KR100509843B1 - 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법 - Google Patents
참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법 Download PDFInfo
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2200/00—Function of food ingredients
- A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
Abstract
본 발명은 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한국이 원산지인 참당귀(Angelica gigas, Nakai)를 이용하여 신장독성 경감 및 당뇨합병증에 따르는 신부전증의 억제효과, 당뇨성 고혈압에 효과를 보이는 참당귀 추출물을 함유하는 식품 및 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법에 관한 것이다.
이를 실현하기 위하여 본 발명은, 원료인 참당귀를 잘게 분쇄한 다음 분쇄한 참당귀에 에탄올을 첨가한 후 온도차이, 용해도 차이, 초음파기 또는 냉침방법을 이용하여 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한국이 원산지인 참당귀(Angelica gigas, Nakai)를 이용하여 신장독성 경감 및 당뇨합병증에 따르는 신부전증의 억제효과, 당뇨성 고혈압에 효과를 보이는 참당귀 추출물을 함유하는 식품 및 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, Protein kinase C (PKC)는 최근 항암제를 비롯한 여러 생리활성물질을 개발하기 위한 주요 타겟이 되고 있는 효소이다. PKC는 동물에서 10여종의 isoezymes이 알려져 있으며 호르몬이나 growth factor등의 1차 외부신호를 세포내에 전달하는 데 관여하는 일련의 과정(signal transduction)에서 세포내 2차 신호를 만들고 조절하는 중요한 역할을 담당하고 있다. 한편 많은 암세포에서 비정상적으로 PKC가 활성화되어 있으며, 강력한 발암물질인 phorbol 화합물의 세포내 수용체가 PKC라는 사실이 밝혀지면서 PKC 조절을 통한 항암제 개발이 활기를 띄게 되었다.
미국의 브리스톨마이어 스퀴번스사에서 개발하고 있는 bryostatin은 PKC를 활성화하는 물질로서 공개되어 있고 이 물질은, bryozoan이라는 원생동물에 극히 소량 함유되어 있고 해양으로부터 채취해야 하는 등의 단점이 있으며 아직까지 화학합성은 이루어지지 못하고 있기 때문에 산업적으로 활용하기 어려운 상태이다. 본 연구자 등은 G7과제의 2단계 연구기간동안 3년간의 연구를 통하여 bryostatin과 유사한 활성을 갖는 물질로서 decursin과 decursinol angelate를 발견하여 이들의 성질이 bryostatin과 유사하다는 것을 밝힌 바 있는데(과학기술부 과제번호 M1-98-08-00-0021 유용 PKC activator(Decursin류)) 이 물질들은 bryostatin과 비교하여 식물체에서 추출한다는 점, 식물체내에서의 함량이 3-7%로서 매우 높다는 점, 분자량이 작으며 화학합성이 가능하다는 점, 그리고 상대적으로 독성이 약하다는 점 등에서 bryostatin보다 우수한 것으로 판단되고 있다. 이 물질들을 조기 산업화를 위하여는 이물질들의 대량 생산공정 개발과 산업화를 위한 기반기술 개발이 조속히 이루어져야 할 것으로 판단된다.
본 연구자등이 밝힌 bryostatin과 유사한 성질을 갖고 있는 물질인 decursin류는 성질 면에서는 bryostatin과 유사하지만 독성이 훨씬 적고, 분자량이 작아서 화학합성이 가능하며, 식물에서 추출할 경우에도 충분히 생산이 가능하다는 등 여러 가지 장점이 있다. 게다가 연구결과 decursin류는 백혈병 치료제 및 신장독성 경감제로서의 효능이 매우 우수하며 특히 당뇨병으로 인한 신장 손상과 중금속이나 약물의 남용에 의한 신장의 독성을 경감하는 효과가 뛰어남을 확인하였다. 이러한 신장 보호효과는 선진국에서도 아직까지 보고되지 않은 새로운 결과로서 현재까지는 세계적으로 시장이 형성되어 있지 않지만 향후 세계적인 신장보호제로서의 시장성이 엄청나게 커질 것으로 판단되고 있다.
