KR20230026450A - 항암 약물로서의 퀴녹살린 유도체 - Google Patents

항암 약물로서의 퀴녹살린 유도체 Download PDF

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KR20230026450A
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아비프사 고쉬
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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00077
의 아자퀴놀론 화합물, 및 의약에서의 이의 용도에 관한 것이다.

Description

항암 약물로서의 퀴녹살린 유도체
본 발명은 효소의 폴리(ADP-리보스) 폴리머라아제(PARP) 패밀리를 억제하는 치환된 아자퀴놀론 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 염에 관한 것이다. 본 발명은 또한 의약에서의, 예를 들어 PARP1 또는 PARP1 기능의 억제가 치료적으로 중요한 질환의 치료에서의 이들 화합물 및 이의 제약상 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 화합물을 사용하는 약제의 제조 방법 및 치료 방법에 관한 것이다.
PARP 패밀리의 효소는 복제, 재조합, 염색질 리모델링 및 DNA 손상 복구와 같은 다수의 세포 과정에서 중요한 역할을 한다(문헌[O’Connor MJ, Mol Cell (2015) 60(4) :547-60]).
PARP 억제제 및 그의 작용 메커니즘의 예는 예를 들어 WO2004/080976에 교시되어 있다.
PARP1 및 PARP2는 DNA 손상 복구에서의 역할에 대해 가장 광범위하게 연구된 PARP이다. PARP1은 DNA 손상 파괴에 의해 활성화되고 표적 단백질에 대한 폴리(ADP-리보스)(PAR) 사슬의 부가를 촉매하는 기능을 한다. PAR화(PARylation)로 알려진 이 번역 후 변형은 DNA 병변으로의 추가 DNA 복구 인자의 모집을 매개한다.
이러한 모집 역할의 완료 후 PARP 자가-PAR화는 DNA로부터의 결합 PARP의 방출을 촉발하여 다른 DNA 복구 단백질에 대한 접근을 허용하여 복구를 완료한다. 따라서 손상된 부위에 대한 PARP의 결합, 그의 촉매 활성, 및 DNA로부터의 그의 최종 방출은 모두 암세포가 화학요법제 및 방사선 요법에 의해 야기되는 DNA 손상에 반응하는 중요한 단계이다(문헌[Bai P. Biology of poly(ADP-ribose) polymerases: the factotums of cell maintenance. Mol Cell 2015;58:947-58.]).
PARP 패밀리 효소의 억제는 상보적인 DNA 복구 경로를 불활성화하여 암세포를 선택적으로 사멸시키는 전략으로 활용되었다. 다수의 전임상 및 임상 연구에서 상동 재조합(HR)에 의한 이중 가닥 DNA 파괴(DSB) 복구에 관여하는 주요 종양 억제 단백질인 BRCA1 또는 BRCA2의 유해한 변경을 포함하는 종양 세포가 PARP 패밀리의 DNA 복구 효소의 소분자 억제제에 선택적으로 민감하다는 것이 입증되었다. 이러한 종양은 결함성 상동 재조합 복구(homologous recombination repair; HRR) 경로를 가지며, 생존을 위해 PARP 효소 기능에 의존한다. PARP 억제제 요법은 주로 BRCA-돌연변이 암을 표적으로 했지만 PARP 억제제는 상동 재조합 결함(homologous recombination deficiency; HRD)을 나타내는 비-BRCA 돌연변이 종양에서 임상적으로 시험되었다(문헌[(Turner N, Tutt A, Ashworth A. Hallmarks of 'BRCAness' in sporadic cancers. Nat Rev Cancer 2004;4: 814-9.]).
PARP1에 대한 개선된 선택성을 갖는 PARP 억제제는 다른 임상적 PARP1/2 억제제와 비교하여 개선된 효능 및 감소된 독성으로 이어질 수 있는 것으로 여겨진다. 또한 PARP1을 선택적으로 강력하게 억제하면 DNA 상에 PARP1이 포획되어, S-기의 복제 분기점의 붕괴를 통한 DNA 이중 가닥 파괴(DSB)로 이어진다고 여겨진다. 또한 PARP1-DNA 포획은 HRD를 갖는 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 효과적인 메커니즘인 것으로 여겨진다.
따라서 효과적이고 안전한 PARP 억제제, 특히 PARP1에 대한 선택성을 갖는 PARP 억제제에 대한 충족되지 않은 의학적 요구가 존재한다.
본 출원인은 놀랍게도 본원에 기술된 아자퀴놀론이 PARP 억제 활성을 가지며, 따라서 PARP 기능이 약리학적 중요성을 갖는 질환 및 병태의 치료에 유용할 수 있음을 발견하였다. 또한, 본원에 기술된 아자퀴놀론은 PARP2, PARP3, PARP5a 및 PARP6과 같은 다른 PARP 패밀리 구성원에 비해 PARP1에 대해 놀랍도록 높은 선택성을 갖는다.
본 출원인은 놀랍게도 본원에 기술된 아자퀴놀론이 혈액 뇌 장벽(BBB)을 투과할 수 있음을 추가로 발견하였다. 따라서, 본원에 기술된 아자퀴놀론은 뇌 및 척수와 같은 중추신경계의 조직에서 발생하는 질환 및 병태의 치료에 유용할 수 있다.
일 양태에서, 본 출원인은 하기 화학식 I의 화합물 부류, 또는 이의 제약상 허용가능한 염을 사용할 수 있게 한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
여기서,
R1은 H, C1-4 알킬, C3-6 시클로알킬, C1-4 플루오로알킬, 및 C1-4 알킬옥시로부터 독립적으로 선택되며;
R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 독립적으로 선택되며;
R3은 H 또는 C1-4 알킬이며;
R4는 할로 또는 C1-4 알킬이다.
또 다른 양태에서, 본 출원인은 하기 화학식 I의 화합물 부류, 또는 이의 제약상 허용가능한 염을 사용할 수 있게 한다:
[화학식 I]
Figure pct00002
여기서,
R1은 H, C1-4 알킬, C1-4 플루오로알킬, 및 C1-4 알킬옥시로부터 독립적으로 선택되며;
R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 독립적으로 선택되며;
R3은 H 또는 C1-4 알킬이며;
R4는 할로 또는 C1-4 알킬이다.
일 양태에서, R1은 메틸, 에틸, 이소프로필, 시클로프로필, 1,1-디플루오로에틸, 1-플루오로에틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 및 메톡시 중 어느 하나로부터 선택된다. 특정 양태에서, R1은 메틸 또는 에틸이다.
일 양태에서, R2는 H, 클로로, 플루오로, 메틸, 및 디플루오로메틸 중 어느 하나로부터 선택된다. 일 양태에서, R2는 플루오로 또는 메틸이다.
일 양태에서, R3은 메틸 또는 에틸이다.
일 양태에서, R4는 클로로, 플루오로 및 메틸 중 어느 하나로부터 선택된다. 특정 양태에서, R4는 플루오로이다.
일 양태에서, R1이 C1-4 알킬이며, R2가 할로이며, R3이 C1-4 알킬이며, R4가 할로 또는 C1-4 알킬인 화학식 I의 화합물, 또는 이의 제약상 허용가능한 염이 제공된다.
추가 양태에서, 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물, 또는 이의 제약상 허용가능한 염, 및 적어도 하나의 제약상 허용가능한 희석제, 부형제 또는 불활성 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
추가 양태에서, PARP1의 억제가 유익한 질환 및 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염이 제공된다. 일 양태에서, 본 명세서는 암 치료에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염을 제공한다. 일 양태에서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암, 예컨대 위암 및 결장직장암, 또는 폐암, 예컨대 소세포 또는 비소세포 폐암이다. 일 양태에서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암 또는 전립선암이다. 일 양태에서, 암은 신경교종 또는 교모세포종과 같은 뇌암이다. 일 양태에서, 뇌암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암, 예컨대 위암 및 결장직장암, 또는 폐암, 예컨대 소세포 또는 비소세포 폐암과 같은 신체의 다른 부위의 종양으로 인해 생기는 전이성 암이다.
추가 양태에서, PARP1 억제가 유익한 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 본 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 상기 질환 또는 병태는 암이다. 일 양태에서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암, 예컨대 위암 및 결장직장암, 또는 폐암, 예컨대 소세포 또는 비소세포 폐암이다. 일 양태에서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암 또는 전립선암이다. 일 양태에서, 암은 신경교종 또는 교모세포종과 같은 뇌암이다. 일 양태에서, 뇌암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암, 예컨대 위암 및 결장직장암, 또는 폐암, 예컨대 소세포 또는 비소세포 폐암과 같은 신체의 다른 부위의 종양으로 인해 생기는 전이성 암이다.
추가 양태에서, PARP1의 억제가 유익한 질환 또는 병태의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염이 제공된다. 일 양태에서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암, 예컨대 위암 및 결장직장암, 또는 폐암, 예컨대 소세포 또는 비소세포 폐암이다. 일 양태에서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암 또는 전립선암이다. 일 양태에서, 암은 신경교종 또는 교모세포종과 같은 뇌암이다. 일 양태에서, 뇌암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암, 예컨대 위암 및 결장직장암, 또는 폐암, 예컨대 소세포 또는 비소세포 폐암과 같은 신체의 다른 부위의 종양으로 인해 생기는 전이성 암이다.
추가 양태에서, PARP1의 억제가 유익한 질환 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에서의 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염의 용도가 제공된다. 일 양태에서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암, 예컨대 위암 및 결장직장암, 또는 폐암, 예컨대 소세포 또는 비소세포 폐암이다. 일 양태에서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암 또는 전립선암이다. 일 양태에서, 암은 신경교종 또는 교모세포종과 같은 뇌암이다. 일 양태에서, 뇌암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암, 예컨대 위암 및 결장직장암, 또는 폐암, 예컨대 소세포 또는 비소세포 폐암과 같은 신체의 다른 부위의 종양으로 인해 생기는 전이성 암이다.
추가 양태에서, 혈액 뇌 장벽(BBB)을 투과할 수 있는 화학식 I의 화합물이 제공된다. 일 양태에서, BBB를 투과하는 화합물의 비는 >0.1이고, 여기서, 1은 완전한 BBB 투과이고 0은 투과 없음이다. 일 양태에서, BBB를 투과하는 화합물의 비는 >0.2이다. 일 양태에서, BBB를 투과하는 화합물의 비는 >0.3이다. 일 양태에서 BBB를 투과하는 화합물의 비는 래트 kpuu 분석을 사용하여 측정된다. 일 양태에서, 화학식 I의 화합물은 래트 kpuu 분석에서 측정된 바와 같이 >0.3(즉, 0.3 내지 1)의 비를 갖는다.
추가 양태에서, 의약에 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염이 제공된다.
추가 양태에서, 화학식 I의 화합물은 유리 염기 형태이다.
추가 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염이 제공된다.
추가 양태에서, 본원에 개시된 실시예가 제공된다.
일 양태에서, 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 또는 이의 제약상 허용가능한 염인 화학식 I의 화합물이 제공된다.
일 양태에서, 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 또는 이의 제약상 허용가능한 염인 화학식 I의 화합물이 제공된다.
일 양태에서, 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 결정질 형태 B 또는 이의 제약상 허용가능한 염인 화학식 I의 화합물이 제공된다.
일 양태에서, 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 결정질 형태 D 또는 이의 제약상 허용가능한 염인 화학식 I의 화합물이 제공된다.
일 양태에서, 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 메실레이트(선택적으로 결정질 형태 C로서)인 화학식 I의 화합물이 제공된다.
추가 양태는 본 명세서를 읽음으로써 당업자에게 명백해질 것이다.
인간 에테르-
Figure pct00003
-gogo 관련 유전자(hERG)에 의해 코딩된 심장 이온 채널의 차단이 신약 발견 및 개발의 위험 요인이라는 것은 잘 알려져 있다. hERG의 차단은 심장 부정맥과 같은 안전 상의 문제를 야기할 수 있다. 유리하게는, 화학식 I의 화합물은 낮은 hERG 활성을 갖는다. 일 양태에서, IC50 >10 μM인 화학식 I의 화합물이 제공된다. 일 양태에서, IC50 >20 μM인 화학식 I의 화합물이 제공된다.
오프타겟(off-target) 효과의 위험을 최소화하기 위해 약물 분자가 특정 표적에 대한 선택성을 갖는 것이 바람직하다. 화학식 I의 화합물은 유리하게는 PARP2, PARP3, PARP5a 및 PARP6을 포함하는 PARP 패밀리의 다른 구성원에 비해 PARP1에 대한 선택성을 갖는다. 유리하게는, 화학식 I의 화합물은 PARP2에 비해 PARP1에 대한 선택성을 갖는다. 일 양태에서, PARP2에 비해 PARP1에 대해 10배의 선택성을 갖는 화학식 I의 화합물이 제공된다. 일 양태에서, PARP2에 비해 PARP1에 대해 100배의 선택성을 갖는 화학식 I의 화합물이 제공된다.
또 다른 추가 양태는 면역종양학 또는 항체-약물 콘쥬게이트와 같은 항체-기반 요법, 또는 이온화 방사선 또는 화학요법제를 이용한 치료를 위해 종양 세포를 강화하기 위한 또는 암 요법에서 보조제로서 사용하기 위한 약제의 제조에서의 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.
다른 추가 양태는 PARP1의 억제에 의해 개선되는 질환의 치료법으로서, 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물(바람직하게는 제약 조성물 형태)을 투여하는 단계를 포함하는, 치료법과, 암의 치료법으로서, 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의 화학식 I의 화합물(바람직하게는 제약 조성물 형태)을 이온화 방사선 또는 화학요법제와 동시에 또는 순차적으로 조합하여 투여하는 단계를 포함하는, 치료법을 제공한다.
추가 양태에서, 화학식 I의 화합물은 상동 재조합(HR) 의존성 DNA DSB 복구 활성 결함성인 암의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있거나, 또는 HR 의존성 DNA DSB 복구 활성 결함성인 암 환자의 치료법으로서, 상기 환자에게 치료적 유효량의 본 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료법에 사용될 수 있다.
HR 의존성 DNA DSB 복구 경로는 상동 메커니즘을 통해 DNA의 이중 가닥 파괴(DSB)를 복구하여 연속적인 DNA 나선을 재형성한다(문헌[K.K. Khanna and S.P. Jackson, Nat. Genet. 27(3): 247-254 (2001)]). HR 의존성 DNA DSB 복구 경로의 구성 요소는 ATM(NM_000051), RAD51(NM_002875), RAD51L1(NM_002877), RAD51C(NM_002876), RAD51L3(NM_002878), DMC1(NM_007068), XRCC2(NM_005431), XRCC3(NM_005432), RAD52(NM_002879), RAD54L(NM_003579), RAD54B(NM_012415), BRCA1(NM_007295), BRCA2(NM_000059), RAD50(NM_005732), MRE11A(NM_005590) 및 NBS1(NM_002485)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. HR 의존성 DNA DSB 복구 경로에 관련된 다른 단백질은 EMSY와 같은 조절 인자를 포함한다(문헌[Hughes-Davies, et al., Cell, 115, pp523-535]). HR 구성 요소는 또한 문헌[Wood, et al., Science, 291, 1284-1289 (2001)]에 기술되어 있다.
HR 의존성 DNA DSB 복구 결함성인 암은 정상 세포에 비해 그 경로를 통한 DNA DSB 복구 능력이 감소되거나 없어진 하나 이상의 암세포를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 즉, HR 의존성 DNA DSB 복구 경로의 활성이 상기 하나 이상의 암세포에서 감소되거나 무효화될 수 있다.
HR 의존성 DNA DSB 복구 경로의 하나 이상의 구성 요소의 활성은 HR 의존성 DNA DSB 복구 결함성인 암을 갖는 개체의 상기 하나 이상의 암세포에서 무효화될 수 있다. HR 의존성 DNA DSB 복구 경로의 구성 요소는 당업계에서 잘 특성화되어 있으며(예를 들어, 문헌[Wood, et al., Science, 291, 1284-1289 (2001)] 참조), 상기 열거된 구성 요소를 포함한다.
일 양태에서, 암세포는 BRCA1 및/또는 BRCA2 결함성 표현형을 가질 수 있다. 즉, BRCA1 및/또는 BRCA2 활성이 암세포에서 감소되거나 무효화된다. 이 표현형을 갖는 암세포는 BRCA1 및/또는 BRCA2 결함성일 수 있다. 즉, BRCA1 및/또는 BRCA2의 발현 및/또는 활성은 예를 들어 코딩 핵산의 돌연변이 또는 다형성에 의해, 또는 조절 인자를 코딩하는 유전자, 예를 들어 BRCA2 조절 인자를 코딩하는 EMSY 유전자의 증폭, 돌연변이 또는 다형성에 의해 암세포에서 감소되거나 무효화될 수 있다(문헌[Hughes-Davies, et al., Cell, 115, 523-535]).
BRCA1 및 BRCA2는 이형접합 보인자의 종양에서 야생형 대립유전자가 빈번하게 손실되는 알려진 종양 억제자이다(문헌[Jasin M., Oncogene, 21(58), 8981-93 (2002)]; 문헌[Tutt, et al., Trends Mol Med., 8 (12), 571-6, (2002)]). BRCA1 및/또는 BRCA2 돌연변이와 유방암의 연관성은 당업계에 잘 특성화되어 있다(문헌[Radice, P.J., Exp Clin Cancer Res., 21(3 Suppl), 9-12 (2002)]). BRCA2 결합 인자를 코딩하는 EMSY 유전자의 증폭은 유방암 및 난소암과 관련이 있는 것으로도 알려져 있다. 또한 BRCA1 및/또는 BRCA2의 돌연변이 보인자는 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암 및 폐암을 포함한 특정 암의 위험도가 상승된다.
일 양태에서, 개체는 BRCA1 및/또는 BRCA2 또는 이의 조절자의 돌연변이 및 다형성과 같은 하나 이상의 변이에 대해 이형접합성이다. BRCA1 및 BRCA2의 변이의 검출은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 EP 699 754, EP 705 903, 문헌[Neuhausen, S.L. and Ostrander, E.A., Genet. Test, 1, 75-83 (1992)]; 문헌[Chappnis, P.O. and Foulkes, W.O., Cancer Treat Res, 107, 29-59 (2002)]; 문헌[Janatova M., et al., Neoplasma, 50(4), 246-505 (2003)]; 문헌[Jancarkova, N., Ceska Gynekol., 68{1), 11-6 (2003)]에 기술되어 있다. BRCA2 결합 인자 EMSY의 증폭의 결정은 문헌[Hughes-Davies, et al., Cell, 115, 523-535]에 기술되어 있다.
암과 관련된 돌연변이 및 다형성은 변이형 핵산 서열의 존재를 검출함으로써 핵산 수준에서, 또는 변이형(즉, 돌연변이형 또는 대립유전자 변이형) 폴리펩티드의 존재를 검출함으로써 단백질 수준에서 검출될 수 있다.
정의
알킬 기 및 모이어티는 직쇄 또는 분지쇄, 예를 들어 C1-8 알킬, C1-6 알킬, C1-4 알킬 또는 C5-6 알킬이다. 알킬 기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, t-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸, 예컨대 메틸 또는 n-헥실이 있다.
시클로알킬 기로는 포화 환형 알킬 기가 있다. C3-6 시클로알킬은 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 포화 환형 알킬 기이다. C3-6 시클로알킬의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 및 시클로헥실을 포함한다. C3-6 시클로알킬은 C3-5 시클로알킬 및 C3-4 시클로알킬을 포함한다.
플루오로알킬 기는 하나 이상의 H 원자가 하나 이상의 플루오로 원자로 대체된 알킬 기, 예를 들어 C1-8 플루오로알킬, C1-6 플루오로알킬, C1-4 플루오로알킬 또는 C5-6 플루오로알킬이다. 예는 플루오로메틸(CH2F-), 디플루로메틸(CHF2-), 트리플루오로메틸(CF3-), 2,2,2-트리플루오로에틸(CF3CH2-), 1,1-디플루오로에틸(CH3CHF2-), 2,2-디플루오로에틸(CHF2CH2-), 1-플루오로에틸(CH3CHF-), 및 2-플루오로에틸(CH2FCH2-)을 포함한다.
할로는 플루오로, 클로로, 브로모, 및 요오도를 의미한다. 일 양태에서, 할로는 플루오로 또는 클로로이다.
알킬옥시 기는 산소 원자를 통해 분자의 나머지 부분에 연결된 알킬 기이다. 적합한 C1-4 알킬옥시 기의 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, sec-부톡시 및 t-부톡시를 포함한다.
본 명세서에서, 달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "제약상 허용가능한"은, 타당한 의학적 판단의 범주 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉시키는 사용에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본 명세서에서, 달리 언급되지 않는 한, 어구 "유효량"은 치료될 증상 및/또는 병태를 유의미하게 및 긍정적으로 변경시키기에(예를 들어, 긍정적인 임상적 반응을 제공하기에) 충분한 화합물 또는 조성물의 양을 의미한다. 제약 조성물에 사용되는 활성 성분의 유효량은 치료될 특정 병태, 병태의 중증도, 치료 지속기간, 동시 요법의 특성, 이용되는 특정 활성 성분(들), 이용된 특정한 제약상 허용가능한 부형제(들)/담체(들), 및 주치의의 지식과 전문 지식 내에 있는 유사 요인에 따라 달라질 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는"은 달리 지시되지 않는 한, 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 병태, 또는 그러한 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 이의 진행을 억제하거나, 이의 진행을 지연시키거나, 이의 발병을 지연시키거나, 예방하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 달리 지시되지 않는 한, “치료하는”이 바로 위에 정의된 대로 치료하는 행위를 지칭한다. "치료하는"이라는 용어는 또한 대상체의 보조 치료(adjuvant treatment) 및 신-보조 치료를 포함한다. 의심의 여지를 없애기 위해, 본원에서 "치료"에 대한 언급은 치유적, 고식적 및 예방적 치료, 및 이러한 치료에 사용하기 위한 약제의 투여에 대한 언급을 포함한다.
화학식 I의 화합물은 안정한 제약상 허용가능한 산 또는 염기 염을 형성할 수 있으며, 이러한 경우 염으로서의 화합물의 투여가 적절할 수 있다. 산 부가염의 예는 아세테이트, 아디페이트, 아스코르베이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 바이카르보네이트, 바이술페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 콜린, 시트레이트, 시클로헥실 술파메이트, 디에틸렌디아민, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 글루타메이트, 글리콜레이트, 헤미술페이트, 2-히드록시에틸술포네이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 히드록시말레에이트, 락테이트, 말레이트, 말레에이트, 메탄술포네이트(메실레이트), 메글루민, 2-나프탈렌술포네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 파모에이트, 퍼술페이트, 페닐아세테이트, 포스페이트, 디포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 퀴네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술파메이트, 술파닐레이트, 술페이트, 타르트레이트, 토실레이트(p-톨루엔술포네이트), 트리플루오로아세테이트 및 운데카노에이트를 포함한다. 비독성이고 생리학적으로 허용가능한 염이 바람직하지만, 생성물을 단리하거나 정제하는 것과 같은 것에서 다른 염이 유용할 수 있다.
염은 통상적인 수단에 의해, 예컨대 적합한 이온-교환 수지에서 기존 염의 음이온을 또 다른 음이온으로 교환함으로써 또는 동결 건조에 의해 또는 진공에서 제거되는 물과 같은 용매 중에서 또는 염이 불용성인 용매 또는 매질 중에서 생성물의 유리 염기 형태를 1 당량 이상의 적절한 산과 반응시킴으로써 형성될 수 있다.
화학식 I의 화합물은 하나 초과의 키랄 중심을 가질 수 있고, 본 출원은 모든 개별 입체이성질체, 거울상이성질체 및 부분입체이성질체 및 이들의 혼합물을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 화학식 I의 화합물이 하나 이상의 비대칭 탄소 원자에 의해 광학적 활성 형태 또는 라세미 형태로 존재할 수 있는 한에 있어서는, 본 출원은 상기 언급된 활성을 갖는 임의의 이러한 광학적 활성 형태 또는 라세미 형태를 이의 정의에 포함함이 이해되어야 한다. 본 출원은 본원에 정의된 바와 같은 활성을 갖는 이러한 모든 입체이성질체를 포괄한다.
따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐, 화학식 I의 화합물이 언급되는 경우, 용어 '화합물'은 PARP1 억제제인 부분입체이성질체, 부분입체이성질체의 혼합물, 및 거울상이성질체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
화학식 I의 특정 화합물 및 이의 제약적 염은 용매화된 형태 및 비용매화된 형태, 예를 들어 수화된 형태 및 무수 형태로 존재할 수 있음이 또한 이해되어야 한다. 본원의 화합물은 이러한 모든 용매화된 형태를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 명확하게 하기 위해, 이것은 유리 형태의 화합물의 용매화된(예를 들어, 수화된) 형태와, 화합물의 염의 용매화된(예를 들어, 수화된) 형태 둘 다를 포함한다.
본원에 기술된 화학식 I은 그의 구성 원자의 모든 동위 원소를 포괄하는 것으로 의도된다. 예를 들면, H(또는 수소)는 1H, 2H(D) 및 3H(T)를 포함하는 수소의 임의의 동위 원소 형태를 포함하고; C는 12C, 13C 및 14C를 포함하는 탄소의 임의의 동위 원소 형태를 포함하고; O는 16O, 17O 및 18O를 포함하는 산소의 임의의 동위 원소 형태를 포함하고; N은 13N, 14N 및 15N을 포함하는 질소의 임의의 동위 원소 형태를 포함하고; F는 19F 및 18F를 포함하는 불소의 임의의 동위 원소 형태를 포함하고; 기타 유사한 경우도 마찬가지이다. 일 양태에서, 화학식 I의 화합물은 천연 발생 존재비에 상응하는 양으로 그 안에 커버된 원자의 동위 원소를 포함한다. 그러나, 특정 경우에, 통상적으로 더 낮은 존재비로 존재할 특정 동위 원소에서의 하나 이상의 원자의 풍부화가 바람직할 수 있다. 예를 들어, 1H는 통상적으로 99.98%가 넘는 존재비로 존재할 것이지만; 일 양태에서, 본원에 주어진 임의의 화학식의 화합물은 H가 존재하는 하나 이상의 위치에서 2H 또는 3H가 풍부할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에 주어진 임의의 화학식의 화합물이 방사성 동위 원소, 예를 들어 3H 및 14C가 풍부한 경우, 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 분석법(substrate tissue distribution assay)에 유용할 수 있다. 본 출원은 이러한 모든 동위 원소 형태를 포괄하는 것으로 이해되어야 한다.
화학식 I의 화합물, 또는 이의 제약상 허용가능한 염은 보통 제약상 허용가능한 투여 형태로, 활성 성분 또는 이의 제약상 허용가능한 염 또는 용매화물, 또는 이러한 염의 용매화물을 포함하는 제약 제제의 형태로, 경구 경로를 통해 투여될 것이다. 치료될 장애 및 환자에 따라, 조성물은 다양한 용량으로 투여될 수 있다.
상기 기술된 화학식 I의 화합물의 제약 제형은 특히 정제 또는 캡슐의 형태로, 그리고 특히 결장-표적화 약물 방출을 제공하는 것을 목표로 하는 기술을 포함하는 경구 투여용으로 제조될 수 있다(문헌[Patel, M. M. Expert Opin. Drug Deliv. 2011, 8 (10), 1247-1258]).
상기에 기술된 화학식 I의 화합물의 제약 제형은 단위 투여 형태로 편리하게 투여될 수 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985)]에 기술된 바와 같은, 제약 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.
경구 투여에 적합한 제약 제형은 하나 이상의 생리학적으로 상용성인 담체들 및/또는 부형제들을 포함할 수 있고 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 정제 및 캡슐은 결합제, 충전제, 활택제, 및/또는 계면활성제, 예컨대 소듐 라우릴 술페이트를 이용하여 제조될 수 있다. 액체 조성물은 현탁제, 유화제 및/또는 방부제와 같은 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다. 액체 조성물은 단위 투여 형태를 제공하기 위해 예를 들어 젤라틴에 캡슐화될 수 있다. 고체 경구 투여 형태는 정제, 투-피스(two-piece) 경질 쉘 캡슐 및 연질 탄성 젤라틴(SEG) 캡슐을 포함한다. 투-피스 경질 쉘 캡슐은 예를 들어 화학식 I의 화합물을 젤라틴 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC) 쉘에 충전함으로써 제조될 수 있다.
건식 쉘 제형은 전형적으로 약 40% 내지 60%(w/w) 농도의 젤라틴, 약 20% 내지 30% 농도의 가소제(예컨대 글리세린, 소르비톨 또는 프로필렌 글리콜) 및 약 30% 내지 40% 농도의 물을 포함한다. 방부제, 염료, 유백제 및 착향제와 같은 다른 재료도 존재할 수 있다. 액체 충전 재료는 (밀랍, 수소화 피마자유 또는 폴리에틸렌 글리콜 4000과 같은 현탁제를 사용하여) 용해, 가용화 또는 분산된 고체 약물 또는 광유, 식물유, 트리글리세리드, 글리콜, 폴리올 및 표면 활성제와 같은 비히클들의 조합 또는 비히클 중 액체 약물을 포함한다.
인간의 치료적 치료에서 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염의 적합한 일일 용량은 체중 1 kg당 약 0.0001~100 mg이다.
경구 제형, 특히 0.1 mg 내지 1000 mg의 범위의 활성 화합물의 용량을 제공하도록 당업자에게 공지된 방법에 의해 제형화될 수 있는 정제 또는 캡슐이 바람직하다.
도 1은 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 형태 B의 X선 분말 회절도를 나타낸다.
도 2는 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 형태 B의 DSC 자취를 나타낸다.
도 3은 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 형태 D의 X선 분말 회절도를 나타낸다.
도 4는 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 형태 D(ORTEP50)의 단결정 구조를 나타낸다.
도 5는 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 MSA 염 형태 C의 X선 분말 회절도를 나타낸다.
도 6은 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 MSA 염 형태 C의 DSC 자취를 나타낸다.
실시예
이제, 하기 비제한적인 실시예를 참고하여 본 출원의 화합물을 추가로 설명할 것이다.
일반적인 실험 조건
달리 나타내지 않는 한 27℃에서 Bruker 300 MHz, 400 MHz 또는 500 MHz 분광계를 사용하여 1H NMR 스펙트럼을 얻었으며; 화학적 이동은 백만분율(ppm, δ 단위)로 표시되고 용매의 잔존 모노-1H 동위 원소를 참조한다(CHCl3: 7.24 ppm; CHDCl2: 5.32 ppm; CD3S(=O)CD2H: 2.49 ppm). 커플링 상수는 헤르츠(Hz) 단위로 주어진다. 분할 패턴은 명백한 다중성을 설명하고, s(단일선), d(이중선), t(삼중선), q(사중선), m(다중선) 및 br s(브로드 단일선)로 표기된다. Waters SQD 질량 분석기가 장착된 Waters UPLC 또는 Shimadzu 2020 질량 분석기가 장착된 Shimadzu LC-20AD LC-20XR LC-30AD를 사용하여 LC-MS를 수행하였다. 달리 나타내지 않는 한, 보고된 분자 이온은 [M+H]+에 상응하고; 다수의 동위 원소 패턴을 갖는 분자의 경우(Br, Cl 등) 달리 명시되지 않는 한 보고된 값은 가장 낮은 동위 원소 질량에 대해 얻어진 것이다.
