KR20220146014A - 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법 - Google Patents

면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법 Download PDF

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Abstract

피부 면역 과민 반응에 의한 아토피 피부염은 호전과 악화를 반복하는 만성 질환으로 장기간의 꾸준한 치료가 필요하지만 치료제로 사용되고 있는 치료제에 의한 부작용이 보고되어 천연식품소재을 활용한 안전한 소재개발이 필요하다. 이에 본 발명에서는 식품으로 널리 사용되고 있는 도라지의 항산화 효과 및 도라지의 사포닌 함량 및 활성을 증진 시키는 연구를 통하여 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물의 제조방법을 제공하고자 한다.
상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법에 있어서, 세척 후 건조한 도라지 27kg를 170L의 물을 사용하여 100℃ 2시간 추출, 최종 액상 원료 150L가 되게 추출하는 도라지열수추출단계(S1); 및 김치 발효에 사용하는 Lactobacillus plantarum(CM)을 종균으로 3대 계대 배양을 하여 종균이 오염되었는지 확인하는 종균준비단계(S2); 및 상기 종균준비단계에서 준비된 종균을 멸균된 Seed Starter(MRS broth) 1.5L에 활성화된 종균을 1% 접종한 후 15 시간 정치 배양하는 종균배양단계(S3); 및 상기 S1 단계에서 추출한 도라지열수추출물에 종균배양단계에서 배양된 Lactobacillus plantarum(CM) 종균을 접종하여 37℃에서 15~60 시간 배양하는 본배양단계(S4); 및 상기 도라지열수추출물의 산도가 pH 3.6 일 때 배양을 중지하는 배양중지단계(S5); 및 상기 배양이 진행되지 않도록 100℃ 에서 20분간 살균하는 살균단계(S6); 및 상기 살균된 배양액을 동결건조 또는 분무건조하는 건조단계(S7)을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법을 제공한다.
상기와 같은 발명의 구성에 의하여 본 출원 발명은 아토피 피부염과 같이 면역과민반응에 의하여 발생하는 피부질환을 자연에서 유래된 천연성분으로 제공함으로써 오래 사용하여도 부작용이 적은 치료 또는 증상 억제 및 완화작용이 있는 천연 소재를 제공하는 효과가 있다.

Description

면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법{.}
본 출원 발명은 생물 전환된 도라지 발효물 제조방법에 관한 것이다. 더욱 자세하게는 도라지를 발효시킨 발효물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 출원 발명의 출원 이전의 선행기술로 증숙시킨 도라지에 포도즙, 벌꿀을 혼합한 후 바실러스 스브틸리스 발효균으로 발효시킨 증숙 도라지의 제조방법에 관한 기술이 개시되어 있다. 이 기술에서는 도라지 특유의 냄새 및 쓴맛을 제거하고, 사포닌과 스테로이드 등의 약효성분을 향상시켜 도라지의 거담 및 해열작용을 향상하고자한 기술이었다.
또 다른 선행기술로는 항산화 활성 및 알파-글루코시데이즈 저해 활성이 증진된 도라지 발효액의 제조방법에 관한 것으로, 1 내지 10%(w/v)의 도라지를 포함하는 배양액에 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종하여 20 내지 40℃에서 8 내지 24시간 동안 발효된 도라지 액은 항산화 효과 및 알파-글루코시데이즈 저해 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 기술이다.
또 다른 선행기술로는 도라지를 액상으로 배양배지화하고 담자균류 균사를 접종하여 배양 발효한 후에 섬유소 분해효소를 처리한 발효물을 유효성분으로 포함하는, 아토피피부염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 기술이 개시되어 있다.
등록특허공보 제10-1225868호 공개특허공보 제10-2015-0131483호 등록특허공보 제10-2168765호
피부 면역 과민 반응에 의한 아토피 피부염은 호전과 악화를 반복하는 만성 질환으로 장기간의 꾸준한 치료가 필요하지만 치료제로 사용되고 있는 치료제에 의한 부작용이 보고되어 천연식품소재을 활용한 안전한 소재개발이 필요하다. 이에 본 발명에서는 식품으로 널리 사용되고 있는 도라지의 항산화 효과 및 도라지의 사포닌 함량 및 활성을 증진 시키는 연구를 통하여 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물의 제조방법을 제공하고자 한다.
이를 위하여 건조 도라지를 김치유산균인 Lactobacillus plantarum를 이용하여 발효를 하였으며, 도라지의 지표 및 유효성분인 platycodin D 및 platycoside E 함량을 측정을 위한 분석법을 개발하였고, 상기 발효 조성물이 인간 keratinocyte인 HaCaT 세포주를 이용한 실험을 통하여 발효 도라지의 면역과민반응개선 효능이 있음을 구명하였다.
상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 다음의 과제해결 수단을 제공한다.
면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법에 있어서,
세척 후 건조한 도라지 27kg를 170L의 물을 사용하여 100℃ 2시간 추출, 최종 액상 원료 150L가 되게 추출하는 도라지열수추출단계(S1); 및
김치 발효에 사용하는 Lactobacillus plantarum(CM)을 종균으로 3대 계대 배양을 하여 종균이 오염되었는지 확인하는 종균준비단계(S2); 및
상기 종균준비단계에서 준비된 종균을 멸균된 Seed Starter(MRS broth) 1.5L에 활성화된 종균을 1% 접종한 후 15 시간 정치 배양하는 종균배양단계(S3); 및
상기 S1 단계에서 추출한 도라지열수추출물에 종균배양단계에서 배양된 Lactobacillus plantarum(CM) 종균을 접종하여 37℃에서 15~60 시간 배양하는 본배양단계(S4); 및
상기 도라지열수추출물의 산도가 pH 3.6 일 때 배양을 중지하는 배양중지단계(S5); 및
상기 배양이 진행되지 않도록 100℃ 에서 20분간 살균하는 살균단계(S6); 및
상기 살균된 배양액을 동결건조 또는 분무건조하는 건조단계(S7)을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물은 프로폴리스 물 추출액과 혼합하여 피부에 바르는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 함유 연고를 제공한다.
