KR20220102354A - 데커시놀을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

데커시놀을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 데커시놀(decursinol)을 유효성분으로 포함하는 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 고혈압의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 난용성인 데커시놀 이 혈관내피세포 과도증식억제에 의한 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 전립선비대증, 당뇨성 고혈압을 개선하는 것을 확인하고, 이를 이용해 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 전립선비대증, 당뇨성 고혈압 예방 또는 치료용 조성물의 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

데커시놀을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for Preventing or Treating of Disease Caused by Hyper-proliferation of Vascular Smooth Muscle Cell Comprising Decursinol as Active Ingredient}
본 발명은 데커시놀(decursinol)을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식 억제용 조성물에 관한 것이다.
인구 노령화는 세계적으로 중요한 사회적 이슈 중의 하나로, 고령 인구의 급격한 증가와 함께 노인성 질병 또한 급증하고 있어, 이에 따른 의료비 증가를 해결해야 하는 필수적인 사회문제로 대두되고 있다(조맹제, 2009). 특히 혈관 평활근세포의 과다증식은 동맥경화 병변 진행의 핵심 요소이다. 당이 과다 노출되면 혈관내피세포 기능장애가 유도되고 혈관 평활근세포가 과도증식하여 당뇨성 고혈압을 유발한다. 이와 함께 관상동맥의 평활근세포가 과도하게 증식하면 협심증을 유발하게 되고, 심할 경우에는 스탠트 삽입으로 치료를 하게된다. 이런 질병들은 삶을 질을 낮추고 위험도를 높이는 심각한 질병이다. 또한 심혈관계 질환은 과거에 비하여 높은 사망원인으로 분석되고 있으며 사망원인의 50%에 육박하는 것으로 발표되었다.
이에 대한 근본적인 치료법으로는 혈관 평활근의 과도증식을 막는 것으로, 혈관 내피세포가 손상을 받으면 이를 신호전달을 통하여 인식하게 되고 이후에 평활근의 과도 증식이 일어나는데 이에 대한 성장억제 또는 성장제어가 필요하다.
한국공개특허 제10-2010-0047544호에는 참당귀 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이 기재되어 있다. 참당귀는 뿌리를 진통, 항암, 신장 독성경감, 간 기능 개선, 당뇨성 고혈압 치료, 혈액순환 개선 등 다양한 질환에 대한 약재로 사용하고 있다. 당귀의 함유 성분으로는 데커신(decursin), 데커시놀 안젤레이트(decusinol angelate), 노다케닌(nodakenin), 엄벨리페론(umbelliferon), β-시토스테롤(β-sitosterol), α-피넨(α-pinene), 리모넨(limonene) 등이 알려져 있다.
한편, 데커시놀(decursinol)은 데커신, 데커시놀 안젤레이트와 함께 당귀의 생리활성 성분 중의 하나로, 해열 진통효과, 패혈증쇼크 방지, 위점막보호작용, 아토피피부염 예방, 암세포 억제, 신경독성에 대한 보호 등의 효능이 있는 것으로 밝혀졌다. 데커시놀은 당귀 뿌리 내에서 극히 소량 존재하나 참당귀의 주성분인 데커신(decursin)이나 데커시놀 안젤레이트(decursinol angelate)를 염기로 가수분해하여 대량으로 높은 순도로 얻을 수 있다. 본 발명자는 고순도의 데커시놀의 생체 내 효과를 확인하는 과정에서 본 발명을 완성하였다.
종래선행기술인 한국공개특허 제10-2004-0079265호에는 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트를 함유하는 혈관질환예방 또는 치료용 혈관이완제가 기재되어 있으며, 한국등록특허 제1837479호에는 홍삼 추출물, 당귀 추출물 및 진피 추출물을 혼합한 혼합물을 포함하는 혈관 평활근 세포의 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 조성물이 기재되어 있으나, 데커시놀의 혈관 평활근 세포 증식 억제 효과는 기재되어 있지 않다.
한국등록특허 제2028334호에는 한약재 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 의존성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물이 기재되어 있으며, 한국공개특허 제10-2019-0052909호에는 어성초추출물 및 참당귀추출물을 포함하는 전립선비대증 치료조성물 및 그 제조방법이 기재되어 있으나, 본 발명의 데커시놀의 혈관 평활근 세포 증식 억제 조성물과는 그 구성 및 효과에서 차이가 있다.
