KR20210096075A - Ad로 인한 mci 진단 마커 및 그 응용 - Google Patents

Ad로 인한 mci 진단 마커 및 그 응용 Download PDF

Info

Publication number
KR20210096075A
KR20210096075A KR1020217012388A KR20217012388A KR20210096075A KR 20210096075 A KR20210096075 A KR 20210096075A KR 1020217012388 A KR1020217012388 A KR 1020217012388A KR 20217012388 A KR20217012388 A KR 20217012388A KR 20210096075 A KR20210096075 A KR 20210096075A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mir
hsa
mci
kit
diagnostic
Prior art date
Application number
KR1020217012388A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102626614B1 (ko
Inventor
타오 왕
시후 샤오
하이닝 헤
Original Assignee
상하이 멘탈 헬스 센터(상하이 싸이컬로지컬 카운셀링 트레이닝 센터)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 상하이 멘탈 헬스 센터(상하이 싸이컬로지컬 카운셀링 트레이닝 센터) filed Critical 상하이 멘탈 헬스 센터(상하이 싸이컬로지컬 카운셀링 트레이닝 센터)
Publication of KR20210096075A publication Critical patent/KR20210096075A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102626614B1 publication Critical patent/KR102626614B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 AD로 인한 MCI 진단 마커에 관한 것으로서, 상기 마커가 혈장 miRNA이고, 상기 혈장 miRNA에는 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p와 hsa-miR-107이 포함된다. 본 발명은 또한 해당 마커의 응용 및 상응한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 유익한 효과로는, 최로 AD로 인한 MCI에 대하여 비교적 높은 진단 가치를 갖는 생물 마커를 발견하고, 간편한 AD로 인한 MCI의 말초 혈장 진단 마커가 없는 곤경을 돌파하였으며, 속칭 노인 치매라 불리는 알츠하이머병의 조기 진단과 조기 개입에 유리하다.

Description

AD로 인한 MCI 진단 마커 및 그 응용
본 출원은 2018년 9월 26일에 제출되고 출원번호가 201811126537.7인 중국 발명 특허 출원의 우선권을 주장하고, 그 내용은 인용의 방식을 통하여 본 출원에 포함되었다.
본 발명은 알츠하이머병의 전구기 기술분야에 관한 것이고, 특히 진단 마커 기술분야에 관한 것으로서, 구체적으로는 AD로 인한 MCI 진단 마커 및 그 응용을 가리킨다.
알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)는 노인 치매라 속칭되고, 아밀로이드 베타 단백질(amyloid β-protein, Aβ) 퇴적과 고인산화 Tau 단백질에 의한 미세소관 구조 문란으로 형성된 신경원 섬유 매듭을 주요 병리 특징으로 하는 신경 퇴행성 질환이다. AD는 이미 노인들의 흔한 병, 다발병과 높은 부담 질환으로 되었다. AD는 만성이고 비전염성이며 연력과 관련된 복잡한 병인으로 인한 신경 퇴행성 질환이다. 1906년 독일 정신과 의사 알츠하이머가 최초로 질환을 공개한 후의 100여년의 시간에, 이 병은 희귀병 또는 드문 병으로부터 이미 가장 흔한 노인기 치매 유형으로 되었고, 대략 50%~70%를 차지하며, 고령화 사회의 4대 사망 원인 중의 하나이다. 역학 연구에 따르면, 60세 이상 노인 집단의 유병율은 3~5%이고, 5세가 증가할 때마다 발병률이 1배 증가하며, 80세 이상에서는 20%에 달할 수 있고, 90세 이상에서는 50%에 달할 수 있다. 보수적인 추산에 의하면, 현재 중국에는 적어도 600만의 AD 환자가 존재하고, 2020년에 이르러서는 1000만의 환자를 초과하게 된다. AD 의료와 간호 부담이 아주 크고, 직접 및 간접 의료 비용이 모두 아주 높은 바, 예를 들면, 미국 매 중, 말기 AD 환자의 연 평균 의료 간호 비용은 5만불에 달하는 바, AD에 걸리지 않은 노인의 의료 간호 비용에 비하여 2배가 증가된다. 통계에 따르면, 2010년 서계에서 치매에 사용되는 의료 비용이 6040억불에 달하는 바, 같은 시기 세계 국민 총생산의 1%를 차지한다. 중국 고령화의 빠른 진행, 특히 고령화 노인 인구 절대수의 증가에 따라, AD로 인한 의료 간호와 경제 부담 문제가 날로 심각해지고 있다. 그러므로 적극적으로 AD의 조기 예방, 조기 진단과 조기 치료를 진행하여, 의료 간호 부담을 경감시키는 것은 고령화 사회에서 반드시 해결하여야 하는 의료 위생과 사회 경제 과제이다.