또한, 상기 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물과 엉겅퀴 추출물을 1대 0.1 내지 10 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효 조성물을 제공한다.
또한, 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법은
세척 후 건조한 도라지 물을 사용하여 100℃ 2시간 추출하는 도라지열수추출단계(SA1); 및
김치 발효에 사용하는 Lactobacillus plantarum(CM)를 종균으로 사용하는 종균준비단계(SA2); 및
상기 종균준비단계에서 준비된 종균을 멸균된 Seed Starter(MRS broth)에 종균을 접종한 후 15 시간 정치 배양하는 종균배양단계(SA3); 및
상기 S1 단계에서 추출한 도라지열수추출물에 종균배양단계에서 배양된 Lactobacillus plantarum(CM) 종균을 접종하여 37℃에서 15~60 시간 배양하는 본배양단계(SA4); 및
상기 도라지열수추출물의 산도가 pH 3.6 일 때 배양을 중지하는 배양중지단계(S5); 및
상기 배양이 진행되지 않도록 살균하는 살균단계(SA6); 및
상기 살균된 배양액을 동결건조 또는 분무건조하는 건조단계(SA7)을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 도라지열수추출단계는 세척 후 건조한 도라지 27kg를 170L의 물을 사용하여 100℃ 2시간 추출, 최종 액상 원료 150L가 되게 추출하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법을 제공한다.
또한 상기 건조단계에서 건조된 도라지 발효물은 12.15Kg인 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법을 제공한다.
또한 상기 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물은 프로폴리스 물 추출액과 혼합하여 피부에 바르는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 함유 연고를 제공한다.
또한, 상기 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물과 엉겅퀴 추출물을 1대 0.1 내지 10 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효 조성물을 제공한다.
상기와 같은 발명의 구성에 의하여 본 출원 발명은 아토피 피부염과 같이 면역과민반응에 의하여 발생하는 피부질환을 자연에서 유래된 천연성분으로 제공함으로써 오래 사용하여도 부작용이 적은 치료 또는 완화작용이 있는 성분을 제공하는 효과가 있다.
한편으로는 면역과민반응에 효과가 있는 서로 상보적인 산도를 가지는 2개 이상의 성분을 혼합하여 조성물을 만들어 사용함으로써 면역과민반응에 효과적인 조성물을 제공하였다.
도 1은 본 발명의 균주 활성화 단계 설명도
도 2는 본 발명의 배양공정 단계 설명도
도 3은 본 발명의 도라지 추출 발효물 배양 결과 그래프
도 4는 본 발명의 생물전환에 따른 도라지추출발효물의 지표물질 분석 실험결과
도 5는 본 발명의 발효도라지 추출물 처리에 따른 세포 독성평가를 위한 세포생존율 변화 막대그래프
도 6은 본 발명의 발효도라지 추출물 처리에 따른 염증성 바이오마커의 발현 변화 막대 그래프
도 7은 본 발명의 도라지 발효물 제조공정
□ 면역 과민반응의 위험성
과민반응이란 특정 항원에 대해 과도한 면역반응이 일어나 조직 손상 등의 부적절한 피해를 주는 면역 반응을 지칭한다. 과민반응은 제 1형부터 제 4형까지 분류되며, 제 1형 과민반응은 알레르기로 잘 알려져 있다. 현재 알레르기는‘다양한 항원에 대한 면역계의 반응으로 발생하는 질병’으로 보다 제한된 의미로 정의된다. 알레르기는 과민반응(hypersensitivity reactions)으로서 면역 반응들의 여러 유해반응들 중 하나이며, 이런 유해 반응들은 조직 손상을 일으키며 심각한 질병을 일으킬 수 있다.
□ 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 소재 개발의 필요성
아토피 피부염은 가려움증을 특징으로 피부발적, 태선화 및 피부감염 등을 보이는 만성 난치성 염증성 피부질환을 말한다. 그 원인은 선천적인 요인(유전적인 요인)과 후천적인 요인으로 나눌 수 있고, 유전적인 요인으로 filaggrin의 유전자 변이 등이 있고, 후천적 요인으로는 다양한 유발 물질의 자극과 면역학적인 요인 등이 있다. 이들 요인들과 피부장벽의 손상은 서로 복잡한 상호작용에 의해 발생하고 있다.
상기 아토피 피부염은 피부의 면역과민반응을 특징으로 하며, 산업이 발달하고 서구화된 나라에서 더욱 흔히 나타나는 질환으로 소아는 10-20%, 성인은 1-3% 정도의 유병률을 보이며 우리나라도 이와 유사한 유병률을 나타내고 있다. 아토피피부염은 70-80% 정도에서 가족력이 있을 만큼 유전적인 소인이 매우 중요하게 작용하지만, 환경적인 요인도 강력하게 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 대표적인 증상은 건조하고 가려운 피부, 얼굴과 팔꿈치 안쪽과 무릎 뒤 및 손발의 발진 증상이 있다.