플래쉬 크로마토그래피는, 표준 플래시 크로마토그래피 또는 C18-플래시 컬럼을 이용하는, Agela로부터의 Flash Column 실리카-CS 컬럼, 순상 실리카 FLASH+TM(40M, 25M 또는 12 M) 또는 SNAPTM KP-Sil 카트리지(340, 100, 50 또는 10)를 사용하는 Thermo Fisher로부터의 Gilson 시스템에서 또는 ISCO로부터의 CombiFlash®Rf, BiotageTM로부터의 SP1TM 정제 시스템에서, 직선상 플래시 크로마토그래피를 사용하여 수행되었다. 일반적으로, 사용된 모든 용매는 구매가능하고 분석 등급이었다. 무수 용매를 일상적으로 반응에 사용하였다. 실시예에 사용된 상 분리기(Phase Separator)는 ISOLUTE® 상 분리 컬럼이다. 하기에 명명된 중간체 및 실시예는 Advanced Chemistry Development, Inc.(ACD/Labs)의 ACD/Name 12.01을 사용하여 명명되었다. 출발 물질을 상업적 공급처로부터 획득하거나 문헌의 경로를 통해 제조하였다.
X선 분말 회절(XRPD) 분석
Bruker AXS Inc™(미국 위스콘신주 매디슨 소재)로부터 구매가능한 Bruker D8 회절계를 사용하여 XRPD 분석을 수행하였다. 분석용 재료의 샘플(대략 10 mg)을 단결정 규소 웨이퍼 마운트(single silicon crystal wafer mount; 예를 들어, Bruker 실리콘 제로 배경 X선 회절 샘플 홀더) 상에 장착하고, 현미경 슬라이드를 이용하여 샘플을 박층 내로 확산시킴으로써 XRPD 스펙트럼을 얻었다. 샘플을 (계수 통계를 개선하기 위해) 분당 30회전으로 스핀하고, 1.5406 옹스트롬(즉, 약 1.54 옹스트롬)의 파장으로 40 kV 및 40 mA에서 작동되는 구리 장미세 초점 튜브에 의해 생성되는 X선을 조사하였다. 샘플을 세타-세타 모드(theta-theta mode)로 5도 내지 40도 2-세타의 범위에 걸쳐 0.02도 2-세타 증분(연속 스캔 모드)당 1초 동안 노출시켰다. 실행 시간은 D8에 있어서 대략 15분이었다.
XRPD 2θ 값은 합리적인 범위, 예를 들어 ±0.2°의 범위 내에서 달라질 수 있으며, 예를 들어 우선 배향(preferred orientation)을 포함한 다양한 이유로 인해 본질적으로 동일한 결정 형태에 대해 측정할 때 그러한 XRPD 강도가 달라질 수 있다. XRPD의 원리는 간행물, 예를 들어, 문헌[Giacovazzo, C. et al. (1995), Fundamentals of Crystallography, Oxford University Press]; 문헌[Jenkins, R. and Snyder, R. L. (1996), Introduction to X-Ray Powder Diffractometry, John Wiley & Sons, New York]; 및 문헌[Klug, H. P. & Alexander, L. E. (1974), X-ray Diffraction Procedures, John Wiley and Sons, New York]에 기술되어 있다.
DSC 분석
DSC 분석은 TA INSTRUMENTS®(미국 델라웨어주 뉴 캐슬 소재)로부터 입수가능한 Q SERIES™ Q1000 DSC 열량측정계를 사용하여 표준 방법에 따라 제조된 샘플에서 수행되었다. 샘플(대략 2 mg)을 알루미늄 샘플 팬(sample pan) 내에 칭량하여 넣고, DSC로 옮겼다. 기기를 50 mL/분으로 질소로 퍼징하였고 데이터를 10℃/분의 동적 가열 속도를 이용하여 22℃ 내지 300℃에서 수집하였다. 표준 소프트웨어, 예를 들어 TA INSTRUMENTS®로부터의 Universal v.4.5A를 사용하여 열 데이터를 분석하였다.
하기 약어를 사용하였다: AcOH = 아세트산; aq = 수성; BAST = 비스(2-메톡시에틸)아미노설퍼 트리플루오라이드　; Boc2O = 디-tert-부틸 디카르보네이트; Boc = t-부틸옥시카르보닐; CDCl3 = 중수소화 클로로포름; CD3OD = 중수소화 메탄올; CH3NO2 = 니트로메탄; DAST = 디에틸아미노설퍼 트리플루오라이드; DCE = 1,2-디클로로에탄; DCM = 디클로로메탄; DDQ = 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논; DEA = 디에틸아민; DEAD = 디에틸 아조디카르복실레이트; 데스-마틴(Dess-martin) 퍼요오디난 = 1,1,1-트리스(아세틸옥시)-1,1-디히드로-1,2-벤즈요오독솔-3-(1 H )-온; DIPEA = N,N-디이소프로필에틸아민; DMAP = 2,6-디메틸아미노피리딘; DMF = N,N-디메틸포름아미드; DMSO = 디메틸술폭시드; DMSO-d6 = 중수소화 디메틸술폭시드; DPPA = 디페닐 포스포르아지데이트; dppf = 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센; DIAD = 디-이소프로필 (E)-디아젠-1,2-디카르복실레이트; DSC = 시차 주사 열량 측정법; DTAD = 디-tert-부틸 (E)-디아젠-1,2-디카르복실레이트; ee = 거울상 이성질체 과잉률; eq. = 당량; ESI 또는 ES = 전자분무 이온화; Et2O = 디에틸 에테르; EtOAc 또는 EA =에틸아세테이트; EtOH =에탄올; FA = 포름산; 그럽스 촉매(Grubbs catalyst)(1,3-디메시틸이미다졸린-2-일리덴)(트리시클로헥실포스핀)루테늄 디클로라이드; h = 시간; HATU = (디메틸아미노)-N,N-디메틸(3-옥시도-1H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리디닐)메탄이미늄 헥사플루오로포스페이트; HCl = 염산; H2O2 = 과산화수소; HP = 고압; IPA = 이소프로필알코올; KF = 플루오르화칼륨; LC = 액체 크로마토그래피; LiClO4 = 과염소산리튬; mmol = 밀리몰; mCPBA = 메타-클로로퍼옥시벤조산; MeOH = 메탄올; min = 분; MeCN 또는 CH3CN 또는 ACN = 아세토니트릴; MeNO2 = 니트로메탄; MS = 질량 분석법; NBS = N-브로모숙신이미드; NH4Cl = 염화암모늄; NMP = N-메틸-2-피롤리돈; NMR = 핵 자기 공명; Pd/C = 탄소상 팔라듐; Pd2dba3 = 트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐 (0); PdCl2(dppf) = 1,1'-비스(디-tert-부틸포스피노)페로센 팔라듐 디클로라이드; PE = 석유 에테르; PPh3 =트리페닐포스핀; rt =실온; Rt 또는 RT = 체류 시간; Ruphos Pd G3 = (2-디시클로헥실포스피노-2′,6′-디이소프로폭시-1,1′-바이페닐)[2-(2′-아미노-1,1′바이페닐)]팔라듐(II) 메탄술포네이트; Pd-PEPPSI™-IPent = 　디클로로[1,3-비스(2,6-디-3-펜틸페닐)이미다졸-2-일리덴](3-클로로피리딜)팔라듐(II), [1,3-비스(2,6-디-3-펜틸페닐)이미다졸-2-일리덴](3-클로로피리딜)디클로로팔라듐(II), [1,3-비스(2,6-디-3-펜틸페닐)이미다졸-2-일리덴](3-클로로피리딜)팔라듐(II) 디클로라이드; Xphos Pd G2 = 　클로로(2-디시클로헥실포스피노-2′,4′,6′-트리이소프로필-1,1′-바이페닐)[2-(2′-아미노-1,1′-바이페닐)]팔라듐(II), X-Phos 아미노바이페닐 팔라듐 클로라이드; CataCXium A-Pd-G2 = 클로로[(디(1-아다만틸)- N -부틸포스핀)-2-(2-아미노바이페닐)]팔라듐(II); sat = 포화; SFC = 초임계 유체 크로마토그래피; T3P = 2,4,6-트리프로필-1,3,5,2,4,6-트리옥사트리포스피난 2,4,6-트리옥시드; PPh3O = 트리페닐포스핀 옥시드; TBTU = 2-(1H-벤조[d][1,2,3]트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸이소우로늄 테트라플루오로보레이트; TFA = 트리플루오로아세트산; THF = 테트라히드로푸란; TLC = 박층 크로마토그래피; TMS = 트리메틸실릴; Xantphos = 4,5-비스(디페닐포스피노)-9,9-디메틸잔텐; CBr4 = 사브롬화탄소; HBr = 브롬화수소산; Cs2CO3 = 탄산세슘; mgO4 = 황산마그네슘; NaHCO3 = 중탄산나트륨; DDQ = 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논; SOCl2 = 티오닐 클로라이드; DIBAL-H = 디이소부틸알루미늄 히드라이드; NH4HCO3 = 중탄산암모늄; BINAP = 2,2′-비스(디페닐포스피노)-1,1′-바이나프틸; SM = 출발 물질; CH2Cl2 = 디클로로메탄; Et3N = 트리에틸아민; HCO2H = 포름산; LCMS = 액체 크로마토그래피-질량 분석법; N2 = 이질소; Na2SO4 = 황산나트륨; NH4CO3 = 탄산암모늄; UV = 자외선; XPhos Pd G2 = 클로로(2-디시클로헥실포스피노-2′,4′,6′-트리이소프로필-1,1′-바이페닐)[2-(2′-아미노-1,1′-바이페닐)]팔라듐(II); Pd(OAc)2 = 아세트산팔라듐(II), ppt = 침전물.
실시예의 제조
Figure pct00004
중간체 2: 1-브로모-4-플루오로-2-메틸-3-니트로-벤젠
TFA (50 mL) 중 1-플루오로-3-메틸-2-니트로-벤젠 (10.7 g, 68.98 mmol) ( 중간체 1 )의 용액에 진한 H2SO4 (20 mL)를 0℃에서 서서히 첨가하고, 이어서 NBS (13.50 g, 75.87 mmol)를 일부씩 첨가하였다. 첨가 후, 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. 생성된 혼합물을 얼음에 붓고, 형성된 침전물을 여과로 수집하고, 물로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 1-브로모-4-플루오로-2-메틸-3-니트로-벤젠 ( 중간체 2 )을 백색 고체 (14.80 g, 92%)로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 2.43 (3H, s), 7.03 (1H, t), 7.68 (1H, dd).
중간체 3: 2-(4-브로모-3-메틸-2-니트로-아닐리노)프로판산
DMF (15 mL) 중 1-브로모-4-플루오로-2-메틸-3-니트로-벤젠 (13.8 g, 58.97 mmol) ( 중간체 2 ), 알라닌 (6.30 g, 70.76 mmol) 및 탄산칼륨 (24.45 g, 176.90 mmol)의 혼합물을 100℃에서 5시간 동안 교반시키고, 그 후 온도를 110℃까지 상승시키고, 5시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 얼음에 붓고, 0℃의 1 M HCl 수성 용액 (대략 300 ml)으로 서서히 켄칭하여 황색 현탁액을 제공하였다. 고체를 여과로 수집하고, 물로 세척하고, 진공 오븐에서 50℃에서 2일 동안 건조시켜 2-(4-브로모-3-메틸-2-니트로-아닐리노)프로판산 (14.03 g, 78%) ( 중간체 3 )을 황색 고체로서 제공하였다 (약간의 불순물이 존재함). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.39 (3H, d), 2.28 (3H, s), 4.20 (1H, quin), 6.12 (1H, br d), 6.68 (1H, d), 7.58 (1H, d), 12.98 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 303.
중간체 4: 메틸 2-(4-브로모-3-메틸-2-니트로-아닐리노)프로파노에이트
MeOH (150 mL) 중 2-(4-브로모-3-메틸-2-니트로-아닐리노)프로판산 (14.9 g, 49.16 mmol) ( 중간체 3 )의 용액에 티오닐 클로라이드 (10.76 mL, 147.47 mmol)를 0℃에서 적가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 반응 혼합물을 0℃의 포화 NaHCO3 수용액 (대략 300 ml)으로 서서히 켄칭하여 주황색 현탁액을 제공하였다. 고체를 여과로 수집하고, 물로 세척하고, 건조시켜 조 생성물 (14.6 g)을 수득하였다. 고체를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~25% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 메틸 2-(4-브로모-3-메틸-2-니트로-아닐리노)프로파노에이트 ( 중간체 4 )를 밝은 주황색 고체 (12.74 g, 82%)로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.52 (3H, d), 2.43 (3H, s), 3.76 (3H, s), 4.14 (1H, quin), 5.83 (1H, br d), 6.45 (1H, d), 7.48 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 317.
중간체 5: 7-브로모-3,8-디메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온
MeOH (100 mL) 중 메틸 2-(4-브로모-3-메틸-2-니트로-아닐리노)프로파노에이트 (11.6 g, 36.58 mmol) ( 중간체 4 ), 아연 (23.91 g, 365.77 mmol) 및 염화암모늄 (19.56 g, 365.77 mmol)의 교반 혼합물에 작은 얼음 조각을 0℃에서 첨가하였다 (발열성). 그 후 반응 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반시켰다 (빙조). 물 (2 mL)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반시켰다. 밝은 주황색이 사라졌다. 상기 혼합물을 여과지를 통해 여과시키고, 메탄올로 세척하고, 여과액을 진공 하에 농축시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트로 희석시키고, 물, 이어서 염수로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시켜 메틸 2-(2-아미노-4-브로모-3-메틸-아닐리노)프로파노에이트 및 7-브로모-3,8-디메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 (9.8 g)의 혼합물을 제공하였다.
상기 MeOH 중 고체의 용액 (100 mL)에 디옥산 중 4 M HCl 2 ml를 실온에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 추가의 100 ml의 메탄올을 첨가하고 (자유 현탁액을 만들기 위해), 생성된 현탁액을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 에테르 (대략 200 ml)로 희석시키고, 고체를 여과로 수집하고, 에테르로 세척하였다. 여과액을 고체가 침전될 때까지 농축시키고, 고체를 여과로 수집하였다. 이 절차를 몇 번 반복하여 생성물의 첫 번째 부분 7.2 g을 수득하였다. 여과액을 농축시키고, 실리카 겔 컬럼에서 정제하고 (헥산 중 0~100% 에틸 아세테이트로 용출), 생성물 분획을 농축시키고, 생성된 물질을 상기 물질과 합하여 7-브로모-3,8-디메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 (9.10 g, 98%) ( 중간체 5 )을 황백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.23 (3H, d), 2.24 (3H, s), 3.68 (1H, q), 3.75 (br, 1H), (6.54 (1H, d), 7.00 (1H, d), 9.77 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 255.
중간체 6: 7-브로모-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온
DDQ (8.91 g, 39.24 mmol)를 실온의 CH2Cl2 (400 mL) 중 7-브로모-3,8-디메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 (9.1 g, 35.67 mmol) ( 중간체 5 )의 현탁액에 첨가하고, 혼합물을 하룻밤 교반시켰다. LCMS는 클린한 전환을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하고, 포화 NaHCO3 (대략 300 ml) 용액을 첨가하고, 황색 현탁액을 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 물로 세척하였다. 고체를 포화 NaHCO3 (100 ml)에 슬러리화하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 고체를 여과시키고, 물, 이어서 에테르로 세척하고, 건조시켜 7-브로모-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (7.29 g, 81%) ( 중간체 6 )을 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.40 (3H, s), 2.50 (3H, s) (DMSO-d6 피크와 겹쳐짐), 7.32 - 7.65 (2H, m), 11.76 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 253.
중간체 7: 7-(히드록시메틸)-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온
1,4-디옥산 (40 mL) 중 (트리부틸스탄닐)메탄올 (1142 mg, 3.56 mmol), 7-브로모-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (600 mg, 2.37 mmol) ( 중간체 6 ) 및 Xphos Pd G2 (280 mg, 0.36 mmol)의 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~15% 메탄올로 용출)에서 정제하여 7-(히드록시메틸)-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (225 mg, 46%) ( 중간체 7 )을 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.31 (3H, s), 2.40 (3H, s), 4.58 (2H, d), 5.22 (1H, t), 7.33 (1H, d), 7.52 (1H, d), 11.53 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 205.
중간체 8: 7-(브로모메틸)-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온
HBr (15 ml, 132.59 mmol) (물 중 48 중량%) 중 7-(히드록시메틸)-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (223 mg, 1.09 mmol) ( 중간체 7 )을 80℃에서 3.5시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고, 디에틸 에테르를 잔사에 첨가하고, 혼합물을 초음파 처리하고, 고체를 수집하여 7-(브로모메틸)-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (408 mg, 107%) ( 중간체 8 )을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.36 - 2.45 (6H, m), 4.83 (2H, s), 7.34 (1H, d), 7.53 (1H, d), 11.63 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 267, 269.
실시예 1: 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
7-(브로모메틸)-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온, HBr (37 mg, 0.10 mmol) ( 중간체 8 )의 현탁액에 ACN (5 ml), 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (31.5 mg, 0.10 mmol) ( 중간체 32 ) 및 DIPEA (79 μl, 0.45 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃에서 1시간 동안 교반시켜 연한 황색 현탁액을 제공하였다. 상기 현탁액을 실온까지 냉각시키고, 한 방울의 물을 첨가하고, 고체를 여과로 수집하고, 아세토니트릴로 3회 세척하고, 건조시켜 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (0.016 g, 33%) ( 실시예 1 )를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.07 (3H, br s), 2.42 (3H, br d), 2.56 (4H, br s), 2.76 (3H, br s), 3.14 (4H, br s), 3.61 (2H, br s), 7.23 (1H, br d), 7.42 - 7.67 (2H, m), 7.83 (1H, br d), 8.38 (1H, br s), 11.13 - 11.97 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 425.
Figure pct00005
실시예 2: 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
아세토니트릴 (13 mL) 중 7-(브로모메틸)-3,8-디메틸퀴녹살린-2(1H)-온, HBr (240 mg, 0.69 mmol) ( 중간체 8 ), N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (202 mg, 0.69 mmol) ( 중간체 31 )의 현탁액에 DIPEA (0.723 mL, 4.14 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 역상 (C18 컬럼, 0~100% ACN/물 (0.2% 수산화암모늄)로 용출)에서 정제하여 생성물을 갈색 고체로서 수득하였다. 상기 고체를 DCM과 MeOH (2:1)의 혼합물에 현탁시키고, 농축시켜 DCM을 제거하고, 고체를 여과시키고, 메탄올로 세척하였다. 상기 고체를 ACN (3 ml)에 현탁시키고, 물 중 1 M HCl 0.8 ml을 첨가하고, 물 (대략 3 ml)로 희석시키고, 건조상태까지 동결건조시켜 생성물 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드의 HCl 염 (0.033 g, 11%) ( 실시예 2 )을 수득하였다. 1HNMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.45 (3H, s), 2.54 (3H, s), 2.81 (3H, br d), 3.24 - 3.56 (6H, m), 3.88 - 4.02 (2H, m), 4.54 (2H, br s), 7.48 - 7.71 (3H, m), 7.97 (1H, br d), 8.33 (1H, br d), 8.59 (1H, br s), 11.28 (1H, br s), 11.48 - 11.95 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 407.
Figure pct00006
실시예 3: 6-클로로-5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
AcOH 중 HBr (2 mL, 0.18 mmol) (33 중량%)을 NMP (2 mL) 중 7-(히드록시메틸)-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (36 mg, 0.18 mmol) ( 중간체 7 )의 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. DIPEA (0.25 mL, 1.43 mmol)를 NMP (2 mL) 중 6-클로로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (48 mg, 0.19 mmol) ( 중간체 30 )의 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: YMC-Actus Triart C18, 30*250, 5 μm; 이동상 A: 물 (0.05%NH3H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 41 B에서 61 B까지; 254; 220 nm. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-클로로-5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (33.0 mg, 42%) ( 실시예 3 )를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.41 (3H, s), 2.43 (3H, s), 2.54 - 2.62 (4H, m), 2.78 (3H, d), 3.05 - 3.11 (4H, m), 3.62 (2H, s), 7.24 (1H, d), 7.51 (1H, d), 7.65 (1H, d), 7.92 (1H, d), 8.41 - 8.45 (1H, m), 11.56 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 441.
Figure pct00007
실시예 4: 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
AcOH 중 HBr (2 mL, 12.15 mmol) (33 중량%)을 NMP (2 mL) 중 7-(히드록시메틸)-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (43 mg, 0.21 mmol) (중간체 7)의 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. NMP (3 mL) 중 생성된 고체의 용액에 DIPEA (0.25 mL, 1.43 mmol) 및 N,6-디메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (42 mg, 0.18 mmol) ( 중간체 33 )를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: YMC-Actus Triart C18, 30*250, 5 μm; 아세토니트릴 (0.05% NH4OH) 중 물 사용). 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 ( 실시예 4 ) (18.40 mg, 24%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.40 (3H, s), 2.43 (3H, s), 2.48 (3H, s), 2.55 - 2.63 (4H, m), 2.79 (3H, d), 2.87 - 2.94 (4H, m), 3.62 (2H, s), 7.24 (1H, d), 7.46 (1H, d), 7.51 (1H, d), 7.78 (1H, d), 8.39 - 8.44 (1H, m), 11.56 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 421.
Figure pct00008
중간체 10: 메틸 5-브로모-6-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트
건조 플라스크에 아세토니트릴 (300 ml) 중 메틸 5-브로모피콜리네이트 ( 중간체 9 ) (24 g, 111.09 mmol)를 충전시키고, 플루오르화은(II) (50 g, 342.78 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1일 동안 교반시켰다 (N2 하에). LCMS는 약 70%의 전환율을 나타냈다. 또 다른 배치의 AgF2 (16 g)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 하룻밤 계속 교반시켰다. 상기 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 아세토니트릴, 이어서 DCM으로 세척하고, 여과액을 농축시켜 연한 갈색 고체를 수득하였다. 잔사를 DCM과 포화 NH4Cl 용액 사이에 분배하였으며, 이는 백색 현탁액을 제공하였다. 고체를 여과 제거하고 버렸다. 여과액을 분리 깔때기로 옮기고, 유기 층을 분리하고, 수성 층을 에틸 아세테이트 (150 ml x 3)로 추출하였다. 유기물을 합하고, 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 고체가 석출될 때까지 농축시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 에테르로 세척하고, 건조시켜 박편상 황백색 고체를 수득하였다. 합한 여과액을 다시 농축시키고, 고체를 여과로 수집하여 합해진 19.96 g의 생성물을 제공하였다. 여과액의 나머지를 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~25% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 원하는 생성물의 두 번째 부분을 백색 박편상 고체 (3.5 g)로서 수득하였다. 모든 물질을 합하여 메틸 5-브로모-6-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트 (23.46 g, 90%) ( 중간체 10 )를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 3.89 (3H, s), 7.93 (1H, d), 8.51 (1H, t); m/z (ES+) [M+H]+ = 234.
중간체 11: tert-부틸 4-(2-플루오로-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트
N2 하에 1,4-디옥산 (400 mL) 중 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (28.0 g, 150.37 mmol), 메틸 5-브로모-6-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트 ( 중간체 10 ) (23.46 g, 100.25 mmol), RuPhos Pd G3 (5.45 g, 6.52 mmol) 및 Cs2CO3 (82 g, 250.61 mmol)의 혼합물을 80℃에서 하룻밤 교반시켰다. 반응 혼합물을 물 (250 ml)로 희석시키고, 에틸 아세테이트 (250 ml)로 추출하였다. 유기 층을 염수로 세척하고, 수층을 에틸 아세테이트 (100 ml x 1)로 추출하고, 유기물을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~50% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 생성물을 황색 고체로서 수득하고, 고체를 에틸 아세테이트/헥산으로부터 재결정화하고, 여과시키고, 헥산으로 세척하고, 건조시켜 생성물을 결정질 백색 고체 (24.8 g)로서 수득하였다. 여과액을 농축시키고, 실리카 겔 컬럼에서 재정제하여 생성물 1.9 g을 더 수득하였다. 총 수율: tert-부틸 4-(2-플루오로-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 ( 중간체 11 ) (26.7 g, 78%). 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.51 (9H, s), 3.12 - 3.28 (4H, m), 3.48 - 3.67 (4H, m), 3.98 (3H, s), 7.27 (1H, d), 7.99 (1H, dd); m/z (ES+) [M+H]+ = 340.
중간체 12: 메틸 6-플루오로-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복실레이트
MeOH (10 mL) 중 tert-부틸 4-(2-플루오로-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (1.9 g, 5.60 mmol) (중간체 11)의 혼합물에 디옥산 중 4 M HCl (10 ml, 40.00 mmol)을 실온에서 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 에테르로 희석시키고, 고체를 여과로 수집하고, 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 메틸 6-플루오로-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복실레이트 (1.360 g, 78%) (중간체 12)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 3.24 (4H, br s), 3.46 (4H, br s), 3.84 (3H, s), 7.65 (1H, br t), 7.94 (1H, br d), 9.43 (2H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 240.
중간체 13: 메틸 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트
HBr (15 ml, 132.59 mmol) (물 중 48 중량%) 중 7-(히드록시메틸)-3,8-디메틸퀴녹살린-2(1H)-온 (223 mg, 1.09 mmol) (중간체 7)을 80℃에서 3.5시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고, DCM을 잔사에 첨가하고, 농축시켜 7-(브로모메틸)-3,8-디메틸퀴녹살린-2(1H)-온을 황색 고체로서 수득하였다.
아세토니트릴 (20 ml) 중 상기 고체의 용액에 메틸 6-플루오로-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복실레이트, 2HCl (260 mg, 0.83 mmol) ( 중간체 12 ), 및 DIPEA (1.907 ml, 10.92 mmol)를 실온에서 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 0.5 ml의 물을 첨가하고, 고체를 여과로 수집하고, 아세토니트릴로 세척하였다. 고체를 건조시켜 황백색 고체를 메틸 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트 (0.371 g, 80%) ( 중간체 13 )로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.42 (6H, m), 2.52 - 2.59 (4H, m), 3.20 (4H, br d), 3.61 (2H, s), 3.82 (3H, s), 7.23 (1H, d), 7.41 - 7.59 (2H, m), 7.91 (1H, d), 11.55 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 426.
실시예 5: 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드
밀봉 40 ml 바이알에 메틸 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트 (360 mg, 0.85 mmol) ( 중간체 13 ) 및 암모니아 (15 ml, 105.00 mmol, 메탄올 중 7 N)를 충전시키고, 혼합물을 50℃에서 하룻밤 교반시켰다. LCMS는 여전히 약간의 출발 물질이 남아 있음을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 메탄올 중 7 N 암모니아 10 ml를 상기 고체에 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 교반시켜 백색 현탁액을 제공하였다. 고체를 여과로 수집하고, 헥산으로 세척하고, 건조시켜 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드 ( 실시예 5 )(340 mg, 98%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.40 (3H, s), 2.43 (3H, s), 2.56 (4H, br s), 3.14 (4H, br s), 3.61 (2H, s), 7.23 (1H, d), 7.46 (1H, br s), 7.48 - 7.58 (2H, m), 7.76 (1H, br s), 7.84 (1H, br d), 11.11 - 11.70 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 411.
Figure pct00009
중간체 15: tert-부틸 4-(6-메톡시카르보닐-2-메틸-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트
격막 캡이 갖추어진 40 mL 바이알에 메틸 5-브로모-6-메틸피콜리네이트 (중간체 14) (2 g, 8.69 mmol), tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (3.24 g, 17.39 mmol), Cs2CO3 (5.66 g, 17.39 mmol) 및 Ruphos Pd G3 (0.727 g, 0.87 mmol)을 충전시켰다. 반응 바이알을 진공 하에 소기하고, 질소로 충전시켰다. 1,4-디옥산 (20 mL)을 첨가하고, 반응 바이알을 80℃까지 예열된 가열 블록에 넣고, 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기 층을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~50% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 tert-부틸 4-(6-메톡시카르보닐-2-메틸-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 ( 중간체 15 )(2.090 g, 72%)를 연한 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 디클로로메탄-d2) 1.49 (9H, s), 2.59 (3H, s), 2.88 - 3.00 (4H, m), 3.55 - 3.65 (4H, m), 3.92 (3H, s), 7.32 (1H, d), 7.92 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 336.
중간체 16: 메틸 6-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복실레이트
1,4-디옥산 중 4 M 염화수소 용액 (31.2 ml, 124.63 mmol)을 DCM (30 mL) 중 tert-부틸 4-(6-(메톡시카르보닐)-2-메틸피리딘-3-일)피페라진-1-카르복실레이트 ( 중간체 15 ) (4.18 g, 12.46 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 생성된 고체를 디에틸 에테르에 슬러리화하고, 고체를 여과로 수집하여 메틸 6-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복실레이트 ( 중간체 16 ) (3.80 g, 99%)를 연한 황색 고체로서 제공하였다; m/z (ES+) [M+H]+ = 236.
중간체 18: 메틸 5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복실레이트
트리페닐포스핀 (1.584 g, 6.04 mmol) (4.4 g 첨가, 1.6 mmol/g의 PPh3 로딩량을 기준으로 계산됨)을 실온에서 DCM (40 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 (419 mg, 2.01 mmol) ( 중간체 17 ) 및 퍼브로모메탄 (1.335 g, 4.03 mmol)의 교반 슬러리에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시키고, DCM 및 THF로 세척하고, 여과액을 진공 하에 농축시켜 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-메틸퀴녹살린-2(1H)-온을 연한 황색 고체로서 수득하였다.
아세토니트릴 (25 mL) 중 상기 새롭게 제조된 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-메틸퀴녹살린-2(1H)-온의 슬러리에 메틸 6-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복실레이트, 2HCl (590 mg, 1.91 mmol) (중간체 16), 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (1754 μl, 10.07 mmol)을 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 70℃까지 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 농축시키고, 포화 NaHCO3 수용액으로 켄칭하고, 1시간 동안 교반시켰다. 고체를 여과로 단리하고, 물로 세척하였다. 조 고체를 DCM 중 0~10% MeOH를 사용하여 실리카 컬럼 크로마토그래피에서 정제하여 메틸 5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복실레이트 ( 중간체 18 ) (0.263 g, 31%)를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.40 - 2.49 (6H, m), 2.62 (4H, br s), 2.97 (4H, br s), 3.72 (2H, s), 3.83 (3H, s), 7.30 (1H, t), 7.44 (1H, d), 7.52 (1H, d), 7.85 (1H, d), 12.45 (1H, br s); 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.54 (1F, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 426.