최근 20년래, AD의 진단 연구는 큰 발전을 가져왔다. 연구에 따르면, 현지 진단 치료 기술, 예를 들면 대뇌 노인반 이미징 및 뇌척수액 병리 마커 탐지를 이용하면, AD가 현저한 임상 증상을 보이기 20여년 전에 대뇌의 신경 생화학 및 신경 병리 변화를 탐지할 수 있다. 하지만 노인반 이미징 탐지는 아주 비싸고 또한 중국에 임상 응용이 존재하지 않으며, 아울러 전통적인 관념 및 상대적으로 엄중한 침습성 조작으로 인하여, 뇌척수액 검사도 실제로 임상의 조기 진단에 적용될 수 없으며, 또한 대뇌 구조성 영상 검사는 특히 AD로 인한 MCI의 특징적 변화를 조기 발견할 수 없기 때문에, 중국에는 임상에서 보급하고 실제로 적용할 수 있는 임상 생물 마커 조기 진단 방법이 존재하지 않는다. 2011년 미국국회노쇠연구소와 알츠하이머병협회에서 새로 수정한 진단 표준(NIA-AA)에서, AD 병리 생리 과정과 이로 인한 임상 증상에 대하여 재차 정의하고, 정식으로 무증상기 AD(preclinical AD), AD로 인한 경도인지 장애(mild cognitive impairment due to AD)와 AD로 인한 치매기(dementia due to AD) 세 개 서로 다른 단계의 진단 표준을 결정하였다. 역학 연구에 따르면, MCI의 유병율은 대략 15%~17%이고, 매년 10%~15%가 AD로 발전하며, 정상적인 노인의 연 발병율은 대략 1%이다. MCI는 조기 개입의 고위험 집단이고, 또한 조기 예방 개입의 최적의 진입점이다.
최근 10년래, AD 병리 기전에 대한 일부 치료 연구는 커다란 좌절을 겪었는 바, 가장 주목을 받는 약물에는 Aβ 단클론 항체 Bapineuzumab과 Solanezumab 등과 항Tau 단백질 약물 LMTXIII기 임상 시험이 모두 실패로 막을 내렸다. 상기 결과는 AD 발병 기전의 복잡성을 설명하고, 또한 AD 발병 기전 연구 분야에 커다란 기회가 존재한다는 것을 시사하고 있다. 우리는 BACE1의 Aβ 병리적 절단 과정에서의 중요한 작용을 주목하고, 근년래의 연구에 의하면, Aβ의 퇴적이 치매 증상의 발생보다 훨씬 이른 것을 발견하고, 우리들의 연구에 의하면, 마이크로 RNA(microRNA, miRNA)의 유전자 조절 이상이 그 중의 중요한 일환인 것을 시사하고 있다. hsa-miR은 진핵 생물 중 19-23개 뉴클레오티드로 구성된 한 가지 유형의 소분자 단일 가닥 RNA로서, 비코딩 RNA(non-coding RNA)의 대가족에 속하고 또한 전사 후 유전자 발현의 중요한 소분자를 수평 조절할 수 있으며, 대뇌 조직에서 함량이 풍부할 뿐 아니라, 또한 뇌척수액 및 혈장, 혈청 샘플 중에 안정적으로 존재할 수 있으며, 신경계의 발육과 시냅스 가소성의 형성에 중요한 작용을 한다. hsa-miR는 1차 전사물(pri-miRNA) 생성되는 것으로서, pri-miRNA가 RNase III Drosha에 의하여 스템-루프 구조를 포함하는 전구체 miRNA(pre-miRNA)로 가공되고, 그 후 Dicer( 한 가지 RNase III)의 작용 하에, 머리핀 형상의 pre-miRNA가 세포질 중에서 진일보로 절단되어 성숙된 miRNA를 생성한다. 이러한 성숙된 miRNA와 기타 단백질이 함께 miRNA-단백질 복합체(miRNP)를 구성한다. miRNA가 miRNP를 가이드하여 이들의 타켓 mRNA에 도달하도록 하고, 그 후 유전자 조절 기능을 발휘한다.