아토피 피부염은 원인과 발생기전이 다양하고 호전과 악화를 반복하는 만성 질환으로 장기간의 꾸준한 치료가 필요하며, 재발을 반복하는 질병의 특성상 성인이 된 이후까지 중증화, 난치화 되는 경우가 많다.
2016년 국민건강보험공단 발표 자료에 따르면 우리나라 2015년 건강보험 적용 인구를 기준으로 전체 아토피 피부염 환자 93만 3,000명 중 12세 이하 어린이가 거의 절반에 가까운 48.6%를 차지하고 있다. 아토피성 피부염은 심한 소양증 및 만성 피부발진이 특징인 일련의 알레르기 면역질환으로 흔히 태열이라 불리는 유아습진의 가장 흔한 형태로 나타나고 있으며 국내뿐만 아니라 세계적으로도 전체인구의 10~20%에서 나타나는 질환이다. 아토피 질환은 나이가 들면서 자연히 소실되는 경우가 많으나 환자의 30-80%에서 악화되는 경우가 많으며 특히 산업화, 도시화의 영향으로 인한 대기오염의 증가, 수입농산물의 증가 및 생활의 서구화 등 의식주의 변화 등으로 새로운 인자들에 의하여 아토피성 피부염 질환이 점차 증가하는 추세이다.
Data monitor 자료에 의하면 미국, 일본, 프랑스 등 세계 7대 거대시장의 4,000만 명 이상이 아토피피부염으로 고통받고 있는 것으로 분석됨. 국가별로는 미국에서 가장 높은 비율로 아토피 피부염이 발생하는 것으로 나타나며 전체인구 1,000명 중 64명꼴로
아토피 피부염이 발병하는 것으로 분석되어 있다.
세계 7개국 아토피 피부염 환자의 연령별 발병률을 분석한 결과 공통적으로 0세~4세 소아에게서 21% 정도의 높은 발병률을 보이고 있다.
아토피 피부염 치료제의 한계 및 부작용은 현재 사용되고 있는 아토피피부염 치료제는 스테로이드나 tacrolimus와 같은 비특이적 면역억제제 및 항히스타민제임. 국소 스테로이드제가 가장 많이 사용되고 있는 약물이나, 지속적으로 사용할 경우 피부위축, 팽창선, 피부장벽기능 손상 등의 부작용이 발생한다. 따라서 항원 특이적이고, 근원적으로 치료가 가능한 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있다. 현재 아토피피부염 치료로는 피부 보습, 악화요인의 제거, 스테로이드 외용제 및 환자와 가족 교육을 기본으로 하고 증상의 정도에 따라 항히스타민제, 광치료, 면역반응 외용제, 면역억제제 등을 사용하고 있으나, 오랜 기간 비특이적 치료제로 인해 많은 부작용이 나타나, 보다 효과적이고 부작용이 적은 새로운 아토피피부염 치료의 개발이 절실하다.
본 발명의 소재로 사용되는 도라지(Platycodon grandiflorum)는 한국, 일본 및 중국의 산간 지방에 널리 자생하는 초롱꽃과 식물로 주로 뿌리부분을 사용하고 있다. 그중 나물용으로 사용되는 도라지는 주로 1-2년근을 사용하며, 약용으로 사용되는 도라지는 3년근 이상의 도라지를 사용하고 있다(Kim et al., 2007; Lim, 1971; Sung and Seo, 1998). 도라지의 주된 효능으로는 혈당 강하(Seo et al., 2004), 콜레스테롤 대사 개선(Seo et al., 2006; Zhao et al., 2004), 항비만(Byen, 2003), 항염증(Choi et al., 2001), 면역 반응 증가(Choi et al., 2001), 항산화 효과(Jang et al., 2011; Kim et al., 1986), 아토피 피부염 개선(Kim et al., 2011; Kim et al., 2012) 등의 연구들이 보고되고 있다. 이러한 기능성을 가지는 도라지의 유효성분으로 도라지 뿌리에 함유되어 있는 platycodin A, C, D와 polygalacin D 등의 사포닌이 30여종 이상 알려져 있으며, 도라지의 사포닌은 oleanane계 triterpene을 aglycone으로 하는 구조로 각 반응기에 하나 이상의 당을 결합하고 있다(Konish et al., 1976; Li et al., 2010; Tada et al., 1975). Yan 등(2012)의 연구에 따르면 한국 및 중국산 도라지의 사포닌 함량을 조사한 결과 platycoside E 와 platycodin D 함량이 가장 높은 것으로 나타났으며, Ha 등(2006)의 연구에 따르면 도라지에 함유된 사포닌 성분 중 platycoside E, platycodin D 및 polygalacin D가 높은 함량을 나타냈다.
본 발명은 상기의 도라지를 발효하여 그 발효물을 제조하는 기술에 관한 것이다.
이를 위하여 생물전환(발효)에 따른 도라지 추출 및 발효조건을 설정하고 있다.
□ 생물전환에 따른 도라지 추출 및 발효조건 설정
(1) 도라지 추출액 제조방법
- 세척 후 건조한 도라지 27kg를 170L의 물을 사용하여 100℃ 2시간 추출, 최종 액상
원료 150L가 되게 추출 한다.
- 추출된 액상 원료 150L를 동결 건조 했을 때 최종 약제 원료 대비 회수율이 45%, 추출액 대비 7% 되는 추출액을 원료로 사용 한다.