실시예 6: 5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
40 mL 신틸레이션 바이알에서 메탄올 중 7 N 암모니아 (16.47 ml, 115.26 mmol)를 메틸 5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 18) (0.2452 g, 0.58 mmol)에 첨가하고, 밀봉하고, 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 추가의 7 N NH3 용액 (15 mL)을 반응 혼합물에 첨가하고, 50℃에서 하룻밤 교반시켰다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 5 mL의 MeOH에 슬러리화하였다. 고체를 여과 제거하고, 메탄올로 세척하고, 건조시켜 5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 6)(0.151 g, 64%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.42 (3H, s), 2.45 - 2.49 (3H, m), 2.52 - 2.69 (4H, m), 2.94 (4H, br s), 3.71 (2H, s), 7.29 (1H, t), 7.40 - 7.54 (3H, m), 7.77 - 7.84 (2H, m), 12.43 (1H, br s); 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.53 (1F, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 411.
Figure pct00010
중간체 19: 메틸 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복실레이트
HBr (15 ml, 132.59 mmol) (물 중 48 중량%) 중 7-(히드록시메틸)-3,8-디메틸퀴녹살린-2(1H)-온 ( 중간체 7 ) (223 mg, 1.09 mmol)을 80℃에서 4시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고, DCM을 잔사에 첨가하고, 믹스를 초음파 처리하고, 농축시켜 7-(브로모메틸)-3,8-디메틸퀴녹살린-2(1H)-온을 황색 고체로서 수득하였다.
아세토니트릴 (20 ml) 중 상기의 슬러리에 메틸 6-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복실레이트, 2HCl ( 중간체 16 ) (337 mg, 1.09 mmol), 및 DIPEA (1.907 ml, 10.92 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반시켜 투명한 용액을 제공하였다. 생성된 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 용매의 절반을 제거하고, 0.5 ml의 물을 첨가하였다. 고체를 여과로 수집하고, 아세토니트릴로 세척하고, 건조시켜 황색 고체를 수득하였다. 이 고체를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하여 메틸 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복실레이트 ( 중간체 19 ) (213 mg, 46%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.41 (3H, s), 2.43 (3H, s), 2.47 (3H, s), 2.58 (4H, br s), 2.95 (4H, br s), 3.63 (2H, s), 3.82 (3H, s), 7.24 (1H, d), 7.43 (1H, d), 7.51 (1H, d), 7.84 (1H, d), 11.55 (1H, s). m/z (ES+) [M+H]+ = 422.
실시예 7: 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
밀봉 40 ml 바이알에 메틸 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복실레이트 ( 중간체 19 ) (210 mg, 0.50 mmol) 및 암모니아 (15 ml, 105.00 mmol, 메탄올 중 7 N)를 충전시키고, 반응물을 50℃에서 하룻밤 교반시켰다. 반응은 완료되지 않았다. 상기 혼합물을 농축시키고, 메탄올 중 7 N 암모니아 10 ml를 이 고체에 첨가하였다. 바이알의 뚜껑을 닫고 50℃에서 4시간 동안 교반시켜 백색 현탁액을 제공하였다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 고체를 여과로 수집하고, 헥산으로 세척하고, 건조시켜 5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 ( 실시예 7 )(191 mg, 94%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.41 (3H, s), 2.44 (3H, s), 2.49 (3H, s), 2.58 (4H, br s), 2.92 (4H, br s), 3.63 (2H, br s), 7.24 (1H, br d), 7.42 (1H, br s), 7.46 (1H, br d), 7.51 (1H, br d), 7.79 (2H, br d), 10.53 - 11.23 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 407.
Figure pct00011
중간체 21: 메틸 2-아미노부타노에이트
메탄올 (35 mL) 중 2-아미노부탄산 ( 중간체 20 ) (5 g, 48.49 mmol)의 슬러리를 빙조에서 냉각시켰다. 티오닐 클로라이드 (11 mL, 150.72 mmol)를 0℃에서 상기 혼합물에 적가하였다. 반응물을 실온까지 가온하고, 하룻밤 교반시켰다. 투명한 용액을 건조상태까지 농축시켜 잔사를 수득하였다. 생성된 고체를 에테르에 현탁시키고, 여과시키고, 에테르로 세척하고, 건조시켜 메틸 2-아미노부타노에이트.HCl ( 중간체 21 ) (7.35 g, 99%)을 HCl 염으로서 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 0.92 (3H, t), 1.76 - 1.93 (2H, m), 3.75 (3H, s), 3.95 - 4.05 (1H, m), 8.53 (3H, br s).
중간체 23: 메틸 2-(4-브로모-3-클로로-2-니트로-아닐리노)부타노에이트
플라스크에 1,4-디옥산 (30 mL) 중 메틸 2-아미노부타노에이트, HCl ( 중간체 21 )(1.811 g, 11.79 mmol), 1-브로모-2-클로로-4-플루오로-3-니트로벤젠 ( 중간체 22 ) (2.0 g, 7.86 mmol)을 충전시키고, DIPEA (8.24 mL, 47.16 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 105℃에서 24시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~50% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 메틸 2-(4-브로모-3-클로로-2-니트로-아닐리노)부타노에이트 ( 중간체 23 ) (2.100 g, 76%)를 밝은 황색 오일로서 수득하였으며, 이는 정치 후 황색 고체로 변하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 0.99 (3H, t), 1.78 - 1.89 (1H, m), 1.91 - 2.02 (1H, m), 3.77 (3H, s), 4.04 (1H, q), 5.63 (1H, br d), 6.55 (1H, d), 7.52 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 351.
중간체 24: 7-브로모-8-클로로-3-에틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온
소듐 디티오나이트 (3.05 g, 17.49 mmol)를 DMSO (50 mL) 중 메틸 2-(4-브로모-3-클로로-2-니트로-아닐리노)부타노에이트 ( 중간체 23 ) (2.05 g, 5.83 mmol)의 교반 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 120℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (50 ml x 2)로 추출하였다. 유기 층을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~55% 에틸 아세테이트)에서 정제하여 피크 1을 연한 황색 고체로서 7-브로모-8-클로로-3-에틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 25 ) (0.319 g, 19%)으로서 수득하고: 1H NMR (500 MHz, 메탄올-d4) 1.31 (3H, t), 2.89 (2H, q), 7.56 - 7.67 (2H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 287, 289
피크 2를 황색 오일로서 7-브로모-8-클로로-3-에틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 24 ) (0.895 g, 53%)으로서 수득하였는데, 이는 정치시에 황색 고체로 변하였다: 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.04 (3H, t), 1.75 - 1.84 (1H, m), 1.85 - 1.93 (1H, m), 3.89 (1H, dd), 6.51 (1H, d), 7.12 (1H, d), 7.82 (1H, br s). m/z (ES+) [M+H]+ = 289, 291.
중간체 25: 7-브로모-8-클로로-3-에틸-1H-퀴녹살린-2-온
DDQ (772 mg, 3.40 mmol)를 실온의 1,4-디옥산 (20 mL) 중 7-브로모-8-클로로-3-에틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 24 )(895 mg, 3.09 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 생성된 현탁액을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔사를 포화 NaHCO3 용액으로 처리하고, 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 포화 NaHCO3 용액, 물로 세척하고, 건조시켜 7-브로모-8-클로로-3-에틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 25 ) (780 mg, 88%)을 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 메탄올-d4) 1.31 (3H, t), 2.89 (2H, q), 7.56 - 7.67 (2H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 287, 289.
중간체 26: 8-클로로-3-에틸-7-비닐-1H-퀴녹살린-2-온
톨루엔 (50 mL) 중 7-브로모-8-클로로-3-에틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 25 ) (1.05 g, 3.65 mmol), 트리부틸(비닐)스탄난 (1.737 g, 5.48 mmol) 및 Pd(PPh3)4 (0.422 g, 0.37 mmol)의 혼합물을 N2 하에 110℃에서 2시간 동안 교반시켰다. LCMS는 약 44%의 출발 물질이 남아 있음을 나타냈다. 상기 혼합물을 이 온도에서 4.5시간 동안 및 그 후 80℃에서 하룻밤 계속 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~100% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 용해도가 낮은 원하는 생성물 8-클로로-3-에틸-7-비닐-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 26 ) (0.850 g, 99%)을 연한 황색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 235 (이 생성물은 PPh3O로 오염됨).
중간체 27: 5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드
H2O 중 사산화오스뮴 (0.568 mL, 0.07 mmol)을 THF (50 mL)/물 (10 mL)/ tert-부탄올 (3.46 mL, 36.22 mmol) 중 8-클로로-3-에틸-7-비닐-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 26 ) (850 mg, 3.62 mmol), 2,6-루티딘 (0.844 mL, 7.24 mmol) 및 과요오드산나트륨 (3099 mg, 14.49 mmol)의 용액에 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반시켜 황색 현탁액을 제공하였다. 반응물을 농축시키고, 물, 포화 NH4Cl 용액 및 DCM 사이에 분배하고, 층들을 분리하였다. 수성 층을 DCM으로 추출하고, 합한 유기 층을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~50% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 ( 중간체 27 ) (808 mg, 94%)를 연한 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.34 - 1.42 (3H, m), 3.03 (2H, q), 7.88 (2H, d), 8.99 - 9.38 (1H, m), 10.54 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 237.
중간체 28: 8-클로로-3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온
MeOH (30 mL) 중 5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 ( 중간체 27 ) (808 mg, 3.41 mmol)를 0℃까지 냉각시키고, 수소화붕소나트륨 (1292 mg, 3.41 mmol) (염기성 알루미나 상에서 10 중량%)을 한꺼번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 40분 동안 계속 교반하였다. LCMS는 약간의 출발 물질이 남아 있음을 나타냈다. 추가의 213 mg의 NaBH4 (10 중량%)를 이 혼합물에 첨가하고, 교반을 0℃에서 10분 동안 계속하였다. 상기 혼합물에 1 ml의 물을 첨가하고, 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~25% 메탄올로 용출)에서 정제하여 8-클로로-3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 28 ) (625 mg, 77%) (26%의 과다 환원 부산물로 오염됨)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 메탄올-d4) 1.27 - 1.34 (3H, m), 2.91 (2H, q), 4.79 - 4.82 (2H, m), 7.54 (1H, d), 7.75 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 239.
중간체 29: 7-(브로모메틸)-8-클로로-3-에틸-1H-퀴녹살린-2-온
사브롬화탄소 (1612 mg, 4.86 mmol)를 0℃의 CH2Cl2 (40 mL) 중 8-클로로-3-에틸-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 28 ) (580 mg, 2.43 mmol) 및 트리페닐포스핀 (1275 mg, 4.86 mmol)의 용액에 한꺼번에 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~50% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 순수한 7-(브로모메틸)-8-클로로-3-에틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 29 )(200 mg, 27%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.83 (2H, q), 4.85 (2H, s), 7.51 (1H, d), 7.71 (1H, d), 11.89 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 301, 303.
실시예 8: 6-클로로-5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
DIPEA (0.058 mL, 0.33 mmol)를 아세토니트릴 (4 mL) 중 7-(브로모메틸)-8-클로로-3-에틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 29 ) (25 mg, 0.08 mmol) 및 6-클로로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl ( 중간체 30 ) (27.2 mg, 0.08 mmol)의 교반 현탁액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 동안 1.5시간 동안 교반시켜 현탁액을 제공하였다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하고, 분석 정제 그룹에 제출하였으며, 이는 정제 후 6-클로로-5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 ( 실시예 8 ) (24.00 mg, 61%)를 황색 고체로서 제공하였다. 정제 조건 (비키랄): 컬럼 (Xbridge C18 19 mm x 100 mm 5 μm, 이동상 A: H2O (0.2% NH4OH PH 10 함유), 이동상 B: 아세토니트릴; 구배 B%: 8분에 걸쳐 13~95% B; 유량: 20 ml/분; 농도: DMSO 중 35 mg/ml; 로딩 (mg/주입): 15; 컬럼 온도: 실온. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.23 (3H, t), 2.66 (4H, br s), 2.76 - 2.92 (5H, m), 3.13 (4H, br s), 3.77 (2H, s), 7.44 (1H, d), 7.69 (2H, dd), 7.94 (1H, d), 8.43 (1H, q), 10.75 - 11.45 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 475.
Figure pct00012
실시예 9: 5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
DIPEA (0.116 mL, 0.66 mmol)를 아세토니트릴 (4 mL) 중 6-플루오로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl ( 중간체 32 ) (51.6 mg, 0.17 mmol) 및 7-(브로모메틸)-8-클로로-3-에틸퀴녹살린-2(1H)-온 ( 중간체 29 ) (50 mg, 0.17 mmol)의 교반 현탁액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 1.5시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하여 생성물과 PPh3O의 혼합물을 제공하였다. 물질을 정제를 위한 분석 그룹에 제출하였으며, 이는 정제 후 5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 ( 실시예 9 ) (47.0 mg, 62%)를 황색 고체로서 생성하였다. 정제 조건 (비키랄): 컬럼 (Xbridge C18 19 mm x 100 mm 5 μm, 이동상 A: H2O (0.2% NH4OH PH 10 함유), 이동상 B: 아세토니트릴; 구배 B%: 8분에 걸쳐 13~95% B; 유량: 20 ml/분; 농도: DMSO 중 35 mg/ml; 로딩 (mg/주입): 15; 컬럼 온도: 실온.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.63 (4H, br s), 2.76 (3H, d), 2.82 (2H, q), 3.19 (4H, br s), 3.75 (2H, s), 7.43 (1H, d), 7.52 - 7.64 (1H, m), 7.70 (1H, d), 7.84 (1H, d), 8.39 (1H, q), 11.17 - 11.55 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 459.
Figure pct00013
실시예 10: 5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
DIPEA (0.081 mL, 0.46 mmol)를 아세토니트릴 (4 mL) 중 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl ( 중간체 31 ) (34.0 mg, 0.12 mmol) 및 7-(브로모메틸)-8-클로로-3-에틸퀴녹살린-2(1H)-온 ( 중간체 29 ) (35 mg, 0.12 mmol)의 교반 현탁액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 1.5시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하고, 생성된 잔사를 정제를 위한 분석 그룹에 제출하였으며, 이는 정제 후 5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 ( 실시예 10 ) (13.00 mg, 20%)를 백색 고체로서 제공하였다. 정제 조건 (비키랄) 컬럼 (Xbridge C18 19 mm x 100 mm 5 μm, 이동상 A: H2O (0.2% NH4OH PH 10 함유), 이동상 B: 아세토니트릴; 구배 B%: 8분에 걸쳐 13~95% B; 유량: 20 ml/분; 농도: DMSO 중 35 mg/ml; 로딩 (mg/주입): 15; 컬럼 온도: 실온. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.24 (3H, t), 2.79 (3H, d), 2.86 (2H, q), 3.22 - 3.37 (8H, m, 물 피크에 병합됨), 4.39 - 4.65 (2H, m), 7.46 (1H, dd), 7.57 (1H, br d), 7.79 - 7.90 (2H, m), 8.32 (1H, d), 8.43 (1H, br d), 11.87 - 12.21 (1H, m). m/z (ES+) [M+H]+ = 441.
Figure pct00014
실시예 11: 5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
DIPEA (0.111 mL, 0.64 mmol)를 아세토니트릴 (10 mL) 중 N,6-디메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl ( 중간체 33 ) (48.9 mg, 0.16 mmol) 및 7-(브로모메틸)-8-클로로-3-에틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 29 )(48 mg, 0.16 mmol)의 교반 현탁액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반시켜 현탁액을 제공하였다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 고체를 여과로 수집하고, 물로 세척하고, 건조시켜 5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 ( 실시예 11 )(42.0 mg, 58%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.65 (4H, br s), 2.78 - 2.88 (5H, m), 2.95 (4H, br s), 3.38 (3H, s, 물 피크와 겹쳐짐), 3.76 (2H, s), 7.47 (2H, dd), 7.71 (1H, d), 7.79 (1H, d), 8.42 (1H, br d), 11.59 - 11.99 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 455.
Figure pct00015
중간체 35: 1-브로모-2,4-디플루오로-3-니트로-벤젠
황산 (150 mL) 중 1,3-디플루오로-2-니트로벤젠 ( 중간체 34 ) (19.5 g, 122.57 mmol) 및 NBS (26.2 g, 147.08 mmol)의 혼합물을 80℃에서 하룻밤 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 얼음에 서서히 부었다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트 (200 ml)로 추출하고, 유기 층을 물 (50 ml x 2), 포화 NaHCO3 용액 (50 ml x 2), 염수로 세척하고, 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~20% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 1-브로모-2,4-디플루오로-3-니트로-벤젠 ( 중간체 35 ) (26.8 g, 92%)을 연한 황색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 7.42 - 7.73 (1H, m), 8.06 - 8.26 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 238.
중간체 36: 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)-3-히드록시-부타노에이트
DIPEA (8.56 mL, 48.99 mmol)를 실온의 1,4-디옥산 (50 mL) 중 1-브로모-2,4-디플루오로-3-니트로-벤젠 ( 중간체 35 ) (5.3 g, 22.27 mmol) 및 메틸 2-아미노-3-히드록시부타노에이트, HCl (4.53 g, 26.72 mmol)의 교반 용액에 서서히 첨가하고, 생성된 혼합물을 40℃에서 3시간 동안 교반시켰다. LCMS는 약간의 출발 물질이 남아 있음을 나타냈다. 상기 혼합물에 800 mg의 DL-트레오닌 메틸 에스테르 HCl 염을 첨가하고, 그 후 혼합물을 40℃에서 하룻밤 계속 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~30% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)-3-히드록시-부타노에이트 ( 중간체 36 ) (4.69 g, 60%)를 밝은 주황색 고체로서 수득하였다. (HNMR은 이것이 부분입체 이성질체들의 혼합물임을 나타냈다). 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.30 - 1.44 (3H, m), 3.81 (3H, s), 4.00 - 4.22 (1H, m), 4.22 - 4.48 (1H, m), 6.32 - 6.68 (1H, m), 7.40 - 7.66 (2H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 351, 353.
중간체 37: 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)-3-플루오로-부타노에이트
DAST (0.919 mL, 6.95 mmol)를 서서히 10분에 걸쳐 0℃의 CH2Cl2 (40 mL) 중 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)-3-히드록시-부타노에이트 ( 중간체 36 ) (2.22 g, 6.32 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 20분 동안 교반시켰다. LCMS 및 TLC는 출발 물질이 남아 있음을 보여주었다. 상기 혼합물에 0.4 ml의 DAST를 첨가하고, 반응물을 추가로 10분 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 포화 NaHCO3 용액으로 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 유기 층을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시켜 황색 오일을 수득하였다. 생성된 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~30% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 피크 2를 황색 오일로서 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)-3-플루오로-부타노에이트 (1.110 g, 50%) (중간체 37)로서 수득하고 피크 4를 출발 물질인 메틸 2-((4-브로모-3-플루오로-2-니트로페닐)아미노)-3-히드록시부타노에이트 (0.300 g, 13%)로서 수득하였다 (다른 부산물과 함께). 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.37 - 1.51 (3H, m), 2.80 - 2.93 (0.5H, m), 3.00 (0.5H, br d), 3.75 (1.5H, s), 3.85 (1.5H, s), 4.40 - 4.56 (0.5H, m), 5.01 - 5.23 (0.5H, m), 6.43 - 6.58 (0.5H, m), 6.71 - 6.74 (0.5H, m), 7.38 - 7.69 (2H, m). m/z (ES+) [M+H]+ = 353.
중간체 38: 7-브로모-8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온
MeOH (20 mL) 중 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)-3-플루오로-부타노에이트 (중간체 37)(1.11 g, 3.14 mmol), 아연 (2.466 g, 37.72 mmol) 및 염화암모늄 (3.36 g, 62.87 mmol)의 혼합물에 물 (2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반시켰다. 주황색이 사라졌으며 (발열성), LCMS는 완전한 전환을 보여주었다. 상기 혼합물을 여과시키고, 고체를 메탄올로 세척하고, 여과액을 농축시켰다. 생성된 잔사를 DCM에 용해시키고, 유기물을 물로 세척하고, 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~30% 에틸 아세테이트)에서 정제하여 연한 황색 고체인 메틸 2-((2-아미노-4-브로모-3-플루오로페닐)아미노)-3-플루오로부타노에이트 (0.533 g, 52%)를 수득하였다.
상기 황색 고체를 15 ml의 메탄올에 용해시키고, 0.5 1 M HCl (메탄올 중)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 제거하고, 잔사를 DCM/메탄올 (5:1)로 희석시켰다. 유기 층을 50% NaHCO3 용액으로 1회 세척하고, 건조시키고 (무수 Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~31% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 7-브로모-8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 38 ) (0.337 g, 37%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 메탄올-d4) 1.27 - 1.46 (3H, m), 4.26 (1H, dd), 4.90 - 5.12 (1H, m), 6.50 (1H, dd), 6.97 (1H, dd). m/z (ES+) [M+H]+ = 291, 293.
중간체 39: 7-브로모-8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-1H-퀴녹살린-2-온
DDQ (289 mg, 1.27 mmol)를 CH2Cl2 (10 mL) 중 7-브로모-8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 38 ) (337 mg, 1.16 mmol)의 슬러리에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔사를 포화 NaHCO3 용액 (대략 20 ml)으로 희석시키고, 현탁액을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 물로 세척하고, 건조시켜 7-브로모-8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 39 ) (333 mg, 100%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 메탄올-d4) 1.65 - 1.84 (3H, m), 5.87 - 6.18 (1H, m), 7.50 - 7.60 (1H, m), 7.61 - 7.78 (1H, m). m/z (ES+) [M+H]+ = 289, 291.
중간체 40: 8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온
1,4-디옥산 (25 mL) 중 Pd-PEPPSI™-IPent 촉매 (26 mg, 0.03 mmol), (트리부틸스탄닐)메탄올 (1638 mg, 5.10 mmol) 및 7-브로모-8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 39 ) (590 mg, 2.04 mmol)의 혼합물을 탈기시키고, N2로 다시 충전시키고, 혼합물을 80℃에서 17시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~50% 에틸 아세테이트로 용출 (남아 있는 출발 물질을 회수하기 위해), 이어서 DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하여 8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 40 ) (282 mg, 57%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.58 - 1.81 (3H, m), 4.67 (2H, br d), 5.46 (1H, br t), 5.87 - 6.24 (1H, m), 7.33 - 7.48 (1H, m), 7.65 (1H, br d), 12.65 - 12.83 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 241.
중간체 41: 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-1H-퀴녹살린-2-온
CH2Cl2 (15 mL) 중 트리페닐포스핀 (1223 mg, 4.66 mmol) 및 8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (280 mg, 1.17 mmol) ( 중간체 40 )의 현탁액을 0℃까지 냉각시키고, 사브롬화탄소 (1546 mg, 4.66 mmol)를 첨가하였으며, 혼합물은 즉시 투명하게 그리고 보라색으로 변하고, 상기 혼합물을 이 온도에서 10분 동안 계속 교반시켰으며, 혼합물은 황색 용액으로 변하고, 이를 LCMS로 체크하였으며, 이는 완전한 전환(그다지 전적인 것은 아님)을 나타냈고, 상기 혼합물을 농축시키고, 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하여 주요 피크를 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 41 ) (이는 약간의 불순물로 오염됨)으로서 수득하였다. 농축시켜 2.5 g의 고체를 수득하였다 (이론 질량은 353 mg이었으며, 다음 단계로 넘어가기 위해 100% 수율로 가정함). m/z (ES+) [M+H]+ = 303, 305.
실시예 12 및 실시예 13: 6-플루오로-5-[4-[[5-플루오로-2-[(1S 및 1R)-1-플루오로에틸]-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
DIPEA (0.265 mL, 1.52 mmol)를 아세토니트릴 (20 mL) 중 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 41 ) (115 mg, 0.38 mmol) 및 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (94 mg, 0.30 mmol) ( 중간체 32 )의 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 1시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 DMSO (대략 4 ml)에 용해시키고, C18 역상 컬럼 (0~100% ACN/물/0.1%TFA로 용출)에서 정제하였다. 생성물 함유 분획을 합하고, 건조상태까지 동결건조시켰다. 물질을 Gilson (0~80% ACN/물/0.1%TFA로 용출)에서 재정제하여 생성물 6-플루오로-5-[4-[[5-플루오로-2-[(1S 및 1R)-1-플루오로에틸]-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드를 수득하였다. 거울상 이성질체들을 키랄 컬럼으로 분리하였다. 키랄 정제 조건: 컬럼 정보: chiralpak OD 4.6 mm x 100 mm 5 μm, 이동상 A: CO2 (100%), 이동상 B: 메탄올 + 0.2% NH4OH, 등용매 25% B (6분에 걸쳐), 유량: 4.0 ml/분, 희석제: 메탄올, 컬럼 온도: 실온, 출구 압력 (SFC): N/A.
피크 1: 백색 고체를 물 및 ACN으로 희석시키고, 0.1 mL의 수성 0.5 M HCl을 첨가하고, 혼합물을 건조상태까지 동결건조시켜 이성질체 1, 6-플루오로-5-[4-[[5-플루오로-2-[(1S 또는 1R)-1-플루오로에틸]-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드를 HCl 염 ( 실시예 12, 절대 입체화학은 결정되지 않음) (5.42 mg, 10.90 μmol, 3%)으로서 (황색 고체로서의 HCl 염으로서) 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.54 - 1.73 (3H, m), 2.70 - 2.87 (3H, m), 3.53 - 3.90 (8H, m), 4.57 (2H, br s), 5.79 - 6.21 (1H, m), 7.59 - 7.81 (3H, m), 7.87 (1H, d), 8.43 (1H, br d), 11.40 - 11.85 (1H, m), 12.78 - 13.14 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 461, >95%ee.
피크 2: 백색 고체를 물 및 ACN으로 희석시키고, 0.1 mL의 수성 0.5 M HCl을 첨가하고, 혼합물을 건조상태까지 동결건조시켜 이성질체 2, 6-플루오로-5-[4-[[5-플루오로-2-[(1S 또는 1R)-1-플루오로에틸]-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드를 HCl 염 ( 실시예 13, 절대 입체화학은 결정되지 않음)으로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.49 - 1.83 (3H, m), 2.77 (3H, br d), 3.46 - 3.91 (8H, m), 4.56 (2H, br s), 5.80 - 6.26 (1H, m), 7.52 - 7.80 (3H, m), 7.87 (1H, br d), 8.43 (1H, br d), 11.44 - 11.82 (1H, m), 12.77 - 13.24 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 461, >95% ee.
Figure pct00016
실시예 14 및 실시예 15 : 5-[4-[[5-플루오로-2-[(1S 및 1R)-1-플루오로에틸]-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
아세토니트릴 (13 mL) 중 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-(1-플루오로에틸)퀴녹살린-2(1H)-온 ( 중간체 41 ) (138 mg, 0.41 mmol) 및 N,6-디메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (126 mg, 0.41 mmol) ( 중간체 33 )의 현탁액에 DIPEA (429 μl, 2.46 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 3시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 반응물을 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하여 라세미 생성물 5-[4-[[5-플루오로-2-[(1S/1R)-1-플루오로에틸]-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드를 연한 황색 고체 (169 mg)로서 수득하였다. 거울상 이성질체들을 키랄 분리로 분리하였다. 키랄 정제 조건: 컬럼 정보: chiralpak OD 21.2mm x 250mm 5 μm, 이동상 A: CO2 (100%), 이동상 B: 메탄올 + 0.2% NH4OH, 등용매: 25% B (12분에 걸쳐), 유량: 70.0 ml/분, 농도: 메탄올 중 8.45 mg/ml, 로딩: 4.23 mg/주입, 컬럼 온도: 실온, 출구 압력 (SFC): N/A.
키랄 분리 후, 각각의 이성질체를 역상 컬럼 (0~60% ACN/물/0.2% 수산화암모늄으로 용출)에서 재정제하여 다음을 수득하였다:
피크 1: 5-[4-[[5-플루오로-2-[(1S 또는 1R)-1-플루오로에틸]-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드, 이성질체 1 ( 실시예 14 , 절대 입체화학은 결정되지 않음) (30.7 mg, 0.067 mmol, 16%)을 백색 고체로서. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.40 - 1.70 (3H, m), 2.48 (3H, s), 2.54 - 2.69 (4H, m), 2.79 (3H, d), 2.94 (4H, br s), 3.74 (2H, s), 5.83 - 6.22 (1H, m), 7.17 - 7.41 (1H, m), 7.47 (1H, d), 7.65 (1H, d), 7.78 (1H, d), 8.40 (1H, br d), 11.65 - 12.88 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 457; >98% ee.
피크 2: 5-[4-[[5-플루오로-2-[(1S 또는 1R)-1-플루오로에틸]-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드, 이성질체 2 ( 실시예 15 , 절대 입체화학은 결정되지 않음) (37 mg, 0.081 mmol, 20%)를 백색 고체로서. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.68 - 1.88 (3H, m), 2.51 (3H, s), 2.71 (4H, br s), 2.86 - 3.12 (7H, m), 3.81 (2H, s), 5.92 - 6.29 (1H, m), 7.34 (1H, d), 7.44 (1H, t), 7.76 (1H, d), 7.95 (1H, br d), 7.99 (1H, d), 10.24 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 457; 94.5% ee.
Figure pct00017
중간체 43: 메틸 2-(4-브로모-3-클로로-2-니트로-아닐리노)프로파노에이트
플라스크에 1,4-디옥산 (70 mL) 중 메틸 알라니네이트, HCl ( 중간체 42 ) (1.851 g, 13.26 mmol) 및 1-브로모-2-클로로-4-플루오로-3-니트로벤젠 ( 중간체 22 ) (2.25 g, 8.84 mmol)을 충전시켰다. DIPEA (9.27 mL, 53.06 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 105℃에서 24시간 동안 교반시켜 갈색 용액을 제공하였다. LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~30% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 메틸 2-(4-브로모-3-클로로-2-니트로-아닐리노)프로파노에이트 ( 중간체 43 ) (2.120 g, 71%)를 밝은 황색 오일로서 수득하였으며, 이는 정치 후 황색 고체로 변하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.52 (3H, d), 3.77 (3H, s), 6.53 (1H, d), 7.15 (1H, t), 7.53 (1H, d), 7.78 (1H, dd); m/z (ES+) [M+H]+ = 337.