기존의 연구에 따르면, hsa-miR 기능 이상은 AD 병리 과정의 개시 및 진전과 관련된다. hsa-miR은 AD 목표 유전자의 3'UTR와 결합한 후 번역 개시를 제한하거나 또는 목표 유전자가 용해되도록 하는 것을 통하여 전화 후 발현을 제한한다. hsa-miR의 AD 발생 발전 과정 중의 조절과 기능에 관련된 연구는 대부분 β 전분 전구체 단백질 용해 효소1(β-site APP cleaving enzyme 1, BACE1)의 3'단 UTR 구역을 타켓 유전자 사이트로 한다. 시체 대뇌 연구 결과에 의하면, 일부 hsa-miRs의 발현 변화는 그 타켓을 통하여 알츠하이머병의 병리학 통로와 연결된다. 그리고, 연구에 의하면 BACE1은 APP를 절단하여 효소 기능을 발휘하는 외, 또한 대뇌에서 세포 대사를 가이드하는 단백질인 세포 생성 단백질 인산화효소 A(PKA) 기능에 필요한 기타 분자를 파괴하고, 신경원 기능을 손상시킨다. 특히 근년래의 연구에 의하면, Aβ의 퇴적이 치매 증상의 발생보다 훨씬 이른 것을 발견하였으며, 이는 Aβ가 AD의 발전 과정에 참여하였을 뿐 아니라, 또한 AD 발생의 종자와 유발 요소라는 것을 설명한다. hsa-miR가 BACE1의 발현 또는 활성의 변화 발생을 유도하는 작용이 특히 두드러지다. 서로 다른 단계의 AD 환자 대뇌 조직 RNA에 대하여 분석을 진행하여 발견한데 의하면, AD 질환 진행 과정에서 miRNA107 발현이 정도차이로 감소되고, BACE1 발현이 증가하여, 상응한 병리 변화가 나타났다. 해당 연구는 miRNA107가 타켓 유전자 BACE1mRNA의 3'단 UTR 구역과 결합하는 것을 통하여 BACE1의 발현을 조절 제어하고, 나아가 관련 단백질 생성에 영향을 미칠 수 있다고 여긴다. 그리고 서로 다른 연구자의 연구 결과가 각각 miRNA124, micRNA15, miRNA195, miRNA19, miRNA298, miRNA328 등 miRNAs의 AD 발병 과정 중에서의 작용에 초점을 두고 있고, 이러한 miRNAs도 AD 병리의 발생 발전을 일부 조절 제어한다고 여긴다.
인체 생물 표본에서, 혈액은 가장 쉽게 취득할 수 있고 조작이 가장 간단하며 외상이 가장 작고 환자가 감당하는 리스크과 고통이 가장 작은 샘플 중의 하나이다. 혈액은AD 고위험 집단을 선별하고, AD에 대하여 조기 발견, 진단과 치료 개입 추적 연구에 가장 적합한 생물 샘플로 간주된다. hsa-miR은 이미 사람의 혈장 또는 혈청에 아주 안정적인 형식으로 존재할 수 있다는 것이 증명되었고, 이의 구조는 이가 내생성 RNase 효소 활성의 영향을 받지 않고 탐지되고 또한 안정적인 AD 진단 혈장 마커가 되도록 하는 능력을 부여하였다. 출원인의 hsa-miR 연구 결과는 말초 혈액 복수개 유전자 마커 hsa-miR 발현이 AD로 인한 MCI와 정상 대조 (Normal Control, NC) 간에 현저한 차이가 존재하고, 혈장 miRNA의 발현 수준을 탐지하는 것을 AD를 선별 진단하는 일반적인 수단으로 삼아, 임상 AD 진단 전략을 최적화할 수 있다는 것을 시사하고 있다.
본 발명은 상기 종래 기술의 결함을 극복하고, 효과적으로 AD를 선별 진단하고, 임상 AD 진단 전략을 최적화할 수 있는 AD로 인한 MCI 진단 마커 및 그 응용을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 구현하기 위하여, 본 발명의 일 방면에서는 AD로 인한 MCI 진단 마커를 제공하고, 구체적으로 하기 구성을 갖는 바,
상기 마커가 혈장 miRNA이고, 상기 혈장 miRNA에는 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p와 hsa-miR-107이 포함된다.
본 발명에서는 또한 AD로 인한 MCI 진단 마커의 AD로 인한 MCI 진단 키트를 제조하는 중에서의 응용을 제공한다.
본 발명에서는 또한 AD로 인한 MCI 진단 키트를 제공하는 바, 상기 키트가 혈장 중의 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p와 hsa-miR-107의 함량을 측정한다.
바람직하게는, 상기 키트에는 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p와 hsa-miR-107의 프라이머와 프로브가 포함된다.
바람직하게는, 상기 키트에 내부 참조 has-miR-93-5p가 포함된다.
바람직하게는, 상기 키트가 측정한 혈장 중의 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p와 hsa-miR-107의 함량을 대입하는 계산 공식은 하기와 같은 바, 즉 7.341－0.029Хhsa-miR-134-3p－0.150Хhsa-miR-22-5p－0.604Хhsa-miR-1185-2-3p－5.321Хhsa-miR-1909-3p－1.372Хhsa-miR-107이다.
상기 AD로 인한 MCI 진단 키트의 사용 방법에는,
(1) 측정하고자 하는 샘플 중에서 총 RNA를 추출하며;
(2) 추출한 총 RNA를 miRNA 역전사 키를 이용하여 역전사 반응을 진행하여 상응한 cDNA를 취득하며;
(3) 취득한 cDNA를 실시간 형광 정량 PCR을 진행하고, 또한 has-miR-93-5p를 내부 참조로 하며, 탐지 결과를 △Ct로 표시하는 바, 그 중에서 △Ct＝Ct microRNA－Ct has-miR-93-5p이며;
(4) 취득한 결과를 하기 공식에 대입하며,
7.341－0.029Хhsa-miR-134-3p－0.150Хhsa-miR-22-5p－0.604Хhsa-miR-1185-2-3p－5.321Хhsa-miR-1909-3p－1.372Хhsa-miR-107;
계산값을 0.174와 비교하는 단계가 포함된다.