(2) 종균 활성화 및 Seed starter 준비
본 출원 발명은 김치 발효에 사용하는 Lactobacillus plantarum(CM)을 종균으로 사용한다. 생산 계획이 수립되면 종균 활성화 계획을 세운 후 균주를 접종하여 배양을 시작함으로써 균주를 활성화 시키고, 활성화된 균주를 접종한 후 현미경으로 균주가 오염되지 않았는지 확인한 후 3대 계대 배양을 실시한다. 도 1은 이러한 과정을 도시하고 있다.
- Lactobacillus plantarum(CM) 종균의 활성화는 최초 앰플을 접종 한 이후 3대까지 MRS broth 배지에 계대 배양하는 한다.
- 멸균된 Seed Starter(MRS broth) 1.5L에 활성화된 Lactobacillus plantarum 종균을 1% 하며, 배양 시간은 15시간 정치 배양 한다.
(3) 생산제조 발효공정
이렇게 활성화된 종균을 이용하여 도2의 과정을 거쳐 도라지 발효물을 제조한다.
종균을 생산된 배지에 접종하여 본 배양을 하고, 배양 후에 더 이상 발효가 진행하지 않도록 열처리한 후 발효물을 회수하고 동결건조 한 발효물을 분쇄하여 도라지 발효물을 제조한다. 배양배지의 멸균공정과 본 배양 공정은 하기의 표 1, 2와 같다.
- 배양배지 멸균공정
작 업 방 법 기구 / 시간 주의 사항 비 고
배양 탱크 및 라인은 스팀 멸균을 충분히 실시 한다.
 고압스팀멸균기/
15분
생산 계획에 맞는 배지의 원료를 칭량 하여 본 배양 탱크에 삽입 한 후 교반 하여 잘 혼합 한다.
 원료, 칭량 저울/ 1~2시간 배지는 함량에 맞게 측량하고 다른 유입물이 혼입되지 않게 주의 한다. 　
121℃로 15~20분간 고압 스팀 멸균 한 후, 40~60RPM 정도로 교반 하면서 37℃까지 온도를 떨어뜨린 후 N2로 충분히 치환 시켜 준다.
고압스팀멸균기/냉각기/
N2gas/2~3시간		 배지 살균 시 배지가 타지 않게 온도, 압력, 시간을 잘 조절하고, CO2치환 시 충분한 시간 여유를 준다. 기계 이상이 있을 시 담당 관리자에게 보고 한 후 조치 한다.
- 본 배양 공정
작 업 방 법 기구 / 액제 / 시간 주의 사항 비 고
멸균이 끝난 배지에 오염 이상이 없는 Seed starter
를 1%접종 한다.
배양기/ Seed starter
/10분		 접종 시 균주에 맞는 온도, pH를 확인한 후 접종 한다. 　
접종 후 37℃ pH3.5~6의 조건에서 15시간 배양 하고 2시간 마다 온도, pH를 확인 하고, 셈플링 하여 검경을 하고, 배양 상태를 기록 한다.
셈플링 튜브, 현미경/ 10분 　 배양 도중 이상이 있을 시 담당 관리자에게 보고 하고 생산 관리서에 기록 한다.
배양 종료까지 이상이 없을 시 배양을 종료 하고, 100℃
에서 15분간 사균 처리 한 후 50℃까지 냉각 한다.
 배양기/1~2시간 사균 처리 시 배지가 타지 않게 온도, 압력, 시간을 잘
조절 한다.		 　
냉각된 배양액은 회수 라인을 통하여 회수 한다 배양기/분 회수 라인 멸균이 되어 있는지 확인 하고, 외부 오염 유입에 주의 하여 작업을 실시 한다. . 　
회수가 끝난 배양액은 동결
건기에서 4일간 동결 건조
한 후 원말을 회수 하여
분쇄 후 수분이 유입 되지 않게 이중 밀페 용기에 보관 한다. 		동결 건조기, 이중 밀폐 용기/ 분 회수 시, 동결 건조기로 이동 시 외부 오염 유입에 주의하여 작업을 실시 한다. 최종 원말은 오염 검사 및 기능성
검사를 실시 하고,
이상 여부를 담당 관리자에 보고 후 생산 관리서에 기록 한다.
(4) 생산제조 발효 공정 배양 결과
- 도라지추출발효물의 생균수 및 pH 변화 측정 결과 생균수는 표 3과 도 3에 나타내었다. 도라지추출발효물의 생균수는 발효시간과 유의하게 증가함을 확인할 수 있었고, pH는 발효시간이 증가함에 따라 감소하는 것이 확인 되었다.
Time(hr) 1batch
pH cfu/ml brix
0 4.9 1.50E+07 8.2
2 4.89 6.09E+07 8.2
4 4.64 1.49E+08 8.2
6 4.19 6.40E+08 8.1
8 3.89 7.50E+08 8.1
10 3.8 8.00E+08 8.1
12 3.72 9.10E+08 8
14 3.66 1.07E+09 8
15 3.64 1.17E+09 8
(5) 생산제조 건조 공정
- 발효가 끝난 도라지추출 발효물은 동결건조기를 사용 표4 과 같은 조건으로 4일간 동결건조 하였고, 원물 대비 45%, 건조 약량 대비 7% 분말이 생산 되었다.