중간체 44: 7-브로모-8-클로로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온
소듐 디티오나이트 (3.28 g, 18.84 mmol)를 DMSO (50 mL) 중 메틸 2-(4-브로모-3-클로로-2-니트로-아닐리노)프로파노에이트 ( 중간체 43 ) (2.12 g, 6.28 mmol)의 교반 용액에 첨가하고, 혼합물을 120℃에서 5시간 동안 교반시켰다. LCMS 및 TLC는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 물로 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (50 ml x 2)로 추출하였다. 유기 층을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~55% 에틸 아세테이트)에서 정제하여 7-브로모-8-클로로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 45 ) (0.055 g, 3%) (m/z (ES+) [M+H]+ 273, 275) 및 7-브로모-8-클로로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 44 ) (0.190 g, 11%) (m/z (ES+) [M+H]+ = 275, 277)을 수득하였다.
중간체 45: 7-브로모-8-클로로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온
DDQ (157 mg, 0.69 mmol)를 1,4-디옥산 (10 mL) 중 7-브로모-8-클로로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 44 ) (190 mg, 0.69 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰으며, LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 포화 NaHCO3 용액으로 처리하였다. 혼합물을 실온에서 4 동안 교반시키고, 고체를 여과로 단리하고, 포화 NaHCO3 용액 및 물로 세척하였다. 그 후 고체를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하여 7-브로모-8-클로로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 45 ) (122 mg, 65%)을 황색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 273, 275.
중간체 46: 8-클로로-3-메틸-7-비닐-1H-퀴녹살린-2-온
톨루엔 (15 ml) 중 7-브로모-8-클로로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 45 ) (122 mg, 0.45 mmol), 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0) (51.5 mg, 0.04 mmol) 및 트리부틸(비닐)스탄난 (212 mg, 0.67 mmol)의 혼합물을 N2 하에 110℃에서 16시간 동안 교반시켰다. LCMS는 반응 완료를 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~16% 메탄올로 용출)에서 정제하여 8-클로로-3-메틸-7-비닐-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 46 ) (98 mg, 100%)을 갈색 고체로서 수득하였다. (PPh3O로 오염됨). m/z (ES+) [M+H]+ = 221.
중간체 47: 5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드
H2O 중 사산화오스뮴 (0.1 mL, 0.01 mmol)을 THF (10 mL)/물 (2 mL)/ tert-부탄올 (0.607 mL, 6.34 mmol) 중 8-클로로-3-메틸-7-비닐-1H-퀴녹살린-2-온 (140 mg, 0.63 mmol) ( 중간체 46 ), 2,6-루티딘 (0.148 ml, 1.27 mmol) 및 과요오드산나트륨 (543 mg, 2.54 mmol)의 용액에 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반시켜 황색 현탁액을 제공하였다. LCMS 및 TLC는 출발 물질이 여전히 남아 있음을 나타냈다. 상기 혼합물에 THF (10 ml)/물 (2.000 ml), 200 mg의 과요오드산나트륨, 0.3 ml의 사산화오스뮴을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5시간 동안 계속 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 반응물을 물로 희석시키고, 포화 NH4Cl 용액을 첨가하고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 층을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하여 5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 ( 중간체 47 ) (141 mg, 100%)를 황색 고체로서 수득하였다. (그다지 순수하지 않음, 다음 단계로 넘어감). m/z (ES+) [M+H]+ = 223.
중간체 48: 8-클로로-7-(히드록시메틸)-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온
수소화붕소나트륨 (23.96 mg, 0.63 mmol)을 0℃까지 냉각시킨 MeOH (16 mL)와 DCM (8.00 mL)의 혼합물 중 5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 ( 중간체 47 ) (141 mg, 0.63 mmol)의 냉각 용액에 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 계속 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물에 1ml의 물을 첨가하고, 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 40~100% 에틸 아세테이트; 그 후 DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하여 8-클로로-7-(히드록시메틸)-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 48 ) (142 mg, 100%)을 황색 고체로서 수득하였다; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.42 (3H, s), 4.65 (2H, br d), 5.53 (1H, br t), 7.46 (1H, br d), 7.69 (1H, br d), 11.77 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 225.
중간체 49: 7-(브로모메틸)-8-클로로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온
CH2Cl2 (20 ml) 중 8-클로로-7-(히드록시메틸)-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 48 ) (142 mg, 0.63 mmol) 및 트리페닐포스핀 (332 mg, 1.26 mmol)을 0℃까지 냉각시켰다. 퍼브로모메탄 (419 mg, 1.26 mmol)을 한꺼번에 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 및 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. LCMS는 진행이 없음을 나타냈다. 상기 혼합물에 트리페닐포스핀 (332 mg, 1.26 mmol) 및 퍼브로모메탄 (419 mg, 1.26 mmol)의 두 번째 부분을 실온에서 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~100% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 생성물 7-(브로모메틸)-8-클로로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온을 황색 고체로서 수득하였다 ( 중간체 49 ) (32 mg, 18%). DCM 중 20% 메탄올로 추가로 용출시켜 생성물의 두 번째 부분 100 mg (55%)을 갈색 고체로서 제공하였다 (47%의 순도). m/z (ES+) [M+H]+ = 287, 289.
실시예 16: 5-[4-[(5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
DIPEA (0.053 mL, 0.31 mmol)를 아세토니트릴 (4 mL) 중 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (22.43 mg, 0.08 mmol) ( 중간체 31 ) 및 7-(브로모메틸)-8-클로로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 49 )(22 mg, 0.08 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 생성된 현탁액을 70℃에서 1시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 DMSO에 용해시키고, 역상 C18 컬럼 (0~100% ACN/물/0.1%TFA로 용출)에서 정제하였다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 건조상태까지 동결건조시켜 5-[4-[(5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (20 mg, 56%)를 수득하였다. 에테르 중 2 M HCl 1 mL를 첨가하고, 용매를 진공 하에 제거하여 상응하는 HCl 염을 황색 고체로서 제공하였다 ( 실시예 16 ). 1H NMR (500 MHz, 메탄올-d4) 2.96 - 3.03 (3H, m), 3.48 - 3.86 (6H, m), 4.04 - 4.41 (2H, m), 4.78 (2H, s), 4.86 (3H, d, 물 피크에 병합됨), 7.74 (1H, d), 7.84 (1H, d), 8.14 (1H, dd), 8.31 (1H, d), 8.47 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 427.
Figure pct00018
실시예 17: 5-[4-[(5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
DIPEA (0.061 mL, 0.35 mmol)를 아세토니트릴 (5 mL) 중 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl ( 중간체 32 ) (27.1 mg, 0.09 mmol) 및 7-(브로모메틸)-8-클로로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 49 ) (50 mg, 0.09 mmol) (대략 50%의 순도)의 혼합물에 첨가하고, 생성된 용액을 70℃에서 1시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 DMSO에 용해시키고, 역상 C18 컬럼 (0~100% ACN/물/0.1%TFA로 용출)에서 정제하고, 그 후 역상 C18 컬럼 (0~100% ACN/물/0.1%TFA로 용출)에서 두 번째로 정제하였다. 물질을 최종적으로 역상 컬럼 (0~100% ACN/물/수산화암모늄, PH 약 10으로 용출)에서 세 번째로 정제하여 5-[4-[(5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 17) (16.50 mg, 43%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.37 - 2.47 (3H, m), 2.63 (4H, br s), 2.76 (3H, d), 3.13 - 3.23 (4H, m), 3.74 (2H, s), 7.45 (1H, d), 7.57 (1H, dd), 7.68 (1H, d), 7.84 (1H, d), 8.39 (1H, br d), 10.71 - 12.11 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 445.
Figure pct00019
실시예 18: 5-[4-[(5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
DIPEA (0.061 mL, 0.35 mmol)를 아세토니트릴 (5 mL) 중 N,6-디메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (중간체 33) (26.7 mg, 0.09 mmol) 및 7-(브로모메틸)-8-클로로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (50 mg, 0.09 mmol) ( 중간체 49 , 대략 50%의 순도)의 혼합물에 첨가하고, 생성된 용액을 70℃에서 1시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 DMSO에 용해시키고, 잔사를 역상 C18 컬럼 (0~100% ACN/물/0.1%TFA로 용출)에서 정제하였다. 분획의 농축 후, 잔사를 역상 C18 컬럼 (0~100% ACN/물/수산화암모늄, PH 약 10으로 용출)에서 재정제하였다. 순수한 분획을 건조상태까지 동결건조시켜 5-[4-[(5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 ( 실시예 18 ) (18.4 mg, 48%)를 유리 염기로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 메탄올-d4) 2.53 (6H, d), 2.76 (4H, br s), 2.94 (3H, s), 3.04 (4H, br t), 3.86 (2H, s), 7.48 (1H, d), 7.51 - 7.60 (1H, m), 7.69 (1H, d), 7.86 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 441.
Figure pct00020
중간체 50: 7-브로모-8-플루오로-3-(1-히드록시에틸)-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온
염화암모늄 (6.70 g, 125.31 mmol)을 0℃의 MeOH (65 mL) 중 메틸 2-((4-브로모-3-플루오로-2-니트로페닐)아미노)-3-히드록시부타노에이트 ( 중간체 36 ) (4.4 g, 12.53 mmol) 및 아연 (8.19 g, 125.31 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 이것에 물 (2 mL)을 첨가하고, 혼합물을 0℃에서 60분 동안 교반시켰다. 주황색이 사라졌으며 (이는 완전한 전환을 나타냄), LCMS는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 상기 혼합물을 여과시키고, 메탄올로 세척하고, 여과액을 농축시켰다. 잔사를 에틸 아세테이트/메탄올 (10/1)로 희석시키고, 유기물을 물 (대략 20 ml), 염수로 세척하고, 건조시키고 (무수 Na2SO4), 농축시켜 중간체 메틸 2-((2-아미노-4-브로모-3-플루오로페닐)아미노)-3-히드록시부타노에이트를 수득하였다.
상기 고체를 메탄올 (대략 30 ml)에 슬러리화하고, 디옥산 중 4 M HCl (대략 1 ml)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~100% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 7-브로모-8-플루오로-3-(1-히드록시에틸)-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 50 ) (3.20 g, 88%)을 황색 고체로서 수득하였다. (부분입체 이성질체들의 혼합물). m/z (ES+) [M+H]+ = 289, 291.
중간체 51: 7-브로모-8-플루오로-3-(1-히드록시에틸)-1H-퀴녹살린-2-온
DDQ (432 mg, 1.90 mmol)를 CH2Cl2 (30 mL) 중 7-브로모-8-플루오로-3-(1-히드록시에틸)-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 50 ) (500 mg, 1.73 mmol)의 현탁액에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. LCMS는 클린한 전환을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하고, 포화 NaHCO3 (대략 100 ml) 용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 물로 세척하고, 건조시켜 7-브로모-8-플루오로-3-(1-히드록시에틸)-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 51 ) (439 mg, 88%)을 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.39 (3H, d), 4.78 - 5.31 (2H, m), 7.39 - 7.71 (2H, m), 12.72 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 287, 289.
중간체 52: 3-아세틸-7-브로모-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온
DCM 중 DMSO (0.651 mL, 9.17 mmol)의 용액을 -78℃의 디클로로메탄 (20 ml) 중 옥살릴 클로라이드 (3.06 mL, 6.12 mmol) (DCM 중 2 M)의 교반 용액에 적가하였다. 7-브로모-8-플루오로-3-(1-히드록시에틸)-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 51 ) (439 mg, 1.53 mmol)의 용액을 상기 반응 혼합물에 서서히 첨가하고, 생성된 슬러리를 -78℃에서 15분 동안 교반시켰다. 트리에틸아민 (1.279 mL, 9.17 mmol)을 적가하고, 생성된 슬러리를 0℃에서 추가 30분간 교반시켰다. LCMS는 원하는 생성물의 형성을 나타냈다. 물 (30 ml)을 첨가하고, 상기 혼합물을 디클로로메탄/MeOH (5:1) (2 x 50 ml)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔사를 역상 C18 컬럼 (0~100% ACN/물/0.1%TFA로 용출)으로 정제하여 3-아세틸-7-브로모-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 52 ) (85 mg, 19%)을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.52 - 2.66 (3H, m), 7.42 - 7.76 (2H, m), 13.03 (1H, br s). m/z (ES+) [M+H]+ = 285, 287.
중간체 53: 7-브로모-3-(1,1-디플루오로에틸)-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온
DAST (0.148 mL, 1.12 mmol)를 실온의 CH2Cl2 (20 mL) 중 3-아세틸-7-브로모-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 52) (80 mg, 0.28 mmol)의 현탁액에 첨가하고, 생성된 현탁액을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. LCMS는 42%의 생성물 형성률을 나타냈다. 상기 혼합물을 주말 동안 계속 교반시켰다. 상기 혼합물에 물을 첨가하고, DCM으로 추출하였다. 유기 층을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시켰다. 잔사를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하여 7-브로모-3-(1,1-디플루오로에틸)-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 53 ) (65.0 mg, 75%)을 연한 황색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 307, 309. (상기 물질은 그다지 순수하지 않으며, 다음 단계로 넘어감).
중간체 54: 3-(1,1-디플루오로에틸)-8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온
1,4-디옥산 (10 mL) 중 (트리부틸스탄닐)메탄올 (102 mg, 0.32 mmol), Xphos Pd G2 (24.98 mg, 0.03 mmol) 및 7-브로모-3-(1,1-디플루오로에틸)-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 53 ) (65 mg, 0.21 mmol)의 혼합물을 N2 분위기 하에 80℃에서 6시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하여 3-(1,1-디플루오로에틸)-8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 54 ) (55.0 mg, 100%)을 갈색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 259.
중간체 55: 7-(브로모메틸)-3-(1,1-디플루오로에틸)-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온
CBr4 (129 mg, 0.39 mmol)를 0℃의 CH2Cl2 (6 mL) 중 3-(1,1-디플루오로에틸)-8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 54 ) (67 mg, 0.26 mmol) 및 트리페닐포스핀 (102 mg, 0.39 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~100% 에틸 아세테이트로 용출)에서 정제하여 7-(브로모메틸)-3-(1,1-디플루오로에틸)-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 55 ) (56.0 mg, 67%)을 백색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 321, 323.
실시예 19: 5-[4-[[2-(1,1-디플루오로에틸)-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
아세토니트릴 (4 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-(1,1-디플루오로에틸)-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 55 ) (56 mg, 0.16 mmol) 및 N,6-디메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl ( 중간체 33 ) (48.2 mg, 0.16 mmol)의 현탁액에 DIPEA (0.164 mL, 0.94 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 1.5시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 역상 Gilson 컬럼 (0~70% ACN/물/0.1%TFA로 용출)에서 정제하였다. 순수한 분획을 합하고, 0.5 ml의 수성 1 M HCl을 합한 분획에 첨가하고, 건조상태까지 동결건조시켜 5-[4-[[2-(1,1-디플루오로에틸)-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드를 HCl 염 ( 실시예 19 ) (35.0 mg, 44%)으로서 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.08 (3H, br t), 2.52 (3H, s), 2.80 (3H, br d), 3.02 - 3.54 (8H, m), 4.61 (2H, br s), 7.57 (1H, br d), 7.67 - 8.04 (3H, m), 8.52 (1H, br d), 11.74 (1H, br s), 12.77 - 13.55 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 475.
Figure pct00021
중간체 56: 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)프로파노에이트
DIPEA (151 ml, 867.27 mmol)를 DMF (300 mL) 중 1-브로모-2,4-디플루오로-3-니트로벤젠 ( 중간체 35 ) (68.8 g, 289.09 mmol) 및 메틸 알라니네이트, HCl (40.4 g, 289.09 mmol)의 교반 용액에 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다 (LCMS에 의하면 원하는 생성물로 완전히 전환됨). 반응 혼합물을 로켓 증발 시스템을 사용하여 농축시키고, 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 물로 철저히 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에 농축시켰다. 100 mL의 DCM을 상기 주황색 고체에 첨가하고, 현탁액을 실온에서 30분 동안 교반시키고, 고체를 여과시켜 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)프로파노에이트 (24.00 g, 26%) ( 중간체 56 )를 밝은 주황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 디클로로메탄-d2) 1.52 - 1.62 (3H, m), 3.80 (3H, s), 4.28 (1H, quin), 6.49 (1H, dd), 7.19 - 7.39 (1H, m), 7.54 (1H, dd); 19F NMR (471 MHz, 디클로로메탄-d2) -109.49 (1F, s)　; m/z (ES+) [M+H]+ = 321, 323.
중간체 57: 7-브로모-8-플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온
아연 (78 g, 1195.88 mmol)을 0℃의 MeOH (720 ml) 및 물 (16 ml) 중 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)프로파노에이트 ( 중간체 56 ) (48 g, 149.49 mmol) 및 염화암모늄 (64.0 g, 1195.88 mmol)의 혼합물에 일부씩 첨가하고 (발열 반응), 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다 (주황색의 완전한 사라짐은 반응 완료를 나타냄). 고체를 여과 제거하고, 고체 케이크를 DCM 중 20% MeOH로 세척하였다. 여과액을 농축시키고, 물을 조 생성물에 첨가하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 층을 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 오일을 제공하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 291, 293.
이 물질을 에틸 아세테이트 (50 mL) 및 메탄올 (50 mL)에 슬러리화하고, 디옥산 중 4 N HCl 2 mL를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 농축시켜 조 생성물 7-브로모-8-플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 57 ) (38.7 g)을 회색 고체로서 수득하였다. 조 생성물 (38.7 g)은 이 반응의 수율이 100%인 것으로 가정하여 추가 정제 없이 다음 단계에 적용하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 259.
중간체 58: 7-브로모-8-플루오로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온
DDQ (21.55 g, 94.95 mmol)를 DCM (200 mL) 중 7-브로모-8-플루오로-3-메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 57) (20.5 g, 79.13 mmol)의 교반 용액에 한꺼번에 첨가하고, 매우 농후한 황백색 슬러리를 생성하고, 추가의 디클로로메탄 (800 mL)을 첨가하였다. 생성된 슬러리를 실온에서 2시간 동안 교반시켰다 (LCMS에 의하면 원하는 생성물로 완전히 전환됨). 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 포화 중탄산나트륨 수용액 (약 500 mL, 켄칭은 강한 거품을 초래함)으로 켄칭하였다. 상기 슬러리를 실온에서 하룻밤 교반시키고, 고체를 여과 제거하고, 물로 철저히 세척하고, 고체를 필터에서 하룻밤 건조시켰다. 이 고체를 디에틸 에테르로 세척하고, 30분 동안 건조시켜 7-브로모-8-플루오로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 58) (16.28 g, 80%)을 황백색 고체로서 제공하였다. 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -124.18 (1F, s); 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.41 (3H, s), 7.45 - 7.54 (2H, m), 12.60 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 257.
중간체 17: 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온
1,4-디옥산 (200 mL) 중 (트리부틸스탄닐)메탄올 (15.39 g, 47.93 mmol), 7-브로모-8-플루오로-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 58) (11.2 g, 43.57 mmol) 및 Xphos Pd G2 (1.714 g, 2.18 mmol)의 혼합물을 80℃에서 7시간 동안 교반시켰다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~15% 메탄올로 용출)에서 정제하였다. 분획을 슬러리가 될 때까지 농축시키고, 에테르로 희석시키고, 고체를 여과로 수집하고, 건조시켜 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 17) (8.10 g, 89%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.41 (3H, s), 4.63 (2H, br d), 5.39 (1H, t), 7.31 (1H, br t), 7.51 (1H, d), 12.41 (1H, br s). m/z (ES+) [M+H]+ = 209.
실시예 20: 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
질소 하에 0℃에서 트리에틸포스판 (20.90 ml, 145.06 mmol)을 첨가 깔때기로 DCM (400 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 17) (15.1 g, 72.53 mmol) 및 1,2-디브로모-1,1,2,2-테트라클로로에탄 (52.0 g, 159.56 mmol)의 교반 현탁액에 적가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켜 연한 황색 현탁액을 제공하였다. 조 LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. DCM을 진공 하에 제거하고; 잔사를 실온의 300 mL의 디에틸 에테르에 슬러리화하고, 연한 황색 침전물을 여과시키고, 200 ml의 에테르로 세척하였다. 고체를 300 ml의 물에 녹이고, 실온에서 10분 동안 교반시키고, 고체를 여과로 수집하고, 물로 철저히 세척하여 (200 ml), 염을 제거하였다. 고체를 진공 하에 하룻밤 건조시켰다 (가열 없음). 고체를 헥산으로 세척하고, 부셸(bushel) 깔때기에서 진공에서 건조시켜 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 59) (22.76 g, 116%, 약간의 무기 염을 함유할 가능성이 있음)을 황백색 고체로서 제공하였다. 이를 다음 반응에 그대로 사용하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.42 (3H, s), 4.65 - 4.93 (2H, m), 7.28 - 7.42 (1H, m), 7.51 (1H, d), 12.53 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 271, 273.
아세토니트릴 (350 ml) 중 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 59) (22.76 g) 및 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl ( 중간체 32 ) (24.24 g, 77.9 mmol)을 충전시킨 플라스크에 DIPEA (38.0 ml, 217.59 mmol)를 실온에서 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 4시간 동안 교반시켰다. 반응은 완료되지 않았다. 상기 혼합물에 5 g의 KI 및 2 g의 NaI를 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 20시간 동안 교반시켰다. 추가의 540 mg (대략 0.03 당량)의 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (중간체 32)을 상기 혼합물에 첨가하고, 교반을 50℃에서 2시간 동안 계속하였다. 반응 현탁액으로부터의 고체를 여과로 수집하고, 아세토니트릴로 세척하고, 건조시켰다. 그 후, 생성된 물질을 물 (대략 400 ml)에 현탁시키고, 실온에서 20분 동안 슬러리화하고, 여과시키고, 건조시켰다 (LCMS에 의하면 97%의 순도). 그 후, 고체를 환류에서 DCM/MeOH (3/1) (약 1.5 L)의 혼합물에 용해시키고, 실리카 겔 패드를 통해 여과시키고, 고체가 석출될 때까지 대부분의 DCM을 제거하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 유지하였다. 고체를 여과로 수집하고, 여과액에 대해 상기 절차를 반복하고, 고체를 합하여 생성물 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 20) (26 g, 84%)를 연한 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.41 (3H, s), 2.57 - 2.69 (4H, m), 2.76 (3H, d), 3.16 (4H, br s), 3.70 (2H, s), 7.29 (1H, br t), 7.40 - 7.60 (2H, m), 7.83 (1H, d), 8.38 (1H, br d), 12.44 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 429.
Figure pct00022
실시예 21: 6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
DIPEA (0.052 mL, 0.30 mmol)를 아세토니트릴 ( mL) 중 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 59)(40 mg, 0.15 mmol) 및 6-(디플루오로메틸)-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (중간체 60) (50.6 mg, 0.15 mmol)의 교반 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응물을 농축시키고, 정제를 위한 분석 그룹에 제출하였으며 (정제 조건: 잔사를 역상 C18 컬럼 (0~100% ACN/물/0.1% NH4OH로 용출)으로 정제하였으며 이에 의해 6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 21) (15 mg, 22%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.37 (3H, s), 2.64 (4H, br s), 2.84 (3H, d), 3.01 (4H, br d), 3.70 (2H, s), 7.00 - 7.28 (2H, m), 7.42 (1H, br d), 7.86 (1H, d), 8.09 (1H, d), 8.39 (1H, q), 12.24 - 12.63 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 461.
Figure pct00023
중간체 61: 메틸 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복실레이트
중합체 지지된 트리페닐포스핀 (1.512 g, 5.76 mmol) (3.4 g 첨가, 1.6 mmol/g의 PPh3 로딩량에 기초하여 계산됨)을 실온의 DCM (40 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 17) (400 mg, 1.92 mmol) 및 퍼브로모메탄 (1.274 g, 3.84 mmol)의 교반 슬러리에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 23℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응은 완료되지 않았다. 추가의 중합체 결합 PPh3 (1 g)을 첨가하여 반응을 완료하였다. 반응 혼합물을 여과시키고, DCM, THF로 세척하고, 여과액을 진공 하에 농축시켜 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-메틸퀴녹살린-2(1H)-온을 연한 황색 고체로서 수득하였다.
상기 새롭게 제조된 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-메틸퀴녹살린-2(1H)-온에 메틸 6-플루오로-5-(피페라진-1-일)피콜리네이트, 2HCl (중간체 12) (600 mg, 1.92 mmol), 아세토니트릴 (25 mL) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (1674 μl, 9.61 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃까지 1시간 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 농축시키고, 조 고체를 DCM 중 0~10% MeOH를 사용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하여 메틸 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 61) (0.484 g, 59%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.34 - 2.49 (3H, m), 2.52 - 2.62 (4H, m), 3.08 - 3.28 (4H, m), 3.70 (2H, s), 3.83 (3H, s), 7.29 (1H, t), 7.44 - 7.54 (2H, m), 7.91 (1H, dd), 12.45 (1H, s); 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.50 (1F, s), -70.49 (1F, s). m/z (ES+) [M+H]+ = 430.
실시예 22: 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
40 mL 신틸레이션 바이알에서 암모니아 (MeOH 중 7 N 암모니아) (31.3 ml, 218.90 mmol)를 메틸 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복실레이트 ( 중간체 61 )(0.470 g, 1.09 mmol)에 첨가하고, 밀봉하고, 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. LCMS에 의하면 원하는 생성물로 완전히 전환되었다. 백색 고체를 여과시켜 103 mg의 순수한 생성물을 제공하였다. 여과액을 진공 하에 농축시키고, 생성된 황백색 고체를 약 5 mL의 메탄올에 슬러리화하고, 여과시켜 추가의 순수한 생성물 298 mg을 수득하였다. 둘 다의 배치를 합하여 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 22) (0.401 g, 88%)를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.42 (3H, s), 2.59 (4H, br s), 3.09 - 3.27 (4H, m), 3.70 (2H, s), 7.29 (1H, br t), 7.46 (1H, br s), 7.49 - 7.58 (2H, m), 7.76 (1H, br s), 7.85 (1H, br d), 12.35 (1H, br s); 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.49 (1F, s), -72.40 (1F, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 415.
Figure pct00024
중간체 62: 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)부타노에이트
DIPEA (165 ml, 942.91 mmol)를 DMF (733 mL) 중 1-브로모-2,4-디플루오로-3-니트로-벤젠 (중간체 35) (74.8 g, 314.30 mmol) 및 메틸 2-아미노부타노에이트, HCl (48.3 g, 314.30 mmol)의 교반 용액에 서서히 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. DMF를 로켓 증발기에서 제거하고, 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 농축 후 조 물질을 플래시 실리카 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 헥산 중 0~70% EtOAc). 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)부타노에이트 (중간체 62) (49.4 g, 47%)를 적색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 0.82 - 0.98 (3H, m), 1.77 - 1.93 (2H, m), 3.70 (3H, d), 4.38 - 4.54 (1H, m), 6.77 (1H, br d), 7.28 (1H, br d), 7.64 - 7.80 (1H, t); m/z (ES+) [M+H]+ = 335.
중간체 63: 7-브로모-3-에틸-8-플루오로-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온
아연 (44.1 g, 674.07 mmol)을 MeOH (468 mL) 중 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)부타노에이트 (중간체 62) (50.2 g, 149.79 mmol) 및 염화암모늄 (64.1 g, 1198.34 mmol)의 혼합물에 일부씩 첨가하였다 (발열 반응). 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 고체를 여과 제거하고, DCM 중 20% MeOH로 세척하였다. 이 물질을 메탄올 (120 mL)에 용해시키고, 디옥산 중 4 N HCl (10 mL)을 첨가하고, 반응물을 30분 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 에틸 아세테이트로 희석시키고, 포화 NaHCO3 용액으로 염기성화하였다. 유기 층을 분리하고, 물로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시키고, 농축시켜 조 생성물을 제공하였다. 고체를 100 mL의 메탄올로 미분화하고, 10분 동안 교반시키고, 연한 갈색 고체를 여과 제거하여 7-브로모-3-에틸-8-플루오로-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 63) (39.8 g, 97%) 생성물을 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 0.92 (3H, t), 1.49 - 1.77 (2H, m), 3.57 - 3.87 (1H, m), 6.24 - 6.62 (2H, m), 6.99 (1H, dd), 10.44 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 273.
중간체 64: 7-브로모-3-에틸-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온
DDQ (29.7 g, 130.94 mmol)를 DCM (546 mL) 중 7-브로모-3-에틸-8-플루오로-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 63) (29.8 g, 109.12 mmol)의 교반 용액에 한꺼번에 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 고체를 150 mL의 메탄올로 슬러리화하고, 30분 동안 교반시켰다. 고체를 여과 제거하고, 30 mL의 메탄올로 세척하였다. 고체를 2 L의 둥근 바닥 플라스크로 옮기고; 200 mL의 물을 첨가하고, 이어서 300 mL의 중탄산나트륨을 서서히 첨가하였다. 첨가 완료 후 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반시켜 연한 황색 슬러리를 제공하였다. 교반을 중단하고, 수성 층을 경사시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 물로 철저히 세척하여 7-브로모-3-에틸-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 64) (24.45 g, 83%)을 황색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.81 (2H, q), 7.27 - 7.69 (2H, m), 12.59 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 271.
중간체 65: 3-에틸-8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온
Xphos Pd G2 (1.121 g, 1.43 mmol)를 1,4-디옥산 (143 mL) 중 7-브로모-3-에틸-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 64) (7.727 g, 28.50 mmol) 및 (트리부틸스탄닐)메탄올 (10.98 g, 34.20 mmol)의 교반 탈기 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 80℃에서 6시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 100 mL의 디에틸 에테르을 첨가하고, 슬러리를 30분 동안 교반시켰다. 고체를 여과 제거하고, 50 mL의 디에틸 에테르로 세척하여 3-에틸-8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (5.88 g, 93%) (중간체 65)을 황백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.82 (2H, q), 4.64 (2H, br d), 5.40 (1H, t), 7.32 (1H, br t), 7.55 (1H, d), 12.40 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 223.
중간체 66: 7-(브로모메틸)-3-에틸-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온
질소 하에 0℃에서 5분의 기간에 걸쳐 트리에틸포스판 (19.94 ml, 135.00 mmol)을 DCM (355 mL) 중 3-에틸-8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 65) (10 g, 45.00 mmol) 및 CBr4 (49.2 g, 148.50 mmol)의 교반 용액에 적가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. DCM을 진공 하에 제거하고, 잔사를 150 mL의 디에틸 에테르에 슬러리화하였다. 백색 침전물을 여과 제거하고, 50 mL의 디에틸 에테르로 세척하였다. 이 고체를 물 (200 mL)로 슬러리화하고, 30분 동안 교반시켰다. 고체를 여과 제거하고, 물로 철저히 세척하였다. 고체를 진공 하에 하룻밤 건조시켜 7-(브로모메틸)-3-에틸-8-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 66) (11.38 g, 89%)을 연한 갈색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MH z, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.83 (2H, q), 4.81 (2H, s), 7.37 (1H, br t), 7.55 (1H, d), 12.53 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 285.