본 발명을 사용하는 유익한 효과로는, 드넓은 문헌 열독과 리뷰를 통하여, 일 방면으로 공개적으로 발표된 문헌 중에서 임상에서 AD로 인한 MCI를 조기 진단 및 감별 진단할 수 있는 가치가 있는 마커를 선별하고, 다른 일 방면으로 엄밀한 테스트와 통계 분석을 통하여, 최로 AD로 인한 MCI에 대하여 비교적 높은 진단 가치를 갖는 생물 마커 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p 및 hsa-miR-107의 5개 핵산 분자의 조합을 발견하였다. microRNA 마커와 진단 키트의 연구 제조와 응용을 통하여, 간편한 AD로 인한 MCI의 말초 혈장 진단 마커가 없는 곤경을 돌파하였으며, 속칭 노인 치매라 불리는 알츠하이머병의 조기 진단과 조기 개입에 유리하다. 아울러 잠재적인 치료 가치를 갖고 있는 신형 항AD 치료 약물 타켓을 발견하기 위하여 과학적 근거와 임상 지지를 제공하는 것을 크게 추진시킬 가망성이 있다.
도1은 본 발명의 AD로 인한 MCI 환자 타켓 혈장을 감정하는 microRNA 조합 칩 선별, 훈련과 검증 시험 설계 흐름도.
도2는 본 발명의 AD로 인한 MCI 환자 혈장 microRNA 조합을 결정하는 주요 방법 단계 도면.
도3은 로지스틱 회귀 모델, 훈련 집합과 검증 집합의 ROC 곡선.
본 발명의 기술 내용을 명확하게 설명하기 위하여, 아래 구체적인 실시예를 참조하여 진일보의 설명을 진행하도록 한다.
도1~3을 참조하여, 본 발명에서 제공하는 AD로 인한 MCI 진단 마커의 선별, 검증 등에 대하여 구체적인 설명을 진행하도록 한다.
ㄱ. 연구 대상
연구 대상은 상해시 창닝구 지역 사회와 쉬후이구 지역 사회에서 수집한 50명의 AD로 인한 MCI 노인 케이스이고, 대조 그룹은 연령, 성별, 교육 수준 년도가 매칭되는 건강한 노인이다.
ㄴ. 연구 방법
1. 칩 선별
(1) TRIzol 방법을 사용하여 RNA를 추출하고, 또한 RNasey Mini Kit(QIAGEN)를 사용하여 정제한다. NanoDrop ND-1000을 사용하여 정제 후의 RNA 농도를 측정하고, 전기 영동으로 RNA 완전성을 탐지한다.
(2) 추출된 RNA기 품질 검사에 통과한 후, miRCURYTM Array Power Labeling kit(Cat # 208032-A, Exiqon)를 사용하여 miRNA에 대하여 표기를 진행한다. 표기를 완성한 후, 샘플과 miRCURYTM LNA Array(v.19.0)(Exiqon) 칩을 교잡시키는 바, 반응 총 체적이 50ul(샘플 25ul와 교잡 완충액 25ul)이고, 95℃하에서 2분 동안 변성시키며, 얼음 위에 2분 동안 놓고, 칩과 56℃하에서 16~20 시간 교잡시킨다(교잡 시스템은 Nimblegen Systems, Inc, Madison, WI, USA). 교잡 완성 후 Wash buffer kit(Exiqon)를 사용하여 칩을 세척한다.
(3) Axon GenePix 4000B 칩 스캐너를 사용하여 칩을 스캔한다.
2. 제1회 실시간 정량 PCR 검증
칩을 선별한 후, 대조 그룹에 비하여 현저하게 낮아진 microRNA를 선택하여 실시간 정량 PCR 검증을 진행하는 바, 구체적인 실시 방법을 하기와 같다.
(1) TRIzol 방법을 사용하여 RNA를 추출하고, 또한 RNasey Mini Kit(QIAGEN)를 사용하여 정제한다. NanoDrop ND-1000을 사용하여 정제 후의 RNA 농도를 측정한다.