도라지추출발효물 동결건조 조건
날짜 시간 선반온도 트랩온도 진공도
2020-11-30 오전 10:20:00 -7.6
오후 5:20:00 -45
오후 8:10:00 -44 -69 51
2020-12-01 오전 8:30:00 -21.1 -79 30
오후 1:30:00 -8 -77.9 32
오후 5:40:00 1.8 -77.3 27
2020-12-02 오전 8:30:00 34.3 -79.6 22
오후 3:40:00 45 -81.4 20
오후 5:30:00 45.2 -82.1 17
2020-12-03 오전 9:20:00 45 -82.4 17
오후 3:40:00 45 -80.4 17
2020-12-04 오전 9:20:00 40.1 -81.2 17
본 출원 발명의 또 다른 해결과제는 도라지추출발효물의 지표물질 분석방법에 있다. 본 출원 발명의 도라지 발효물의 개발 중 발효를 통하여 도라지의 면역과민반응 억제 효능이 있는 지표물질의 분석방법이 없이 이 분석법을 개발하는 것도 본 출원 발명의 해결과제 이다.
□ 생물전환에 따른 도라지추출발효물의 지표물질 분석법 개발 및 검증
(1) 발효도라지의 지표성분(STD) 분석조건 설정
- 발효된 도라지에 함유된 platycoside E 및 platycodin D의 HPLC 분석은 표5과 같은 분석 조건으로 서로 다른 두 개의 표준물질을 동시분석 하였다. 분석에 사용한 기기는 Waters 2695 Separation Module HPLC system과 Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters, Milford, Ma, USA)로 분석조건은 표5와 같으며 분석용 column은 Capcell pak C18(4.6 mm×250 mm, 5.0 μm, Shiseido, Tokyo, Japan)를 사용하였다.
표 5. HPLC를 이용한 Platycoside E 및 platycodin D 분석조건
Instrument Conditions
Column Capcell Pak C18 UG12, (5.0 μm, 4.6 × 250 mm)
Column temp. 30℃
Mobile phase
(Gradient)		 Time (min) A1) (%) B2) (%)
0 82 18
15 75 25
30 70 30
35 82 18
40 82 18
Detector Waters 996 Photodiode Array Detector (210 nm)
Flow rate 1.0 mL/min
Injection volume 20 μL
Run time 40 min
1) Distilled water (DW)
2) Acetoniltrile
(2) 발효도라지의 지표성분(STD) 표준용액 제조
- Platycoside E 및 platycodin D 표준물질을 각각 10 mg 취한 뒤, 10 mL 정용플라스크를 이용해 1,000 μg/mL의 농도가 되도록 18% acetonitrile로 표선까지 정용하여 이를 stock solution으로 하였다. Working solution은 제조된 stock solution을 이용하여 0.78125, 1.5625, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL가 되도록 18% acetonitrile로 희석하여 사용하였다. Platycoside E 및 platycodin D 표준물질을 각각 10 mg 취하여 10 mL 정용플라스크를 이용해 1,000 μg/mL의 농도 가 되도록 18% acetonitrile로 표선까지 정용하여 이를 stock solution으로 하였다. Working solution은 제조된 stock solution을 이용하여 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL가 되도록 18% acetonitrile로 희석하여 사용하였다. 시험용액은 동결건조 된 시료를 40 mL 칭량한 후 10 mL 정용플라스크를 이용하여 4,000 μg/mL의 농도가 되도록 18% acetonitrile로 정용하고, 0.45 μm pore size PET syringe filter (Whatman, USA)으로 여과하여 시험용액으로 하였다.
(3) 분석법 유효성 검증
- 분석법의 유효성 검증은 직선성(linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy) 및 검출한계(limits of detection, LOD), 정량한계(limits of quantification, LOQ)를 이용하여 분석법의 유효성을 검증하였다.
(4) 실험결과
- 직선성 확인
직선성은 시료 중 일정 범위 내에서 분석대상물질의 양에 비례하는 직선적인 측정값을 얻어낼 수 있는 능력을 말하며, 분석된 결과에 따라 y축을 peak 면적, x축을 표준용액의 농도(μg/mL)로 하여 작성된 calibration curve의 R2값으로 직선성을 확인하였다. Platycoside E 및 platycodin D 표준용액을 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL 농도로 단계적으로 희석하여 HPLC로 분석한 결과 platycoside E 및 platycodin D의 표준검량선은 각각 y=2830.2x + 84.333, y=3545.5x + 23.544로 나타났으며 상관계수(R2) 값은 platycoside E 0.9999, platycodin D 0.9997을 나타내어 우수한 직선성을 보였다. 실험결과 그래프는 도 4에 도시되어 있다. 도4(A)가 platycoside E 측정 결과이며, 도4(B)가 platycodin D이다.
- 정밀성 및 정확성
정밀성은 균일한 시료에 대하여 연속적인 분석을 통해 얻은 각각의 측정값들 사이의 근접성을 의미하며, 정확성은 측정값이 이미 알고 있는 참값이나 표준 값에 근접한 정도를 의미한다. 농도를 알고 있는 발효된 도라지 추출물에 표준용액을 각각 저농도(1.5625 μg/mL), 중간농도(12.5 μg/mL), 고농도(100 μg/mL)로 첨가한 뒤 HPLC로 분석하였으며, 정밀성은 각 측정 결과 값의 분산정도를 확인하여 평가하였고 정확성은 회수율을 측정하여 평가하였다. 정밀성의 결과는 상대표준편차(RSD)로 확인하였으며 platycoside E 및 platycodin D의 정밀성은 일간 정밀성에서 각각 0.58－2.91%와 1.21－3.59%, 일내 정밀성에서 0.4－4.77%와 0.9－4.23%로 5% 이하의 우수한 정밀성을 나타내었다. 정확성의 결과는 회수율을 측정하여 나타내었으며, Table 2와 같이 platycoside E 및 platycodin D의 일간 정확성은 94.81－110.62%, 94.02－115.73%, 일내 정확성은 94.63－104.35%, 94.11－122.82%로 우수한 정확성을 나타내었다. 실험결과는 표6에 나타냈다.
