KR102063897B1

KR102063897B1 - 발효 글루텐세이프 밀가루

Info

Publication number: KR102063897B1
Application number: KR1020160082704A
Authority: KR
Inventors: 김태윤
Original assignee: (주)미토스바이오
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2016-06-30
Publication date: 2020-01-08
Also published as: KR20180003186A

Abstract

본 발명은 글루텐세이프 밀가루에 관한 것으로서, 본 발명에 의하면, 발효 홍삼 복합물질 5 중량%와, 밀가루 95 중량%를 포함하며, 상기 발효 홍삼은 9증9포 홍삼과, 낫토, 진피를 혼합 발효한 복합 물질인 것을 특징으로 하는 발효 글루텐세이프 밀가루가 제공된다.

Description

발효 글루텐세이프 밀가루 {FERMENTED GLUTEN-SAFE WHEAT FLOUR}

본 발명 밀가루에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 대사촉진, 항당뇨, 항노화, 면역증진의 효능이 기대되는 발효 글루텐세이프 밀가루에 관한 것이다.

밀가루속 글루텐 성분의 부작용으로 크롬병이 발생하고 있으며, 이에 대한 우려 때문에 글루텐프리 밀가루로 만든 제품들의 소비가 확산되고 있다. 그러나 밀가루의 필수 성분으로 빵을 부풀게 하고 쫀득한 식감을 만드는 글루텐이 없으면, 빵맛을 느낄 수 없다. 뿐만아니라, 글루텐을 제거하거나 함량을 낮추면, 정제된 밀가루와 설탕, 버터에 의해 단백질 섭취가 부족해지고 탄수화물과 나트륨의 섭취량만 많아져 오히려 영양 불균형을 초래해 질병 유발가능성이 더 커질 수 있다.

등록특허공보 제10-1144471호(2012.05.11.)

본 발명의 목적은 빵맛을 살리기 위해 글루텐을 두면서, 글루텐의 부작용을 상쇄시킬 수 있는 글루텐세이프(gluten-safe) 밀가루를 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면에 따르면,

발효 홍삼 복합물질 5 중량%와, 밀가루 95 중량%를 포함하며, 상기 발효 홍삼은 9증9포 홍삼과, 낫토, 진피를 혼합 발효한 복합 물질인 것을 특징으로 하는 발효 글루텐세이프 밀가루가 제공된다.

본 발명에 의하면 앞서서 기재된 본 발명의 목적을 모두 달성할 수 있다. 구체적으로는, 발효 홍삼 복합물질 5 중량%와, 밀가루 95 중량%를 포함하며, 상기 발효 홍삼은 9증9포 홍삼과, 낫토, 진피를 혼합 발효한 복합 물질인 것을 특징으로 하는 발효 글루텐세이프 밀가루가 제공되므로, 빵맛을 살리기 위해 글루텐을 두면서, 글루텐의 부작용을 상쇄시킬 수 있다.

도 1 내지 도 20은 본 발명에 대한 도면임

이하, 본 발명의 바람직한 실시예의 구성 및 작용을 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 발효 글루텐세이프 밀가루는 발효 홍삼 복합물질 5 중량%와, 밀가루 95 중량를 포함한다.

발효 홍삼 복합물질은 9증9포 홍삼과, 낫토, 진피를 혼합 발효한 복합 물질이다. 홍삼, 낫토, 진피의 항암, 항당뇨, 항노화, 해독증진, 면역증진 효능은 뛰어난 것으로 세계적으로 연구되고 인정받고 있다. 본 발명에 따른 발효 홍삼은 각각 뛰어난 원료를 혼합하되, 단순 혼합이 아니라, 바실러스 서브틸리스균을 이용하여 혼합발효하고, 혼합 원료가 미생물에 의해 발효되어 변화생산된 혼합물 및 미생물에 의해 분비물과 혼합된 생리활성화 복합조성물이다.

예를 들면, 낫토키나아제는 특히 혈중 지방 및 콜레스테롤 분해로 혈액정화 효능이 우수하여 심혈관질병 예방에 뛰어난 것으로 인정받고 있는데, 여기에 홍삼의 진세노사이드 성분, 진피의 살베스트롤 Q40(Salvestrol Q40) 성분, 로얄제리의 R-물질성부(R-Factor) 등이 복합적으로 시너지 효과를 일으켜 기존의 독립원료 제품보다 우수한 효과를 보일 수 있다. 특히 미국의 건강전문잡지 헬스지(Health)가 선정한 세계 5대 건강식품에서 낫토, 김치, 요구르트 등 3가지가 발효식품인만큼 미생물을 이용한 발효의 프로바이오틱 건강효능은 매우 뛰어나다고 볼 수 있다.