(2) 추출한 RNA를 품질 검사를 거친 후, 역전사 반응을 진행한다. 반응 총 체적이 20ul(총 RNA300ng, 역전사 특정 프라이머 0.3ul, RNA 효소 억제제 0.3ul, 완충액 2ul, MMLV 역전사 효소 0.3ul, dNTP 2ul, 무핵산 효소수를 20ul까지 첨가)이고, 서로 다른 온도(16℃, 42℃, 85℃) 하에서 서로 다른 시간(30분, 40분, 5분) 반응을 진행한다. 역전사 특정 프라이머 정보는 하기 표1과 같다.
microRNA 역전사 특정 프라이머 정보
유전자 명칭 RT primer
hsa-miR-93-5p 5'GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCTACCTG3'
hsa-miR-134-3p 5'GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTTGGTG3'
hsa-miR-34b-5p 5'GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAATCAG3'
hsa-miR-22-5p 5'GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTAAAGC3'
hsa-miR-1909-3p 5'GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCGGTGAGC3'
hsa-miR-1185-2-3p 5'GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACATGAGAG3'
hsa-miR-569 5'GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACTTTC3'
hsa-miR-5691 5'GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGCTTTC3'
hsa-miR-107 5'GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTGATAG3'
(3) 실시간 정량 PCR 확장 총 시스템이 10ul이고, 모두 40개 사이클 진행하며, 각 반응을 3회 반복한다. hsa-miR-93-5p를 내부 참조로 하고, 탐지 결과를 2 -△△CT로 표시하며, 그 중에서 2 - △△CT 값이 작을 수록 발현량이 더욱 낮다. PCR가 사용하는 프라이머 정보는 하기 표2와 같다.
실시간 정량 PCR가 사용하는 프라이머 정보
유전자 명칭 양방향 프라이머 시퀀스 어닐링 온도(℃) 생성물 길이(bp)
hsa-miR-93-5p GSP:5'GGCAAAGTGCTGTTCGTG3'
R:5'CAGTGCGTGTCGTGGAGT3'		 60 65
hsa-miR-134-3p GSP:5'GAACCTGTGGGCCACCTAGT3'
R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'		 60 64
hsa-miR-34b-5p GSP:5'GGGGGGTAGGCAGTGTCA3'
R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3'		 60 67
hsa-miR-22-5p GSP:5'GGGGAGTTCTTCAGTGGCAA3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3' 60 60
hsa-miR-1909-3p GSP:5'AACGCAGGGGCCGGGT3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3' 60 62
hsa-miR-1185-2-3p GSP:5'GGGGAATATACAGGGGGAGA3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3' 60 66
hsa-miR-569 GSP:5'GGGGGGTAGTTAATGAATCCTG3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3' 60 65
hsa-miR-5691 GSP:5'GCTTGCTCTGAGCTCCGA3'R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3' 60 62
hsa-miR-107 GSP:5'GGAGCAGCATTGTACAGG3'
R:5'CAGTGCGTGTCGTGGA3'		 60 65
3. 제2회 실시간 정량 PCR 검증
제1회 실시간 정량 PCR 검증 후, 발현량이 현저하게 대조 그룹보다 낮은 microRNA를 선택하고, 아울러 그 전에 알츠하이머병 환자 집단에서 발현량이 현저하게 낮아졌다는 것이 증면된 hsa-miR-107을 첨가하여, 재차 검증을 진행하는 바, 구체적인 실시 방법은 위와 같다.
ㄷ. 연구 결과
칩 선별 단계, MCI 그룹 중 hsa-miR-134-3p, hsa-miR-34b-5p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-1909-3p, hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-569와 hsa-miR-5691의 발현 수준이 정상 대조 그룹보다 현저하게 낮고, 구체적인 데이터는 하기 표3과 같다.
정산 대조 그룹(NC) 및 경도 인지 장애(MCI) 그룹 microRNA 발현 차이 수준
microRNA 명칭 Fold Change P값 FDR
hsa-miR-134-3p 0.099 0.362 0.767
hsa-miR-34b-5p 0.225 0.337 0.758
hsa-miR-22-5p 0.369 0.039 0.635
hsa-miR-1909-3p 0.311 0.006 0.592
hsa-miR-1185-2-3p 0.372 0.048 0.642
hsa-miR-569 0.444 0.054 0.642
hsa-miR-5691 0.374 0.016 0.598
실시간 정량 PCR 검증 단계, MCI 그룹 중 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p과 hsa-miR-107의 발현 수준이 정상 대조 그룹보다 현저하게 낮고, 구체적인 데이터는 하기 표4와 같다.
NC 및 MCI 그룹 microRNA 발현 수준(2 - △△CT 값)
microRNA 명칭 제1회 제2회
NC 그룹
(n=20)		 MCI 그룹
(n=10)		 P값 NC 그룹
(n=40)		 MCI 그룹
(n=40)		 P값
hsa-miR-134-3p 1.06 0.34 ＜0.001 1.43 1.12 0.03
hsa-miR-34b-5p 0.90 0.92 0.81 - - -
hsa-miR-22-5p 0.92 0.58 ＜0.001 1.24 0.91 ＜0.001
hsa-miR-1909-3p 0.79 0.35 ＜0.001 1.11 0.69 ＜0.001
hsa-miR-1185-2-3p 0.89 0.16 ＜0.001 2.17 1.37 ＜0.001
hsa-miR-569 0.92 0.67 ＜0.001 - - -
hsa-miR-5691 1.07 0.87 ＜0.001 - - -
hsa-miR-107 - - - 1.52 0.89 ＜0.001
ROC 곡선 분석에 의하면, hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p와 hsa-miR-107 다섯 가지 microRNA를 생물 마커로 하는 것은 AD로 인한 MCI에 대하여 비교적 높은 진단 가치가 있다(AUC가 0.901, 민감도와 특정도는 각각 80.00%와 85.00%).