한국공개특허 제10-2010-0047544호, 참당귀 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관평활근세포 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물, 2010. 05. 10. 공개. 한국공개특허 제10-2004-0079265호, 데커신 또는 데커시놀 안젤레이트를 함유하는 혈관질환예방 또는 치료용 혈관이완제, 2004. 09. 14. 공개. 한국등록특허 제1837479호, 홍삼 추출물, 당귀 추출물 및 진피 추출물을 혼합한 혼합물을 포함하는 혈관 평활근 세포의 이상 증식성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 2018. 03. 06. 등록. 한국등록특허 제2028334호, 한약재 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 의존성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 2019. 09. 27. 등록. 한국공개특허 제10-2019-0052909호, 어성초추출물 및 참당귀추출물을 포함하는 전립선비대증 치료조성물 및 그 제조방법, 2019. 05. 17. 공개.
Lee Y.Y., et al., Platelet anti-aggregatory effects of coumarins from the roots of Angelica genuflexa and A. gigas, Arch. Pharm. Res., 26(9), 723-726, 2003.
본 발명의 목적은 데커시놀(decursinol)을 유효성분으로 하는 혈관평활근의 성장의 억제용 조성물을 제공하는 데 있다. 또한, 이를 통하여 혈관평활근의 과도한 성장에 기인한 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 전립선비대증, 당뇨성 고혈압의 치료 조성물 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 데커시놀을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식 억제용 조성물을 제공한다. 상기 평활근세포 증식 억제용 조성물은 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 전립선비대증, 당뇨성 고혈압의 치료용으로 이용될 수 있다.
상기 평활근세포 증식 억제용 조성물은 데커시놀에 계면활성제를 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 제1단계; 상기 1차 혼합물에 에탄올을 넣은 후, 수용성 키토산을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 제2단계; 상기 2차 혼합물에 염기성 아미노산 및 정제수를 첨가하여 녹이고, pH가 8.6이 되도록 맞추어 3차 혼합물을 제조하는 제3단계; 및 상기 3차 혼합물을 멸균 처리하는 제4단계;를 포함하는 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.
상기 제1단계의 계면활성제(detergent)는 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween-80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테레이트(polyoxythylene sorbitan monostearate, Tween-60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미페이트(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, Tween-40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20), 트리톤 X-100(triton X-100), 및 노닐페녹시폴리에톡실에탄올(nonyl phenoxypolyethoxylethanol, NP-40)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 제2단계의 수용성 키토산은 분자량 20,000 이하로 구성된 키토산일 수 있다.
상기 제3단계의 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 혈관평활근 과도 성장억제는 고혈당에 의한 증식 억제일 수 있다.
본 발명의 평활근세포 증식 억제용 조성물은 혈관내피세포 과도 성장에 의한 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 전립선비대증, 당뇨성 고혈압의 개선용 건강기능식품으로 제조될 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
상기 당귀 추출물은 당귀를 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 아세톤, 헥산, 디클로로메탄 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출하여 얻을 수 있으며, 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등일 수 있다. 바람직하게는 에탄올이다.
또한, 상기 당귀 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물로 재분획한 분획물일 수 있으며, C1 내지 C4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등일 수 있다.
상기 데커시놀은 당귀 추출물에 염기성 용액을 가하여 열분해 시킨 후, 산성 용액으로 중성화시켜 분리할 수 있다.
상기 염기성 용액은 KOH, NaOH 또는 이들의 혼합물 일 수 있으며, 바람직하게는 KOH이다. 그러나 이에 한정되지 않는다.
상기 산성 용액은 HCl, HNO3, H2SO4 또는 이들의 혼합물 일 수 있으며, 바람직하게는 HCl이다. 그러나 이에 한정되지 않는다.
한편, 본 발명의 데커시놀은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 합성될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있다.