Decursin류의 백혈병 치료제 및 신장독성 경감제로서의 효능이 산업화될 경우 백혈병의 치료효과는 암환자들에게 새로운 희망을 가져다 줄 것으로 생각되며, 신부전증에 걸린 많은 환자들이 평생동안 신장 투석으로 고생하는 것과 투석에 드는 많은 사회적, 개인적인 비용을 고려할 때에 decursin의 신장보호 효과는 당뇨병환자들의 건강 증진, 중금속오염 및 약물남용에 의한 신장손상 예방을 통하여 복지사회 구현에 크게 이바지할 수 있을 것이다.
본 발명은 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 한국이 원산지인 참당귀(Angelica gigas, Nakai)를 이용하여 신장독성 경감 및 당뇨합병증에 따르는 신부전증의 억제효과, 당뇨성 고혈압에 효과를 보이는 참당귀 추출물을 함유하는 식품 및 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법에 관한 것이다.
참당귀는 한국이 원산지로서 그 사용 범위가 보혈제로서 한방약제로 이용되어져 왔으며 최근에는 한국산 지표물질인 데커신과 주요 성분인 데커시놀이 혈류개선 작용과 항 헬리코박터 작용이 있다고 보고 되어 있으며 본 발명자 등이 밝힌 순수 정제된 데커신이 신장독성 억제와 당뇨합병증에 의한 신부전증의 예방 효과 및 당뇨성 고혈압에 효과가 있음을 동물실험을 통하여 밝힌바 있다.(PCT/KR99/00632). 그러나 기존의 방법보다 간편하고 추출량을 다량 확보할 수 있는 농축 방법을 확보하여 제조하였고 이것을 액제로 제조하여 실험동물에 경구적으로 투여 할 때 장관에서 용이하게 흡수되는 것을 확인 할 수 있었다. 데커신과 데커시놀 안젤레이트는 구조 이성질체로서 현재까지 잘 알려져 있지 않았으나 본 연구자등이 그 작용을 연구하여 왔으며 그 분석법에 관한 것도 확립하였다. 데커신은 실온에서 고체로 존재할 수 있으나 데커신 안젤레이트는 영하 20도에서도 액체로 존재하며 참당귀에서는 데커신과 데커신 안젤레이트의 비율이 약 3:2정도 인 것으로 본 연구자 등의 분석 결과 밝혀졌다.
또한, 경구 투여 후 흡수가 되어 데커신과 데커시놀 안젤레이트가 데커시놀로 대사되어 혈액내에 존재하는 것이 관찰 되었다. 따라서 경구적 투여로 인한 결과로 이들 성분이 용이하게 생체내로 흡수됨을 알 수 있었다. 기존의 알콜 추출방법이나 70%알콜 추출방법으로는 참당귀에 존재하는 데커신의 추출이 농축액의 35%내외인 것으로 알려져 왔고 그 양이 50%를 넘지 않지만 본 연구자의 결과로서 99%이상의 주정 알콜 및 약전 에탄올을 사용하였을 때 그 농축된 함유량이 높게 나와 최대 75% 이상 함유하는 결과를 도출 하였으며 특히 그 함유량 중에서 데커시놀 안젤레이트와 데커신을 분리하여 정량하는 방법을 개발하여 정확한 함량을 알 수 있었다.
본 발명은 당귀의 추출 농축물에 존재하는 데커신 및 데커시놀 알젤레이트가 경구적 투여에 의해 생체로 용이하게 흡수 가능하다는 사실을 이용하여 신장독성 억제 효능과 당뇨합병증에 의한 신부전증의 억제 효능 및 당뇨에 의한 고혈압에 효과가 있는 경구적으로 복용 가능한 참당귀 추출물을 함유하는 식품 및 약제학적 조성물을 제공할 수 있도록, 기존의 일반적인 추출방법보다 더욱 효과적으로 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출할 수 있는 새로운 추출방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
삭제
상기와 같은 목적 달성을 위하여 본 발명은, 원료인 참당귀를 잘게 분쇄한 다음 분쇄한 참당귀에 에탄올을 첨가한 후 온도차이, 용해도 차이, 초음파기 또는 냉침방법을 이용하여 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 것을 특징으로 한다.