본 발명의 핵심기술은 낫토와 9증9포 홍삼을 이용하여 독자개발한 홍삼 바실러스 서브틸리스(Red Ginseng Bacillus Subtilis) 우량종과 이 바실러스 미생물을 이용하여 제조하는 정통 9증9포 홍삼과, 이를 베이스 원료로 여러 생약원료들을 홍삼 바실러스로 혼합발효하는 기술이다. 바실러스란 일반적으로 대두를 낫토로 발효시킬 때 쓰는 미생물이지만, 홍삼에서 이 미생물을 배양하여 우량종균으로 만드는 경우는 종래에 찾아볼 수 없는 기술이다.

본 발명에서 정통 9증9포 홍삼은, 수삼을 세척하여 부직포 위에 배치하는 단계와, 콩을 삶아서 43~45℃의 발효실에 넣고 48시간을 발효시킨 다음 같은 양의 홍삼분말을 혼합하여 35~38℃의 발효실에 25시간 발효시키고 이를 55~60℃에서 건조시켜 분말한 것에 홍삼 바실러스균을 분무하여 접종하는 단계와, 홍삼 바실러스균이 접종된 것을 증기로 가열하고 건조시키는 것을 9회 반복하여 부직포 위에 배치하는 것을 특징으로 하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

9증9포 발효 홍삼은, 홍삼과 낫토를 혼합한 물질로 홍삼바실러스균을 배양하고 그 균을 이용하여 정통 9증9포 홍삼을 제조한 후, 이 홍삼을 다시 홍삼바실러스균으로 발효시킨 홍삼을 의미한다. 이러한 홍삼은 진세노사이드 함유율도 높고, 진세노사이드의 인체 흡수율도 높다.

종합적으로 본 발명에 따른 발효 글루텐세이프 밀가루는 크롬병 예방, 글루텐의 부작용 예방, 소화촉진, 대사촉진, 항당뇨, 항노화, 면역증진의 효능이 기대된다.

이하, 밀가루의 글루텐으로 발생되는 부작용을 억제하는 본 발명에 따른 복합단백질(GRB) 조성물 및 복합단백질의 면역조절강화 효과에 대한 연구 결과이다.

- 복합단백질(　unite protein)

홍삼에 바실러스를 배양한다고 Red Ginseng　Bacillus또는 RGB라고 합니다.

홍삼 청국장 또는 홍삼바실러스 , 발효한약재 등으로 표현하기도 합니다.

복합단백질(　RGB)은 여러 물질(인삼, 진피, 대두,) 등이 찌고 말리고 발효하는 과정에서 상호보완작용을 하여 얻어지는 복합물질로 시너지 효과를 기대할 수 있습니다.

세균 내독소로 면역 활성을 유도시킨 대식세포와 실험동물의 비장세포에서 면역조절 효능을 연구하여, 면역 조절능이 가장 우수한 용매추출법이 개발되어, 복합단백질(　RGB)을 밀가루에 첨가하여 글루텐으로 발생되는 부작용을 억제하는 밀가루를 만들어 인류의 식생활에 도움을 주고자 합니다.

진피(밀감껍질)에 들어있는 살베스트롤Q40은 세계가 주목하는 항암물질입니다. 살베스트롤Q40을 생산하기위한, 진피(밀감껍질)발효분야는 영국을 비롯하여 전 세계의 과학자들이 연구에 매진하고 있습니다. 영국레스터대학 약학대학의 훈 탄 박사는 맨체스터에서 열린 영국약학회의(BPC)에서 연구발표를 통해 "감귤 껍질에 있는 살베스트롤-Q40이라는 성분은 식물이 해충이나 곰팡이 등 외부 침입자를 퇴치하기 위해 만들어내는 피토알렉신(phytoalexin)의 일종으로 이 물질은 암세포에 들어가면 독소로 변해 암세포를 죽인다."라고 밝히고, 이를 대량생산하려면. 진피(밀감껍질)발효기술에 대한 많은 연구가 필요하다고 말했습니다.

약용작물학회지에 보면 양등은 감초에 식물유래 조효소액을 법제 처리하여 조효소액을 처리하지 않은 실험군에 비해 조효소액을 처리한 실험군에서 Liquiritin의 함량은 줄어 들고, 중금속 등의 해독에 효과가 있는 Liquiritigenin의 함량이 증가하는 것을 관찰하였음.

아토피 피부염은 특징적 임상증상을 갖고 있는 만성재발성의 습진성 질환으로 다양한 면역학적 이상을 갖고 있으며 면역학적 이상으로 인한 다양한 속발증상을 함께 갖고 있는 질환으로 보고 있고, 이러한 면역학적 이상은 면역계 발달 과정 중 비정상적 성숙으로 인해 Th2 반응에 치우친 생물학적 반응에 기인한다고 설명하고 있음. 면역력을 증강 시키는 한약재를 우수한 종균으로 발효시킨 발효한약으로 면역이상으로 인한 아토피와 알레르기성 비염을 치료하고 있으며 현재 매우 우수한 효과를 나타내고 있음.

한국 응용생명화학회지에 보면 우 등은 미생물을 이용하여 홍삼을 발효시키면 Rg1, Rh1, Rb1, Rb2 등과 같은 고분자의 일반사포닌들은 감소하고, Rg1(20S), Rg3(20S), Rg3(20SR), Rg5 등 저분자 사포닌이 증가한다고 발표하였음.