Figure pct00025
실시예 23: 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
DIPEA (20.90 ml, 119.64 mmol)를 아세토니트릴 (178 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-에틸-8-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 66) (11.37 g, 39.88 mmol) 및 N,6-디메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 33) (14.09 g, 45.86 mmol)의 교반 슬러리에 첨가하였다. 생성된 용액을 50℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응이 완료되었다. 용매의 절반을 증발에 의해 제거하고, 10 mL의 포화 중탄산나트륨을 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반시켰다. 고체를 여과 제거하고, 물, 이어서 50 mL의 아세토니트릴로 세척하였다. 고체를 DCM/메탄올 (대략 9/1)에 용해시키고, 실리카 베드를 통해 여과시켰다. 여과액을 농축시켜 연한 황색 고체를 제공하였다. 이 물질을 대략 120 mL의 메탄올로 미분화하고, 고체를 여과 제거하고, 건조시켰다. LCMS는 여전히 대략 2.1%의 불순물을 보여준다 (시약으로 인한 것일 가능성이 있음). 물질을 다시 아세토니트릴로 미분화하고, 그 후 아세토니트릴 중 3% 메탄올로 미분화하여 대략 14 g의 백색 고체를 제공하였다. 메탄올 (40 mL)을 첨가하고, 3시간 동안 교반시켰다. 고체를 여과 제거하여 순수한 생성물 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 23) (12.26 g, 70%)를 제공하였다. 1HNMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.23 (3H, t), 2.48 (3H, s), 2.62 (4H, br s), 2.76 - 2.88 (5H, m), 2.95 (4H, br s), 3.73 (2H, s), 7.31 (1H, t), 7.47 (1H, d), 7.56 (1H, d), 7.79 (1H, d), 8.41 (1H, q), 12.44 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 439.
Figure pct00026
실시예 24: 6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
DIPEA (0.049 mL, 0.28 mmol)를 아세토니트릴 (2 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-에틸-8-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 66) (40 mg, 0.14 mmol) 및 6-(디플루오로메틸)-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (중간체 60) (48.1 mg, 0.14 mmol)의 교반 혼합물에 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응물을 농축시키고, 정제를 위한 분석 그룹에 제출하였다 (정제 조건: 잔사를 역상 C18 컬럼 (0~100% ACN/물/0.1% NH4OH로 용출)으로 정제하였으며 이에 의해 6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 24) (56.0 mg, 84%)를 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.23 (3H, t), 2.65 (4H, br d), 2.77 - 2.86 (5H, m), 2.97 - 3.06 (4H, m), 3.73 (2H, s), 7.00 - 7.26 (1H, t), 7.30 (1H, br d), 7.55 (1H, br d), 7.86 (1H, d), 8.09 (1H, d), 8.39 (1H, q), 12.45 (1H, br d); m/z (ES+) [M+H]+ = 475.
Figure pct00027
중간체 67: 메틸 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복실레이트
DIPEA (246 μl, 1.41 mmol)를 아세토니트릴 (2 mL) 중 7-(브로모메틸)-3-에틸-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 66) (134 mg, 0.47 mmol) 및 메틸 5-(피페라진-1-일)피콜리네이트, 2HCl (중간체 119)(138 mg, 0.47 mmol)의 교반 슬러리에 첨가하였다. 생성된 용액을 50℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: DCM 중 0~20% MeOH). 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 메틸 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 67) (0.142 g, 71.0%)를 백색 고체로서 수득하였다; m/z (ES+) [M+H]+ = 426.
실시예 25: 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
메탄올 중 암모니아 (7 N) (3 mL, 6.00 mmol)를 메틸 메틸 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 67) (130 mg, 0.31 mmol)에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 50℃에서 24시간 동안 교반시켰다 (밀봉 튜브). 용매를 제거하고, 생성된 잔사를 플래시 실리카 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: DCM 중 0~35% MeOH). 생성물 분획을 감압 하에 농축시켜 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 25) (0.079 g, 63%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.23 (3H, t), 2.54 - 2.61 (4H, m), 2.83 (2H, q), 3.32 - 3.40 (4H, m), 3.70 (2H, s), 7.24 - 7.34 (2H, m), 7.38 (1H, dd), 7.56 (1H, d), 7.76 (1H, br d), 7.84 (1H, d), 8.27 (1H, d), 12.44 (1H, br s); m/z (ES+) [M+H]+ = 411.
Figure pct00028
중간체 68: 메틸 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복실레이트
질소 하에 0℃에서 5분의 기간에 걸쳐 트리에틸포스핀 (0.399 ml, 2.70 mmol)을 DCM (7.10 mL) 중 3-에틸-8-플루오로-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 65) (0.2 g, 0.90 mmol) 및 CBr4 (0.985 g, 2.97 mmol)의 교반 용액에 적가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. DCM을 진공 하에 제거하고, 생성된 고체를 디에틸 에테르에서 슬러리화하였다. 백색 침전물을 진공 하에 여과시키고, 물, 이어서 에테르로 세척하였다. 고체를 진공 하에 (가열 없이) 하룻밤 건조시켜 7-(브로모메틸)-3-에틸-8-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온을 연한 갈색 고체로서 제공하였다.
상기 조 생성물에 메틸 6-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜리네이트, 2HCl (중간체 16) (278 mg, 0.90 mmol), 아세토니트릴 (10 mL) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (785 μl, 4.51 mmol)을 첨가하고, 1시간 동안 70℃까지 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 농축시키고, NaHCO3 수용액 (1 mL)으로 켄칭하고, 1시간 동안 교반시켰다 (실온에서). 물 (3 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 10분 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 물 (50 mL)로 세척하였다. 고체를 DCM 중 0~10% MeOH를 사용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 단리된 생성물은 LCMS에 의하면 순도가 89%였다. NH4OH 개질제를 함유하는 물 중 20~40% 아세토니트릴을 사용하여 질량 지시 분취용 HPLC를 사용하여 상기 고체를 추가로 정제하여 메틸 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 68) (115 mg, 0.262 mmol, 29%)를 백색 고체로서 수득하였으며, 이때 LCMS 순도는 93%였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.23 (3H, t), 2.45 - 2.49 (3H, m), 2.53 - 2.69 (4H, m), 2.83 (2H, q), 2.98 (4H, br s), 3.73 (2H, s), 3.83 (3H, s), 7.31 (1H, t), 7.45 (1H, d), 7.56 (1H, d), 7.86 (1H, d), 12.44 (1H, br s); 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.54 (1F, s). m/z (ES+) [M+H]+ = 440.
실시예 26: 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
40 mL 신틸레이션 바이알에서 메탄올 중 7 N 암모니아 (6.40 ml, 44.78 mmol)를 메틸 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 68) (0.0984 g, 0.22 mmol)에 첨가하고, 밀봉하고, 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 추가의 암모니아 (6.40 ml, 44.78 mmol) 용액을 첨가하고, 50℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 추가의, 메탄올 중 NH3을 첨가하고, 실온에서 주말 동안 교반시켰다. LCMS에 의하면 반응이 완료되었다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 생성된 고체를 디에틸 에테르에서 슬러리화하였다. 고체를 여과시키고, 추가의 에테르 및 메탄올로 세척하여 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 26) (0.095 g, 100%)를 백색 고체로서 수득하였다; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, br t), 2.45 - 2.49 (3H, m), 2.52 - 2.68 (4H, m), 2.82 (2H, q), 2.94 (4H, br s), 3.72 (2H, br s), 7.30 (1H, br t), 7.38 - 7.51 (2H, m), 7.55 (1H, br d), 7.80 (2H, br d), 12.41 (1H, br s); 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.53 (1F, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 425.
Figure pct00029
중간체 69: 2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드
데스-마틴 퍼요오디난 (458 mg, 1.08 mmol)을 DCM (5 mL) 중 3-에틸-8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 65) (그의 위치 이성질체 3-에틸-8-플루오로-5-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (160 mg, 0.72 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. 용매를 증발시켜 조 생성물을 수득하고, 이를 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.4% FA) 중 5~30% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 (그의 위치 이성질체 3-에틸-8-플루오로-2-옥소-1H-퀴녹살린-5-카르브알데히드로 오염됨) (중간체 69) (110 mg, 69%)를 황색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 221.
실시예 27: 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
티타늄 이소프로폭시드 (64.5 mg, 0.23 mmol)를 THF (3 mL) 중 2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 (중간체 69) (그의 위치 이성질체 3-에틸-8-플루오로-2-옥소-1H-퀴녹살린-5-카르브알데히드로 오염됨) (50 mg, 0.23 mmol) 및 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (54.1 mg, 0.23 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2분 동안 교반시켰다. 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (중간체 32)(192 mg, 0.91 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 MeOH (0.1 mL)로 켄칭하였다. 용매를 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 잔사를 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: Xselect CSH OBD 컬럼 30*150 mm 5 um; 이동상 A: 물(0.05% TFA), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 10분 내에 10% B에서 20% B까지; 254; 220 nm) 및 (컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 19*250 mm, 10 um; 이동상 A: 물(10MMOL/L NH4HCO3+0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 7분 내에 21 B에서 95 B까지; 254/220 nm. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 27) (6 mg, 6%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.56 - 2.64 (4H, m), 2.76 (3H, d), 2.82 (2H, q), 3.14 - 3.20 (4H, m), 3.71 (2H, s), 7.27 - 7.33 (1H, m), 7.53 - 7.59 (2H, m), 7.82 - 7.86 (1H, m), 8.38 - 8.45 (1H, m), 12.46 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -72.58, -135.51; m/z (ES+) [M+H]+ = 443.
Figure pct00030
실시예 28: 6-클로로-5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
티타늄 이소프로폭시드 (51.6 mg, 0.18 mmol)를 THF (3 mL) 중 2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 (중간체 69) (그의 위치 이성질체 3-에틸-8-플루오로-2-옥소-1H-퀴녹살린-5-카르브알데히드로 오염됨) (40 mg, 0.18 mmol) 및 6-클로로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 30)(50 mg, 0.20 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2분 동안 교반시켰다. 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (154 mg, 0.73 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 MeOH (0.1 mL)로 켄칭하고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 30*150 mm, 5 um; 이동상 A: 물 (0.05% NH3H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 21 B에서 41 B까지; 254/220 nm. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-클로로-5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 28) (37.5 mg, 45%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.57 - 2.65 (4H, m), 2.76 - 2.86 (5H, m), 3.05 - 3.15 (4H, m), 3.72 (2H, s), 7.29 (1H, t), 7.55 (1H, d), 7.65 (1H, d), 7.93 (1H, d), 8.40 - 8.45 (1H, m), 12.45 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -135.46; m/z (ES+) [M+H]+ = 459.
Figure pct00031
실시예 29: 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
티타늄 이소프로폭시드 (51.6 mg, 0.18 mmol)를 THF (3 mL) 중 2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 (중간체 69) (그의 위치 이성질체 3-에틸-8-플루오로-2-옥소-1H-퀴녹살린-5-카르브알데히드로 오염됨) (40 mg, 0.18 mmol) 및 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 31)(50 mg, 0.23 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2분 동안 교반시켰다. 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (154 mg, 0.73 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 MeOH (0.1 mL)로 켄칭하고, 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: Xselect CSH OBD 컬럼 30*150 mm 5 um, n; 이동상 A: 물 (0.1% FA), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 6 B에서 17 B까지; 254; 220 nm. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 29) (17.29 mg, 22%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.53 - 2.63 (4H, m), 2.74 - 2.87 (5H, m), 3.05 - 3.15 (4H, m, 물 피크에 병합됨), 3.69 (2H, s), 7.29 (1H, t), 7.37 (1H, dd), 7.54 (1H, d), 7.81 (1H, d), 8.25 (1H, d), 8.35 - 8.42 (1H, m), 12.44 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -135.49; m/z (ES+) [M+H]+ = 425.
Figure pct00032
중간체 70: 5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드
데스-마틴 퍼요오디난 (1.34 g, 3.16 mmol)을 DCM (20 ml) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 17) (8-플루오로-5-(히드록시메틸)-3-메틸-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (0.33 g, 0.79 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.4% FA) 중 5~30% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 (8-플루오로-3-메틸-2-옥소-1H-퀴녹살린-5-카르브알데히드로 오염됨) (중간체 70) (0.300 g, 92%)를 황백색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 207.
실시예 30: 6-클로로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
티타늄 이소프로폭시드 (89 mg, 0.31 mmol)를 THF (3 mL) 중 5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 (8-플루오로-3-메틸-2-옥소-1H-퀴녹살린-5-카르브알데히드로 오염됨) (중간체 70) (150 mg, 0.36 mmol) 및 6-클로로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 30)(80 mg, 0.31 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반시켰다. 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (266 mg, 1.26 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 MeOH (0.1 mL)로 켄칭하고, 농축시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 19*250 mm, 10 um; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3+0.1% NH3.H2O), 이동상 B: MeOH-분취용; 유량: 20 mL/분; 구배: 7분 내에 57 B에서 80 B까지; 254/220 nm. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-클로로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 30) (35.6 mg, 25%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.42 (3H, s), 2.58 - 2.66 (4H, m), 2.79 (3H, d), 3.06 - 3.16 (4H, m), 3.72 (2H, s), 7.30 (1H, t), 7.53 (1H, d), 7.65 (1H, d), 7.93 (1H, d), 8.41 - 8.48 (1H, m), 12.47 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -135.45; m/z (ES+) [M+H]+ = 445.
Figure pct00033
실시예 31: 5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
티타늄 이소프로폭시드 (105 mg, 0.37 mmol)를 THF (3 mL) 중 5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 (8-플루오로-3-메틸-2-옥소-1H-퀴녹살린-5-카르브알데히드로 오염됨) (중간체 70) (150 mg, 0.36 mmol) 및 N,6-디메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, HCl (중간체 33)(100 mg, 0.37 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2분 동안 교반시켰다. 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (313 mg, 1.48 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 MeOH (0.1 mL)로 켄칭하고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 30*150 mm, 5 um; 이동상 A: 물(0.05% NH3H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 19 B에서 39 B까지; 254/220 nm. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 31) (12.39 mg, 8%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.42 (3H, s), 2.48 (3H, s), 2.57 - 2.67 (4H, m), 2.80 (3H, d), 2.90 - 2.98 (4H, m), 3.72 (2H, s), 7.30 (1H, t), 7.47 (1H, d), 7.52 (1H, d), 7.79 (1H, d), 8.39 - 8.46 (1H, m), 12.46 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -135.52; m/z (ES+) [M+H]+ = 425.
Figure pct00034
실시예 32: 5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
티타늄 이소프로폭시드 (103 mg, 0.36 mmol)를 THF (3 mL) 중 5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-카르브알데히드 (8-플루오로-3-메틸-2-옥소-1H-퀴녹살린-5-카르브알데히드로 오염됨) (150 mg, 0.36 mmol) 및 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 31)(80 mg, 0.36 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2분 동안 교반시켰다. 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (308 mg, 1.45 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 MeOH (0.1 mL)로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: Xbridge Phenyl OBD 컬럼, 5 um, 19*150 mm; 이동상 A: 물(0.05%TFA ), 이동상 B: MeOH-분취용; 유량: 20 mL/분; 구배: 12분 내에 24 B에서 32 B까지; 254/220 nm 및 컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 19*250 mm, 10 um; 이동상 A: 물(10 mmol/L NH4HCO3+0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 10분 내에 15 B에서 30 B까지; 254/220 nm. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (12.4 mg, 8%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.42 (3H, s), 2.55 - 2.60 (4H, m), 2.78 (3H, d), 2.90 - 2.98 (4H, m, 물 피크에 병합됨), 3.70 (2H, s), 7.30 (1H, t), 7.38 (1H, dd), 7.52 (1H, d), 7.82 (1H, d), 8.26 (1H, d), 8.38 - 8.43 (1H, m), 12.47 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -135.48; m/z (ES+) [M+H]+ = 411.
Figure pct00035
중간체 72: 4-브로모-3-플루오로-벤젠-1,2-디아민
철 분말 (5.2 g, 93.11 mmol)을 MeOH (30 mL) 중 4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐린 (중간체 71) (7.3 g, 31.06 mmol) 및 HCl (10 mL, 100.00 mmol)(10 M)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 반응 혼합물을 포화 Na2CO3 용액 (100 mL)으로 염기성화하였다. 수성 층을 EtOAc (2 x 100 mL)로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 4-브로모-3-플루오로-벤젠-1,2-디아민 (중간체 72) (6.05 g, 95%)을 어두운 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz,DMSO-d6) 4.66 (2H, s), 4.94 (2H, s), 6.30 (1H, dd), 6.56 (1H, dd); m/z (ES+) [M+H]+ = 205, 207.
중간체 73: 7-브로모-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온
톨루엔 중 에틸 2-옥소아세테이트 (6.41 g, 31.39 mmol)를 톨루엔 (30 mL) 중 4-브로모-3-플루오로-벤젠-1,2-디아민 (중간체 72) (4.46 g, 21.75 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 30분 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 반응 혼합물을 (PE: 10 mL 및 EA: 2 mL)로 희석시켰다. 침전물을 여과로 수집하고, EtOAc (5 mL)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 7-브로모-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 73) (6-브로모-5-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (2.75 g, 52%)을 황백색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 243.
중간체 74 : 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온
CataCXium A-Pd-G2 (0.12 g, 0.18 mmol)를 1,4-디옥산 (30 mL) 중 (트리부틸스탄닐)메탄올 (1.25 g, 3.89 mmol) 및 7-브로모-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 73) (1 g, 2.06 mmol) (6-브로모-5-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 질소 하에 100℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 포화 KF (10 mL)로 켄칭하고, 여과시키고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.1% 포름산) 중 3~30% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 74) (260 mg, 69%) (5-플루오로-6-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨)을 황백색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 195.
실시예 33: 5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
SOCl2 (0.3 mL, 4.11 mmol)를 DCM (3 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 74) (158 mg, 0.41 mmol) (5-플루오로-6-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. DIPEA (0.25 mL, 1.43 mmol) 및 N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 31)(141 mg, 0.64 mmol)를 NMP (3.00 mL) 중 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 19*250 mm, 5 um; 이동상 A: 물(10 mmol/L NH4HCO3+0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 9분 내에 18 B에서 24 B까지; 254; 220 nm). 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 33) (13.00 mg, 8%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.55 - 2.60 (4H, m), 2.77 (3H, d), 3.28 - 3.33 (4H, m), 3.71 (2H, s), 7.30 - 7.42 (2H, m), 7.61 (1H, d), 7.82 (1H, d), 8.20 (1H, s), 8.25 (1H, d), 8.37 - 8.42 (1H, m); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -129.26; m/z (ES+) [M+H]+ = 397.
Figure pct00036
실시예 34: 6-클로로-5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
SOCl2 (0.3 mL, 4.11 mmol)를 DCM (3 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 74) (5-플루오로-6-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (143 mg, 0.37 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. DIPEA (0.25 mL, 1.43 mmol) 및 6-클로로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 30)(101 mg, 0.40 mmol)를 NMP (3.00 mL) 중 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 19*250 mm, 5 um; 이동상 A: 물(10MMOL/L NH4HCO3+0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 9분 내에 25 B에서 28 B까지; 254/220 nm. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-클로로-5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 34) (23.0 mg, 14%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.58 - 2.65 (4H, m), 2.78 (3H, d), 3.07 - 3.14 (4H, m), 3.73 (2H, s), 7.35 (1H, dd), 7.61 (1H, d), 7.65 (1H, d), 7.93 (1H, d), 8.20 (1H, s), 8.41 - 8.45 (1H, m), 12.58 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -135.18; m/z (ES+) [M+H]+ = 431.
Figure pct00037
실시예 35: 5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
SOCl2 (0.3 mL, 4.11 mmol)를 DCM (3 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 74) (5-플루오로-6-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (143 mg, 0.37 mmol) (153 mg, 0.39 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. NMP (3 mL) 중 DIPEA (0.25 mL, 1.43 mmol) 및 N,6-디메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 33)(137 mg, 0.58 mmol)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 19*250 mm, 5 um; 이동상 A: 물(10MMOL/L NH4HCO3+0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 9분 내에 24 B에서 28 B까지; 254/220 nm. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 35) (13.0 mg, 8%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.48 (3H, s), 2.56 - 2.65 (4H, s), 2.79 (3H, d), 2.92 - 2.97 (4H, m), 3.73 (2H, s), 7.31 - 7.39 (1H, m), 7.47 (1H, d), 7.61 (1H, d), 7.78 (1H, d), 8.19 (1H, s), 8.39 - 8.44 (1H, m), 12.55 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -135.25; m/z (ES+) [M+H]+ = 411.
Figure pct00038
실시예 36: 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
SOCl2 (0.3 mL, 4.11 mmol)를 DCM (3 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (5-플루오로-6-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (144 mg, 0.37 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. DIPEA (0.25 mL, 1.43 mmol) 및 6-플루오로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 32)(94 mg, 0.39 mmol)를 NMP (3.00 mL) 중 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 19*250 mm, 5 um; 이동상 A: 물(10MMOL/L NH4HCO3+0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 9분 내에 23 B에서 25 B까지; 254/220 nm; RT1:6.9,8.46. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 36) (16.0 mg, 10%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.56 - 2.62 (4H, m), 2.76 (3H, d), 3.13 - 3.20 (4H, m), 3.71 (2H, d), 7.33 (1H, dd), 7.55 (1H, t), 7.61 (1H, d), 7.83 (1H, dd), 8.19 (1H, s), 8.37 - 8.43 (1H, m), 12.56 (1H, brs); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -72.57, -135.21; m/z (ES+) [M+H]+ = 415.
Figure pct00039
실시예 37: 5-[4-[[2-(디플루오로메틸)-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
물 (0.5 mL) 중 염화철(II) (6.18 mg, 0.05 mmol) 및 아연(II) 디플루오로메탄술피네이트 (86 mg, 0.29 mmol)의 용액을 실온에서 DMSO (3 mL) 중 5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 35) (40.0 mg, 0.10 mmol) 및 TFA (7.51 μl, 0.10 mmol)의 교반 용액에 일부씩 첨가하였다. 이어서 tert-부틸 히드로퍼옥시드 (9.44 μl, 0.10 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼, 컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼 30×150 mm 5 um; 이동상 A: 물 (0.05% NH3H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 12% B에서 32% B까지; 254/220 nm; Rt: 6.07분. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[[2-(디플루오로메틸)-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 37) (2.2 mg, 5%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.49 (3H, s), 2.60 - 2.65 (4H, m), 2.80 (3H, d), 2.92 - 2.99 (4H, m), 3.76 (2H, s), 7.08 (1H, t), 7.39 (1H, t), 7.48 (1H, d), 7.70 (1H, d), 7.79 (1H, d), 8.42 (1H, q), 13.01 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -124.324, -134.183; m/z (ES+) [M+H]+ = 461.
Figure pct00040
중간체 72: 4-브로모-3-플루오로-벤젠-1,2-디아민
철 분말 (3.56 g, 63.83 mmol)을 실온에서 MeOH (30 mL) 중 4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐린 (중간체 71) (3.00 g, 12.77 mmol), 진한 염산 (10.64 ml, 127.65 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 물 (100 mL)로 희석시키고, 에틸 아세테이트 (100 mL x 3)로 추출하였다. 유기 층을 MgSO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 4-브로모-3-플루오로-벤젠-1,2-디아민 (중간체 72) (2.5 g, 96%)을 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 4.66 (2H, s), 4.94 (2H, s), 6.30 (dd, 1H), 6.56 (dd, 1H); m/z (ES+) [M+H]+ = 205.
중간체 75: 7-브로모-8-플루오로-3-메톡시-1H-퀴녹살린-2-온
메틸 2,2,2-트리메톡시아세테이트 (2.402 g, 14.63 mmol)를 실온에서 톨루엔 (20 mL) 중 4-브로모-3-플루오로벤젠-1,2-디아민 (중간체 72) (1.500 g, 7.32 mmol), 트리스(((트리플루오로메틸)술포닐)옥시)이테르븀 (0.454 g, 0.73 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 5시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 C18 컬럼에서 역상 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 중 5~70% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 7-브로모-8-플루오로-3-메톡시-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 75) (0.650 g, 32%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 3.97 (3H, s), 7.31 (1H, dd), 7.45 (1H, dd); m/z (ES+) [M+H]+ = 273.
중간체 76: 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메톡시-1H-퀴녹살린-2-온
(트리부틸스탄닐)메탄올 (882 mg, 2.75 mmol)을 질소 하에 실온에서 1,4-디옥산 (20 mL) 중 7-브로모-8-플루오로-3-메톡시퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 75) (300.0 mg, 1.1 mmol), cataCXium A-Pd-G2 (73 mg, 0.11 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 포화 KF (10 mL)로 켄칭하고, 그 후 여과시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 C18 컬럼에서 역상 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 중 5~100% MeOH). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메톡시-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 76) (130 mg, 53%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 3.97 (3H, s), 4.88 (2H, d), 5.36 (1H, s), 7.27 - 7.32 (1H, m), 7.36 (1H, d), 12.45 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 225.
중간체 77: 7-(클로로메틸)-8-플루오로-3-메톡시-1H-퀴녹살린-2-온
SOCl2 (8 ml, 109.62 mmol)를 실온에서 디에틸 에테르 (50 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메톡시-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 76) (50.0 mg, 0.22 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하여 7-(클로로메틸)-8-플루오로-3-메톡시-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 77) (66.7 mg, 122%, 조 물질)을 황색 오일로서 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 직접적으로 다음 단계에서 사용하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 3.97 (3H, s), 4.88 (2H, s), 7.27 - 7.42 (2H, m), 12.60 (1H, s) m/z (ES+) [M+H]+ = 243.
실시예 38: 5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 31)(150 mg, 0.68 mmol)를 실온에서 MeCN (10 mL) 중 7-(클로로메틸)-8-플루오로-3-메톡시-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 77)(198 mg, 0.82 mmol), DIPEA (0.595 mL, 3.40 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 중 5~70% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 생성물 (103.0 mg)을 황색 고체로서 수득하였다 (Uv에 의하면 80%의 순도). 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 재정제하였다 (용출 구배: 물 중 5~70% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 38) (36.0 mg, 12%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 2.51 - 2.60 (4H, m), 2.77 (3H, d), 3.18 - 3.45 (4H, m), 3.66 (2H, s), 3.95 (3H, s), 7.10 - 7.27 (1H, m), 7.27 - 7.42 (2H, m), 7.81 (1H, d), 8.25 (1H, d), 8.39 (1H, q), 12.30 (1H, s); 19F NMR (282 MHz, DMSO-d6) -134.783; m/z (ES+) [M+H]+ = 427.
Figure pct00041
실시예 39: 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
SOCl2 (0.065 mL, 0.89 mmol)를 실온에서 디에틸 에테르 (10 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메톡시-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 76) (0.040 g, 0.18 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. MeCN (10.00 mL) 중 6-플루오로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 32)(0.043 g, 0.18 mmol) 및 DIPEA (0.156 mL, 0.89 mmol)를 실온에서 상기 고체에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC 컬럼으로 정제하였다, 컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 19*250 mm, 10 um; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3 + 0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 7분 내에 34 B에서 48 B까지; 254/220 nm; RT1:5.9. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 39)(0.020 g, 25%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 2.55 - 2.61 (4H, m), 2.75 (3H, d), 3.11 - 3.19 (4H, m), 3.67 (2H, s), 3.96 (3H, s), 7.18 - 7.29 (1H, m), 7.35 (1H, d), 7.55 (1H, dd), 7.79 - 7.88 (1H, m), 8.41 (1H, d), 12.50 (1H, s); 19F NMR (282 MHz, DMSO-d6) -72.581, -134.799; m/z (ES+) [M+H]+ = 445.
Figure pct00042
실시예 40: 5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
N,6-디메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 33)(0.097 g, 0.41 mmol)를 실온에서 MeCN (10 mL) 중 7-(클로로메틸)-8-플루오로-3-메톡시퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 77) (0.100 g, 0.41 mmol), DIPEA (0.360 mL, 2.06 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다, 컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 30×150 mm 5 um; 이동상 A: 물 (0.05% NH3H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 10B에서 30B까지; 254/220 nm. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 40) (0.063 g, 35%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.48 (3H, s), 2.58 - 2.63 (4H, m), 2.80 (3H, d), 2.92 - 2.96 (4H, m), 3.69 (2H, s), 3.97 (3H, s), 7.25 (1H, t), 7.36 (1H, d), 7.47 (1H, d), 7.79 (1H, d), 8.43 (1H, q), 12.51 (1H, s); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -134.815; m/z (ES+) [M+H]+ = 441.
Figure pct00043
실시예 41: 6-클로로-5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
SOCl2 (0.065 mL, 0.89 mmol)를 실온에서 디에틸 에테르 (10 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메톡시-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 76) (0.040 g, 0.18 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하여 조 7-(클로로메틸)-8-플루오로-3-메톡시-1H-퀴녹살린-2-온 (0.045 g, 0.18 mmol)을 수득하였다. MeCN (10.00 mL)을 상기 고체에 첨가하고, 이어서 6-클로로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 30)(0.045g, 0.18 mmol) 및 DIPEA (0.156 mL, 0.89 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 분취용 HPLC 컬럼으로 정제하였다, 컬럼: YMC-Actus Triart C18, 30*250,5 um; 이동상 A: 물 (0.05% NH3H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 21 B에서 41 B까지; 254, 220 nm; RT1:6.18. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-클로로-5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 41) (0.041 g, 50%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 2.56 - 2.66 (4H, m), 2.79 (3H, d), 3.06 3.16 (4H, m), 3.70 (2H, s), 3.97 (3H, s), 7.19 - 7.30 (m, 1H), 7.36 (d, 1H), 7.66 (d, 1H), 7.93 (d, 1H), 8.44 (d, 1H), 12.47 (s, 1H); 19F NMR (282 MHz, DMSO-d6) -134.746; m/z (ES+) [M+H]+ = 461.
Figure pct00044
중간체 78: 2-(4-브로모-3-메틸-2-니트로-아닐리노)부탄산
2-아미노부탄산 (0.793 g, 7.69 mmol)을 실온에서 DMF (20 mL) 중 1-브로모-4-플루오로-2-메틸-3-니트로벤젠 (중간체 2)(1.500 g, 6.41 mmol), K2CO3 (2.66 g, 19.23 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 6시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 얼음물에 붓고, 0℃의 1 M HCl (20 mL)로 서서히 켄칭하여 황색 현탁액을 제공하였다. 고체를 여과로 수집하고, 물로 세척하고, 건조시켜 2-(4-브로모-3-메틸-2-니트로-아닐리노)부탄산 (중간체 78) (1.4 g, 74%)을 황색 고체 (그다지 순수하지 않음, 추가 정제 없이 다음 단계로 넘어감)로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 317.