또한, 참당귀(Angelica gigas, Nakai)에 함유된 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출 농축하여 당뇨성 고혈압 및 신장독성 경감에 효능을 보이도록 정제나, 캅셀제 , 수제(액제) 및 가루 형태로 단독 및 투여가능한 부형제 등 첨가제가 복합된 형태로 경구 투여토록 제조된 것을 특징으로 한다.
또한, 참당귀(Angelica gigas, Nakai)에 함유된 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출 농축하여 당뇨성 고혈압 및 신장독성 경감에 효능을 보이도록 성인 1일 복용량이 100mg에서 500mg의 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예들을 첨부된 예시도면에 의거하여 상세히 설명한다.
(실시예)
이하의 실험 예에서는 참당귀로부터 데커신 및 데커신 안젤레이트의 추출방법에 관한 것과 분석 결과를 예시한 것이다. 또한 경구 투여 목적으로 추출 농축물을 제제화하여 흡수시키고 그 결과를 혈액 분석한 것을 예시한 것이다. 또한 추출 농축물의 효능에 관한 것을 예시하였다.
[실시예 1] 데커신 및 데커신 알젤레이트 고 함유 농축물 제조 방법
(1) 온도차이를 이용한 추출방법을 예시한 것이다.
참당귀로부터 데커신 및 데커신 안젤레이트를 분리 농축하는 방법으로서 한국산 및 북한산 당귀인 참당귀를 이용하여 실시하였다. 식품용으로 사용키 위하여 약전 에탄올 및 주정 알콜을 사용하였고 물을 사용할 때는 정제수를 사용하였다. 원료인 참당귀를 40메시(40 mesh)이하로 잘게 분쇄하여 수분함량 5% 이하로 건조하고 약전용 알콜 또는 주정알콜(이하 에탄올로 표기)로 분쇄 참 당귀의 2배에서 4배를 첨가하여 진탕하에서 상온에서 12시간 추출하였고 이것을 여과하여 정량하였다. 이 경우에는 농축물에 함유된 데커신과 데커시놀 안젤레이트의 함량이 37.7%를 나타내었다. 또한 참당귀 원료로서는 데커신 및 데커시놀 안젤레이트로 3.92%를 보였다. 이 에탄올 분획물을 영하20도에서 20시간 이상 방치시켜 에탄올에 용해성이 낮은 물질을 온도차이를 이용하여 침전시키고 여과하여 에탄올 분획을 분취하였다. 이 분획물을 정량하였을 때는 데커신 및 데커시놀 안젤레이트는 38.1%로 농축되었다. 여기서 나온 에탄올 분획물을 농축하여 에탄올을 온도 80도 이상에서 증발시키고 남아 있는 고형분을 회수하였다. 이 회수물을 분석한 결과 데커신 및 데커시놀 안젤레이트로서 64.24%로 아주 높은 고 함량이 되었다.
2) 용해도 차이를 이용하여 추출방법을 예시이다.
참당귀로부터 데커신 및 데커신 안젤레이트를 분리 농축하는 방법으로서 한국산 및 북한산 당귀인 참당귀를 이용하여 실시하였다. 식품용으로 사용키 위하여 약전 에탄올 및 주정 알콜을 사용하였고 물을 사용할 때는 정제수를 사용하였다. 원료인 참당귀를 40메시(40 mesh)이하로 잘게 분쇄하여 수분함량 5% 이하로 건조하고 에탄올을 분쇄 참 당귀의 2배에서 4배를 첨가하여 진탕하에서 상온에서 12시간 추출하였고 이것을 여과하였다. 여과된 에탄올을 온도 80도 이상에서 증발시키고 남아 있는 고형분을 회수하였다. 이 회수물을 2배량의 에탄올을 넣어 녹이고 추가적으로 초음파를 처리하여 녹였다. 이것을 여과하여 에탄올 층을 취하고 여기에 다량(에탄올의 약 20배)의 수용액(0.05% tween 80 함유)을 첨가하여 침전되는 물질을 수거하였다. 이것은 목적 주성분인 데커신이나 데커시놀안젤레이트가 에탄올에는 녹고 물에서 녹지 않는 성질을 이용한 것이다. 이 수거물을 건조하여 수분을 제거하고 함량을 분석한 결과 76.71%의 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 함유하였다. 이것은 일반적인 추출에서 30%내외의 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 함유하는 것과 비교시 상당한 농축물인 것으로 판단된다.