발효삼(醱酵蔘)은 면역결핍(Immunodeficiency)으로 인한 악성종양(癌)과 혈당증(糖尿)에 특효가 있고, 임상에서 무기력, 피로 등의 증상에 활용하면 빠른 효과를 보며, 수험생 보약으로도 좋은 반응을 보이고 있다. 당뇨 및 암 등의 난치병 치료시 훌륭한 면역증강제로도 활용되고 있음.

[개발 내용 및 방법]

제 1 절 개발 목표

□ 면역증강 효과를 극대화할 수 있는 RGB추출기술의 개발

여러 가지 유기 용제를 이용하여 물질을 추출하는 용매추출법을 활용하여 최적의 RGB추출기법을 마련함

내독소로 과면역반응을 유발한 대식세포에서 가장 월등한 산화질소(nitric oxide, NO) 저해효과를 나타내는 추출물을 스크리닝하여 최적 추출법으로 결정함.

대식세포 및 비장세포에서 면역조절 기능 규명함으로써 RGB원재료 추출물이 기능성 식품소재로서 가지는 우수성을 분자생화학적 방법으로 입증

세균 내독소로 면역 활성을 유도시킨 대식세포에서 nitric oxide, 사이토카인 분비에 대한 조절 효과 규명

NF-kappaB 신호전달 경로에서 면역조절 메카니즘에 대한 연구

실험동물의 비장세포에서 RGB 가 세포 증식능 및 사이토카인 분비에 미치는 효과 규명

제 2 절 과제개발 연구방법

□ 추출물의 제조

RGB를 주정(EtOH) 혹은 열수(H₂O)로 추출하였음.

주정 추출RGB 분말 1 kg 당 10 L의 주정에 담궈 72시간 동안 추출하였음. 추출액은 여과지(Whatman, No.2)로 여과한 후 60±2℃에서 회전 감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축하고 초저온냉동고((Nihon freezer, Japan)에서 동결한 후에 freezer dryer(Labconco, USA)에서 건조하였음. 고열수 추출물의 수율은 9.4 %였으며, 실험에 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였음.

열수 추출 RGB원재료 분말 1 kg 당 15 L의 물을 가한 후에 3시간동안 전탕하였음. 실온으로 식힌 열수 추출물은 filter paper(Watman, No.2)로 여과하였고, 주정추출물과 같은 방식으로 농축하고 동결건조하여 최종 열수 추출물을 준비하였음. 열수 추출물의 수율은 15.4 %였으며, 실험에 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였음.

□ 대식세포 배양

Murine macrophage cell line인 Raw 264.7 cells은 한국세포주연구재단 (Seoul, Korea)에서 구입하여 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin 및100 μg/ml streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였음. 실험과정의 모든 cells은 80~90%의 confluence에서 실험하였고, 15 passages를 넘기지 않은 cell만 실험에 사용하였음.

□ 실험동물의 사육

실험동물은 Balb/c mouse (5주령, 암컷)는 대한바이오링크 (음성, 한국)로부터 공급받아 1주일 동안 실험실환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 사육실 환경은 온도 20-23℃, 습도 50%, 12시간 간격으로 light/dark cycle을 유지하고, 사료 (Nestle Purina Petcare Korea, Seoul, Korea)와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였음.

□ 체중 및 비장 무게 변화량 조사를 위한 동물 실험

Balb/c 마우스를 각 군당 5마리씩 배정하여 5개의 group (CON, MTX, MTX+50, MTX+100, 100)을 만들었음. MTX (1 mg/kg/day)는 실험 개시 첫날부터 5일 동안, 시험물질인 RGB원재료 재 주정추출물 (50, 100 mg/kg/day)은 MTX 투여 4일 째 되는 날부터 시작하여 10일 동안 경구 투여하였음.

시험물질 투여전과 투여종료 익일에 마우스의 체중을 측정하였으며, 체중변화율은 개시체중 (initial body weight)에 대한 종료체중 (final body weight) 백분율로 구하였음. 비장 무게변화는 쥐를 희생시킨 후 비장을 때내 여과지로 장기 표면의 피를 없앤 후에 무게를 측정하고 이를 체중에 대한 상대적 장기 무게의 백분율로 나타내었음.

□ 비장세포 배양

Spleen cell은 실험동물로부터 적출한 비장을 일차 배양하여 실험에 사용하였음. 즉, 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 cell strainer (Nylon, BD falcon, USA)에서 압착하여 세포를 분리시켰으며, RBC lysis buffer로 적혈구를 제거한 후에 DMEM/F12 배지로 배양하였음.

□ MTT assay

Cell을 96 well plate에 5×10⁴ cells/well로 분주한 다음 RGB원재료 추출물을 농도별로 처치한 후에 37℃, 5% CO₂의 환경이 유지되는 배양기에서 24-48h 동안 culture하였음. MTT (0.1 mg/ml)는 well당 50 μl씩 넣고 4시간 incubation한 후 배지를 조심스럽게 제거하고 생성된 dark formazan crystals을 dissolving solution (DMSO)에 녹여 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였음.

