和HBV DNA的抑制更为显著。(结果参见图3)
3.4第48天血生化结果
表16
/>
给药后48天，相对于PBS对照组，未检测到受试物引起显著的血生化指标变化。提示，该剂量下受试物没有明显的肝肾毒性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (11)
1.一种增强抗乙型肝炎病毒活性的小干扰核酸(siRNA)组，其特征在于，所述小干扰核酸包括正义链和反义链组成的组，所述序列为SEQ NO.1-8所示的ALN-1、GBL-1、ARO-X、ARO-S中至少一组
2.一种小核酸偶联物，其特征在于，所述偶联物包括在权利要求1所述的核酸序列的正义链或反义链中嵌入抗乙肝病毒的小分子片段，所述小分子片段选自恩替卡韦及其变体、替诺福韦及其变体等肝部疾病治疗的核苷类药物、具有核衣壳抑制功能的分子。
3.根据权利要求2所述的小核酸偶联物，所述恩替卡韦单体通过磷酸二酯键或者硫代磷酸二酯键链接嵌入到核酸链中；嵌入的位置为核酸序列正义或反义链中鸟苷单体所在的位置。
4.根据权利要求3所述的小核酸偶联物，所述正义或/和反义链中小分子片段的数量可以是在任一一条或者两条核酸链上一共插入1-5个，但可优选为1-4个，1-3个，1-2个，或1个。
5.根据权利要求2-4任一项所述的小核酸偶联物，所述siRNA进一步与靶向配体共价连接。
6.根据权利要求5所述的小核酸偶联物，所述靶向配体为GalNac，结构如
所示。
7.根据权利要求6所述的小核酸偶联物，进一步的，所述靶向配体连接于所述siRNA的5’端。
8.根据权利要求2所述的小核酸偶联物，所述核衣壳抑制剂结构为
所示，通过磷酸键连接于所述siRNA中反义链的5’端。
9.根据权利要求2-8所述的小核酸偶联物，其序列结构如表5-表11其中任意一组单独编号的siRNA组所示。
10.根据权利要求1所述的小干扰核酸siRNA或权利要求2-8中任一项所述的小核酸偶联物在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
11.一种用于治疗乙型肝炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的小干扰核酸siRNA或权利要求2-8中任一项所述的小核酸偶联物。
Priority Applications (1)
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| CN202211149094.XA CN117737057A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 一种具有增强抗乙肝效果的小核酸序列以及其偶联物 |
Publications (1)
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| CN117737057A true CN117737057A (zh) | 2024-03-22 |
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ID=90249528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| CN202211149094.XA Pending CN117737057A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 一种具有增强抗乙肝效果的小核酸序列以及其偶联物 |
Country Status (1)
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-
2022
- 2022-09-21 CN CN202211149094.XA patent/CN117737057A/zh active Pending
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