상기 다섯 가지 microRNA는 독립 변수이고, 다섯 가지 microRNA 연합 예측 확률은 종속 변소이며, 선형 피팅을 진행하여 예측 확률값을 계산하고, 해당 계산 모델(계산 모델1)이 취득한 수치를 재차 ROC 곡선 분석을 진행한 결과에 의하면, 해당 계산 모델이 취득한 수치는 여전히 비교적 높은 진단 가치를 갖는 바, AUC가 0.901이고, 극한값이 0.174이며, 민감도와 특정도가 각각 80.00%와 82.50%이다. 결과는 표5와 표6과 같다.
다섯 가지 microRNA2 - △△CT 값을 변수로 하는 선형 피팅 모델 요약
-2 로그 가능도 Cox & Snell R2 Nagelkerke R2
64.407 0.441 0.588
다섯 가지 microRNA2 - △△CT 값을 변수로 하는 선형 피팅 모델 계수표
변수 명칭 비 표준화 계수 Wals값 P값
B 표준 에러
상수 7.341 1.843 15.868 ＜0.001
hsa-miR-134-3p -0.029 0.593 0.002 0.961
hsa-miR-22-5p -0.150 1.321 0.013 0.909
hsa-miR-1185-2-3p -0.604 0.465 1.688 0.194
hsa-miR-1909-3p -5.321 1.662 10.255 0.005
hsa-miR-107 -1.372 0.603 5.171 0.023
계산 모듈1은,
Logit(p=MCI)=7.341-0.029Хhsa-miR-134-3p-0.150Хhsa-miR-22-5p-0.604Хhsa-miR-1185-2-3p-5.321Хhsa-miR-1909-3p－1.372Хhsa-miR-107.
분석 방법 설명: SPSS 20.0 소프트웨어 패킷을 사용하여 데이터 분석을 진행하는 바, 두 그룹 간의 비교에 대하여, 우선 분산 동질성 검증을 진행하고, 분산이 동질성인 두 그룹 데이터에 대하여 student's t-test를 사용하여 비교 분석을 진행하며, 분산이 고르지 않은 두 그룹 데이터에 대하여, Welch를 사용하여 교정 분석을 진행한다. P＜0.05는 차이가 통계학적 유의성을 갖는다고 간주한다. 통계학적 차이를 갖는 데이터에 대하여 2원 Logistic 회귀를 진행하여 예측 확률값을 취득하고, 예측 확률값을 후속 ROC 곡선 분석에 사용한다. ROC 곡선 분석은 microRNA의 AD로 인한 MCI 진단에서의 가치를 평가하기 위한 것으로서, 곡선 아래 면적(AUC)이 1에 근접할 수록 해당 지표의 진단 가치가 더욱 높다는 것을 설명한다.
현재 AD로 인한 MCI의 생물학 진단은 비싸고 또한 중국 내에서 지적재산권이 없는 대뇌 노인반 PET-CT 검사와 침습적이고 전통적인 관념에 받아들여지지 않는 요추 천자 뇌척수액 검사를 진행하고, 간편하고 최소 침습적인 말초 혈장 검사 조기 진단 기술이 존재하지 않는다.
본 발명의 유익한 효과로는, 드넓은 문헌 열독과 리뷰를 통하여, 일 방면으로 공개적으로 발표된 문헌 중에서 임상에서 AD로 인한 MCI를 조기 진단 및 감별 진단할 수 있는 가치가 있는 마커를 선별하고, 다른 일 방면으로 엄밀한 테스트와 통계 분석을 통하여, 최로 AD로 인한 MCI에 대하여 비교적 높은 진단 가치를 갖는 생물 마커 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p 및 hsa-miR-107의 5개 핵산 분자의 조합을 발견하였다. microRNA 마커와 진단 키트의 연구 제조와 응용을 통하여, 간편한 AD로 인한 MCI의 말초 혈장 진단 마커가 없는 곤경을 돌파하였으며, 속칭 노인 치매라 불리는 알츠하이머병의 조기 진단과 조기 개입에 유리하다. 아울러 잠재적인 치료 가치를 갖고 있는 신형 항AD 치료 약물 타켓을 발견하기 위하여 과학적 근거와 임상 지지를 제공하는 것을 크게 추진시킬 가망성이 있다.
본 명세서에 있어서, 본 발명은 특정 실시방식을 참조하여 설명을 진행하였다. 하지만 이는 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 상황 하에서 여러 가지 수정과 변환을 진행할 수 있을 것이다. 그러므로, 명세서와 도면은 설명을 위한 것이지 제한을 진행하는 것이 아니다.