세포생존율은 control cell에 대한 백분율로 나타내었음. [i.e. viability (% control) = 100×/(absorbance of treated sample)/(absorbance of control)].

□ WST-1 assay

배양조건은 MTT assay와 동일하며 세포배양이 끝난 후 Premix WST-1(Takara, Japan)을 well당 10 μl씩 더하여 2h 동안 반응하였음. WST-1에 의해 생성되는 formazan 색소는 수용성으로 배지에 녹아있음으로 잘 섞은 후에 440 nm에서 흡광도를 측정하였음. 세포생존율은 상기와 동일한 방법으로 나타내었음.

□ 산화질소(nitric oxide, NO)생성량 측정

Raw 264.7 cell을 LPS (1 μg/ml)로 activation하여 생성된 NO는 세포 배양액 중에 존재하는 NO₂ ^-의 형태로서 Griess 시약을 이용하여 측정하였음. 간략하게 설명하면 세포배양 상등액 50 μl와 Griess시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H₂O) 50 μl를 96 well plates에 혼합하고 암실에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)로 흡광도를 측정하였음.

NO의 농도는 sodium nitrate를 표준물질로 하여 얻은 standard curve를 사용하여 계산하였고 control에 대한 ratio로 나타내었음

□ Total cell lysates의 준비

배양 세포는 10 mM Tris-Cl(pH 7.4), 5 mM EDTA(pH 8.0), 130 mM NaCl, 1% Triton X-100), 0.2 M phenyl-methyl-sulfonyl fluoride, proteinase inhibitor cocktail을 함유하는 buffer로 녹였음. Cell lysates는 27-gauge needle로 3회 homogenizing하고 15분간 얼음에 방치한 후, 15,000×g에서 15 min분간 원심분리하여 cell debris를 제거하고 상등액을 취하여 total cell lysate로 사용하였음.

□ 핵분획의 제조

배양 세포를 ice cold PBS로 2회 세척하고, 이를 PBS와 함께 microtube에 넣은 후, 2,000×g로 5분간 원심분리하였음. 이후 PBS를 제거하고, 10 mM HEPES (pH 7.9), 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluoride)를 포함하는 buffer를 넣어 10분간 얼음위에 방치한 후 7,200×g로 5분간 원심분리한 후에 상등액을 제거하였음. Crude nuclei가 포함된 pellet은 20 mM HEPES(pH 7.9), 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 1 mM PMSF를 포함하는 extraction buffer를 50 μl를 넣고 30분간 얼음위에 방치한 후에 15,800×g로 10분간 원심분리하였음. 상등액을 조심스럽게 회수하여 NF-kappaB (NF-κB) 발현 측정을 위한 핵분획으로 사용하였음.

□ 단백질의 농도 측정

단백질 농도는 Micro BCA protein assay reagent kit (Pierce, Rockford, IL, USA) 및 Bradford protein assay dye reagent (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도로 측정하였고 bovine serum albumin (BSA)를 표준물질로 하여 standard curve를 작성한 후에 표준곡선에 따라 정량하였음.

□ Immunoblot analysis

Total cell lysate 및 핵분획물은 30~50 μg의 단백질 양으로 취하여 10% gel의 전기영동으로 단백질을 분리하였고 nitrocellulose membrane으로 이전하였음. Nitrocellulose membrane은 iNOS, COX-2, I-κBα, NF-κB, Actin 등의 1차 antibody를 가하여 반응시킨 후에 ECL chemiluminescence detection kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)를 사용하여 면역반응성 단백질을 확인하였음.

□ Cytokine 측정

Cytokine (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12p40, IL-1α)은 ELISA Kit (Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였으며, 실험의 방법은 manufacturer's instruction에 따라 수행하였음. 배양 배지는 수거하여 cytokine으로 coating된 96 well plate에 배지를 50 μl 씩 첨가하여 상온에서 2시간 동안 배양하였음. 50 μL의 biotinylated antibody reagent를 각각의 well에 처리하여 1시간동안 상온에서 반응시킨 후 3회 100 μl의 streptavidin-HRP solution을 각각의 well에 첨가하여 1시간 동안 상온에 반응하였음. 각각의 well에 TMB substrate 100 μl를 처리하고 30분간 반응시키고 stop solution 100 μl를 처리한 후 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였음.

□ PGE₂의 측정

배양 배지속의 PGE₂를 측정하기 위하여 시판 ELISA kit(RnD Systems, MN, USA)를 사용하였음. 배양 배지는 coating된 96 well plate에 배지를 100 μl씩 첨가하고 primary antibody solution과 PGE₂ conjugate를 50 μl씩 각각의 well에 넣은 후 상온에서 2시간 동안 배양하였음. Washing buffer로 4회 세척하고 200 μl의 substrate solution에 30분간 반응시키고 stop solution을 50 μl를 처리한 후 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였음.