중간체 79: 7-브로모-3-에틸-8-메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온
철 분말 (1.585 g, 28.38 mmol)을 실온에서 MeOH (100 mL) 중 2-(4-브로모-3-메틸-2-니트로-아닐리노)부탄산 (중간체 78) (1.800 g, 5.68 mmol), 진한 염산 (4.73 ml, 56.76 mmol)에 서서히 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 7시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 여과시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 반응 혼합물을 포화 Na2CO3 (40 mL)으로 켄칭하고, EtOAc (3 x 50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 갈색 고체를 수득하였다. 조 생성물을 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 중 5~50% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 7-브로모-3-에틸-8-메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 79) (650 mg, 43%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 0.90 (3H, t), 1.43 - 1.72 (2H, m), 2.22 (3H, s), 3.56 (1H, ddd), 6.16 (1H, d), 6.56 (1H, d), 6.97 (1H, d), 9.76 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 269.
중간체 80: 7-브로모-3-에틸-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온
DDQ (1.316 g, 5.80 mmol)를 실온에서 1,4-디옥산 (150 mL) 중 7-브로모-3-에틸-8-메틸-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 79) (1.300 g, 4.83 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 (150 mL)으로 켄칭하였다. 침전물을 여과로 수집하였다. 고체를 물 (10 mL x 3)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 원하는 생성물 7-브로모-3-에틸-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 80) (1.2 g, 93%)을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 1.20 (3H, t), 2.44 - 2.53 (3H, m), 2.78 (2H, q), 7.48 (2H, s), 11.74 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 267.
중간체 81: 3-에틸-7-(히드록시메틸)-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온
(트리부틸스탄닐)메탄올 (1202 mg, 3.74 mmol)을 질소 하에 실온에서 1,4-디옥산 (40 mL) 중 7-브로모-3-에틸-8-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 80) (400 mg, 1.50 mmol), Pd(PPh3)4 (173 mg, 0.15 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 KF (10 mL)로 켄칭하고, 고체를 여과 제거하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 중 5~100% MeOH). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 3-에틸-7-(히드록시메틸)-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 81) (100 mg, 31%)을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 1.22 (3H, t), 2.32 (3H, s), 2.81 (2H, q), 4.59 (2H, d), 5.25 (1H, s), 7.33 (1H, d), 7.55 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 219.
실시예 42: 5-[4-[(2-에틸-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
AcOH 중 HBr (1 ml, 6.08 mmol) (33 중량%)을 실온에서 3-에틸-7-(히드록시메틸)-8-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 81) (65.0 mg, 0.30 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. NMP (3 mL) 중 N,6-디메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 33)(69.8 mg, 0.30 mmol) 및 DIPEA (0.156 ml, 0.89 mmol)를 실온에서 상기 고체에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC 컬럼으로 정제하였다, 컬럼: Sunfire 분취용 C18 컬럼, 30*150, 5 um; 이동상 A: 물(0.1%FA), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 9 B에서 20 B까지; 254/220 nm; RT1:5.15; 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(2-에틸-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 42) (0.049 g, 38%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 1.20 (3H, t), 2.42 (3H, s), 2.50 (3H, s), 2.53 - 2.59 (4H, m), 2.73 - 2.86 (5H, m), 2.87 - 2.93 (4H, m), 3.61 (2H, s), 7.23 (1H, d), 7.45 (1H, d), 7.52 (1H, d), 7.76 (1H, d), 8.39 (1H, d), 11.52 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 435.
Figure pct00045
실시예 43: 5-[4-[(2-에틸-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
AcOH 중 HBr (1ml, 6.08 mmol)(33 중량%)을 실온에서 3-에틸-7-(히드록시메틸)-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 81) (65.0 mg, 0.30 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 32)(71.0 mg, 0.30 mmol)를 상기 고체에 첨가하고, 이어서 NMP (3 mL) 중 DIPEA (0.156 ml, 0.89 mmol)를 첨가하였다 (실온에서). 생성된 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC 컬럼으로 정제하였다, 컬럼: XBridge Prep OBD C18 컬럼, 30×150 mm 5 um; 이동상 A: 물(0.05%NH3H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 31 B에서 51 B까지; 254/220 nm; RT1:6.27; 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(2-에틸-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 43) (0.043 g, 33%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 1.20 (3H, t), 2.41 (3H, s), 2.49 - 2.59 (4H, m), 2.70 - 2.81 (5H, m), 3.08 - 3.16 (4H, m), 3.59 (2H, s), 7.22 (1H, d), 7.47 - 7.60 (2H, m), 7.82 (1H, dd), 8.37 (1H, d), 11.52 (1H, s); 19F NMR (282 MHz, DMSO-d6) -72.539; m/z (ES+) [M+H]+ = 439.
Figure pct00046
실시예 44: 5-[4-[(2-에틸-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
AcOH 중 HBr (1 ml, 18.42 mmol) (33 중량%)을 실온에서 3-에틸-7-(히드록시메틸)-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 81) (65.0 mg, 0.30 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 31)(65.6 mg, 0.30 mmol) 및 DIPEA (0.156 ml, 0.89 mmol)를 실온에서 NMP (3 mL) 중 상기 고체에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 60℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: Sunfire 분취용 C18 컬럼, 30*150, 5 um; 이동상 A: 물(0.1% FA), 이동상 B: ACN; 유량: 60 mL/분; 구배: 7분 내에 9 B에서 20 B까지; 254/220 nm; RT1:5.15; 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[(2-에틸-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 44) (0.014 g, 10%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 1.16-1.26 (3H, m), 2.41 (3H, s), 2.49 - 2.59 (4H, m), 2.70 - 2.81 (5H, m), 3.30 - 3.35 (4H, m, 물 피크에 병합됨), 3.61 (2H, s), 7.25 (1H, d), 7.38 (1H, d), 7.55 (1H, d), 7.82 (1H, d), 8.26 (1H, s), 8.38 (1H, s), 11.53 (1H, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 421.
Figure pct00047
중간체 82: tert-부틸 4-[6-(에틸카르바모일)-2-플루오로-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
tert-부틸 4-(2-플루오로-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 11) (500 mg, 1.47 mmol)를 물 중 에틸아민 (10 mL, 1.47 mmol) (65 중량%)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응이 완료되었다. 침전물을 여과로 수집하고, 물 (2 mL x 3)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 tert-부틸 4-[6-(에틸카르바모일)-2-플루오로-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 82) (0.515 g, 99%)를 황백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 1.09 (3H, t), 1.42 (9H, s), 3.11 (4H, t), 3.23 - 3.30 (2H, m), 3.49 (4H, t), 7.59 (1H, dd), 7.85 (1H, d), 8.45 (1H, t); m/z (ES+) [M+H]+ = 353.
중간체 83: N-에틸-6-플루오로-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드
tert-부틸 4-[6-(에틸카르바모일)-2-플루오로-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 82) (536 mg, 1.52 mmol)를 1,4-디옥산 중 HCl (5 mL, 20.00 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. DIPEA (5 mL)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.1% NH4HCO3) 중 5~50% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 N-에틸-6-플루오로-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 83) (0.368 g, 96%)를 황색 고체로서 수득하였다. 샘플은 순수하지 않았으며, 추가 정제 없이 다음 단계로 넘어갔다; m/z (ES+) [M+H]+ = 253.
실시예 45: N-에틸-6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드
Ph3P (94 mg, 0.36 mmol)를 CH2Cl2 (3 mL) 중 CBr4 (119 mg, 0.36 mmol), 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 (중간체 17) (50 mg, 0.24 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. NMP (3 mL) 중 N-에틸-6-플루오로-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 83) (60 mg, 0.24 mmol) 및 DIPEA (1.5 mL, 8.59 mmol)를 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (NH4HCO3) 중 0~25% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 N-에틸-6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 45) (2.60 mg, 3%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 1.09 (3H, t), 2.40 (3H, s), 2.52 - 2.62 (4H, m), 3.17 - 3.27 (4H, m), 3.25 (2H, q), 3.68 (2H, s), 7.28 (1H, t), 7.48 - 7.59 (2H, m), 7.82 (1H, d), 8.41 (1H, t),12.48 (1H, s); 19F NMR (282 MHz, DMSO-d6) -72.58, -135.52; m/z (ES+) [M+H]+ = 443.
Figure pct00048
중간체 84: 5-브로모-N-에틸-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
H2O 중 에탄아민 (3 mL, 2.20 mmol) (65 중량%)을 메틸 5-브로모-6-메틸-피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 14) (505 mg, 2.20 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하여 5-브로모-N-에틸-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 84) (0.500 g, 94%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 1.13 (3H, t), 2.66 (3H, s), 3.26 - 3.39 (2H, m), 7.76 (1H, d), 8.18 (1H, d), 8.67 - 8.72 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 243.
중간체 85: tert-부틸 4-[6-(에틸카르바모일)-2-메틸-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
Cs2CO3 (1.340 g, 4.11 mmol)을 1,4-디옥산 (5 mL) 중 5-브로모-N-에틸-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 84) (0.5 g, 2.06 mmol), tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (0.575 g, 3.09 mmol), BINAP (0.128 g, 0.21 mmol) 및 Pd(OAc)2 (0.046 g, 0.21 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 질소 하에 100℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 EtOAc (10 mL)로 희석시키고, 순차적으로 물 (10 mL x 2), 이어서 염수 (10 mL x 1)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 플래시 실리카 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 석유 에테르 중 0~40% EtOAc). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 tert-부틸 4-[6-(에틸카르바모일)-2-메틸-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 85) (0.481 g, 67%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, 클로로포름-d) 1.26 (3H, t), 1.49 (9H, s), 2.54 (3H, s), 2.85 - 2.98 (4H, m), 3.49 (2H, qd), 3.56 - 3.65 (4H, m), 7.32 (1H, d), 7.91 - 8.01 (2H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 349.
중간체 86: N-에틸-6-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드
1,4-디옥산 중 HCl (4 ml, 16.00 mmol, 4 M)을 MeOH (10 mL) 중 tert-부틸 4-[6-(에틸카르바모일)-2-메틸-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 85) (0.481g, 1.38 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 반응 혼합물을 MeOH (3 mL) 중 DIPEA (1 mL)로 염기성화하였다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (NH4HCO3) 중 0~20% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 N-에틸-6-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 86) (0.189 g, 55%)를 황색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 1.12 (3H, t), 2.81 - 2.92 (8H, m), 3.27 - 3.36 (5H, m), 7.46 (1H, d), 7.81 (1H, d), 8.43 (1H, t); m/z (ES+) [M+H]+ = 249.
실시예 46: N-에틸-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
Ph3P (299 mg, 1.14 mmol)를 CH2Cl2 (3.00 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-메틸퀴녹살린-2(1H)-온 (158 mg, 0.76 mmol) (중간체 17), CBr4 (378 mg, 1.14 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. N-에틸-6-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 86) (188 mg, 0.76 mmol) 및 DIPEA (1.5 mL, 8.59 mmol)를 NMP (3 mL) 중 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (NH4HCO3) 중 0~25% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 N-에틸-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 46) (7.40 mg, 2%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 1.10 (3H, t), 2.40 (3H, s), 2.50 (3H, s), 2.54 - 2.64 (4H, m), 2.87 - 2.97 (4H, m), 3.30 (2H, q), 3.70 (2H, s), 7.28 (1H, t), 7.47 (1H, d), 7.52 (1H, d), 7.77 (1H, d), 8.42 (1H, t), 12.44 (1H, s); 19F NMR (282 MHz, DMSO-d6) -135.54; m/z (ES+) [M+H]+ = 439.
Figure pct00049
중간체 87: 7-브로모-8-플루오로-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온
에틸 3,3,3-트리플루오로-2-옥소프로파노에이트 (2.30 g, 13.52 mmol)를 톨루엔 (10 mL) 중 4-브로모-3-플루오로-벤젠-1,2-디아민 (중간체 72) (2.20 g, 10.73 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 100℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.1% NH4HCO3) 중 3~70% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 7-브로모-8-플루오로-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 87) (6-브로모-5-플루오로-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (3.40 g, 501%)을 황백색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 311.
중간체 88: 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온
CataCxium A Pd G2 (53 mg, 0.08 mmol)를 1,4-디옥산 (15 mL) 중 7-브로모-8-플루오로-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 87) (6-브로모-5-플루오로-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (0.5 g, 0.80 mmol) 및 (트리부틸스탄닐)메탄올 (0.5 mL, 0.80 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 질소 하에 80℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 포화 KF (1.25 mL)로 켄칭하였다. 반응 용액을 여과로 수집하고, 디옥산 (2.5 mL)으로 세척하였다. 합한 유기 층의 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 플래시 C18-플래시 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.1%, TFA) 중 3~40% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 88) (5-플루오로-6-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (0.217 g, 51%)을 황백색 고체로서 수득하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 263.
실시예 47: 5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
SOCl2 (0.5 mL, 6.85 mmol)를 Et2O (5 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 88) (5-플루오로-6-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (160 mg, 0.31 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. DIPEA (4 mL, 22.90 mmol) 및 N,6-디메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 33)(134 mg, 0.57 mmol)를 MeCN (10 mL) 중 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge BEH C18 OBD Prep 컬럼, 5 μm, 19 mm 250 mm; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3+0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 10분 내에 24 B에서 33 B까지; 254/220 nm; RT1:8.2/9.5). 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 47) (8.8 mg, 6%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.50 (3H, s), 2.58 - 2.66 (4H, m), 2.79 (3H, d), 2.90 - 2.99 (4H, m), 3.77 (2H, s), 7.41 (1H, t), 7.47 (1H, d), 7.72 (1H, d), 7.78 (1H, d), 8.39 - 8.44 (1H, m),13.21 (1H, brs); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -68.50, -133.81; m/z (ES+) [M+H]+ = 479.
Figure pct00050
실시예 48: 6-플루오로-5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
SOCl2 (0.4 mL, 5.48 mmol)를 Et2O (5 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 88) (5-플루오로-6-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (120 mg, 0.23 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. DIPEA (2 mL, 11.45 mmol) 및 6-플루오로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 32)(156 mg, 0.65 mmol)를 MeCN (10 mL) 중 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge BEH C18 OBD Prep 컬럼, 5 μm, 19 mm 250 mm; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3+0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 10분 내에 25 B에서 37 B까지; 254/220 nm; RT1:7.58/8.97). 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-플루오로-5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 48) (8.9 mg, 8%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.58 - 2.65 (4H, m), 2.76 (3H, d), 3.14-3.21 (4H, m), 3.75 (2H, s), 7.39 (1H, t), 7.56 (1H, dd), 7.71 (1H, d), 7.84 (1H, dd), 8.37 - 8.43 (1H, m), 13.39 (1H, brs); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -68.48, -72.59, -133.78; m/z (ES+) [M+H]+ = 483.
Figure pct00051
실시예 49: 6-클로로-5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
SOCl2 (0.4 mL, 5.48 mmol)를 Et2O (5 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 88) (5-플루오로-6-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (120 mg, 0.23 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. DIPEA (2 mL, 11.45 mmol) 및 6-클로로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 30)(157 mg, 0.62 mmol)를 MeCN (10 mL) 중 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 19*250 mm, 10 um; 이동상 A: 물 (10MMOL/L NH4HCO3+0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 10분 내에 45 B에서 57 B까지; 254/220 nm). 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-클로로-5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 49) (18 mg, 16%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.60 - 2.68 (4H, m), 2.78 (3H, d), 3.07 - 3.16 (4H, m), 3.77 (2H, s), 7.40 (1H, t), 7.66 (1H, d), 7.72 (1H, d), 7.93 (1H, d), 8.40 - 8.43 (1H, m), 13.25 (1H, brs); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -68.51, -133.73; m/z (ES+) [M+H]+ = 499.
Figure pct00052
실시예 50: 5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
SOCl2 (0.4 mL, 5.48 mmol)를 Et2O (5 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (중간체 88) (5-플루오로-6-(히드록시메틸)-3-(트리플루오로메틸)-1H-퀴녹살린-2-온으로 오염됨) (120 mg, 0.23 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. DIPEA (2 mL, 11.45 mmol) 및 N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드 (중간체 31)(259 mg, 1.18 mmol)를 MeCN (10 mL) 중 상기 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. 조 생성물을 분취용 HPLC로 정제하였다 (컬럼: XBridge Shield RP18 OBD 컬럼, 19*250 mm, 10 um; 이동상 A: 물 (10 mmol/L NH4HCO3+0.1% NH3.H2O), 이동상 B: ACN; 유량: 20 mL/분; 구배: 10분 내에 15 B에서 35 B까지; 254/220 nm; RT1:10.18/11.2). 원하는 화합물을 함유하는 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 50) (6 mg, 6%)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 2.51 - 2.57(4H, m), 2.76 (3H, d), 3.25 - 3.34 (4H, m), 3.72 (2H, s), 7.30 (1H, t), 7.39 (1H, dd), 7.65 (1H, d), 7.83 (1H, d), 8.27 (1H, d), 8..36 - 8.41 (1H, m); 19F NMR (376 MHz, DMSO-d6) -68.34, -133.80; m/z (ES+) [M+H]+ = 465.
Figure pct00053
중간체 90: 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)-3-메틸-부타노에이트
DIPEA (2.202 mL, 12.61 mmol)를 DMF (6 mL) 중 1-브로모-2,4-디플루오로-3-니트로벤젠 (중간체 35) (1 g, 4.20 mmol) 및 메틸 발리네이트, HCl (중간체 89) (0.704 g, 4.20 mmol)의 교반 용액에 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다 (LCMS에 의하면 원하는 생성물로 완전히 전환됨). 반응 혼합물을 농축시키고, 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 헥산: 에틸 아세테이트를 이용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하여 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)-3-메틸-부타노에이트 (0.763 g, 52.0%) ( 중간체 90 )를 밝은 주황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 디클로로메탄-d2) 1.00 - 1.14 (6H, m), 2.20 - 2.35 (1H, m), 3.78 (3H, s), 4.06 (1H, dd), 6.52 (1H, br d), 7.39 (1H, br d), 7.52 (1H, dd); 19F NMR (471 MHz, 디클로로메탄-d2) -109.33 (1F, s); m/z (ES+) [M+H]+ = 349.
중간체 91: 7-브로모-8-플루오로-3-이소프로필-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온
아연 분말 (1.143 g, 17.48 mmol)을 0℃의 MeOH (12 mL) 및 물 (0.3 mL) 중 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)-3-메틸-부타노에이트 (0.763 g, 2.19 mmol) ( 중간체 90 ) 및 염화암모늄 (0.935 g, 17.48 mmol)의 혼합물에 일부씩 첨가하고 (발열 반응), 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다 (출발 물질은 남아 있지 않음, 주황색의 완전한 사라짐은 반응 완료를 나타냄). Zn을 여과 제거하고, 고체 케이크를 DCM 중 20% MeOH로 세척하고, 여과액을 진공 하에 농축시켰다. 물을 상기 조 생성물에 첨가하고, 생성물을 에틸 아세테이트 층 내로 추출하였다. 유기 층을 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 무색 오일을 제공하였다. 조 생성물을 1:1의 에틸아세테이트:메탄올에 슬러리화하고, 디옥산 중 4 N HCl 0.5 mL를 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반시켰다 (비환화 생성물은 남아 있지 않음). 반응 혼합물을 농축시켜 7-브로모-8-플루오로-3-이소프로필-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 91 )을 수득하였다. 조 생성물은 이 반응의 수율이 100%인 것으로 가정하여 추가 정제 없이 다음 단계를 위한 시약에 적용하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 287.
중간체 92: 7-브로모-8-플루오로-3-이소프로필-1H-퀴녹살린-2-온
4,5-디클로로-3,6-디옥소시클로헥사-1,4-디엔-1,2-디카르보니트릴 (595 mg, 2.62 mmol)을 DCM (20 mL) 중 7-브로모-8-플루오로-3-이소프로필-3,4-디히드로퀴녹살린-2(1H)-온 (627 mg, 2.18 mmol) ( 중간체 91 )의 교반 용액에 한꺼번에 첨가하였다. 생성된 슬러리를 실온에서 2시간 동안 교반시켰다 (LCMS에 의하면 원하는 생성물로 완전히 전환됨). 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 포화 중탄산나트륨 수용액으로 켄칭하였다. 상기 슬러리를 실온에서 하룻밤 교반시키고, 고체를 여과 제거하였다. 여과된 고체를 물, 이어서 디에틸 에테르로 철저히 세척하고, 건조시켜 7-브로모-8-플루오로-3-이소프로필-1H-퀴녹살린-2-온 (0.425 g, 68.3%) ( 중간체 92 )을 황백색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (6H, d), 3.36 - 3.52 (1H, m), 7.45 - 7.58 (2H, m), 12.62 (1H, br s); 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -124.16 (1F, s).; m/z (ES+) [M+H]+ = 285.
중간체 93: 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-이소프로필-1H-퀴녹살린-2-온
Xphos Pd G2 (103 mg, 0.13 mmol)를 1,4-디옥산 (6.58 mL) 중 7-브로모-8-플루오로-3-이소프로필퀴녹살린-2(1H)-온 (375 mg, 1.32 mmol) ( 중간체 92 ) 및 (트리부틸스탄닐)메탄올 (507 mg, 1.58 mmol)의 교반 탈기 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 80℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, DCM 중 0~10% MeOH를 사용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하여 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-이소프로필-1H-퀴녹살린-2-온 (0.255 g, 82%) ( 중간체 93 )을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (6H, d), 3.39 - 3.52 (1H, m), 4.64 (2H, d), 5.41 (1H, t), 7.33 (1H, s), 7.55 (1H, d), 12.42 (1H, br s).; 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -137.71 (1F, s).; m/z (ES+) [M+H]+ = 237.
중간체 94: 7 -( 브로모메틸 )-8- 플루오로 -3-이소프로필-1H-퀴녹살린-2-온
트리에틸포스판 (0.477 ml, 3.23 mmol)을 질소 하에 0℃에서 5분의 기간에 걸쳐 DCM (8.49 mL) 중 8-플루오로-7-(히드록시메틸)-3-이소프로필퀴녹살린-2(1H)-온 (0.2541 g, 1.08 mmol) ( 중간체 93 ) 및 CBr4 (1.177 g, 3.55 mmol)의 교반 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시키고, DCM을 진공 하에 제거하고, 생성된 고체를 디에틸 에테르에 슬러리화하였다. 백색 침전물을 진공 하에 여과시키고, 물, 이어서 에테르로 세척하였다. 고체를 진공 하에 (가열 없이) 하룻밤 건조시켜 7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-이소프로필-1H-퀴녹살린-2-온 (0.313 g, 97%) ( 중간체 94 )을 연한 갈색 고체로서 제공하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 299.
실시예 51: 6 - 플루오로 -5-[4-[(5- 플루오로 -2-이소프로필-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-이소프로필퀴녹살린-2(1H)-온 (100 mg, 0.33 mmol) ( 중간체 94 )에 6-플루오로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (104 mg, 0.33 mmol) ( 중간체 32 ), 아세토니트릴 (5 mL) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (291 μL, 1.67 mmol)을 첨가하고, 70℃까지 가열하였다. LCMS는 1시간 후 출발 물질이 완전히 사라지고 원하는 생성물이 형성됨을 나타냈다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 농축시키고, NaHCO3 수용액 (1 mL)으로 켄칭하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 물 (3 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 10분 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 다량의 물 (50 mL)로 세척하였다. 고체를 DCM 중 0~10% MeOH를 사용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하여 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-이소프로필-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (0.050 g, 32.8%) ( 실시예 51 )를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (6H, d), 2.53 - 2.65 (4H, m), 2.77 (3H, d), 3.12 - 3.24 (4H, m), 3.36 - 3.52 (1H, m), 3.71 (2H, s), 7.30 (1H, t), 7.52 - 7.59 (2H, m), 7.84 (1H, d), 8.36 - 8.41 (1H, m), 12.46 (1H, br s).; 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.53 (1F, s), -72.59 (1F, s).; m/z (ES+) [M+H]+ = 457.
Figure pct00054
실시예 52: 5 -[4-[(5- 플루오로 -2-이소프로필-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일) 메틸 ]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-이소프로필퀴녹살린-2(1H)-온 (109 mg, 0.36 mmol) ( 중간체 94 )에 N,6-디메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (112 mg, 0.36 mmol) ( 중간체 33 ), 아세토니트릴 (5 mL) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (317 μl, 1.82 mmol)을 첨가하고, 70 C까지 가열하였다. LCMS는 1시간 후 출발 물질이 완전히 사라지고 원하는 생성물이 형성됨을 나타냈다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 농축시키고, NaHCO3 수용액 (1 mL)으로 켄칭하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 물 (3 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 10분 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 다량의 물 (50 mL)로 세척하였다. 고체를 DCM 중 0~10% MeOH를 사용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하여 5-[4-[(5-플루오로-2-이소프로필-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (0.057 g, 34.6%)를 백색 고체로서 수득하였다 ( 실시예 52 ). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (6H, d), 2.46 - 2.49 (3H, m), 2.52 - 2.68 (4H, m), 2.80 (3H, d), 2.94 (4H, br s), 3.36 - 3.52 (1H, m), 3.73 (2H, s), 7.30 (1H, t), 7.47 (1H, d), 7.56 (1H, d), 7.79 (1H, d), 8.37 - 8.44 (1H, m), 12.46 (1H, s).; 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.55 (1F, s).; m/z (ES+) [M+H]+ = 453.
Figure pct00055
실시예 53: 5 -[4-[(5- 플루오로 -2-이소프로필-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일) 메틸 ]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
7-(브로모메틸)-8-플루오로-3-이소프로필퀴녹살린-2(1H)-온 (100 mg, 0.33 mmol) ( 중간체 94 )에 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (98 mg, 0.33 mmol) ( 중간체 31 ), 아세토니트릴 (5 mL) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (291 μl, 1.67 mmol)을 첨가하고, 70℃까지 가열하였다. LCMS는 1시간 후 출발 물질이 완전히 사라지고 원하는 생성물이 형성됨을 나타냈다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 농축시키고, NaHCO3 수용액 (1 mL)으로 켄칭하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 물 (3 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 10분 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 다량의 물 (50 mL)로 세척하였다. 고체를 DCM 중 0~10% MeOH를 사용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하여 5-[4-[(5-플루오로-2-이소프로필-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (0.052 g, 35.5%) ( 실시예 53 )를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.22 (6H, d), 2.52 - 2.61 (4H, m), 2.78 (3H, d), 3.26 - 3.30 (4H, m), 3.36 - 3.52 (1H, m), 3.70 (2H, s), 7.31 (1H, t), 7.38 (1H, dd), 7.56 (1H, d), 7.82 (1H, d), 8.26 (1H, d), 8.38 (1H, br d), 12.45 (1H, br s).; 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.54 (1F, s).; m/z (ES+) [M+H]+ = 439.
Figure pct00056
중간체 96: 메틸 2-(4- 브로모 -3- 플루오로 -2-니트로- 아닐리노 )-2- 시클로프로필 -아세테이트
DIPEA (2.202 mL, 12.61 mmol)를 DMF (6 mL) 중 1-브로모-2,4-디플루오로-3-니트로벤젠 (중간체 35) (1 g, 4.20 mmol) 및 메틸 2-아미노-2-시클로프로필아세테이트, HCl (중간체 95) (0.696 g, 4.20 mmol)의 교반 용액에 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 18시간 동안 교반시켰다 (LCMS에 의하면 원하는 생성물로 완전히 전환됨). 반응 혼합물을 농축시키고, 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과시키고, 진공 하에 농축시켰다. 조 생성물을 헥산 및 에틸 아세테이트를 사용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하여 메틸 2-(4-브로모-3-플루오로-2-니트로-아닐리노)-2-시클로프로필-아세테이트 (0.635 g, 43.5%) ( 중간체 96 )를 밝은 주황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 디클로로메탄-d2) 0.39 - 0.49 (1H, m), 0.54 (1H, td), 0.64 - 0.75 (2H, m), 1.25 - 1.39 (1H, m), 3.74 - 3.83 (4H, m), 6.45 (1H, dd), 7.34 (1H, br d), 7.52 (1H, dd). 19F NMR (471 MHz, 디클로로메탄-d2) -109.53 (1F, s).; m/z (ES+) [M+H]+ = 347.
중간체 97: 7 - 브로모 -3- 시클로프로필 -8- 플루오로 -3,4- 디히드로 -1H-퀴녹살린-2-온
아연 분말 (957 mg, 14.63 mmol)을 0℃의 MeOH (12 mL) 및 물 (0.3 mL) 중 메틸 2-((4-브로모-3-플루오로-2-니트로페닐)아미노)-2-시클로프로필아세테이트 (635 mg, 1.83 mmol) ( 중간체 96 ) 및 염화암모늄 (783 mg, 14.63 mmol)의 혼합물에 일부씩 첨가하고 (발열 반응), 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다 (출발 물질은 남아 있지 않음, 주황색의 완전한 사라짐은 반응 완료를 나타냄). Zn을 여과 제거하고, 고체 케이크를 DCM 중 20% MeOH로 세척하였다. 여과액을 농축시켰고, 조 물질은 대부분 환화되지 않은 생성물을 나타냈다. 물을 상기 조 생성물에 첨가하고, 생성물을 에틸 아세테이트 층 내로 추출하였다. 유기 층을 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 오일을 제공하였다. 이 물질을 1:1의 에틸아세테이트:메탄올에 슬러리화하고, 디옥산 중 4 N HCl 0.5 mL를 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반시켰다 (비환화 생성물은 남아 있지 않음). 반응 혼합물을 농축시켜 7-브로모-3-시클로프로필-8-플루오로-3,4-디히드로-1H-퀴녹살린-2-온 ( 중간체 97 )을 회색 고체로서 수득하였다. 조 생성물은 이 반응의 수율이 100%인 것으로 가정하여 추가 정제 없이 다음 단계를 위한 시약에 적용하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 285.
중간체 98: 7 - 브로모 -3- 시클로프로필 -8- 플루오로 -1H-퀴녹살린-2-온
4,5-디클로로-3,6-디옥소시클로헥사-1,4-디엔-1,2-디카르보니트릴 (499 mg, 2.20 mmol)을 DCM (20 mL) 중 7-브로모-3-시클로프로필-8-플루오로-3,4-디히드로퀴녹살린-2(1H)-온 (522 mg, 1.83 mmol) ( 중간체 97 )의 교반 용액에 한꺼번에 첨가하였다. 생성된 슬러리를 실온에서 2시간 동안 교반시켰다 (LCMS에 의하면 원하는 생성물로 완전히 전환됨). 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 포화 중탄산나트륨 수용액으로 켄칭하였다. 상기 슬러리를 실온에서 하룻밤 교반시키고, 고체를 여과 제거하였다. 고체를 물, 이어서 디에틸 에테르로 철저히 세척하고, 건조시켜 7-브로모-3-시클로프로필-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 (0.382 g, 73.7%) ( 중간체 98 )을 황백색 고체로서 제공하였다. m/z (ES+) [M+H]+ = 283.