표 6. HPLC를 이용한 Platycoside E 및 platycodin D 분석조건
Analytes Concentration (μg/mL) Mean ± SD (μg/mL) RSD (%) Recovery (%)
Fermented
Platycodon
grandiflorum
extracts		 Platycoside E Intra-day 1.5625 1.63 ± 0.08 4.77 104.35
12.5 12.06 ± 0.39 3.20 96.44
100.0 94.63 ± 0.38 0.40 94.63
Inter-day 1.5625 1.73 ± 0.05 2.91 110.62
12.5 11.97 ± 0.24 2.00 95.79
100.0 94.81 ± 0.55 0.58 94.81
Platycodin D Intra-day 1.5625 1.92 ± 0.08 4.23 122.82
12.5 12.54 ± 0.40 3.22 100.35
100.0 94.11 ± 0.85 0.90 94.11
Inter-day 1.5625 1.81 ± 0.03 1.58 115.73
12.5 12.27 ± 0.44 3.59 98.15
100.0 94.02 ± 1.13 1.21 94.02
- 검출한계 및 정량한계
검출한계는 주어진 신뢰 수준에서 검출 가능한 분석대상물질의 최소량을 말하며, 정량한계는 일정 수준의 신뢰성을 가지고 정량 분석할 수 있는 분석대상물질의 최소량을 의미한다. 검출한계와 정량한계를 분석한 결과 platycoside E 및 platycodin D의 검출한계는 각각 0.22 μg/mL, 0.31 μg/mL로 측정되었고, 정량한계는 0.68 μg/mL, 0.93 μg/mL로 측정되었다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때 발효된 도라지 추출물의 platycoside E 및 platycodin D는 HPLC를 이용한 동시분석과 정량분석이 가능한 것으로 나타났다. 표 7은 검출한계 및 정량한계치 실험결과를 보여주고 있다.
표 7. 발효도라지 추출물의 검출한계 및 정량한계
Analytes Range
(μg/mL)		 Slope Intercept Correlation
coefficient (R2)		 LOD
(μg/mL)		 LOQ
(μg/mL)
Platycoside E 0.78-200 3018.48 204.90 0.9999 0.22 0.68
Platycodin D 0.78-200 3928.47 366.36 0.9997 0.31 0.93
□ 생물전환된 발효도라지 추출물의 지표물질 분석
(1) 발효도라지 추출물의 platycoside E 및 platycodin D 함량 분석
- 확립된 분석법을 이용하여 발효된 도라지 추출물 내 platycoside E 및 platycodin D의 함량을 분석한 결과 platycoside E 2.29±0.08 mg/dry weight g, platycodin D 2.09±0.37 mg/dry weight g의 수준으로 함유되어 있는 것으로 분석되었다. 표8은 실험결과이다.
표 8. 발효도라지추출의 지표물질 함량
Sample (mg/dry weight g) Platycoside E Platycodin D
Non-fermented Platycodon grandiflorum extract 1.09 ± 0.04 1.99 ± 0.05
Fermented Platycodon grandiflorum extract 2.29 ± 0.04 2.09 ± 0.08
□ 생물전환된 발효도라지 추출물의 효능평가
(1) 발효도라지 추출물의 Human Keratinocyte(HaCaT) 세포독성 평가
- 도라지 및 발효도라지의 세포독성평가를 XTT assay를 이용하여 측정하였으며, 양성대조군으로는 silymarin을 사용하였다. Silymarin 12.5 μg/mL과 도라지 및 발효도라지 200 μg/mL 농도의 모든 시료에서 세포 독성을 보이지 않았다. 뿐만 아니라 HaCaT세포의 염증 반응을 유발하는 TNF-α와 INF-γ를 동시 처리하였을 때도 세포 독성을 보이지 않았고, 모든 실험에서 현미경관찰을 통한 세포형태의 변화가 관찰되지 않았다.
도 5는 도라지 및 발효도라지의 세포독성평가 그래프 이다.
(2) HaCaT세포를 이용한 발효도라지 추출물의 면역과민반응 개선 효과
- 발효도라지의 피부 면역과민반응 개선 효과를 측정하기위하여 표피세포인 HaCaT 세포를 이용하였다. 양성대조군으로는 silymarin을 사용하였으며, 피부 염증 반응은 TNF-α와 INF-γ를 처리하여 염증을 유발하였다. 피부면역 조절기능 이상을 판단 하기위한 바이오마커로 IL-6, IL-1β, MDC, TARC를 선정하였으며, 효소면역측정법 (ELISA)로 측정하였다. 모든 바이오마커에서 TNF-α와 INF-γ 처리로 인한 발현이 증가 되었지만, 도라지 및 발효도라지 추출물에서 감소되었다. 특히 생물전환된 발효도라지는 도라지에 비해 유의적으로 면역기능 조절 바이오마커의 감소를 유도하였다. 도 6은 발효도라지의 피부 면역과민반응 개선 효과 측정 결과이다. 여기서 NP는 Non-fermented Platycodon grandiflorum extract로 도라지 추출액이며, FP는 Fermented Platycodon grandiflorum extract로 도라지 발효물이다. 이하 그래프에서 표시는 동일하다.