[연구 결과]

Part. 1. RGB 의 추출조건 확립

RGB 는 주정(EtOH)과 열수(H₂O)로 추출하여 준비하였으며 각각의 수율은 9.4%, 15.4%였음.

LPS (1 μg/mL)로 면역반응을 과도하게 유도시킨 대식세포 Raw264.7에서 각각의 추출물(25, 50, 100 μg/mL)이 nitric oxide(NO) 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 주정추출물에서 과도하게 생성된 NO를 저해하는 효과가 확인되었음 (도 1a). 하지만 열수추출물은 실험에 사용된 농도에서 어떤 저해 효과도 나타내지 못했음 (도 1b).

RGB 주정추출물에 의한 NO 저해효과가 세포독성에 의한 세포수 감소에 기인하는 것은 아닌지 확인하기 위해 MTT assay로 생존세포수를 조사하였음. 실험시료는 최고농도인 100 μg/ml부터 2배씩 dilution하여 2.5 μg/ml까지의 농도 범위를 사용하여 48시간 동안 배양하였으며 MTT assay 결과, 실험에 사용한 농도 (25-100 μg/ml)에서 세포 독성이 관찰되었음. 따라서, Fig. 1에서 얻은 실험결과는 발효한약재 주정추출물의 효과 혹은 단순 세포수 감소에 기인한다고 설명되어질 수 있음.

이에, 저농도 범위에서 세포독성을 유발하지 않는 농도 범위를 조사하였으며, 도 2에서 나타난 결과로부터 RGB 주정추출물이 세포독성을 유발하지 않는 농도로 0.3, 1, 3 μg/ml을 결정하여 모든 실험에 사용하였음 (도 2). 반대로 열수추출물은 1000 μg/ml의 고농도에서도 세포독성이 전혀 관찰되지 않았기 때문에 100, 300, 1000 μg/ml을 실험농도로 결정하였음 (도 3).

세포독성을 유발하지 않는 농도 범위 내에서 각 추출물이 NO 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 주정추출물은 농도의존적인저해 효과를 보였으나 열수추출물은 1000 μg/ml의 농도에서만 저해활성이 나타났음. 따라서, RGB 는 주정(EtOH)으로 추출물을 준비하는 것이 면역조절 작용에 효과적인 추출법이라 할 수 있겠음.

Part 2. LPS로 과도 면역반응을 유도한 대식세포에서 RGB주정추출물의

면역조절 효과 및 작용 기전 규명

□ RGB 주정추출물이 LPS로 과다 생성된 NO에 미치는 영향

세포독성을 유발하지 않는 농도에서 각 추출물의 NO 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 주정추출물은 저농도(0.3, 1, 3 μg/ml)에서 농도의존적으로 유의한 NO 생성 저해효과를 나타내었음 (도 4a). 하지만 열수추출물은 1000 μg/ml의 농도에서 NO 생성 저해 효과가 관찰되었으며, 저해율도 0.3 μg/ml의 주정추출물 보다 현저히 낮게 관찰되었음 (도 4b).

□. RGB 주정추출물이 LPS로 과다 생성된 PGE₂에 미치는 영향

Arachidonic acid로부터 PGG₂, PGH₂를 거쳐 생성되는 PGE₂는 염증, 부종, 통증 및 발열 등의 증상을 일으키며, 염증 반응시 PGE₂는 COX-2에 의해 생성되며 혈관을 확장시키고 혈관투과성을 증가시켜 백혈구의 염증 부위로의 화학주성을 증가시킴.

본 실험에서 LPS는 PGE₂의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, RGB 주정추출물( 0.3, 1, 3 μg/ml)에 의해 농도의존적으로 PGE₂ 생성이 억제되었음 (도 5).

□ RGB 주정추출물이 LPS로 유도된 Raw 264.7 cell의 iNOS 및 COX-2의 발현에 미치는 영향

NO는 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase (NOSs)를 경유하여 생성되므로, RGB 주정추출물의 NO 생성 억제가 iNOS 단백질의 발현 감소에 기인하는지를 조사하기 위하여 western blot analysis를 실시하였음. 그 결과, LPS 처치시에는 iNOS 단백질의 발현이 유의하게 증가되었으나, LPS에 주정추출물을 처치한 실험군에서는 iNOS의 발현량이 농도의존적으로 유의하게 감소하였음 (도 6a).

PGE₂와 같은 프로스타글란딘의 생성에 기여하는 효소는 cyclooxygenase (COX)로 COX-1과 COX-2 두 가지의 isoform이 알려져 있음. COX-1은 신혈관 확장으로 신기능을 유지시키고 위장의 점막을 보호하는 작용을 하는 인체에 유익한 ‘housekeeping' protein이지만, COX-2는 LPS등에 의해 유도되어 과도한 PGE₂를 생성하여 염증을 매개하는 효소임. Western blotting 결과, COX-2의 발현도 역시 LPS 처리에 의해 증가되었으나, RGB 주정추출물에 의해 줄어듬을 확인하였음 (도 6a).