3) 초음파기를 이용한 방법을 예시한 것이다.
참당귀로부터 데커신 및 데커신 안젤레이트를 분리 농축하는 방법으로서 한국산 및 북한산 당귀인 참당귀를 이용하여 실시하였다. 식품용으로 사용키 위하여 약전 에탄올 및 주정 알콜을 사용하였다. 원료인 참당귀를 40메시(40 mesh)이하로 잘게 분쇄하여 수분함량 5% 이하로 건조하고 에탄올을 참 당귀의 2배에서 4배를 첨가하여 진탕하에서 상온에서 12시간 추출하였고 이 조작중에 초음파기를 이용하여 10분간 2회이상 초음파 처리 하였다. 이것을 여과하였고 여과된 에탄올 층을 온도 80도 이상에서 증발시키고 남아 있는 고형분을 회수하였다. 이 수거물의 함량을 분석한 결과 참당귀에서 9%이상의 데커신 및 데커신 안젤레이트를 추출할 수 있었다. 이것은 기존의 참당귀에서 초음파 처리를 하지 않는 추출법에 비하여 2배정도로 많은 데커신 및 데커신 안젤레이트를 추출한 결과로서 농축물에서 88%를 보였다.
4) 이 방법은 냉침의 방법으로 추출하는 것을 예시한 것이다.
참당귀로부터 데커신 및 데커신 안젤레이트를 분리 농축하는 방법으로서 한국산 및 북한산 당귀인 참당귀를 이용하여 실시하였다. 식품용으로 사용키 위하여 약전 에탄올 및 주정 알콜을 사용하였다. 원료인 참당귀를 40메시(40 mesh)이하로 잘게 분쇄하여 에탄올을 참 당귀의 2배에서 4배를 첨가하여 진탕하에서 냉침하여 4일 동안 추출하였다. 또한 비교 데이터로 활용코자 가열 추출한 방법을 실시하였다. 이 추출물을 여과하여 에탄올 층을 수거하고 이 에탄올층을 80도의 온도에서 에탄올을 휘발시키고 남아있는 반 고체상의 잔유물을 수거하였고 분석한 결과로 가열 추출한 경우에는 데커신 및 데커신 안젤레이트의 함량이 38%를 보인 반면에 4일간 냉침한 경우에는 59.39%로 수거되었다.
[실시예 2] 액제로 제제화하여 용액에서의 안정성 실험 결과 및 경구 투여한 후 혈액분석한 결과
1)가용화시킨 엘릭실제(emulsion 형태)
Decursin과 데커시놀 안젤레이트 추출물은 물에는 녹지 않으며 60% Ethanol에서의 용해도가 약6.6mg/ml 정도이다 따라서 고용량으로 액체화시에 석출되어 가용화를 시키는 제제기술을 도입하여 균일화 하였다. 균일한 함량(함량균일성)을 위하여 에탄올로 1차적으로 완전용해 후 액제로 가용화 시켰다. 100mg Decursin을 1ml 알코올에 녹인 후 제제화된 수용액에 emulsion화 시켰으며 이 제제화된 수용액의 조성은 다음의 예시와 같다. 추출농축 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 48gram 취하고 240ml의 에탄올에 가용화 하였다. 이것을 경우투여할 목적으로 수용액(3.3gram 트윈80, 120gram HPMC, D-sorbitol 1.2kg, 구연산 30 gram, Sucrarose 2.4gram, 자일리톨 2.4kg)에 희석하여 액제로 조제하였다. 이중에서 구연산은 산성조건을 유지하기 위하여 사용하였고 그 외의 산성 물질도 사용할 수 있다. 데커신 및 데커시놀 안젤레이트는 알카리에서 분해하는 성질이 있으며 산성 조건에서는 안정한 것으로 본 연구자 등이 연구한바 있다. 최종적으로 산도를 pH 3.5내외를 유지하였다.