Claims (7)

  1. AD로 인한 MCI 진단 마커에 있어서, 상기 마커가 혈장 miRNA이고, 상기 혈장 miRNA에는 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p와 hsa-miR-107이 포함되는 것을 특징으로 하는 AD로 인한 MCI 진단 마커.
  2. 청구항1의 상기 AD로 인한 MCI 진단 마커의 AD로 인한 MCI 진단 키트를 제조하는 중에서의 응용.
  3. AD로 인한 MCI 진단 키트에 있어서, 상기 키트가 혈장 중의 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p와 hsa-miR-107의 함량을 측정하는 것을 특징으로 하는 AD로 인한 MCI 진단 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 키트에는 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p와 hsa-miR-107의 프라이머와 프로브가 포함되는 것을 특징으로 하는 AD로 인한 MCI 진단 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 키트에 내부 참조 has-miR-93-5p가 포함되는 것을 특징으로 하는 AD로 인한 MCI 진단 키트.
  6. 제3항에 있어서, 상기 키트가 측정한 혈장 중의 hsa-miR-1185-2-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-134-3p, hsa-miR-1909-3p와 hsa-miR-107의 함량을 대입하는 계산 공식은 하기와 같은 바, 즉
    7.341－0.029Хhsa-miR-134-3p－0.150Хhsa-miR-22-5p－0.604Хhsa-miR-1185-2-3p－5.321Хhsa-miR-1909-3p－1.372Хhsa-miR-107인 것을 특징으로 하는 AD로 인한 MCI 진단 키트.
  7. 제3항 내지 제6항의 어느 한 항의 상기 AD로 인한 MCI 진단 키트의 사용 방법에 있어서,
    (1) 측정하고자 하는 샘플 중에서 총 RNA를 추출하며;
    (2) 추출한 총 RNA를 miRNA 역전사 키를 이용하여 역전사 반응을 진행하여 상응한 cDNA를 취득하며;
    (3) 취득한 cDNA를 실시간 형광 정량 PCR을 진행하고, 또한 has-miR-93-5p를 내부 참조로 하며, 탐지 결과를 △Ct로 표시하는 바, 그 중에서 △Ct＝Ct microRNA－Ct has-miR-93-5p이며;
    (4) 취득한 결과를 하기 공식에 대입하며,
    7.341－0.029Хhsa-miR-134-3p－0.150Хhsa-miR-22-5p－0.604Хhsa-miR-1185-2-3p－5.321Хhsa-miR-1909-3p－1.372Хhsa-miR-107;
    계산값을 0.174와 비교하는 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 AD로 인한 MCI 진단 키트의 사용 방법.
KR1020217012388A 2018-09-26 2019-07-12 Ad로 인한 mci 진단 마커 및 그 응용 KR102626614B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811126537.7A CN109055541B (zh) 2018-09-26 2018-09-26 Ad所致mci诊断标志物及其应用
CN201811126537.7 2018-09-26
PCT/CN2019/095667 WO2020063034A1 (zh) 2018-09-26 2019-07-12 Ad所致mci诊断标志物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210096075A true KR20210096075A (ko) 2021-08-04
KR102626614B1 KR102626614B1 (ko) 2024-01-19

Family

ID=64766130

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217012388A KR102626614B1 (ko) 2018-09-26 2019-07-12 Ad로 인한 mci 진단 마커 및 그 응용

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210340624A1 (ko)
EP (1) EP3828287A4 (ko)
JP (1) JP7291221B2 (ko)
KR (1) KR102626614B1 (ko)
CN (1) CN109055541B (ko)
WO (1) WO2020063034A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055541B (zh) * 2018-09-26 2020-08-28 上海市精神卫生中心（上海市心理咨询培训中心） Ad所致mci诊断标志物及其应用
CN111518205B (zh) * 2019-02-01 2022-03-29 长春金赛药业有限责任公司 人源化抗Aβ单克隆抗体及其应用
CN110623975B (zh) * 2019-10-09 2022-07-05 新乡医学院 调节TERT基因表达的microRNA328及其应用
CN111690739B (zh) * 2020-07-31 2022-09-16 上海市精神卫生中心（上海市心理咨询培训中心） Mci诊断标志物、mci诊断试剂盒及相应的检测方法
CN112458165A (zh) * 2020-12-27 2021-03-09 中山大学孙逸仙纪念医院 一种阿尔茨海默病的预测标志物、检测试剂盒及应用
CN114736959B (zh) * 2022-05-09 2023-09-22 上海市精神卫生中心（上海市心理咨询培训中心） 轻度认知功能损害诊断标志物、试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130040303A1 (en) * 2011-08-08 2013-02-14 Eugenia Wang Biomarker for Alzheimer's Disease and/or Mild Cognitive Impairment, and Use Thereof
WO2017165458A1 (en) * 2016-03-21 2017-09-28 Diamir, Llc Methods of using mirnas from bodily fluids for detection and differentiation of neurodegenerative diseases
US10246747B2 (en) * 2011-04-18 2019-04-02 Diamir, Llc Methods of using miRNA from bodily fluids for early detection and monitoring of mild cognitive impairment (MCI) and Alzheimer's disease (AD)

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104903468B (zh) * 2012-11-16 2019-04-23 萨尔大学 用于帕金森氏病的新诊断MiRNA标志物