RGB 주정추출물 단독 처치는 iNOS 발현에 전혀 영향을 미치지 않았고, COX-2의 발현은 약간 증가하였으나 그 정도는 LPS에 비해 미비하였음 (도 6b).

□ RGB 주정추출물이 LPS로 증가된 사이토카인 (cytokine) 생성에 미치는 영향

RAW 264.7 세포에서 LPS에 의한 cytokine의 억제 효과를 확인하기 위해 TNF-α, IL-1β, IL-6 생성량을 ELISA Kit를 사용하여 확인하였음 (도 7).

TNF-α는 macrophage와 mast cell 등에서 분비되며, LPS반응의 주요 매개체로서 만성염증 등의 면역반응의 수행에 관여하고 있음. 본 연구에서 LPS는 TNF-α의 분비를 증가시켰으며, 발효한약재 주정추출물은 1, 3 μg/ml의 농도에서 TNF-α의 생성량을 유의하게 감소시켰음 (도 7a).

IL-1β는 T-cell의 활성화, B-cell의 성숙, NK cell의 activity를 활성화하는 cytokine임. LPS에 의해 증가되어졌던 IL-1β의 분비가RGB 주정추출물에 의해 농도의존적으로 유의성 있게 감소함을 확인하였음 (도 7b).

IL-6는 B-cell이 plasma세포로 분화되도록 촉진시키고 항체의 분비를 자극하는 cytokine으로 염증 부위에서 항상 높은 수치를 나타내는 것으로 알려져 있음. 본 실험에서 LPS는 IL-6를 급격하게 증가시켰으며, 실험에 사용한 전농도 (0.3, 1, 3 μg/ml)에서 IL-6의 생성량을 유의하게 감소시켰음 (도 7c).

□ NF-κB 신호전달계를 통한 RGB 주정추출물의 면역조절 작용 기전 규명

NF-κB는 iNOS와 COX-2의 발현에 관여하는 것으로 알려진 전사조절인자로 apoptosis의 억제, cell cycle의 조절, oncogenesis 등과도 관련이 있으며, TNF-α 등의 cytokine의 발현에도 관여하는 것으로 보고되어 있음. 일반적인 상태에서 NF-κB는 세포질에서 억제단백질인 I-κB와 결합하여 비활성형으로 존재함. I-κB 단백질의 종류는 I-κBα, I-κBβ, I-κBε등으로 알려져 있지만, 세포에서 가장 풍부한 NF-κB의 억제단백질은 I-κBα임. LPS 등의 자극에 의해 NF-κB의 신호전달계가 작동되면 I-κB의 인산화가 진행되면서 degradation됨. I-κB가 떨어져 나가 자유로워진 NF-κB는 핵으로 전위하여 COX-2, iNOS 및 cytokine 등의 전사를 유도함.

RGB 주정추출물은 iNOS 및 COX-2의 발현을 저해하는 효과를 나타냈기 때문에 NF-κB의 신호전달계에 연관이 있을 것으로 사료되어 western blot을 실시하여 total I-κBα 단백질 및 핵 내의 NF-κB 단백질 발현량을 조사하였음 (도 8)

I-κBα는 LPS 처리에 의해 세포내에서 급격하게 감소하였으나, RGB 주정추출물에 의해 감소정도가 회복되는 것을 확인할 수 있었음. 그리고 핵분획에서의 NF-κB는 LPS 처치에 의해 유의하게 증가하였으나, RGB 주정추출물에 의하여 NF-κB량이 유의성있게 감소하였음

RGB주정추출물의 단독 처치에 의한 I-κBα 및 NF-κB의 발현량 변화는 관찰되지 않았음 (도 8).

이러한 결과는 RGB 주정추출물이 I-κBα의 degradation을 억제하여 NF-κB와 결합하게 함으로써 NF-κB가 핵으로 전위되는 과정을 저해함을 나타냄. 전체적으로는 RGB 주정추출물이 NF-κB 신호 전달계를 방해함으로써 NO, PGE₂, cytokine 등의 면역인자들을 조절한다고 설명할 수 있음 (도 9).

Part 3. 비장세포에서 RGB 주정추출물의 면역세포 증식 및 사이토카인 조절 효과 규명

□ 비장세포에서 RGB 주정추출물의 세포 증식 효과

RGB 주정추출물이 비장세포의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 다양한 농도 (0.3 ~ 100 μg/ml)의 발효한약재 추출물을 처치하여 48시간 동안 배양시킨 후에 살아있는 세포수를 비색법 (MTT 혹은 WST-1 assay)으로 측정하였음.

주정추출물은 비장세포 증식효과를 나타내었으며 특히, 10 μg/ml의 농도에서 가장 높은 세포 증식 효과가 관찰되었음 (도 10). 이는, MTT assay와 WST-1 assay에서 동일하게 확인된 결과로 향후 모든 실험에서 10 μg/ml의 농도를 선택하여 사용하였음.