2) 안정성 실험.
실험의 조건은 40℃, 70% 상대습도에서 시간별 함량 실험을 검사하였고 분석법으로 고속액체크로마토그래피법(HPLC)를 사용하였다. 분석 결과로 가속조건에서 안정성이 유지됨을 알 수가 있었다.
(1) Decursin : RT = 7.84
Figure 1.
(2) Decursinol: RT = 1.87
Figure 2
(3) 결과
| 시간 | 0hr | 1hr | 2hr | 4hr | 8hr | 24hr | 48hr | 7day | 30day |
| 함량(%) | 99.66 | 99.60 | 99.42 | 98.91 | 99.17 | 98.52 | 98.55 | 98.12 | 97.17 |
3) 동물 실험한 결과는 다음과 같다.
(1) Decursin 투여량(경구투여) : 50mg/kg Rat
| Time | 0(대조군) | 1hr | 2hr | 4hr | 8hr |
| 군수 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
(2) 투여군수 및 채취시간
* 비투여 대조군 : 5마리
투여 시험군 : 20마리
(3) Decursin 용액: Decursin 100mg/ml(Ethanol)
(4) 투여: 100mg/ml(ethanol)을 제제화된 수용액에 10배 희석하여 현탁시키고 1ml씩 200g Rat에 투여하였다.
(6) 분석: 혈액 채취 후 혈장을 분리 후 HPLC로 분석하였다.
실험용 Rat를 이용하여 각 시간별로 채취하여 경구 투여 된 상태를 확인하였다.
이것은 경구투여가 가능한 액제 형태로 개발하고자 가용화시킨 데커신 및 데커신 안젤레이트를 경구 투여 후 실험하였고 실험수행은 경성대학교 약학대학 약리실에서 수행하였다. 실험 결과의 분석은 바이넥스 연구소에서 실시하였다. 일차적으로 Decursin 및 Decursino angelate의 경구투여 후 흡수가 되는지를 확인코자 하였으며 분석이 용이한 Decursinol을 분석코자 혈청을 분리후에 Methanol 1ml을 처리하여 가용화된 상등액을 취하여 확인 실험을 실시하였다.
(투여량 및 투여수)
| Time | 0hr(Control) | 1hr | 2hr | 4hr | 8hr |
| 3마리 | 4마리 | 5마리 | 5마리 | 5마리 | |
| 투여량 | 50mg/kg | 50mg/kg | 50mg/kg | 50mg/kg | 50mg/kg |
(분석 결과)
표준액의 제조는 Decursinol 50mg을 메탄올에 녹여 총 50ml 로 제조하였다.
HPLC 분석조건은 Hitachi HPLC을 사용하였고 컬럼으로는 COSMOSIL C18을 사용하였고 이동상은 MeOH : H2O = 60 : 40을 사용하고 유속은 1.0ml/min으로 검출기 파장은 280nm로 하였다. Injection volume 을 20㎕로 하였다.
가 . Standard : Decursinol
나. Control : time 0 hr 에서의 결과
다. 투여 1시간 후
라. 투여 2시간 후
마. 투여 4시간 후
바. 투여 8시간 후
결론으로는 RT 3.24에서 Decursinol 이 분리가 되었다. 데커신 흡수후에 생체내에서 분해되어 Decursinol로 분해 됨이 확인되었고 Decursinol 자체도 독성이 거의 없는 물질로서 대사산물에 의한 독성의 문제가 없을 것으로 보여진다. 따라서 경구 투여 후에 흡수가 됨을 확인하였다.