상기 제제는 데커시놀에 계면활성제를 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 제1단계; 상기 1차 혼합물에 에탄올을 넣은 후, 가용성 키토산을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 제2단계; 상기 2차 혼합물에 염기성 아미노산 및 정제수를 첨가하여 녹이고, pH가 8.6이 되도록 맞추어 3차 혼합물을 제조하는 제3단계; 및, 상기 3차 혼합물을 멸균 처리하는 제4단계; 를 통해 가용화시킨 데커시놀을 포함할 수 있다.
상기 가용화(solubilization)는 물에 잘 녹지 않은 물질의 용해도가 증가하는 현상을 말하는 것으로, 난용성 물질인 본 발명의 데커시놀의 용해도를 높이기 위해 상기 가용화 방법을 이용할 수 있다.
상기 제1단계의 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미페이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 트리톤 X-100, 및 노닐페녹시폴리에톡실에탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 계면활성제는 난용성 물질 대비 0.01중량% 이상으로 첨가될 수 있다.
상기 제2단계의 수용성 키토산은, 키토산의 용해성을 증가시키고, 균일성을 높이기 위한 것으로, 분자량 20,000 이하를 이용하여 녹이는 단계; 를 통해 제조할 수 있다.
상기 수용성 키토산은 약학 조성물을 기준으로 0.1~10%[w/v]가 포함될 수 있다. 가용성 키토산의 함량이 0.1% 미만일 경우는 분산력을 부여하기 어렵고 실질적인 효과가 나타나지 않으며, 10%를 초과할 경우에는 과도한 점성으로 오히려 균일성이 떨어지며, 제조용량이 증가하면 혼합하기도 어렵고, 경제적으로도 바람직하지 못하다.
상기 제3단계의 염기성 아미노산은 용해 보조제로 활용하는 것으로, 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 바람직하게는 아르기닌 또는 라이신이다.
상기 염기성 아미노산은 약학 조성물을 기준으로 0.1~4%[w/v]가 포함될 수 있다. 염기성 아미노산의 함량이 0.1% 미만일 경우에는 용해성을 보조하기가 어렵고 실질적인 효과가 나타나지 않으며, 4%를 초과할 경우에는 과도한 점성으로 인해 겔화가 될 수 있으며, 경제적으로도 바람직하지 못하다.
본 발명의 평활근세포 증식 억제용 조성물은 혈관내피세포 과도 성장에 의한 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 전립선비대증, 당뇨성 고혈압의 치료를 목적으로 한약학 조성물로 제조될 수 있다.
상기 약학 조성물은 상기 데커시놀이 전체 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001 내지 40중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 액제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 감미제, 산미제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 컴파운드 K 및 데커시놀에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테라인산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제, 산미제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 제제는 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 및 피부 도포에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명의 평활근세포 증식 억제용 조성물은 혈관내피세포 과도 성장에 의한 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 전립선비대증, 당뇨성 고혈압의 개선용 건강기능식품으로 제조될 수 있다.
상기 건강기능식품은 상기 데커시놀에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 혈관평활근 과도성장 억제로 통한 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 전립선비대증, 당뇨성 고혈압의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 데커시놀은 전체 식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001중량% 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001중량% 내지 30중량%, 가장 바람직하게는 0.001중량% 내지 10중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명은 데커시놀(decursinol)을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식 억제용 조성물에 관한 것으로, 평활근세포의 과도 증식에 의한 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 전립선비대증, 당뇨성 고혈압의 예방 또는 치료에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 데커시놀(Decursinol) 정제물의 TLC 분석결과이다. Lane 1: 본 발명에서 사용한 99% 이상의 데커시놀. Lane 2: 참당귀 추출물. Lane 3: 참당귀 추출물의 1차 정제물. Lane 4: 참당귀 추출물의 2차 정제물.
도 2는 표준품 데커시놀 (A) 및 본 발명의 정제 데커시놀(B)의 NMR 분석 결과이다.
도 3은 5.5 및 30 mM 글루코오스 조건에서 혈관평활근세포 A10 cell의 증식을 보여주는 그래프이다.