□ Methotreaxate (MTX)를 처치한 비장세포의 증식에 RGB 주정추출물이 미치는 영향

MTX는 면역억제제로서 800 μg/ml의 농도에서 비장세포의 증식을 억제한다고 보고가 되어져 있음 (J Ethnopharmacol. 84: 193-198, 2003). 본 실험에서 비장세포의 성장을 저해시키는 MTX의 농도를 결정하기 위해 0.4, 0.8, 1.6, 2 mg/ml의 농도로 48 h 동안 배양한 결과, 2 mg/ml의 농도에서 비장세포 증식이 저해됨을 확인하였음 (도 11a).

2 mg/ml의 MTX에 의한 세포 성장 억제는 10 μg/m의 . RGB 주정추출물에 의해 어느 정도 회복되었음. MTX는 control에 비해 60%의 세포 생존율을 보인 반면, RGB 주정추출물을 함께 배양하였을 때 72%까지 향상되었음 (도 11b).

□ Methotreaxate (MTX)를 처치한 비장세포의 cytokine level에 . RGB 주정추출물이 미치는 영향

IL-12는 human T cell 및 NK cell을 stimulation하는 분자로 발견되었으며, p35와 p40 두 가지의 subunit으로 구성되어 있는 heterodimer임. IL-1은 IL-2, IL-4, IFN-γ 등의 분비를 유도시키고 B 림프구가 pre B 림프구로부터 성숙하는 단계에 관여하는 cytokine임.

기 발표된 연구 논문 결과에 의하면 IL-1α와 IL-12p40은 mouse splenocytes에서 MTX 처치에 의해 유전자 발현이 저해됨이 보고되어 있음 (J Ethnopharmacol. 84: 193-198, 2003).

본 실험에서도 IL-12p40은 control을 1로 두었을 때 2 mg/ml의 MTX에 의해 0.84 ± 0.04로 생성량이 감소되었으나 발효한약재 주정추출물에 의해 1.28 ± 0.11의 수준으로 cytokines 생성량이 회복되었음 (도 12a). 반면에, IL-1α는 MTX와 RGB 주정추출물에 의해 변화를 보이지 않았음 (도 12b)

□ LPS 존재 하에서 비장세포의 증식에 RGB 주정추출물이 미치는 영향

분리한 비장세포에 lymphocyte mitogen을 처리하지 않은 control의 세포생존율을 100%로 하였을 때, B 임파구의 mitogen으로 작용하는 LPS를 처치했을 때 비장세포 증식율을 174 ± 19%까지 증가시켰음. LPS와 RGB

주정추출물을 함께 처치하였을 때 207 ± 18%의 세포 증식율을 나타내었음 (도 13). 이러한 결과는 RGB 주정추출물이 비장세포 (B lymphocyte)의 세포생존율을 강력하게 증가시켜 면역능을 활성화시킬 수 있음을 보여주는 것임.

□ LPS 존재 하에서 비장세포의 pro-inflammatory cytokines의 생성에 RGB 주정추출물이 미치는 영향

Pro-inflammatory cytokine인 TNF-α (도 14a)와 IL-6 (도 14b)는 LPS 처치에 의해 크게 증가하였지만 발효한약재에 의해 감소하였음. 이는 비장세포에서 . RGB 주정추출물이 염증매개성 사이토카인을 저해함으로써 면역조절 작용을 할 수 있음을 시사하는 것임.

□ 면역 억제제인 MTX를 투여한 mouse에서 RGB 주정추출물이 체중 및 비장 무게 변화에 미치는 영향

면역 억제된 실험동물에서 . RGB 주정추출물이 체중 및 비장 무게 변화에 미치는 효과를 살펴보기 위해 도 15와 같이 실험하였음. 즉, MTX (1 mg/kg/day)는 5일동안, 주정추출물 (50, 100 mg/kg/day)은 MTX 투여 4일 째 되는 날부터 시작하여 10일 동안 경구 투여하였음. 익일에 실험동물은 체중을 측정하였고 복개하여 비장을 적출한 후 무게를 측정하였음. 체중변화는 실험 개시일에 측정와 체중과 실험 마지막 날의 체중을 백분율로 표기하였고, 상대적인 장기 무게는 비장의 무게를 마지막 날 체중으로 나누어 백분율로 나타내었음.

MTX에 의해 체중은 감소한 반면, 비장 무게는 증가하였음. 체중변화는 control에서 103.1 ± 0.2%이었으나 MTX 처치에 의해 92.5 ± 11.9%로 감소했음. RGB 주정추출물의 투여가 MTX에 의해 감소된 체중을 회복시키지 못했음. 하지만 MTX에 의해 크게 증가하였던 비장무게는 . RGB 주정추출물의 투여에 의해 감소되었음 (도 16 및 도 20의 표). Control의 상대적 비장무게 (relative spleen weight)가 0.36 ± 0.04%였을 때, MTX는 0.63 ± 0.04%, MTX를 처치한 후에 50 혹은 100 mg/kg의 주정추출물은 각각 0.39 ± 0.09%, 0.37 ± 0.11%였음.