Figure 3. 데커신 구조
Figure 4. 데커시놀 안젤레이트
[실시예 3] 데커신과 데커시놀 안젤레이트의 당뇨성 질환에 관한 효능에 관한 실험
당뇨에 의한 혈관질환의 병인은 매우 복잡하다. 당뇨병으로 인한 다양한 대사변화 중에서 고혈당이 혈관질환을 일으키는 가장 중요한 요인으로 알려져 왔다. 고혈당에 의해 유도된 vascular smooth muscle cell (VSMC)의 성장증가는 동맥경화나 고혈압을 유발하게 된다. 그러나 고혈당과 혈관질환과 관련된 신호전달 메커니즘은 아직 분명하지 않다. 고혈당이 diacylglycerol (DAG)을 증가시키고, DAG의 증가가 protein kinase C (PKC) pathway를 활성화 시키기 때문에 고혈당에 의한 혈관질환이 발생한다는 여러 보고가 있었다. 따라서 PKC signaling pathway를 inhibition 시키는 물질을 찾는 것이 당뇨합병증을 치료하거나 예방하기 위한 좋은 방법 중의 하나라고 생각되어 왔다. 그래서 그 동안 PKC inhibitor를 가지고 많은 연구를 하였으나, PKC inhibitor는 그 자체의 독성과 nonspecificity가 문제점으로 제기되었다.
데커신은 참당귀 추출물로서 PKC activator로 알려졌고, 암세포의 증식을 저해하고, 강력한 PKC activator인 phorbol ester와는 달리 활성화된 PKC를 더 빨리 downregulation 시킨다는 보고가 있었다. 따라서 본 실험에서는 데커신과 그 유도체가 high glucose에 의해 유도된 VSMC의 증식을 저해하는지, 그리고 그 저해 메커니즘은 어떤 것인지에 대해서 연구했다.
Glucose 농도에 의해 vascular smooth muscle cell인 A10 cell의 growth가 증가하는지 확인하고, hyperglycemia 상태를 최적화하기위해 A10 cell을 다양한 glucose 농도에서 배양했다. 96 well plate에 A10 cell을 1X103 cells/ml로 로딩하고, 16시간 후에 5, 10, 20, 30, 40, 50 mM D-glucose 농도의 배지로 갈아준 후 72시간 뒤에 MTT assay로 viable cell 수를 측정했다. 72시간 후에 A10 cell의 증식은 glucose 농도가 증가함에 따라 현저히 증가하였다. 50 mM D-glucose에서의 세포증식이 5.5 mM D-glucose에서의 증식보다 약 15% 증가했다.
일반적으로 normal glucose는 5.5 mM D-glucose로 high glucose는 25 mM D-glucose로 많이 사용했었다. 그러나 normal glucose와 high glucose와의 차이를 더 크게 하기위해서 이번 실험에서는 high glucose를 30 mM D-glucose로 사용했다. A10 cell을 6 well plates에 3X103으로 로딩하고 16시간 후에 5.5 mM D-glucose와 30 mM D-glucose로 배지를 갈아주었다. Cell은 5일 동안 배양했고, 매일 trypan blue exlusion assay로 viable cell 수를 counting 했다. High glucose에서 배양된 cell은 normal glucose에서 배양된 것 보다 stationary phase가 더 길게 나타났고, 결과적으로 high glucose에서의 cell이 normal glucose의 cell보다 약 20% 정도 더 많이 자랐다.