도7에 본 출원 발명의 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 생산 공정도를 도시하고 있다.
앞서 설명한 종균으로부터 균주를 활성화하는 공정과 도라지 추출물을 이용하여 생산 배지를 제공하고 본 배양을 하고 열처리 및 발효물을 회수하고 동결건조하는 과정이 전체적으로 도시되어 있다.
본 발명의 도라지 발효물을 제조하기 위하여 도라지는 100℃에서 2시간동안 열수 추출하였으며, 121℃에서 20분간 멸균한 후 접종하여 발효시킨다.
본 발효 조건은 균주를 1 중량% 접정하고 37℃에서 15~ 16 시간동안 발효시킨다. 발효는 발효액의 산도가 ph 3.6에 도달하는 시점에서 종료한다.
더 이상의 발효를 막기 위하여 발효액은 발효 종료시점에 도달하면, 100℃에서 20분간 살균처리한다. 이렇게 생산된 발효액은 동결건도 또는 분무건조 후 필요한 경우 분쇄하여 최종 발효물을 생산한다.
이렇게 생산된 발효물은 각종 기능성 식품 또는 약제 또는 바르는 성분으로 첨가하여 사용할 수 있다.
본 출원 발명에서는 도라지 발효물의 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 효과를 더욱 높이기 위하여 1 대 0.1 내지 10의 중략 비율로 고려엉겅퀴 열수 추출액을 동결건조한 고려엉겅퀴 추출물을 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 도라지 발효물과 고려엉겅퀴 추출물의 혼합비율은 혼합물의 산도가 pH 4.5 ~5.5 농도에 맞추는 것을 특징으로 하고, 피부 염증이 많은 경우 pH 4.5에 그렇지 않은 경우에는 pH 5.5에 가깝도록 혼합비율을 조절하는 것을 특징으로 한다.
상기 고려엉겅퀴 추출물은 알칼리성 성분으로 상기 도라지 발효물과 혼합하여 사용하면 상기 도라지 발효물의 산성을 중화시키고, 고려엉겅퀴 추출물이 가지는 아토피 피부염 완화 기능이 상승 작용을 하여 더 향상된 면역과민반응의 억제 효과가 있다.
이는 상기 엉겅퀴 추출물이 항아토피 피부염 조성물로 사용될 수 있음을 구명한 공개특허공보 제10-2010-0079586 발명을 이용한 것으로, 이 발명에서는 IL-4, IL-13 등에 엉겅퀴가 억제효과가 있는 것을 보여주고 있어, 본 출원 발명의 도라지 발효물이 도6에 도시된 바와 같이 IL-6 IL-1Beta MDC TARC 등의 면역기능 조절 바이오마커의 감소를 유도하는 기능과 결합하여 사용한다면 항아토피 즉, 면역과민반응에 의한 피부질환의 개선에 큰 도움이될 수 있다. 또한, 환자의 상태에 따라 면역반응을 일으키는 원인을 찾아 상기 도라지 발효물과 엉겅퀴 추출물의 혼합비율을 달리한다면 더 큰 치료 또는 억제 효과가 있을 것으로 기대한다. 상기 공개특허공보 제10-2010-0079586 의 내용은 실제 기재하지는 않았으나, 상기 공개특허공보의 번호를 기재하는 것으로 모든 내용을 기재한 것으로 대체한다.
상기 엉겅퀴(곤드레)의 추출방법은 하기와 같다. 생물 엉겅퀴를 선별한 다음 수세한 후 찜 용기에서 90℃에서 40분간 쪄 증자한다. 상기 증자한 엉겅퀴를 찜 용기에서 빼낸 후 공기가 잘 통하는 장소로 이동시킨 후 수분함량이 10중량%가 되도록 건조한다. 상기 건조된 엉겅퀴에 100g와 주정(에탄올) 2,000㎖을 추출용 용기 넣고 5분 동안 초음파를 가한 후, 1.5기압 65 ℃로 4시간 동안 열을 가하였다. 상기 추출된 엉겅퀴 추출물을 동결 건조하여 농축 및 분말화하여 분말 25g의 엉겅퀴 추출물을 획득한다.
상기와 같은 작용효과는 나타내는 발명의 구성은 다음과 같다. 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법에 있어서,
세척 후 건조한 도라지 27kg를 170L의 물을 사용하여 100℃ 2시간 추출, 최종 액상 원료 150L가 되게 추출하는 도라지열수추출단계(S1); 및
김치 발효에 사용하는 Lactobacillus plantarum(CM)을 종균으로 3대 계대 배양을 하여 종균이 오염되었는지 확인하는 종균준비단계(S2); 및
상기 종균준비단계에서 준비된 종균을 멸균된 Seed Starter(MRS broth) 1.5L에 활성화된 종균을 1% 접종한 후 15 시간 정치 배양하는 종균배양단계(S3); 및
상기 S1 단계에서 추출한 도라지열수추출물에 종균배양단계에서 배양된 Lactobacillus plantarum(CM) 종균을 접종하여 37℃에서 15~60 시간 배양하는 본배양단계(S4); 및
상기 도라지열수추출물의 산도가 pH 3.6 일 때 배양을 중지하는 배양중지단계(S5); 및
상기 배양이 진행되지 않도록 100℃ 에서 20분간 살균하는 살균단계(S6); 및
상기 살균된 배양액을 동결건조 또는 분무건조하는 건조단계(S7)을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물은 프로폴리스 물 추출액과 혼합하여 피부에 바르는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 함유 연고를 제공한다.