중간체 99: 3 - 시클로프로필 -8- 플루오로 -7-( 히드록시메틸 )-1H-퀴녹살린-2-온
Xphos Pd G2 (92 mg, 0.12 mmol)를 1,4-디옥산 (5.86 mL) 중 7-브로모-3-시클로프로필-8-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (332 mg, 1.17 mmol) ( 중간체 98 ) 및 (트리부틸스탄닐)메탄올 (452 mg, 1.41 mmol)의 교반 탈기 용액에 첨가하고, 생성된 용액을 80℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, DCM 중 0~10% MeOH를 사용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하여 3-시클로프로필-8-플루오로-7-(히드록시메틸)-1H-퀴녹살린-2-온 (0.224 g, 82%) ( 중간체 99 )을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.02 - 1.14 (4H, m), 2.52 - 2.73 (1H, m), 4.62 (2H, d), 5.38 (1H, t), 7.29 (1H, t), 7.43 (1H, d), 12.43 (1H, br s).; 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -137.67 (1F, s).; m/z (ES+) [M+H]+ = 235.
중간체 100: 7 -( 브로모메틸 )-3- 시클로프로필 -8- 플루오로 -1H-퀴녹살린-2-온
트리에틸포스판 (0.422 ml, 2.86 mmol)을 질소 하에 0℃에서 5분의 기간에 걸쳐 DCM (7.52 mL) 중 3-시클로프로필-8-플루오로-7-(히드록시메틸)퀴녹살린-2(1H)-온 (0.223 g, 0.95 mmol) ( 중간체 99 ) 및 CBr4 (1.043 g, 3.14 mmol)의 혼합물에 적가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. DCM을 진공 하에 제거하고, 생성된 고체를 디에틸 에테르에서 슬러리화하였다. 연한 녹색을 띤 백색 침전물을 진공 하에 여과시키고, 물, 이어서 에테르로 세척하였다. 고체를 진공 하에 (가열 없이) 하룻밤 건조시켜 7-(브로모메틸)-3-시클로프로필-8-플루오로-1H-퀴녹살린-2-온 (0.193 g, 68.2%) ( 중간체 100 )을 연한 녹색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.03 - 1.17 (4H, m), 2.63 - 2.76 (1H, m), 4.79 (2H, s), 7.33 (1H, t), 7.43 (1H, d), 12.55 (1H, br s).; 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -133.65 (1F, s).; m/z (ES+) [M+H]+ = 297.
실시예 54: 5 -[4-[(2- 시클로프로필 -5- 플루오로 -3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일) 메틸 ]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
7-(브로모메틸)-3-시클로프로필-8-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (75 mg, 0.25 mmol) ( 중간체 100 )에 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (79 mg, 0.25 mmol) ( 중간체 32 ), 아세토니트릴 (5 mL) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (220 μl, 1.26 mmol)을 첨가하고, 70 C까지 가열하였다. LCMS는 1시간 후 출발 물질이 완전히 사라지고 원하는 생성물이 형성됨을 나타냈다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 농축시키고, NaHCO3 수용액 (1 mL)으로 켄칭하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 물 (3 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 10분 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 다량의 물 (50 mL)로 세척하였다. 고체를 DCM 중 0~10% MeOH를 사용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하여 5-[4-[(2-시클로프로필-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (0.048 g, 41.8%) ( 실시예 54 )를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.04 - 1.13 (4H, m), 2.52 - 2.63 (4H, m), 2.71 (1H, s), 2.77 (3H, d), 3.12 - 3.21 (4H, m), 3.69 (2H, s), 7.26 (1H, t), 7.43 (1H, d), 7.55 (1H, dd), 7.84 (1H, d), 8.39 (1H, br d), 12.46 (1H, br s).; 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.52 (1F, s), -72.58 (1F, s).; m/z (ES+) [M+H]+ = 455.
Figure pct00057
실시예 55: 5 -[4-[(2- 시클로프로필 -5- 플루오로 -3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일) 메틸 ]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
7-(브로모메틸)-3-시클로프로필-8-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (75 mg, 0.25 mmol) ( 중간체 100 )에 N,6-디메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (78 mg, 0.25 mmol) ( 중간체 33 ), 아세토니트릴 (5 mL) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (220 μL, 1.26 mmol)을 첨가하고, 70℃까지 가열하였다. LCMS는 1시간 후 원하는 생성물로의 완전한 전환을 나타냈다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 농축시키고, NaHCO3 수용액 (1 mL)으로 켄칭하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 물 (3 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 10분 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 다량의 물 (50 mL)로 세척하였다. 고체를 DCM 중 0~10% MeOH를 사용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하여 5-[4-[(2-시클로프로필-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (0.049 g, 43.1%) ( 실시예 55 )를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.03 - 1.15 (4H, m), 2.46 - 2.49 (3H, m), 2.52 - 2.65 (4H, m), 2.65 - 2.75 (1H, m), 2.80 (3H, d), 2.94 (4H, br s), 3.71 (2H, s), 7.26 (1H, t), 7.40 - 7.50 (2H, m), 7.79 (1H, d), 8.37 - 8.44 (1H, m), 12.46 (1H, s).; 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.54 (1F, s).; m/z (ES+) [M+H]+ = 451.
Figure pct00058
실시예 56: 5 -[4-[(2- 시클로프로필 -5- 플루오로 -3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일) 메틸 ]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
7-(브로모메틸)-3-시클로프로필-8-플루오로퀴녹살린-2(1H)-온 (43 mg, 0.14 mmol) ( 중간체 100 )에 N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (42.4 mg, 0.14 mmol) ( 중간체 31 ), 아세토니트릴 (5 mL) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (126 μl, 0.72 mmol)을 첨가하고, 70℃까지 가열하였다. LCMS는 1시간 후 출발 물질이 완전히 사라지고 원하는 생성물이 형성됨을 나타냈다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 농축시키고, NaHCO3 수용액 (1 mL)으로 켄칭하고, 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 물 (3 mL)을 상기 혼합물에 첨가하고, 10분 동안 교반시켰다. 침전물을 여과시키고, 다량의 물 (25 mL)로 세척하였다. 고체를 DCM 중 0~10% MeOH를 사용하여 순상 크로마토그래피를 통해 정제하여 5-[4-[(2-시클로프로필-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (0.020 g, 31.7%) ( 실시예 56 )를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.03 - 1.16 (4H, m), 2.53 - 2.60 (4H, m), 2.65 - 2.80 (5H, m), 3.68 (2H, s), 7.25 (1H, br t), 7.38 (1H, dd), 7.42 (1H, d), 7.82 (1H, d), 8.25 (1H, d), 8.35 - 8.40 (1H, m), 12.38 - 12.51 (1H, m) (없어진 3H는 DMSO 피크와 겹칠 가능성이 있음 ); 19F NMR (471 MHz, DMSO-d6) -135.52 (1F, s).; m/z (ES+) [M+H]+ = 437
Figure pct00059
중간체 102: 7 - 브로모 -3- 메톡시 -8- 메틸 -1H-퀴녹살린-2-온
밀봉 튜브에서 톨루엔 (10 mL) 중 4-브로모-3-메틸벤젠-1,2-디아민 (1.75 g, 8.70 mmol) (중간체 101), 메틸 2,2,2-트리메톡시아세테이트 (2.86 g, 17.41 mmol) 및 이테르븀(III) 트리플루오로메탄술포네이트 (0.540 g, 0.87 mmol)의 혼합물을 탈기시키고, N2로 다시 충전시키고, 100℃에서 하룻밤 교반시켜 갈색 현탁액을 제공하였으며, LCMS는 원하는 생성물의 형성을 나타냈고, 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 고체를 여과로 수집하고, 메탄올로 세척하고, 건조시켜 7-브로모-3-메톡시-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (1.2 g, 51.2%) (중간체 102)을 황색 고체로서 수득하였다 (약 8%의 그의 위치 이성질체 6-브로모-3-메톡시-5-메틸퀴녹살린-2(1H)-온으로 오염됨). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.50 (3H, br s), 3.97 (3H, s), 7.32 (1H, d), 7.45 (1H, d), 11.79 (1H, br s); (m/z) (ES+) [M+H]+ = 269.
중간체 103: 7 -( 히드록시메틸 )-3- 메톡시 -8- 메틸 -1H-퀴녹살린-2-온
1,4-디옥산 (40 mL) 중 (트리부틸스탄닐)메탄올 (1.844 g, 5.74 mmol), 7-브로모-3-메톡시-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (1.03 g, 3.83 mmol) (중간체 102) 및 Xphos Pd G2 (0.452 g, 0.57 mmol)의 혼합물을 N2 하에 80℃에서 하룻밤 교반시켜 어두운 혼합물을 제공하였으며, LCMS는 거의 완전한 전환을 나타냈다. 용매를 감압 하에 제거하고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하고, 분획을 황색 고체가 될 때까지 농축시키고, 고체를 LCMS로 체크하였으며, 이는 상기 고체가 그다지 순수하지 않음을 나타냈고, 그 후 생성물을 20 mL의 메탄올에 슬러리화하고, 고체를 여과로 수집하고, 건조시켜 순도가 55%인 생성물을 황색 고체로서 제공하였다 (30%의 출발 물질 및 9.5%의 탈브롬화 부산물로 오염됨).
상기 수득된 고체를 1,4-디옥산 (40 mL)이 있는 건조 플라스크에 충전시키고, 플라스크에 (트리부틸스탄니)메탄올 900 mg 및 xphos Pd G2 300 mg을 첨가하고, 혼합물을 탈기시키고, 그 후 80℃에서 하룻밤 교반시켰다 (N2 하에). 용매를 감압 하에 제거하고, 상기 혼합물을 실리카 겔 컬럼 (DCM 중 0~20% 메탄올로 용출)에서 정제하여 7-(히드록시메틸)-3-메톡시-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (800mg, 95%) (중간체 103)을 황색 고체로서 수득하였으며, 이때 LCMS에 의하면 순도가 80%였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.32 (3H, s), 3.91 - 4.01 (3H, m), 4.56 (2H, d), 5.15 (1H, t), 7.27 (1H, d), 7.37 (1H, d), 11.57 (1H, br s); (m/z) (ES+) [M+H]+ = 221.
중간체 104: 7 -( 브로모메틸 )-3- 메톡시 -8- 메틸 -1H-퀴녹살린-2-온
N2 하에 0℃에서 트리에틸포스판 (294 μl, 2.04 mmol)을 CH2Cl2 (20 mL) 중 7-(히드록시메틸)-3-메톡시-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (300 mg, 1.36 mmol) (중간체 103) 및 1,1,2,2-테트라브로모-1,2-디클로로에탄 (875 mg, 2.11 mmol)의 현탁액에 적가하고, 그 후, 생성된 혼합물을 실온에서 3.5시간 동안 교반시키고, 용매를 감압 하에 제거하고, 잔사를 에테르 (10 mL)에 현탁시키고, 여과시키고, 고체를 에테르 (10 mL x 2)로 세척하고, 그 후 고체를 물 (20 mL)에 현탁시키고, 여과시키고, 물 (5 mL x 3)로 세척하고, 건조시켜 7-(브로모메틸)-3-메톡시-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (0.250 g, 64.8%) (중간체 104)을 연한 황색 고체로서 제공하였다. (m/z) (ES+) [M+H]+ = 285.
실시예 57: 5 -[4-[(2- 메톡시 -5- 메틸 -3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일) 메틸 ]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드
아세토니트릴 (6 mL) 중 N,6-디메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (83 mg, 0.27 mmol) (중간체 33) 및 7-(브로모메틸)-3-메톡시-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (85 mg, 0.27 mmol) (중간체 104)의 현탁액에 DIPEA (236 μL, 1.35 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반시켜 투명한 용액을 제공하고, 상기 혼합물을 실온까지 냉각시켜 현탁액을 제공하고, 고체를 여과로 수집하고, 물, 아세토니트릴로 세척하고, 건조시켜 5-[4-[(2-메톡시-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (0.064 g, 54.3%) ( 실시예 57)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.43 (3H, s), 2.49 (3H, s), 2.57 (4H, br s), 2.80 (3H, d), 2.91 (4H, br s), 3.60 (2H, s), 3.95 (3H, s), 7.18 (1H, d), 7.35 (1H, d), 7.46 (1H, d), 7.78 (1H, d), 8.40 (1H, q), 11.58 (1H, br s); (m/z) (ES+) [M+H]+ = 437
Figure pct00060
실시예 58: 6 - 플루오로 -5-[4-[(2- 메톡시 -5- 메틸 -3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일) 메틸 ]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
아세토니트릴 (6 mL) 중 6-플루오로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드, 2HCl (84 mg, 0.27 mmol) (중간체 32) 및 7-(브로모메틸)-3-메톡시-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (85 mg, 0.27 mmol) (중간체 104)의 현탁액에 DIPEA (236 μL, 1.35 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반시켜 현탁액을 제공하고, 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 고체를 여과로 수집하고, 물, 아세토니트릴로 세척하고, 건조시키고, 고체를 아세토니트릴에 현탁시키고, 여과시키고, 건조시켜 6-플루오로-5-[4-[(2-메톡시-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (0.073 g, 61.3%) ( 실시예 58)를 베이지색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.42 (3H, s), 2.55 (4H, br s), 2.76 (3H, d), 3.14 (4H, br s), 3.58 (2H, s), 3.95 (3H, s), 7.17 (1H, br d), 7.35 (1H, br d), 7.50 - 7.63 (1H, m), 7.83 (1H, br d), 8.38 (1H, br d), 11.58 (1H, s); (m/z) (ES+) [M+H]+ = 442.
Figure pct00061
중간체 106: 메틸 6- 브로모 -5- 플루오로 -피리딘-2- 카르복실레이트
황산 (1.5 mL, 28.14 mmol)을 MeOH (8 mL) 중 6-브로모-5-플루오로피콜린산 (500 mg, 2.27 mmol) (중간체 105)의 혼합물에 서서히 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 계속 교반하여 백색 현탁액을 제공하였다. LCMS는 완전한 전환을 나타냈으며, 혼합물을 포화 NaHCO3 수용액에 붓고, DCM (40 mL x 2)으로 추출하고, 유기 층을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시켜 메틸 6-브로모-5-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트 (532 mg, 100%) (중간체 106)를 백색 고체로서 수득하고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 4.01 (3H, s), 7.55 (1H, t), 8.15 (1H, dd); (m/z) (ES+) [M+H]+ = 236.
중간체 107: tert -부틸 4-(2- 브로모 -6- 메톡시카르보닐 -3- 피리딜 )피페라진-1-카르복실레이트
DMF (60 mL) 중 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (8.21 g, 44.06 mmol), 메틸 6-브로모-5-플루오로-피리딘-2-카르복실레이트 (6.065 g, 25.92 mmol) (중간체 106) 및 탄산칼륨 (4.66 g, 33.69 mmol)의 혼합물을 110℃에서 5시간 동안 교반시켰으며, LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, DCM 및 물로 희석시키고, 층들을 분리하고, 수층을 DCM으로 2회 추출하고, 유기 층을 합하고, 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~50% 에틸 아세테이트로 용출, UV: 221, 310 nm)에서 정제하여 원하는 생성물 tert-부틸 4-(2-브로모-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (7.68 g, 74.1%) (중간체 107)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.51 (9H, s), 3.14 (4H, br t), 3.60 - 3.71 (4H, m), 3.99 (3H, s), 7.32 (1H, d), 8.08 (1H, d); (m/z) (ES+) [M+H]+ = 402.
중간체 108: tert -부틸 4-[2- 브로모 -6-( 메틸카르바모일 )-3- 피리딜 ]피페라진-1-카르복실레이트
밀봉 용기에서 메탄아민 (100 mL, 19.16 mmol) (에탄올 중 33%) 중 tert-부틸 4-(2-브로모-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (7.67 g, 19.16 mmol) (중간체 107)를 60℃에서 4.5시간 동안 교반시켰으며, LCMS는 완전한 전환을 나타냈고, 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 농축시키고, 잔사를 DCM에 용해시키고, 포화 NH4Cl 용액으로 세척하고, 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시켜 tert-부틸 4-[2-브로모-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (7.48 g, 98%) (중간체 108)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.50 (9H, s), 3.02 (3H, d), 3.08 (4H, br t), 3.60 - 3.71 (4H, m), 7.36 (1H, d), 7.68 (1H, br d), 8.11 (1H, d); (m/z) (ES+) [M+H]+ = 401.
중간체 109: tert -부틸 4-[6-( 메틸카르바모일 )-2-비닐-3- 피리딜 ]피페라진-1-카르복실레이트
1,4-디옥산 (25 ml) 중 tert-부틸 4-[2-브로모-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (1.344 g, 3.37 mmol) (중간체 108), 트리부틸(비닐)스탄난 (1.174 g, 3.70 mmol) 및 Xphos Pd G2 (0.132 g, 0.17 mmol)의 혼합물을 N2 하에 100℃에서 2.5시간 동안 교반시켰으며, LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 DCM으로 희석시키고, 포화 NH4Cl로 세척하고, 유기 층을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~80% 에틸 아세테이트로 용출, UV: 226, 293 nm)에서 정제하여 tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-2-비닐-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (0.961 g, 82%) (중간체 109)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.50 (9H, s), 2.90 - 3.01 (4H, m), 3.05 (3H, d), 3.55 - 3.68 (4H, m), 5.54 (1H, dd), 6.42 (1H, dd), 7.10 (1H, dd), 7.39 (1H, d), 7.98 (1H, br d), 8.07 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 346.6, 348.5.
중간체 110: tert -부틸 4-[2- 포르밀 -6-( 메틸카르바모일 )-3- 피리딜 ]피페라진-1-카르복실레이트
H2O 중 사산화오스뮴 (0.0435 mL, 6.00 μmol)을 THF (25 mL)/물 (5 mL)/ tert-부탄올 (2650 μL, 27.71 mmol) 중 tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-2-비닐-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (960 mg, 2.77 mmol) (중간체 109), 2,6-루티딘 (646 μl, 5.54 mmol) 및 과요오드산나트륨 (2371 mg, 11.08 mmol)의 용액에 첨가하고, 실온에서 하룻밤 교반시켜 황색 현탁액을 제공하였다. LCMS 및 TLC는 완전한 전환을 나타냈다. 반응물을 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 농축 후 조 물질을 실리카 컬럼 (헥산 중 0~100% 에틸 아세테이트로 용출, UV: 226, 310 nm)을 통해 정제하여 tert-부틸 4-[2-포르밀-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (0.732 g, 76%) (중간체 110)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.50 (9H, s), 3.07 (3H, d), 3.15 - 3.30 (4H, m), 3.63 - 3.79 (4H, m), 7.48 (1H, d), 7.85 (1H, br d), 8.28 (1H, d), 10.10 (1H, s); (m/z) (ES+) [M+H]+ = 349.
중간체 111: tert -부틸 4-[2-( 디플루오로메틸 )-6-( 메틸카르바모일 )-3- 피리딜 ]피페라진-1-카르복실레이트
CH2Cl2 (10 mL) 중 tert-부틸 4-[2-포르밀-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (730 mg, 2.10 mmol) (중간체 110)를 0℃까지 냉각시키고, DCM (5 mL) 중 DAST (692 μL, 5.24 mmol)를 상기 혼합물에 첨가하고, 그 후, 생성된 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반시켰으며, TLC 및 LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO3 수용액 적가로 켄칭하고, DCM으로 추출하고, 유기물을 건조시키고 (무수 Na2SO4), 여과시키고, 농축시키고, 잔사를 실리카 겔 컬럼 (헥산 중 0~100% 에틸 아세테이트로 용출, UV: 254, 293 nm)에서 정제하여 tert-부틸 4-[2-(디플루오로메틸)-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (0.666 g, 86%) (중간체 111)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.50 (9H, s), 2.93 - 3.02 (4H, m), 3.05 (3H, d), 3.57 - 3.72 (4H, m), 6.99 (1H, t), 7.62 (1H, d), 7.92 (1H, br d), 8.27 (1H, d); (m/z) (ES+) [M+H]+ = 371.
중간체 60: 6 -( 디플루오로메틸 )-N- 메틸 -5-피페라진-1-일-피리딘-2- 카르복스아미드 , 2HCl
디옥산 중 4 M HCl (7 mL, 28.00 mmol)을 tert-부틸 4-[2-(디플루오로메틸)-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (665 mg, 1.80 mmol) (중간체 111) 및 교반 막대가 충전된 플라스크에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켜 황색 현탁액을 제공하였다. 용매를 제거하고, 잔사를 에테르로 희석시키고, 고체를 여과로 수집하고, 건조시켜 6-(디플루오로메틸)-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (0.617 g, 100%) (중간체 60)을 주황색 고체로서 수득하였다. (m/z) (ES+) [M+H]+ = 272.
실시예 59: 6 -( 디플루오로메틸 )-5-[4-[(2- 메톡시 -5- 메틸 -3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
아세토니트릴 (6 mL) 중 6-(디플루오로메틸)-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (87 mg, 0.25 mmol) (중간체 60) 및 7-(브로모메틸)-3-메톡시-8-메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (80 mg, 0.25 mmol) (중간체 104)의 현탁액에 DIPEA (222 μL, 1.27 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반시켜 투명한 용액을 제공하고, 혼합물을 실온까지 냉각시켜 현탁액을 제공하고, 고체를 여과로 수집하고, 아세토니트릴, 물로 세척하고, 건조시켜 6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(2-메톡시-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (0.070 g, 58.3%) ( 실시예 59)를 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.43 (3H, s), 2.59 (4H, br s), 2.83 (3H, br d), 2.98 (4H, br s), 3.60 (2H, s), 3.95 (3H, s), 6.92 - 7.29 (2H, m), 7.35 (1H, d), 7.85 (1H, br d), 8.08 (1H, d), 8.38 (1H, br d), 11.58 (1H, br s); ((m/z) (ES+) [M+H]+ = 473.
Figure pct00062
실시예 60: 6 -( 디플루오로메틸 )-5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드
아세토니트릴 (25 mL) 중 7-(브로모메틸)-3,8-디메틸-1H-퀴녹살린-2-온 (196 mg, 0.73 mmol) (중간체 8), 6-(디플루오로메틸)-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (252 mg, 0.73 mmol) (중간체 60) 및 Et3N (0.614 mL, 4.41 mmol)의 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반시켜 투명한 용액을 제공하였으며, LCMS는 완전한 전환을 나타냈다. 상기 혼합물을 실온까지 하룻밤 냉각시켰다. 고체를 상기 혼합물로부터 결정화하고, 고체를 여과로 수집하고, 아세토니트릴, 물로 세척하고, 건조시켜 생성물의 부분 1 (141 mg)을 수득하고, 여과액을 농축시키고, 역상 gilson (5~80% ACN/물/0.1%TFA로 용출)에서 정제하여 생성물의 두 번째 부분 (92 mg)을 TFA 염으로서 수득하였다. 전체적으로, 황백색 고체로서의 6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (0.233 g, 64.0%) ( 실시예 60). 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.40 (3H, s), 2.43 (3H, s), 2.60 (4H, br s), 2.83 (3H, d), 2.98 (4H, br d), 3.63 (2H, s), 6.95 - 7.22 (1H, m), 7.23 - 7.29 (1H, m), 7.51 (1H, d), 7.85 (1H, d), 8.08 (1H, d), 8.38 (1H, br d), 11.54 (1H, br s); (m/z) (ES+) [M+H]+ = 457.
Figure pct00063
중간체 113 : 메틸 6- 클로로 -5-(피페라진-1-일) 피콜리네이트
피페라진 (1.0 g, 11.61 mmol)을 MeCN (30 mL) 중 메틸 6-클로로-5-플루오로피콜리네이트 (중간체 112, 1.0 g, 5.28 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.1% NH4HCO3) 중 5~60% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 메틸 6-클로로-5-(피페라진-1-일)피콜리네이트 (중간체 113, 1.28 g, 95%)를 적색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.81 - 2.91 (4H, m), 3.04 - 3.08 (4H, m), 3.85 (3H, s), 7.61 (1H, d), 8.00 (1H, d) (NH 양성자는 표시되지 않음); m/z (ES+) [M+H]+ = 256.
중간체 30 : 6 - 클로로 -N- 메틸 -5-(피페라진-1-일) 피콜린아미드
THF (40 mL, 80.00 mmol) 중 2 M 메틸아민 용액을 메틸 6-클로로-5-(피페라진-1-일)피콜리네이트 (중간체 113, 1.26 g, 4.93 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.1% NH4HCO3) 중 5~60% MeCN). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 6-클로로-N-메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 30, 1.12 g, 89%)를 담황색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 2.79 (3H, d), 2.85 - 2.89 (4H, m), 2.97 - 3.02 (4H, m), 7.63 (1H, d), 7.94 (1H, d), 8.45 (1H, q) (피페라진-NH 양성자는 표시되지 않음); m/z (ES+) [M+H]+ = 255.
Figure pct00064
중간체 114: tert -부틸 4-[2- 플루오로 -6-( 메틸카르바모일 )-3- 피리딜 ]피페라진-1-카르복실레이트
메틸아민 (120 mL, 36.80 mmol, 에탄올 중 33 중량%) 중 tert-부틸 4-(2-플루오로-6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 11, 12.49 g, 36.80 mmol)를 실온에서 24시간 동안 교반시켰다. (밀봉 튜브). 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔사를 DCM에 용해시키고, 실리카 겔 베드를 통해 여과시키고, 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과액을 농축시키고, 진공 하에 건조시켜 tert-부틸 4-[2-플루오로-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 114, 12.45 g, 100%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.42 (9H, s), 2.77 (3H, d), 3.04 - 3.16 (4H, m), 3.43 - 3.56 (4H, m), 7.59 (1H, dd), 7.80 - 7.93 (1H, m), 8.41 (1H, q); m/z (ES+) [M+H]+ = 340.
중간체 32: 6 - 플루오로 -N- 메틸 -5-피페라진-1-일-피리딘-2- 카르복스아미드
HCl (디옥산 중 4 M, 100 ml, 400.00 mmol)을 0℃의 1,4-디옥산 (50 mL) 중 tert-부틸 4-[2-플루오로-6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 114, 12.5 g, 36.94 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 5시간 동안 교반시켰으며, 그 동안 온도를 실온까지 가온하여 황색 현탁액을 제공하였다. 상기 현탁액을 에테르로 희석시키고, 고체를 여과 제거하고, 에테르로 세척하였다. 이 고체를 진공 하에 건조시켜 6-플루오로-N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl (중간체 32, 11.42 g, 99%)을 연한 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.8 (d, J=4.6 Hz, 3 H) 3.3 (br s, 4 H) 3.4 (br d, J=4.4 Hz, 4 H) 7.6 - 7.7 (m, 1 H) 7.9 (d, J=8.1 Hz, 1 H) 8.4 (br d, J=4.4 Hz, 1 H) 9.0 - 9.3 (m, 2 H); m/z (ES+) [M+H]+ = 239
Figure pct00065
중간체 115 : 5 - 브로모 - N,6 - 디메틸피콜린아미드
THF 중 2 M 메틸아민 용액 (20 mL, 40.00 mmol)을 메틸 5-브로모-6-메틸피콜리네이트 (중간체 14, 2.0 g, 8.69 mmol)에 첨가하고, 생성된 혼합물을 80℃에서 18시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.1% NH4HCO3) 중 5~80% MeOH). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 5-브로모-N,6-디메틸피콜린아미드 (중간체 115, 1.5 g, 75%)를 담황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 2.65 (3H, s), 2.82 (3H, d), 7.75 (1H, d), 8.17 (1H, d), 8.57 - 8.76 (1H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 229
중간체 116 : tert -부틸 4-(2- 메틸 -6-( 메틸카르바모일 )피리딘-3-일)피페라진-1-카르복실레이트
5-브로모-N,6-디메틸피콜린아미드 (중간체 115, 1.0 g, 4.37 mmol)를 질소 하에 톨루엔 (20 mL) 중 tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (0.894 g, 4.80 mmol), BINAP (0.272 g, 0.44 mmol), Pd(OAc)2 (0.098 g, 0.44 mmol) 및 Cs2CO3 (3.56 g, 10.91 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 80℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 역상 크로마토그래피로 정제하였다 (용출 구배: 물 (0.4% HCO2H) 중 5~30% MeOH). 순수한 분획을 건조상태까지 증발시켜 tert-부틸 4-(2-메틸-6-(메틸카르바모일)피리딘-3-일)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 116, 1.2 g, 82%)를 갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 1.50 (9H, s), 2.58 (3H, s), 2.92 - 3.00 (7H, m), 3.62 (4H, m), 7.50 (1H, d), 7.88 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 335.
중간체 33 : N,6 -디메틸-5-(피페라진-1-일) 피콜린아미드
tert-부틸 4-(2-메틸-6-(메틸카르바모일)피리딘-3-일)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 115, 1.18 g, 3.53 mmol)를 1,4-디옥산 중 4 M HCl 용액 (10 mL, 329.15 mmol)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 침전물을 여과로 수집하고, 석유 에테르 (5 mL x 2), Et2O (5 mL x 2)로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 N,6-디메틸-5-(피페라진-1-일)피콜린아미드 (중간체 33, 0.77 g, 81%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, CD3OD) δ 2.86 (3H, s), 3.02 (3H, s), 3.42 - 3.54 (8H, m), 8.29 (2H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 235.
Figure pct00066
중간체 117: tert -부틸 4-(6- 메톡시카르보닐 -3- 피리딜 )피페라진-1- 카르복실레이트
Ruphos Pd G3 (4.07 g, 4.86 mmol)을 1,4-디옥산 (200 mL) 중 메틸 5-브로모피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 9, 30 g, 138.87 mmol), tert-부틸 피페라진-1-카르복실레이트 (27.2 g, 145.81 mmol), Cs2CO3 (90 g, 277.73 mmol)의 탈기 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 110℃에서 6시간 동안 교반시켰다 (N2 분위기 하에). 그 후 상기 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트 (150 ml x 3)로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과시켰다. 이 여과액에 3-(디에틸렌트리아미노)프로필-작용화 실리카 겔 (12 g, 1.3 mmol/g 로딩)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 상기 혼합물을 여과시키고, 여과액을 대략 100 mL까지 농축시켰다. 결정질 황색 고체를 여과 제거하고, 에테르로 세척하고, 진공 하에 건조시켜 tert-부틸 4-(6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 117, 26.36 g, 82 mmol, 59.1%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.50 (9H, s), 3.31 - 3.42 (4H, m), 3.56 - 3.68 (4H, m), 3.98 (3H, s), 8.04 (1H, d), 8.37 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 322.