High glucose에 의해 유도된 A10 cell의 proliferation에서 데커신의 효과를 조사하기위해 A10 cell에 다양한 농도의 데커신 (1,5,10,25 mM)을 처리하고, 3일 후에 counting을 했다. 데커신 25 mM을 normal glucose와 high glucose에서 처리한 경우 모두 데커신을 처리하지 않은 대조군에 비해 약 20% 정도 cell 증식이 저해되었다. 그러나 high glucose에 5, 10 mM 데커신을 처리했을 때는 cytotoxicity없이 control 수준으로 증식이 저해되었다. 데커신이 cell에 toxic한 건지 cell의 증식을 저해하는 건지 확인하기 위해 살아있는 cell과 죽은 cell 수를 모두 측정하였다. 그 결과 데커신을 처리했을 때 살아있는 cell이 98% 이상인 것으로 확인되었다. 결과적으로, 데커신을 normal glucose에 처리했을 때는 cell growth에 영향을 주지 않는 반면, high glucose에 처리했을 때는 세포독성 없이 농도 dependent하게 세포증식이 저해되었음을 알 수 있다. decursinol angelate와 decursinol tiglate가 decursin 보다 효과가 더 좋은 것으로 나타났다. 그들의 효과를 counting으로 다시 한번 확인하기 위해서 A10 cell에 1, 5, 10, 25 mM decursinol angelate와 decursinol tiglate를 처리한 후 3일 후에 trypan blue exclusion assay로 counting 했다. Decursinol angelate와 decursinol tiglate는 normal glucose에서는 세포증식에 영향을 주지 않는 반면, high glucose에서는 농도 dependent하게 세포증식을 저해했다. Decursinol angelate 25 mM은 normal glucose, high glucose에서 모두 약 20% 정도 세포증식을 저해했지만, 5와 10 mM은 세포독성 없이 high glucose에서의 세포증식을 저해했다. Decursinol tiglate는 normal glucose에서 세포독성 없이 high glucose에 의해 유도된 세포증식을 농도 dependent하게 저해했다.
[실시예 4] Decursin에 의한 cisplatin의 신장 독성 경감효과
Decursin에 의한 cisplatin의 독성 경감효과를 조사하기 위해서 50 ??M의 cisplatin과 함께 다양한 농도의 decursin을 함께 처리하였다. 24시간 후에 LDH의 방출량과 floating 세포의 수를 확인하여 세포의 사멸을 조사하였다. 그림 5에서 보는바와 같이 decursin의 농도가 증가함에 따라 생존세포수가 증가하였다. 이는 방출된 LDH의 양이 감소하고 floating 세포의 수가 감소하는 것으로 확인 할 수 있다.
이러한 decursin의 보호 효과가 PKC activator로서의 효과인지를 확인하기 위하여 다양한 PKC activator를 사용하여 cisplatin의 독성 경감효과를 확인하였다. Tumor-promoter로 알려진 PMA와 합성된 DAG, 그리고 특이한 PKC activator로 알려진 bryostatin을 사용하여 실험한 결과 cisplatin(CDDP)의 독성 경감효과는 관찰되지 않았다. 이러한 결과로 미루어 볼때 decursin에 의한 cisplatin의 독성 경감효과는 PKC activator와는 무관한 기전을 가지고 있음을 확인하였다. PKC는 세포의 성장에 중요한 역할을 하는 단백질로 알려지 있기 때문에 이러한 결과는 cisplatin의 세포독성이 일반적인 세포의 신호전달 과정과 상이함을 시사한다.(그림 6)
Decursin의 신장세포 보호 효과를 확인하기 위해서 FACS와 전기영동을 실시하였다. DNA에 특이하게 결합하는 propidium iodide를 이용하여 FACS를 실시한 결과, cisplatin에 의해서 발생하는 세포 사멸을 억제하는 결과를 얻었으며 세포내의 DNA를 전기영동한 결과 apoptosis의 marker인 DNA laddering이 감소하는 것을 확인하였다. (그림 7)
A)는 대조군이며 B는 Cisplatin(CDDP) 처리군이며, C)는 Decursin 처리군이며 D)는 Cisplatin과 Decursin을 동시에 처리한 군이다. 따라서 Decursin이 Apotosis를 방지하는 결과를 보였다.
위와 같은 실험의 결과를 통하여 decursin이 cisplatin에 의해서 야기되는 세포독성을 억제하는0. 효과를 가지고 있음을 확인하였다. 또한 이러한 decursin의 활성은 decursin이 PKC activator로 밝혀진 것과는 다른 작용에 의한 것임을 확인하였다.
[실시예 5]
당귀농축 추출물을 이용한 액제로 제제화하여 1인당 하루 300mg의 데커신 및 데커신 안젤레이트를 1일 1회 또는 1일 3회 분복하도록 복용을 한 결과로 환자의 상태의 변화중에서 소변의 색깔이 맑아지고 또한 소변의 악취가 없어지는 결과를 얻을 수 있었다. 또한 1일 300mg의 데커신 및 데커신 안젤레이트를 1일 2회 또는 3회 복용을 한 결과 설사를 유발하는 경우가 발생하여 다소 복용량이 많은 것으로 추측되는 결과를 얻을 수 있었다. 따라서 1일 300mg을 1회 또는 1일 2회 150mg을 사용토록 하는 것이 좋을 것이라 판단된다.