도 4는 데커시놀이 5.5 및 30 mM 글루코오스 조건에서 혈관평활근세포 A10 cell의 증식에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 데커시놀이 5.5 및 30 mM 글루코오스 조건에서 혈관평활근세포 A10 cell 내 phospho-protein kinase C (p-PKC)의 발현에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 고당의 삼투압 환경이 혈관평활근세포 A10 cell의 증식에 영향을 미치는지를 확인한 그래프이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 실시예 1. 데커시놀의 제조>
실시예 1-1. 당귀 추출물의 제조
본 발명에서 사용된 당귀는 한국산 및 북한산 참당귀를 이용하였다. 참당귀를 40메시(mesh) 이하로 잘게 분쇄하여 수분함량이 5% 이하가 되도록 건조하였다. 분쇄 건조된 참당귀에 참당귀 무게의 2~4 배가 되도록 95%[v/v] 에탄올을 넣고 12시간 동안 반응하여 추출액을 확보하였고, 여과지를 이용해 고형물을 제거한 후, 증발 건조시켜 1차 당귀 농축물을 얻었다. 1차 농축물 1㎏당 에탄올 1ℓ를 넣어 현탁하고, -20℃에서 10시간 동안 방치한 후, 생성된 침전물을 원심분리를 통해 제거하여 상층액을 확보하고, 확보한 상층액을 증발 건조하여 2차 당귀 농축물을 만들었다. 2차 당귀 농축물에 60%[v/v] 에탄올 50ℓ를 넣어 현탁한 후, 원심 분리하여 60%[v/v] 에탄올 층만을 분리하였다. 분리한 60%[v/v] 에탄올 용액을 증발 건조하여 농축하고, 이를 다시 90% 에탄올에 녹여 상등액을 취하여 최종의 참당귀 추출물을 얻었다.
실시예 1-2. 데커시놀의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 참당귀 추출물 1000g을 95%[v/v] 에탄올로 현탁하고, 0.1N KOH 5000㎖을 처리하여 열분해 시킨 후, 6N HCl 575㎖ 넣어 중성화하였다. 중성화 과정에서 생성된 KCl 침전물을 원심 분리로 제거하고, 상층액은 소량의 에탄올이 남을 때까지 농축하여 4℃ 이하에서 방치하였다. 방치 중 에탄올에서 용해도가 낮은 데커시놀이 침전되면, 여과를 통해 침전물만을 따로 분리하고, 분리한 침전물을 0~4℃정도의 차가운 증류수를 이용하여 2회 세척하여 데커시놀 1차 정제물을 수득하였다. 또한 상기와 같은 조작을 반복하여 데커시놀 2차 정제물을 수득하였으며, 상기 조작을 최소 7회 반복하여 본 발명의 데커시놀 1,000 g을 확보하였다.
도 1은 본 발명의 데커시놀 정제물의 박막크로마토그래피 (Thin Layer Chromatography; TLC) 분석결과이다. Lane 2는 실시예 1-1에서 제조한 참당귀 추출물, Lane 3은 실시예 1-1의 참당귀추출물의 1차 정제물, Lane 4는 참당귀추출물의 2차 정제물이며, Lane 1은 본 발명에서 상기 열분해 정제과정을 7회 반복하여 얻은 데커시놀을 TLC 분석 결과이다. 도 1에서 보는 바와 같이, 참당귀 추출물의 경우, 정제과정을 통하여 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 비율이 매우 높였다. 이를 알칼리와 열 분해과정을 반복하였고, 얻어진 결과물은 데커신 및 데커시놀 안젤레이트가 거의 검출되지 않아 당귀 추출물의 주요성분인 데커신(Decursin)과 데커시놀 안젤레이트(Decursinol angelate)가 데커시놀로 전환되었음을 보여준다.
상기에서 얻은 높은 순도의 데커시놀 및 데커시놀 기준품을 NMR로 확인하여 도 2에 나타내었다. 실험은 부산대학교 기초과학연구소에 의뢰하여 실시하였다. 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 열분해 정제과정으로 수득한 데커시놀은 99.9%의 순도를 가지는 것을 확인하였다.
< 실시예 2. 데커시놀이 가용화된 용액의 제조>
본 발명의 난용성 성분인 데커시놀을 가용화시킨 용액을 제조하였다. 이때, 본 발명자의 한국등록특허 제10-1717672호에 기재된 방법을 참고하였다.