도 17은 PC12 세포에 RGB 의한 신경 돌기에 미치는 영향을 보여 줌. NGF(50ng/ml)와 NGF+RGB를 첨가한 후 1 일당 최대 신경 돌기의 평균 길이를 비교하였음.

RGB : 2.5g / 100ml (증류수) -> 가열 추출 후 2.5g / 50ml (증류수)

2000rpm에서 원심 분리 후 0.22μm의 미니뽀아로 여과 멸균

이를 20μl / ml (배양액 DMEM) + NGF (50ng / ml 배양액 DMEM)에서 사용

결과 : NGF + RGB는 NGF만보다 신경 돌기가 더 잘 자라있음을 확인할 수 있었음

DMEM

가장 일반적으로 사용되는 animal cell culture용 media. 동물세포배양용 배지. 이름은 Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium.의 약자.

NGF ( 신경생장인자 )

[ nerve growth factor 神經生長因子 ]

NGF로 약기. 신경조직의 분화, 생장 활성을 나타내는 시토카인성 펩티드인자.

도 18과 도 19는 홍삼 바실러스 식품의 암 치료 및 예방 효과 시험의 결과를 보여 줌

홍삼 바실러스(RGB)식품의 암 모델에서의 암 치료 및 예방 효과를 관찰한 결과, 체중 변화 관찰에서 양성 대조군 23.31±1.41g과 비교 시 치료형 그룹 중 Xeloda그룹이 22.04±0.36g으로 감소하였다. Tumor size를 확인한 결과, 치료형 그룹에서 양성 대조군은 2027.5±611mm2이며 Xeloda를 섭취한 그룹의 경우 1979±1567mm2, HB-DW그룹 1260±374mm2, HB-Xel 그룹 874±164mm2로 HB-Xel를 섭취한 그룹이 Tumor size가 가장 작게 나타났다.

예방형 그룹에서는 양성 대조군이 1437±396mm2, HB-DW그룹 361±74mm2, HB-6W그룹 60±87mm2로 HB-6W그룹의 Tumor size가 가장 적게 나타났다.

통계적 유효성의 경우 치료형 그룹에서 Xeloda그룹(P < 0.005), HB-DW그룹 (P < 0.00001),HB-Xel그룹 (P < 0.01)로 치료형 그룹 전체에서 통계적인 유효성을 보였으며, 예방형 그룹의 경우 HB-DW그룹 (P < 0.001), HB-6W그룹 (P < 0.002) 모두 통계적인 유효성을 보였다.

치료형 그룹에서 약제 투여 그룹 중 Xeloda만을 섭취한 그룹의 Tumor가 가장 크게 나타났으며, HB과 Xeloda를 병행하여 섭취한 그룹에서 Tumor의 크기가 가장 작게 나타났다.

예방형 그룹의 경우 HB과 육각수를 같이 섭취한 그룹의 Tumor의 크기가 가장 적게 나타났다. 위와 같은 소견을 종합해 볼 때 HB만 투여한 그룹보다 Xeloda와 HB를 같이 섭취할 경우 더 효과가 있는 것으로 판단되며 HB를 투여하지 않은 그룹보다 HB를 투여한 그룹에서 암 예방 효능이 향상되는 결과를 보였다.

이상의 결과로 보아, 본 시험조건에서 시험물질(HB)이 암 생성의 억제와 생성된 암 성장을 저해하는 예방의 효과가 있는 것으로 사료된다.

Claims

발효 홍삼 복합물질 5 중량%와, 밀가루 95 중량%를 포함하며,
상기 발효 홍삼 복합 물질은 9증9포 홍삼, 낫토 및 진피를 혼합 발효한 것을 특징으로 하는 발효 글루텐세이프 밀가루.
제1항에 있어서, 상기 발효 홍삼 복합물질은 홍삼 바실러스균(Red Ginseng Bacillus)을 이용하여 발효시키는 것을 특징으로 하는 발효 글루텐세이프 밀가루.
제1항에 있어서, 상기 발효 홍삼 복합물질은 9증9포 홍삼, 낫토 및 진피가 홍삼 바실러스균에 의해 발효되어 생산된 혼합물 및 상기 홍삼 바실러스균의 대사산물을 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 글루텐세이프 밀가루.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 홍삼 바실러스균은, 콩을 삶아서 43~45℃의 발효실에 넣고 48시간 동안 발효시킨 다음, 상기 발효시킨 콩과 동일한 양의 홍삼분말을 혼합하여 35~38℃의 발효실에서 25시간 동안 발효시키고, 상기 발효시킨 혼합물을 55~60℃에서 건조시켜 분말화한 것을 특징으로 하는 발효 글루텐세이프 밀가루.
제1항에 있어서, 상기 9증9포 홍삼은 다음 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것을 특징으로 하는 발효 글루텐세이프 밀가루:
(a) 수삼을 세척하여 부직포 위에 배치하는 단계;
(b) 상기 수삼에 홍삼 바실러스균을 분무하여 접종하는 단계; 및
(c) 상기 홍삼 바실러스균을 접종한 수삼을 증기로 가열하고 건조시키는 것을 9회 반복하는 단계.