종래의 일반적인 추출방법을 이용하는 경우에 최종 수거물 중 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 함유량이 약 30~40% 정도였던 것에 비하여, 본 발명에 따른 방법에 의하여 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 경우에는 최종 수거물 중 데커신 및 데커시놀 안젤레이트 함유량이 온도차이를 이용한 추출방법은 약 64%, 용해도 차이를 이용하는 추출방법은 약 76%, 초음파 처리를 이용한 추출방법은 약 88%, 냉침방법을 이용한 경우에는 약 59%를 나타냄으로써, 참당귀를 이용하여 주성분으로 효과를 보이고 있는 데커신과 데커시놀 안젤레이트를 일정량을 함유토록 한 식품 및 약제학적 조성물을 제조함에 있어서 본 발명에 의한 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법을 이용하는 것이 매우 효과적임을 알 수 있다.
도1은 참당귀 추출물에서 분석된 데커신과 데커신 안젤레이트의 결과를 크로마토그램으로 도시한 도면.(RT= 29.40은 Decursin을 RT=30.84는 Decursinol angelate를 나타내며 그 비율은 3:2)
Claims (4)
- 참당귀를 40메시(mesh) 이하로 잘게 분쇄하여 수분함량 5% 이하로 건조하고 분쇄한 참당귀에 에탄올을 참당귀의 2~4배를 첨가하여 진탕하에서 12시간 추출한 후 여과, 정량하는 단계; 상기 여과·정량된 에탄올 분획물을 영하 20℃에서 20시간 방치하여 에탄올에 용해성이 낮은 물질을 온도차이를 이용하여 침전시킨 후 여과하여 에탄올 분획을 분취하는 단계; 상기 분취된 에탄올 분획물의 에탄올을 80℃에서 증발시키고 남아 있는 고형분을 회수하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법.
- 참당귀를 40메시(mesh) 이하로 잘게 분쇄하여 수분함량 5% 이하로 건조하고 분쇄한 참당귀에 에탄올을 참당귀의 2~4배를 첨가하여 진탕하에서 12시간 추출한 후 여과, 정량하는 단계; 상기 여과·정량된 에탄올 분획물의 에탄올을 80℃에서 증발시킨 후 남아 있는 고형분을 회수하는 단계; 회수된 고형분에 2배량의 에탄올을 넣어 용해시키고 추가적으로 초음파를 처리하여 용해시키는 단계; 상기 용해물을 여과하여 에탄올 층을 취하고 여기에 tween 80 0.05%를 함유한 수용액(에탄올량의 20배)을 첨가하여 첨전되는 물질을 수거한 후 건조시켜 수분을 제거하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법.
- 참당귀를 40메시(mesh) 이하로 잘게 분쇄하여 수분함량 5% 이하로 건조하고 분쇄한 참당귀에 에탄올을 참당귀의 2~4배를 첨가하여 진탕하에서 12시간 추출하며, 추출 조작 중에 초음파기를 이용하여 10분간 2회 초음파 처리를 하는 단계; 상기 초음파 처리를 하여 추출, 여과·정량된 에탄올 분획물의 에탄올을 80℃에서 증발시킨 후 남아 있는 고형분을 회수하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법.
- 참당귀를 40메시(mesh) 이하로 잘게 분쇄하여 수분함량 5% 이하로 건조하고 분쇄한 참당귀에 에탄올을 참당귀의 2~4배를 첨가하여 진탕하에서 냉침하여 4일 동안 추출하는 단계; 상기 추출물을 여과하여 에탄올 층을 수거한 후 80℃에서 에탄올을 증발시키고 남아있는 반고체상의 잔유물을 수거하는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는 참당귀로부터 데커신 및 데커시놀 안젤레이트를 추출하는 방법.
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