데커시놀 약 130 μg(약 5μM), 260 μg(약 10 μM), 650 μg(약 25 μM)을 채취하여 각각에 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween-80) 0.01g을 넣고 균일하게 혼합하였다. 이 후, 95%[v/v] 에탄올 1㎖을 넣고 혼합한 후, 염기성 아미노산인 라이신 또는 아르기닌 1.5g과 정제수 약 90㎖을 첨가하여 혼합한 다음, 6M HCl 또는 6M NaOH를 이용하여 pH가 8.6이 되도록 맞추었다. 이후 정제수를 총 부피가 100㎖이 되도록 넣어주었다. 이 용액을 고온증기멸균 처리를 통해 무균 조작과 함께 에탄올 성분을 휘발시켜 데커시놀이 가용화된 용액을 제조하였다.
< 실시예 3. 당귀추출물 및 정제 데커시놀의 혈압 안전성 실험>
본 발명자는 수년간의 당귀(Angelica gigas Nakai)에 관한 연구를 해 오면서 참당귀추출물의 혈압에 대한 영향을 관찰하여 왔다. 참당귀는 일반적으로, 피를 만드는 조혈작용과 항암, 항산화, 항염증 작용이 뛰어나 오랫동안 식용 및 약용으로 사용되어 왔던 전통 약초중의 하나이다. 그러나 참당귀추출물을 제조하여 직접 사용하는 경우, 추출물의 제조에 따라 오히려 고혈압을 유발하는 문제가 있었다. 하기에서는 실시예 1-1 및 1-2에서 수득한 당귀 추출물 및 본 발명의 99.9%의 데커시놀을 래트에 투여하고 혈압 측정을 통해 안전성을 확인하였다.
래트를 동물용 혈압측정기(3R229 3 channel for Rat, life science)를 이용하여 혈압을 측정하면서 혈압측정조작에 적응시켰다. 래트의 경우, 혈압기를 작용하면 공기압력의 소리로 인하여 실험용 래트가 놀라게 되어 혈압이 상승하는데, 이러한 영향을 제거하기 위하여 매일 5회씩 반복적으로 측정하여 적응을 시킨 후 혈압이 안정하게 유지되는 시기가 오면 실험을 수행하였으며, 실험 중에도 매일 규칙적으로 혈압을 측정하여 적응시켰다. 혈압을 측정할 때는 안정화를 위하여 빛을 차단하고자 머리 부분에 손수건 등을 이용하여 덮어주었다. 각 15마리의 실험용 래트는 다음투여 실험을 위하여 3마리씩 5 그룹으로 나누어 혈압을 측정하였다. 대조군(Control; 생리식염수), 당귀 추출물 및 데커시놀을 각각 2주간 경구 투여하였고 최종 투여 후, 다음날 측정한 혈압을 표 1에 나타내었다.
투여량 Control 당귀 추출물 Decursinol (99%)
Systolic Diastolic Systolic Diastolic Systolic Diastolic
0.0 mg/kg 121 115 120 115 125 118
0.5 mg/kg 111 104 130 110 110 91
1.0 mg/kg 110 102 135 105 110 92
2.0 mg/kg 126 121 142 122 117 92
5.0 mg/kg 123 115 140 120 115 90
상기 표 1에서 보는 바와 같이, 대조군(Control)의 경우, 수축기 평균 혈압은 110mmHg에서 126mmHg이었다. 당귀 추출물 투여군의 경우, 투여량 0.5 mg/Kg 이상인 모든 군에서 대조군에 비하여 혈압이 상승하여, 최소 130 mmHg에서 최고 142 mmHg까지 상승하였다. 상기와 같이, 참당귀 추출물의 투여는 정제되지 않을 경우에 혈압상승의 심각한 부작용을 보일 수 있음을 확인하였다.
상기 실시예 1-2에서 제조된 99 w/w% 데커시놀(Decursinol)을 동일한 방법으로 혈압측정실험을 수행한 경우, 상기 표 1에서 보는 바와 같이, 오히려 래트의 수축기 혈압을 낮추어 최대 117 mmHg에서 최소 110 mmHg까지 낮추어 정제되지 않은 참당귀 추출물 투여시 나타나는 심각한 부작용을 없앨 수 있음을 확인하였다.