중간체 118: tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트
메틸아민 (100 mL, 1155.26 mmol, 물 중 40%)을 MeOH (100 mL) 중 tert-부틸 4-(6-메톡시카르보닐-3-피리딜)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 117, 36 g, 112.02 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반시켜 백색 현탁액을 제공하였다. 상기 혼합물을 농축시키고, 잔사를 포화 NH4Cl 용액과 DCM 사이에 분배하고, 층들을 분리하였다. 수성 층을 DCM으로 추출하고, 유기 층을 합하고, 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜 tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 118, 35.9 g, 100%)를 황색 고체로서 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) 1.49 (9H, s), 3.02 (3H, d), 3.26 - 3.35 (4H, m), 3.58 - 3.67 (4H, m), 7.23 (1H, dd), 7.81 (1H, br d), 8.07 (1H, d), 8.16 (1H, d); m/z (ES+) [M+H]+ = 321.
중간체 119: 메틸 5-(피페라진-1-일)피콜리네이트
디옥산 중 4 M HCl (20 ml, 576.01 mmol)을 0℃의 MeOH (2 mL) 중 tert-부틸 4-(6-(메톡시카르보닐)피리딘-3-일)피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 117, 1.55 g, 4.82 mmol)의 혼합물에 첨가하고, 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반시켜 현탁액을 제공하였으며, LCMS는 완전한 전환을 나타냈고, 상기 혼합물을 에테르 (대략 80 ml)로 희석시키고, 고체를 여과로 수집하고, 에테르로 세척하고, 건조시켜 메틸 5-(피페라진-1-일)피콜리네이트 (중간체 119)(1.384 g, 98%)를 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 3.21 (4H, br s), 3.66 (4H, br d), 3.83 (3H, s), 7.43 - 7.55 (1H, m), 7.95 (1H, br d), 8.43 (1H, br s), 9.49 (2H, br s); (m/z) (ES+) [M+H]+ = 223.0.
중간체 31: 카르복실레이트 N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드
HCl (디옥산 중 4 M, 150 mL, 600.00 mmol)을 MeOH (50 mL) 중 tert-부틸 4-[6-(메틸카르바모일)-3-피리딜]피페라진-1-카르복실레이트 (중간체 118, 35.9 g, 112.05 mmol)의 현탁액에 첨가하고, 생성된 주황색 현탁액을 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. 약 80 mL의 용매를 감압 하에 제거하고, 상기 혼합물을 에테르, 헥산 (200 ml, 1/1)으로 희석시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 헥산으로 세척하고, 건조시키고, 진공 하에 건조시켜 N-메틸-5-피페라진-1-일-피리딘-2-카르복스아미드, 2HCl 염 (중간체 31, 37.0 g, 100%)을 황색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 2.79 (3H, d), 3.22 (4H, br s), 3.53 - 3.67 (4H, m), 7.51 (1H, dd), 7.91 (1H, d), 8.33 (1H, d), 8.50 (1H, br s), 9.19 - 9.49 (2H, m); m/z (ES+) [M+H]+ = 221.
실시예 61: 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 결정질 형태 B (무수 형태)의 제조
방법 1
43 mg (0.10 mmol)의 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (예를 들어 실시예 20)를 1.0 ml의 MeOH에 현탁시키고, 0.11 ml의 1 M 메탄술폰산 (MSA) 수용액을 첨가하여 투명한 용액을 얻었다. 이 용액에 0.11 ml의 1 N NaOH 수용액을 첨가하였다. NaOH 용액의 첨가가 완료된 후 백색 고체가 침전되기 시작하였다. 슬러리를 실온에서 1일 동안 교반시켰다. 36 mg의 백색 고체를 여과시키고, 공기 중에서 건조시켰다. XRPD는 고체가 순수한 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 형태 B임을 보여준다.
방법 2
피리딘 (93.5 g)을 75±5℃의 물 (47.9 kg) 및 에탄올 (38.0 kg) 중 순수 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 메실레이트 (4.67 kg, 실시예 63의 방법 2를 통해 제조) 용액에 첨가하고, 이어서 방법 1에 따라 제조한 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 형태 B 시드 (4.7 g)를 첨가하였다. 슬러리를 75±5℃에서 40분 동안 교반시키고, 그 후 50:50 (v:v)의 물:에탄올 (4.2 kg) 중 피리딘 (651 g) 용액을 3시간 40분에 걸쳐 점진적으로 첨가하였다. 슬러리를 75±5℃에서 50분 동안 교반시키고, 그 후 50:50 (v:v)의 물:에탄올 (4.1 kg) 중 4-메틸모르폴린 (900 g) 용액을 3시간 50분에 걸쳐 점진적으로 첨가하였다. 슬러리를 75±5℃에서 1시간 10분 동안 교반시키고, 4시간 50분에 걸쳐 25±5℃까지 냉각시키고, 25±5℃에서 15시간 동안 교반시키고, 그 후 여과시켰다. 생성된 고체를 50:50 (v:v)의 물:에탄올 (12.5 kg x 2)로 2회 세척하고, 그 후 진공 하에 25℃~50℃에서 1일 동안 건조시켜 순수한 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 형태 B (3.54 kg)를 93% 수율로 제공하였다.
방법 1의 형태 B를 XRPD로 분석하였으며, 결과는 아래 표 (표 1)에 나와 있으며, 도 1에 예시되어 있다.
[표 1]
Figure pct00067
Figure pct00068
형태 B는 CuKα 방사선을 사용하여 측정된 하기 2θ 값 중 적어도 하나를 제공하는 것을 특징으로 한다: 6.2, 14.3, 및 15.6°.
형태 B (방법 1로부터)를 열적 기술로 분석하였다. DSC 분석은 형태 B가 275℃에서 시작되고 276℃에서 피크를 갖는 융점을 가짐을 나타냈다. TGA에 의하면 형태 B는 약 25℃에서 약 100℃까지 가열할 때 약 0.2%의 질량 손실을 나타내는 것으로 나타났다. 형태 B의 대표적인 DSC/TGA 서모그램이 도 2에 예시되어 있다.
실시예 62: 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 결정질 형태 D (무수 형태)의 제조.
5~6 mg의 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 20)를 MeOH/DCM/H2O (0.50 ml/0.50 ml/0.20 ml)의 혼합 용매에 용해시키고, 투명한 용액을 주위 조건에서 서서히 증발시켜 백색 고체를 수득하였다. XRPD는 생성된 백색 고체가 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 형태 D임을 보여준다.
형태 D를 XRPD로 분석하였으며, 결과는 아래 표 (표 2)에 나와 있으며, 도 3에 예시되어 있다.
[표 2]
Figure pct00069
Figure pct00070
형태 D는 CuKα 방사선을 사용하여 측정된 하기 2θ 값 중 적어도 하나를 제공하는 것을 특징으로 한다: 7.9, 13.1 및 16.3°.
형태 D의 단결정을 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드의 DMF 용액 (또는 DMF/H2O)의 증발에 의해 수득하였다. 단결정 구조 분석에 의해 형태 D가 무수 형태임을 확인하였다. 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 형태 D의 분자 구조가 도 4에 예시되어 있다. 결정학적 데이터: 공간군 단사정계 P21/c, 단위 셀 치수: a = 17.4559(8) Å, b = 5.0647(2) Å, c = 22.564(1) Å, β = 92.609(1)°, V = 1992.8(2) Å3.
실시예 63: 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 MSA 결정질 염 형태 C (무수 형태)의 제조.
방법 1
427 mg의 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (실시예 20)를 8.0 ml의 MeOH에 현탁시켰다. 상기 현탁액에, 1.1 ml의 1.0 M MSA 수용액 (1.1 mmol)을 첨가하고, 투명한 용액을 수득하였다. 생성된 용액을 여과시키고, 투명한 용액의 용매를 제거하였다. 생성된 고체를 1.0 ml의 EtOH 및 2.0 ml의 THF에 현탁시켜 슬러리를 수득하였다. 슬러리를 실온에서 1일 동안 교반시켰다. 고체를 여과로 수집하고, 공기 건조시켰다. 452 mg의 황백색 고체를 수득하였다. XRD는 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 MSA 염 형태 C가 수득되었음을 보여준다.
방법 2
메탄술폰산 (16.8 g)을 25℃의 4:1 (v:v)의 THF:에탄올 (750 mL) 중 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 (80.8 g, 92.8% w/w)의 교반 현탁액에 첨가하였다. 생성된 현탁액을 25℃에서 16시간 동안 교반시키고, 그 후 여과시켰다. 고체를 4:1 (v:v)의 THF:에탄올 (300 mL)로 세척하고, 그 후 진공 하에 35℃에서 건조시켜 6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드 메실레이트 형태 C (90.3 g)를 98% 수율로 제공하였다.
방법 1로부터의 MSA-형태 C를 XRPD로 분석하였으며, 결과는 아래 표 (표 3)에 나와 있으며, 도 5에 예시되어 있다.
[표 3]
Figure pct00071
방법 1로부터 수득된 MSA-형태 C를 열적 기술로 분석하였다. DSC 분석은 MSA-형태 C가 254℃에서 시작되고 258℃에서 피크를 갖는 온도에서 용융 및 분해가 시작됨을 나타냈다. TGA에 의하면 MSA-형태 C는 약 25℃에서 약 100℃까지 가열할 때 약 0.3%의 질량 손실을 나타내는 것으로 나타났다. MSA-형태 C의 대표적인 DSC/TGA 서모그램이 도 6에 예시되어 있다.
생물학적 분석법
하기 테스트 절차를 사용하여 본원에 기술된 화합물의 억제 특성을 결정할 수 있다.
PARP 형광 이방성 결합 분석
재조합 전장 6HIS 태깅 PARP1 단백질을 50 mM 트리스(Tris) pH 8, 0.001% 트리톤(Triton) X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl을 사용하여 6 nM까지 희석시키고, 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl로 희석된 당량 부피의 2 nM 형광 프로브와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 프로브의 최종 DMSO 농도를 1%(v/v) 미만으로 유지하였다.
재조합 전장 PARP2 단백질을 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl을 사용하여 6 nM까지 희석시키고, 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl로 희석된 당량 부피의 2 nM 형광 프로브와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 프로브의 최종 DMSO 농도를 1%(v/v) 미만으로 유지하였다.
재조합 전장 PARP3 단백질을 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl을 사용하여 100 nM까지 희석시키고, 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl로 희석된 당량 부피의 6 nM 형광 프로브와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 프로브의 최종 DMSO 농도를 1%(v/v) 미만으로 유지하였다.
재조합 PARP5a 결합 도메인을 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl을 사용하여 160 nM까지 희석시키고, 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl로 희석된 당량 부피의 6 nM 형광 프로브와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 프로브의 최종 DMSO 농도를 1%(v/v) 미만으로 유지하였다.
재조합 전장 GST 태깅 PARP6 단백질을 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl을 사용하여 160 nM까지 희석시키고, 50 mM 트리스 pH 8, 0.001% 트리톤 X100, 10 mM MgCl2, 150 mM NaCl로 희석된 당량 부피의 6 nM 형광 프로브와 함께 4시간 동안 인큐베이션하였다. 프로브의 최종 DMSO 농도를 1%(v/v) 미만으로 유지하였다.
단백질에 결합되는 경우 프로브의 형광 이방성을 테스트 화합물 또는 용매 대조군의 존재 하에 BMG Pherastar FSXⓒ를 사용하여 측정하고, 이방성에 대한 영향을 결정하였다. IC50 값을 결정하기 위해 상이한 테스트 화합물 농도에 대한 억제율(%) 값을 계산하고, 4개 파라미터 로지스틱 플롯에 피팅시켰다. 필요한 경우 화합물의 K i는 문헌[Anal Biochem.　1980 Sep 1;107(1):220-39]에 정의된 Munson Rodbard 방정식을 사용하여 IC50 값으로부터 결정될 수 있으며, 관련 PARP 단백질에 결합하는 프로브의 공지된 K D를 기반으로 한다.
PARP 증식 분석(7일 화합물 투약)
DLD1 및 BRCA2 (-/-) DLD1 세포를 완전 배지 중에 각각 5000개의 세포/ml 및 2.5E4개의 세포/ml의 밀도까지 수확하고, Multidrop Combi를 사용하여 40 μL/웰을 384웰 플레이트(Greiner, 오스트리아 크렘스문스테르 소재; 781090) 내에 시딩하고, 그 후 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음 날(제1일) Multidrop Combi를 사용하여 sytox green(5 ul, 2 uM) 및 사포닌(10 ul, 0.25% 스톡)을 제0일 플레이트에 첨가하고, 흑색 접착 뚜껑을 사용하여 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 >3시간 동안 인큐베이션하였다. 4x 대물렌즈가 장착된 Cell Insight(Thermo Fisher)를 사용하여 세포를 이미지화하였다. Echo 555를 사용하여 테스트 화합물을 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 유지되는 인큐베이터에 넣고, 7일 동안 인큐베이션하였다. 제8일에 sytox green(5 ul, 2 uM) 및 그 후 사포닌(10 ul, 0.25% 스톡)을 플레이트에 첨가하고, 흑색 접착 뚜껑을 사용하여 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 >3시간 동안 인큐베이션하였다. 4x 대물렌즈가 장착된 Cell Insight에서 모든 세포를 판독하였다. 제0일 및 제8일 플레이트에 대한 Cell Insight로부터의 총 세포 수 출력을 평가하여 Genedata에서 증식 속도를 결정한다.
시험관 내 인간 수송체 유출
MDR1 및 BCRP를 발현하는 MDCKII 세포를 소정의 밀도로 96웰 트랜스웰(Transwell) 삽입 시스템의 폴리에틸렌 막 상에 시딩하여 융합성 세포 단층을 형성하였다. 테스트 및 기준 화합물을 수송 완충액(HBSS HEPES pH7.4)으로 1 또는 0.1 μM의 농도까지 희석시켰다. 유기 용매의 최종 부피 퍼센트는 1% 미만이었다. A에서 B 방향으로의 그리고 B에서 A 방향으로의 테스트 화합물의 투과를 95%의 상대 습도로 37℃ 및 5% CO2에서의 90분 인큐베이션에 걸쳐 결정하였다. 인큐베이션이 끝나면 첨부(apical side) 및 기저외측부(basolateral side)로부터의 샘플을 채취하고, 그 후 내부 표준을 함유하는 저온 아세토니트릴로 침전시켰다. 4000 rpm에서 원심분리한 후 상청액을 0.1% 포름산 수용액으로 희석시키고, LC-MS/MS로 정량화하였다. 세포 단층의 무결성을 마커 Lucifer 옐로우를 사용하여 확인하였다.
하기 식을 사용하여 투과율 계수(1 x 10-6 cm/s)를 계산하였다:
Papp =(dCr/dt)×Vr/(A×C0)
(1) 하기 식을 사용하여 유출비를 계산하였다:
유출비 = Papp(B→A)/Papp(A→B)
(2) 여기서 dCr/dt는 시간의 함수로서의 수용 챔버 내의 화합물의 누적 농도(μM/s)이며; Vr은 수용 챔버 내의 용액 부피이며(첨부에서 0.1 ml, 및 기저외측부에서 0.3 ml); A는 수송을 위한 표면적, 즉 상기 단층의 면적에 대해 0.11 cm2이며; C0은 도너 챔버 내에서의 초기 농도(μM)이다.
혈장에서의 미결합 분율의 결정
미결합 분율을 RED 장치를 사용하여 결정하였다.
화합물을 DMSO에서 10 mM 용액으로 제조하였다. 최대 9개의 테스트 화합물(각각 4 uL)과 1개의 대조군(uL)을 혼합하여 1 mM 작업 스톡을 제조하였다. 9개 미만의 테스트 화합물이 포함된 경우 블랭크 DMSO의 첨가 부피를 추가하여 부피를 40 uL로 만든다.
동결된 혈장을 37℃의 수조에서 해동하였다. 그 후, 혈장을 4,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 혈전을 제거하고 상청액을 새로운 튜브에 수집하였다. 혈장의 pH를 체크하고, pH 7 ~ pH 8 범위 내에서만 사용하였다. 각 카세트의 작업 용액 3 μL를 597 μL의 블랭크 혈장에 첨가하고, 1000 rpm에서 5분 동안 볼텍싱하였다. 유기 용매의 최종 부피 퍼센트는 0.5%이고, 테스트 화합물의 최종 농도는 5 μM이었다. 즉시 50 μL의 스파이크된 혈장 현탁액을 96웰 플레이트로 옮겨 T=0 대조 샘플로 작용하게 하였다. 샘플들을 인큐베이션 후의 샘플들과 동일하게 처리한다. 나머지 혈장은 투석을 시작하기 전에 37℃에서 유지한다.
개방 단부를 위로 하여 삽입물을 베이스 플레이트의 웰에 넣는다. 적색 링으로 표시된 샘플 챔버에 300 μL의 스파이크된 혈장 샘플을 첨가한다. 완충제 챔버에 500 μL의 인산염 완충제(pH 7.4)를 첨가한다. 가스 투과성 뚜껑으로 상기 유닛을 덮고 CO2 인큐베이터에서 오비탈 진탕기에서 5% CO2를 이용하여 300 rpm에서 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션이 끝나면, 뚜껑을 제거하고, 각각, 분석을 위해 분리된 96웰 플레이트로 완충제 및 혈장 챔버 둘 다로부터 투석 후 샘플 50 μL를 피펫팅한다.
샘플은 50 μL의 블랭크 래트 혈장을 완충제 샘플에 첨가하고 동일한 부피의 PBS를 수집된 혈장 샘플에 첨가함으로써 매트릭스 매칭시키고 볼텍싱하여 혼합하였다. 적절한 내부 표준(IS)을 함유하는 400 μL의 아세토니트릴을 첨가하여 단백질을 침전시키고 화합물을 방출하고, 플레이트를 10분 동안 볼텍싱함으로써 혼합하고, 이어서 4,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 250 μL의 상청액을 새로운 96웰 플레이트로 옮기고, 다시 원심분리하였다(4,000 rpm, 30분). 그 후 100 μL의 상청액을 새로운 96웰 플레이트로 옮기고, 1,000 rpm에서 5분 동안 볼텍싱에 의해 각 샘플에 대해 100 μL의 증류수와 혼합하였다. 샘플을 LC-MS/MS로 분석하고, 약물 농도를 스파이크된 블랭크 혈장으로부터 생성된 보정 곡선에 대해 결정하였으며, 이때 전형적인 범위는 1~7500 nM이었다.
미결합 %는 다음과 같이 결정되었다: 미결합 % = (완충제 챔버의 농도/혈장 챔버의 농도) × 100%. 미결합 분율 = 미결합 %/100.
뇌 절편(slice)에서의 미결합 분획의 측정
뇌 절편에서의 미결합 부피를 결정하는 방법의 원리는 이전에 공개되었다(문헌[Development of a High-Throughput Brain Slice Method for Studying Drug Distribution in the Central Nervous System;
Figure pct00072
et al,; Drug Metabolism and Disposition, 2009, 37 (6) 1226-1233]. 간단히 말해서,
화합물 스톡 용액을 DMSO에서 10 mM 농도로 제조하였다. 최대 9개의 테스트 화합물(각각 4 uL)과 1개의 대조군(4 uL)을 혼합하여 1 mM 작업 스톡을 제조하였다. 9개 미만의 테스트 화합물이 포함된 경우 블랭크 DMSO를 첨가하여 부피를 40 uL로 만든다. 실험 당일에 4 ul를 40 mL ECF 완충액에 희석시켜 각 테스트 화합물의 100 nM 용액을 얻은 다음 인큐베이션 시작 전에 37℃로 예열하였다.
뇌 절편을 준비하기 위해 대략 300 g으로 칭량되는 래트를 흡입에 의해 이소플루란으로 말기 마취하고, 뇌를 조심스럽게 꺼내고, 빙냉 산소화 ECF 완충액에 침지시켰다. 래트의 뇌를 빙냉, O2 공급 ECF 완충액이 들어 있는 디쉬로 옮기고, 면도칼로 트리밍한 후 마이크로슬라이서의 트레이에 붙였으며, 이때 뇌를 트레이 중앙에 뒷면 표면이 아래로 향하게 하여 두었다. 빙냉 ECF 완충액을 첨가하여 글루(glue)를 경화시키고, 뇌를 습윤시켰다. 트레이를 마이크로슬라이서에 놓고 적합한 절단 속도를 사용하여 선조체 영역이 나타날 때까지 100~400 μm를 슬라이스 절단하였다. 각 뇌에 대해 4~6개, 300 μm 두께의 선조체 영역의 관상 슬라이스를 절단하고, 인큐베이션할 때까지 빙냉 O2 공급 완충액 내에 두었다. 6개의 슬라이스를 예열(37℃) 카세트 혼합물 40 mL를 포함하는 인큐베이션 트레이로 옮겼다. 뇌를 꺼낸 시점으로부터 슬라이스가 칵테일 혼합물에 들어갈 때까지의 시간은 최대 20분이었다. 인큐베이션 트레이를 가스 투과성 뚜껑으로 덮고, 37℃의, O2가 내부로 펌핑되는 수조에 넣고, 5시간 동안 45 rpm의 진탕 빈도로 인큐베이션하였다.
인큐베이션 전에 200 μL의 비-인큐베이션 카세트 용액을 T=0 샘플로 저장한다. 그 후 200 μL를 ECF 완충액(4배 부피(w/v)) 중 블랭크 뇌 균질물 200 μL와 혼합하였다. 인큐베이션 후 카세트 용액의 pH를 측정하고 기록하며, pH 값은 7.3 초과여야 한다. 카세트 용액의 표면으로부터의 200 μL를 ECF 완충액(4배 부피(w/v)) 중 블랭크 뇌 균질물 200 μL를 함유하는 튜브로 옮겼다. 각 뇌 절편을 여과지에서 건조시키고 2 mL 에펜도르프 튜브에서 칭량한다. 9배 부피(w/v)의 ECF 완충액의 첨가 후 슬라이스를 소니케이터(sonicator)로 균질화하였다. 샘플을 하기와 같이 침전시키고 희석시켰다.
각 샘플로부터의 50 μL 분취물과 각 카세트 용액(블랭크 균질물과 혼합)으로부터의 3x50 μL를 0.6 mL 원심분리 튜브로 옮겼다. 샘플을 내부 표준을 함유하는 200 μL 빙냉 아세토니트릴로 침전시키고, 2,000 rpm에서 3분 동안 볼텍싱하고, 이어서 4℃에서 15분 동안 14000 rpm에서 원심분리하였다. 100 μL의 상청액을 분석을 위해 새로운 96웰 플레이트로 옮기고, 100 μL의 증류수를 각 샘플로 옮기고, LC-MS/MS에 의한 분석을 위해 플레이트를 1000 rpm에서 2분 동안 진탕시켰다.
그 후, 혼합 슬라이스 샘플을 ECF 완충액(4배 부피(w/v))에 150 μL의 블랭크 뇌 균질물로 준비한 이중 블랭크 샘플을 사용하여 10배 및 100배의 두 단계로 추가 희석하고, 이를 150 μL의 ECF 완충액을 함유하는 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 2,000 rpm에서 2분 동안 볼텍싱한다. 샘플을 1200 μL 빙냉 아세토니트릴로 침전시키고, 2,000 rpm에서 3분 동안 볼텍싱하고, 이어서 4℃에서 15분 동안 14000 rpm에서 원심분리한다. 그 후 상청액 100 μL를 분석을 위해 새로운 96웰 플레이트로 옮긴다. 각 샘플에 100 μL의 증류수를 첨가하여 이중 블랭크 샘플을 얻는다.
뇌의 미결합 부피(Vu,뇌)를 다음과 같이 계산하였다: Vu = (Cslice - V0 * CECF)/(1-V0)*CECF
여기서, C슬라이스, CECF 및 V0는 각각 슬라이스에서의 약물의 양, ECF에서의 약물 농도(뇌 ECF에서의 약물 농도, 즉 자유 농도를 나타냄) 및 뇌 슬라이스의 수분 부착력(0.0931)이다.
뇌에서의 미결합 분율 fu,뇌 = 1/Vu,뇌이다.
래트에서의 Kpuu의 결정
혈장 내 총/미결합 약물 대 뇌 내 총/미결합 약물의 비(Kp/Kpuu)를 다음과 같이 결정하였다.
화합물을 1:1:1의 테트라에틸렌글리콜:디메틸아세트아미드:물에서 각각 0.5 mM 농도의 혼합물로 제형화하고, Han Wistar 래트에게 4 mL/kg의 부피로 2
Figure pct00073
mol/kg/h로 정맥내 주입을 통해 투여하였다. 4시간 후 동물을 희생시키고, 뇌 및 혈액 샘플을 수집하였다. 혈장을 혈액으로부터 준비하고, 모든 샘플을 분석할 때까지 -20℃에서 냉동 보관하였다. 수집 후 뇌 샘플을 정제수에서 1:3(w/v)의 비로 균질화하고 분석할 때까지 -20℃에서 냉동 보관하였다.
혈장 및 뇌 샘플을 단백질 침전, 이어서 LC-MS/MS에 의해 분석하고, 농도를 적절한 농도 범위에 걸쳐 약물로 블랭크 래트 혈장 또는 뇌 균질물을 스파이크하여 생성된 보정 곡선에 대해 결정하였다. 총 뇌 농도로부터 혈장 농도의 0.8%를 차감함으로써 잔존 혈액에 대해 뇌 농도를 보정하였다.
그 후 Kp를 다음과 같이 계산하였다: Kp = ((4 * [뇌 균질물]) - (0.008 * [혈장]))/[혈장]
그 후 Kpuu를 다음과 같이 계산하였다: Kpuu = Kp * (뇌 절편에서의 미결합 분율/혈장에서의 미결합 분율)
[표 4]
생물학적 데이터
Figure pct00074
Figure pct00075

Claims (35)

  1. 하기 화학식 I의 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염:
    [화학식 I]
    Figure pct00076

    (여기서,
    R1은 H, C1-4 알킬, C3-6 시클로알킬, C1-4 플루오로알킬, 및 C1-4 알킬옥시로부터 독립적으로 선택되며;
    R2는 H, 할로, C1-4 알킬, 및 C1-4 플루오로알킬로부터 독립적으로 선택되며;
    R3은 H 또는 C1-4 알킬이며;
    R4는 할로 또는 C1-4 알킬임).
  2. 제1항에 있어서, R1은 메틸, 에틸, 이소프로필, 시클로프로필, 1,1-디플루오로에틸, 1-플루오로에틸, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 및 메톡시 중 어느 하나로부터 선택되는 화합물.
  3. 제2항에 있어서, R1은 메틸 또는 에틸인 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 H, 클로로, 플루오로, 메틸, 및 디플루오로메틸 중 어느 하나로부터 선택되는 화합물.
  5. 제4항에 있어서, R2는 플루오로 또는 메틸인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R3은 메틸 또는 에틸인 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 클로로, 플루오로 및 메틸 중 어느 하나로부터 선택되는 화합물.
  8. 제7항에 있어서, R4는 플루오로인 화합물.
  9. 제1항에 있어서, R1은 C1-4 알킬이며, R2는 할로이며, R3은 C1-4 알킬이며, R4는 할로 또는 C1-4 알킬인 화합물, 또는 이의 제약상 허용가능한 염.
  10. 제1항에 있어서, 다음으로부터 선택되는 화합물:
    5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-클로로-5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-클로로-5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-클로로-2-에틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-플루오로-5-[4-[[5-플루오로-2-[(1S 및 1R)-1-플루오로에틸]-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[[5-플루오로-2-[(1S 및 1R)-1-플루오로에틸]-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-클로로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[[2-(1,1-디플루오로에틸)-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-클로로-5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-에틸-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-클로로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-클로로-5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[[2-(디플루오로메틸)-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-클로로-5-[4-[(5-플루오로-2-메톡시-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-에틸-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-에틸-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-에틸-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    N-에틸-6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]피리딘-2-카르복스아미드,
    N-에틸-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-플루오로-5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-클로로-5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[[5-플루오로-3-옥소-2-(트리플루오로메틸)-4H-퀴녹살린-6-일]메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-이소프로필-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-플루오로-2-이소프로필-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(5-플루오로-2-이소프로필-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-시클로프로필-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-6-플루오로-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-시클로프로필-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-시클로프로필-5-플루오로-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    5-[4-[(2-메톡시-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N,6-디메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-플루오로-5-[4-[(2-메톡시-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(2-메톡시-5-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드, 및
    6-(디플루오로메틸)-5-[4-[(2,5-디메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드,
    또는 이의 제약상 허용가능한 염.
  11. 제1항에 있어서, 다음의 화합물:
    6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드, 또는 이의 제약상 허용가능한 염.
  12. 제1항에 있어서,
    6-플루오로-5-[4-[(5-플루오로-2-메틸-3-옥소-4H-퀴녹살린-6-일)메틸]피페라진-1-일]-N-메틸-피리딘-2-카르복스아미드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염, 및 하나 이상의 제약상 허용가능한 희석제, 부형제 또는 불활성 담체를 포함하는 제약 조성물.
  14. 약제로 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염.
  15. 암의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 HR 의존성 DNA DSB 복구 경로 결함성인 화합물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 암은 정상 세포에 비해 HR에 의한 DNA DSB의 복구 능력이 감소되거나 없어진 하나 이상의 암세포를 포함하는 화합물.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 암세포는 BRCA1 또는 BRCA2 결함성 표현형을 갖는 화합물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 암세포는 BRCA1 또는 BRCA2 결함성인 화합물.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 HR 의존성 DNA DSB 복구 경로의 구성 요소를 코딩하는 유전자의 돌연변이에 대해 이형접합성인 화합물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 개체는 BRCA1 및/또는 BRCA2의 돌연변이에 대해 이형접합성인 화합물.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암, 폐암, 및 뇌암 중 어느 하나로부터 선택되는 화합물.
  23. 치료 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
  24. 제23항에 있어서, 이를 필요로 하는 환자는 암에 걸린 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 암은 HR 의존성 DNA DSB 복구 경로 결함성인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 암은 정상 세포에 비해 HR에 의한 DNA DSB의 복구 능력이 감소되거나 없어진 하나 이상의 암세포를 포함하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 암세포는 BRCA1 또는 BRCA2 결함성 표현형을 갖는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 암세포는 BRCA1 또는 BRCA2 결함성인 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 HR 의존성 DNA DSB 복구 경로의 구성 요소를 코딩하는 유전자의 돌연변이에 대해 이형접합성인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 개체는 BRCA1 및/또는 BRCA2의 돌연변이에 대해 이형접합성인 방법.
  31. 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암, 폐암, 및 뇌암 중 어느 하나로부터 선택되는 방법.
  32. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, PARP1의 억제가 유익한 질환 및 병태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 화합물 또는 이의 제약상 허용가능한 염.
  33. 제32항에 있어서, 질환 또는 병태는 암인 화합물.
  34. 제33항에 있어서, 암은 유방암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 혈액암, 위장암, 폐암, 및 뇌암 중 어느 하나로부터 선택되는 화합물.
  35. 제1항에 있어서, R1은 H, C1-4 알킬, C1-4 플루오로알킬, 및 C1-4 알킬옥시로부터 독립적으로 선택되는 화합물.
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