또한, 상기 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물과 엉겅퀴 추출물을 1대 0.1 내지 10 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효 조성물을 제공한다.
또한, 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법은
세척 후 건조한 도라지 물을 사용하여 100℃ 2시간 추출하는 도라지열수추출단계(SA1); 및
김치 발효에 사용하는 Lactobacillus plantarum(CM)를 종균으로 사용하는 종균준비단계(SA2); 및
상기 종균준비단계에서 준비된 종균을 멸균된 Seed Starter(MRS broth)에 종균을 접종한 후 15 시간 정치 배양하는 종균배양단계(SA3); 및
상기 S1 단계에서 추출한 도라지열수추출물에 종균배양단계에서 배양된 Lactobacillus plantarum(CM) 종균을 접종하여 37℃에서 15~60 시간 배양하는 본배양단계(SA4); 및
상기 도라지열수추출물의 산도가 pH 3.6 일 때 배양을 중지하는 배양중지단계(S5); 및
상기 배양이 진행되지 않도록 살균하는 살균단계(SA6); 및
상기 살균된 배양액을 동결건조 또는 분무건조하는 건조단계(SA7)을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 도라지열수추출단계는 세척 후 건조한 도라지 27kg를 170L의 물을 사용하여 100℃ 2시간 추출, 최종 액상 원료 150L가 되게 추출하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법을 제공한다.
또한 상기 건조단계에서 건조된 도라지 발효물은 12.15Kg인 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법을 제공한다.
또한 상기 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물은 프로폴리스 물 추출액과 혼합하여 피부에 바르는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 함유 연고를 제공한다.
또한, 상기 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물과 엉겅퀴 추출물을 1대 0.1 내지 10 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효 조성물을 제공한다.

Claims (10)

  1. 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법에 있어서,
    세척 후 건조한 도라지 27kg를 170L의 물을 사용하여 100℃ 2시간 추출, 최종 액상 원료 150L가 되게 추출하는 도라지열수추출단계(S1); 및
    김치 발효에 사용하는 Lactobacillus plantarum(CM)을 종균으로 3대 계대 배양을 하여 종균이 오염되었는지 확인하는 종균준비단계(S2); 및
    상기 종균준비단계에서 준비된 종균을 멸균된 Seed Starter(MRS broth) 1.5L에 활성화된 종균을 1% 접종한 후 15 시간 정치 배양하는 종균배양단계(S3); 및
    상기 S1 단계에서 추출한 도라지열수추출물에 종균배양단계에서 배양된 Lactobacillus plantarum(CM) 종균을 접종하여 37℃에서 15~60 시간 배양하는 본배양단계(S4); 및
    상기 도라지열수추출물의 산도가 pH 3.6 일 때 배양을 중지하는 배양중지단계(S5); 및
    상기 배양이 진행되지 않도록 100℃ 에서 20분간 살균하는 살균단계(S6); 및
    상기 살균된 배양액을 동결건조 또는 분무건조하는 건조단계(S7)을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법.
  2. 제1항의 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법으로 제조된 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물은 프로폴리스 열수 추출액과 혼합하여 피부에 바를 수 있는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 함유 연고 조성물.
  3. 제1항의 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법으로 제조된 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물과 엉겅퀴 추출물을 1대 0.1 내지 10 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효 조성물.
  4. 제3항의 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효 조성물에 프로폴리스 열수 추출액과 혼합하여 피부에 바를 수 있는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 함유 연고 조성물.
  5. 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법은
    세척 후 건조한 도라지 물을 사용하여 100℃ 2시간 추출하는 도라지열수추출단계(SA1); 및
    김치 발효에 사용하는 Lactobacillus plantarum(CM)를 종균으로 사용하는 종균준비단계(SA2); 및
    상기 종균준비단계에서 준비된 종균을 멸균된 Seed Starter(MRS broth)에 종균을 접종한 후 15 시간 정치 배양하는 종균배양단계(SA3); 및
    상기 S1 단계에서 추출한 도라지열수추출물에 종균배양단계에서 배양된 Lactobacillus plantarum(CM) 종균을 접종하여 37℃에서 15~60 시간 배양하는 본배양단계(SA4); 및
    상기 도라지열수추출물의 산도가 pH 3.6 일 때 배양을 중지하는 배양중지단계(S5); 및
    상기 배양이 진행되지 않도록 살균하는 살균단계(SA6); 및
    상기 살균된 배양액을 동결건조 또는 분무건조하는 건조단계(SA7)을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 도라지열수추출단계는 세척 후 건조한 도라지 27kg를 170L의 물을 사용하여 100℃ 2시간 추출, 최종 액상 원료 150L가 되게 추출하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 건조단계에서 건조된 도라지 발효물은 12.15Kg인 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법.
  8. 제5항의 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법으로 제조된 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물은 프로폴리스 열수 추출액과 혼합하여 피부에 바르는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 함유 연고.
  9. 제5항의 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 제조방법으로 제조된 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물과 엉겅퀴 추출물을 1대 0.1 내지 10 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효 조성물.
  10. 제9항의 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효 조성물에 프로폴리스 열수 추출액과 혼합하여 피부에 바를 수 있는 것을 특징으로 하는 면역과민반응에 의한 피부상태 개선 도라지 발효물 함유 연고 조성물.
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