< 실시예 4. 데커시놀의 혈관평활근세포 성장억제 효과 확인>
실시예 4-1. 고당에 의한 혈관평활근세포의 과도 성장
고농도의 glucose에 의해 혈관 평활근 세포인 A10 cell의 성장이 증가하는지 확인하였다. 96 well plate에 A10 cell을 1×103 cells/ml로 로딩하고, 16시간 후에 5, 10, 20, 30 mM D-glucose 농도의 배지로 갈아준 후 72시간 뒤에 MTT assay로 viable cell 수를 측정했다. 72시간 후에 A10 cell의 증식은 glucose 농도가 증가함에 따라 현저히 증가하였다.
상기 실험을 기초로 Hyperglycemia 상태를 30 mM D-glucose 농도로 결정하고 정상 D-glucose 농도에서 배양한 세포와 세포 증식을 비교하였다. 96 well plate에 A10 cell을 1×103 cells/ml로 로딩하고, 16시간 후에 5.5 및 30 mM D-glucose 농도의 배지로 갈아주었다. 24, 72, 96, 120시간 뒤에 MTT assay로 viable cell 수를 측정하여 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보는 바와 같이, A10 cell의 증식은 30 mM D-glucose 농도의 배지에서 현저히 증가하였다. High glucose에서 배양된 cell은 normal glucose에서 배양된 것보다 stationary phase가 더 길게 나타났고, 결과적으로 high glucose에서의 cell이 normal glucose의 cell보다 약 20%~25% 정도 더 많이 증식하였다.
실시예 4- 2. 데커시놀에 의한 혈관평활근세포의 과도 성장의 억제
고당에 의해 유도된 A10 cell의 증식에 대한 데커시놀의 효과를 조사하였다. 96 well plate에 A10 cell을 1×103 cells/ml로 로딩하고, 16시간 후에 5.5 및 30 mM D-glucose 농도의 배지로 갈아주었다. 이후 각 웰에 가용화 데커시놀 25 μM 을 처리하고, 1, 2, 3일 후에 각각 세포수를 측정하여 도 4에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 데커시놀 25 μM 은 정상 당 농도인 5.5 mM D-glucose 농도에서 A10 cell의 증식을 크게 저해하지는 않았다. 그러나 30 mM D-glucose 농도의 배지에서 의해 과도하게 증식된 A10 cell는 유의적으로 성장을 억제시켰으며, 3일째에는 20% 정도 A10 cell의 증식이 저해되었다.
데커시놀이 세포독성을 확인하기 위하여 살아있는 cell과 죽은 cell 수를 모두 측정하여 분석한 결과 데커시놀을 처리했을 때 살아있는 cell이 98% 이상인 것으로 확인되었다. 결과적으로, 데시놀을 정상 glucose에 처리했을 때는 혈관 평활근 세포의 증식에 영향을 주지 않는 반면, high glucose에 처리했을 때는 세포독성 없이 농도 의존적으로 세포증식이 저해되었음을 알 수 있었다.
실시예 4-3. 데커시놀에 의한 Phosphate-protein kinase 억제 효과 확인
데커시놀이 고당에 의해 유도된 A10 cell의 증식을 저해하는 효과가 PKC와 관계 있는지 확인하였다. 96 well plate에 A10 cell을 1×103 cells/ml로 로딩하고, 16시간 후에 5.5 및 30 mM D-glucose 농도의 배지로 갈아주었다. 이후 각 웰에 가용화 데커시놀 10 및 25 μM 을 처리하고, 24시간 후 pan-phospho-PKC antibody를 사용하여 western blotting 하여 도 5에 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이, 고당 환경의 A10 cell은 phospho-PKC 단백질 발현 수준이 정상 당 환경에 비해 현저히 증가하였다. 이때 데커시놀을 24시간 처리하였을 경우, 고당에서 증가되었던 phospho-PKC 발현 수준은 데커시놀에 의하여 농도 의존적으로 현저히 감소하였다.
상기 결과를 통해 데커시놀이 phospho-PKC 단백질 발현 수준을 저감시켜 PKC 활성을 낮춤으로써 고당에 의해 유도된 A10 cell의 증식을 저해한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4-5. A10 세포 성장에서의 삼투압 영향 관찰
고당 환경에서의 A10 cell 의 증식이 단순한 삼투압의 영향인지를 추가로 확인하였다. 6-well plates를 이용하여 A10 cells를 3 × 104 cells를 접종하고, 하룻밤 배양하였다. 이후, 배지를 도 6에 기재된 당 조성으로 교환해주고 다시 3일동안 배양하였다. 당 조성은 4개 Group으로 설계하였고, A Group은 D-glucose(5.5mM) 만을 처리한 군이고, B Group은 D-glucose (5.5mM) + L-glucose(24.5mM)을 처리한 군이며, C group은 D-glucose(5.5mM) + Mannitol(24.5mM)을 처리한 군이며, 마지막으로 D group은 D-glucose(30mM) 만을 처리한 군이다. 각 실험은 3회 반복하였다. 배양된 세포를 트리판블루 Exclusion 방법을 이용하여 살아있는 세포의 수를 세어 도 6에 나타내었다.
도 6에서 보는 바와 같이, 30 mM D-glucose를 처리한 D group은 과도성장하였으나 A10 세포에서 대사되지 않는 Mannitol 이나 L-glucose는 대조군과 비교하여 세포수에서 큰 차이를 나타내지 않았다. 따라서, 30 mM D-glucose의 고당에 의한 A10 세포 성장은 삼투압에 의한 영향은 없는 것으로 관찰되었다.
실시예 4-6 데커시놀 , 데커신 및 데커시놀 안젤레이트의 치료계수 확인
당귀뿌리의 10%가 데커신, 데커시놀 안젤레이트 및 데커신으로 고형분의 대부분을 이루고 있으며, 이중 데커신이 54%, 데커신의 이성질체인 데커시놀 안젤레이트가 44%, 그리고 데커시놀이 2%을 차지하고 있다. 그러나, 상기 실시예 3과 같이 당귀 추출물이 정제방법에 따라 일정한 부작용을 나타내는 점 및 99 w/w% 이상의 고순도 데커시놀 투여에서는 상기와 같은 고혈압 유도 등의 부작용이 나타나지 않는 점에서 본 발명자는 데커신, 데커시놀 안젤레이트 및 데커시놀의 세포독성과 high glucose에서 A10 cell의 성장저해 효과를 관찰하였다. 이는 데커신, 데커시놀 안젤레이트 및 데커시놀 중, normal glucose에서 세포독성이 거의 없고, high glucose에서 유도된 A10 cell의 증식을 억제하는 물질과 그 농도를 찾기 위함이다.
96 well plate에 혈관 평활근세포인 A10 cell을 1×103 cells/ml로 로딩하고, 16시간 후에 5.5 mM 또는 30 mM D-glucose 농도의 배지로 갈아주었다. 이후, 데커신, 데커시놀 안젤레이트 및 데커시놀을 각각 0, 20, 50, 100, 200, 500 μM 로 처리한 후, 세포를 50%를 억제하는 농도의 값(IC50)과 고당에서 세포의 성장을 억제하여 정상세포수를 보이는 농도(EC100)를 나누어서 치료계수를 산출하여 표 2에 나타내었다. 표 2에서 보는 바와 같이, 데커시놀의 IC50 값은 500 μM 이상으로 세포독성이 거의 없었다. 그 다음에 데커신, 데커시놀 안젤레이트가 high glucose에서 A10 cell의 증식을 얼마나 저해하는지 그 효과를 EC100으로 나타냈다. EC100은 약물에 의해 high glucose에서 유도된 A10 cell의 증식이 normal glucose 수준으로 저해되는 농도를 말한다. 데커시놀 안젤레이트의 EC100은 4.4 μM 로서 성장 저해 효과가 가장 좋았다. 즉, decursinol angelate> Decursin > decursinol 순으로 나타났다. 그러나 독성을 고려하여 계산한 치료계수 Therapeutic index를 살펴보면, 정상상태에서는 거의 세포독성이 없으면서 저농도에서 high glucose에 의해 유도된 A10 cell의 증식을 저해하는 가장 효과적인 물질로 decursinol > decursinol angelate > decursin 의 순서이며 decursin 11.5, Decursinol angealte 28.1, 그리고 Decursinol이 34.7 이상으로 Decursinol이 가장 우수한 것으로 나타났다.
즉, 데커시놀 안젤레이트의 고당 환경에서의 평활근 증식 억제 효과는 좋으나, 세포독성을 나타내고 있으며, 데커시놀 안젤레이트의 이성질체로 함께 존재하는 데커신은 데커시놀 안젤레이트보다 세포독성으로 인한 부작용을 나타낼 가능성이 더욱 높은 것을 알 수 있다. 이는 데커신 및 데커시놀 안젤레이트이 가장 많이 함유된 당귀 추출물 상태에서 실시예 3에서와 같이 고혈압을 유도하는 부작용을 나타낼 수 있는 점과도 같은 결과이다.
따라서, 당귀 추출물에 포함된 데커시놀 및 데커시놀을 상기 실시예 1-2와 같이 과정을 통하여 순도 높은 데커시놀로 전환시킴으로써 효과와 안전성을 모두 얻게 됨을 알 수 있었다.
IC50(μM) EC100(μM) Therapeutic index*
Decursin 82.7 7.2 11.5
Decursinol angelate 123.5 4.4 28.1
Decursinol > 500 10.1 > 49.5
* Therapeutic index was defined as IC50/EC100
< 제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 데커시놀이 가용화된 혼합물 200㎎을 각각 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 데커시놀이 가용화된 혼합물 100㎎, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
< 제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
본 발명의 데커시놀이 가용화된 혼합물을 각각 조리용 양념에 1중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 데커시놀이 가용화된 혼합물을 밀가루에 0.1중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 데커시놀이 가용화된 혼합물을 육즙에 0.1중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.
제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 데커시놀이 가용화된 혼합물을 우유에 0.1중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-5. 야채주스 제조
본 발명의 데커시놀이 가용화된 혼합물을 각각 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
제제예 2-6. 과일주스 제조
본 발명의 데커시놀이 가용화된 혼합물을 각각 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims (12)

  1. 데커시놀(decursinol)을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 평활근세포 증식 억제용 조성물은,
    데커시놀에 계면활성제를 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 제1단계;
    상기 1차 혼합물에 에탄올을 넣은 후, 가용성 키토산을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 제2단계;
    상기 2차 혼합물에 염기성 아미노산 및 정제수를 첨가하여 녹이고, pH가 8.6이 되도록 맞추어 3차 혼합물을 제조하는 제3단계; 및
    상기 3차 혼합물을 멸균 처리하는 제4단계;
    로 이루어진 과정을 통해 제조된 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제1단계의 계면활성제(detergent)는 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween-80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테레이트(polyoxythylene sorbitan monostearate, Tween-60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미페이트(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, Tween-40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20), 트리톤 X-100(triton X-100), 및 노닐페녹시폴리에톡실에탄올(nonyl phenoxypolyethoxylethanol, NP-40)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 제2단계의 가용성 키토산은, 분자량 20,000 이하인 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 제3단계의 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 평활근세포 증식성 질환은 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 전립선비대증 및 고혈압으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 데커시놀(decursinol)을 유효성분으로 포함하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 평활근세포 증식 억제용 조성물은,
    데커시놀에 계면활성제를 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 제1단계;
    상기 1차 혼합물에 에탄올을 넣은 후, 가용성 키토산을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 제2단계;
    상기 2차 혼합물에 염기성 아미노산 및 정제수를 첨가하여 녹이고, pH가 8.6이 되도록 맞추어 3차 혼합물을 제조하는 제3단계; 및
    상기 3차 혼합물을 멸균 처리하는 제4단계;
    로 이루어진 과정을 통해 제조된 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제1단계의 계면활성제(detergent)는 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(polyoxyethylene sorbitan monooleate, Tween-80), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테레이트(polyoxythylene sorbitan monostearate, Tween-60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미페이트(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, Tween-40), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(polyoxyethylene sorbitan monolaurate, Tween-20), 트리톤 X-100(triton X-100), 및 노닐페녹시폴리에톡실에탄올(nonyl phenoxypolyethoxylethanol, NP-40)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제2단계의 가용성 키토산은, 분자량 20,000 이하인 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 제3단계의 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 평활근세포 증식성 질환은 협심증, 동맥경화증, 뇌경색, 전립선비대증 및 고혈압으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 평활근세포 증식성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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