US20160022840A1 (en) * 2013-03-09 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Heterologous untranslated regions for mrna
US20140272993A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 The Translational Genomics Research Institute Method of sequencing a full microrna profile from cerebrospinal fluid
US11098362B2 (en) * 2013-11-18 2021-08-24 Diamir, Llc Methods of using miRNAs from bodily fluids for detection and monitoring of Parkinson's disease (PD)
CN104480106B (zh) * 2014-10-08 2017-07-07 河北医科大学第一医院 检测轻度认知障碍患者血清/血浆微小rna标志物及其应用
EP3269823B1 (en) * 2015-03-13 2019-06-05 Hiroshima University Method for assisting detection of alzheimer's disease or mild cognitive impairment
KR101734645B1 (ko) * 2015-05-18 2017-05-11 (주)에이엔티랩스 초기 알츠하이머 병 또는 경도 인지 장애 진단 방법
CN105648088A (zh) * 2016-03-04 2016-06-08 深圳大学 一种ad或mci检测标志物及其检测方法
CN108277271A (zh) * 2018-02-05 2018-07-13 范瑶飞 一种辅助检测阿兹海默疾病的miRNA
CN109055541B (zh) * 2018-09-26 2020-08-28 上海市精神卫生中心（上海市心理咨询培训中心） Ad所致mci诊断标志物及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10246747B2 (en) * 2011-04-18 2019-04-02 Diamir, Llc Methods of using miRNA from bodily fluids for early detection and monitoring of mild cognitive impairment (MCI) and Alzheimer's disease (AD)
US20130040303A1 (en) * 2011-08-08 2013-02-14 Eugenia Wang Biomarker for Alzheimer's Disease and/or Mild Cognitive Impairment, and Use Thereof
WO2017165458A1 (en) * 2016-03-21 2017-09-28 Diamir, Llc Methods of using mirnas from bodily fluids for detection and differentiation of neurodegenerative diseases

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Alzheimers Res Ther,11(1):46. (2019.05.15.) *
Front Mol Neurosci,6:24. (2013.08.30.) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3828287A4 (en) 2022-05-04
WO2020063034A1 (zh) 2020-04-02
JP7291221B2 (ja) 2023-06-14
CN109055541B (zh) 2020-08-28
KR102626614B1 (ko) 2024-01-19
EP3828287A1 (en) 2021-06-02
US20210340624A1 (en) 2021-11-04
JP2022508304A (ja) 2022-01-19
CN109055541A (zh) 2018-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102626614B1 (ko) Ad로 인한 mci 진단 마커 및 그 응용
Cao et al. MicroRNA biomarkers of Parkinson’s disease in serum exosome-like microvesicles
CN113286895A (zh) 用于诊断和治疗脑疾患，尤其是认知障碍的长的非编码RNA(lncRNA)
JP6021893B2 (ja) 軽度認知機能障害（ＭＣＩ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）の早期検出ならびにモニタリングのために体液からのｍｉＲＮＡを使用する方法
CA2780222C (en) Methods of using small rna from bodily fluids for diagnosis and monitoring of neurodegenerative diseases
KR102082016B1 (ko) 알츠하이머병을 나타내는 마이크로rna 바이오마커들
Piscopo et al. MicroRNAs and mild cognitive impairment: A systematic review
US20230143011A1 (en) METHODS OF DETECTING circRNA
Ozdilek et al. Serum microRNA expression levels in Turkish patients with Parkinson’s disease
CN111690739B (zh) Mci诊断标志物、mci诊断试剂盒及相应的检测方法
US20240175085A1 (en) Small rna predictors for huntington's disease
Schubert et al. Targeted proteomic analysis of cognitive dysfunction in remitted major depressive disorder: Opportunities of multi-omics approaches towards predictive, preventive, and personalized psychiatry
CN104480106B (zh) 检测轻度认知障碍患者血清/血浆微小rna标志物及其应用
CN112980941B (zh) 一种诊断受试者是否患阿尔茨海默病的试剂盒及其用途
CN115595363A (zh) 轻度认知功能损害诊断标志物、试剂盒及其应用
KR20180078783A (ko) 알츠하이머병 진단을 위한 신규한 miRNA
CN112458165A (zh) 一种阿尔茨海默病的预测标志物、检测试剂盒及应用
Belzeaux et al. Predicting worsening suicidal ideation during antidepressant treatment with clinical features and peripheral expression of messenger RNA and micro RNA
Yoffe et al. Small noncoding RNAs as biomarkers for pregnancy complications
CN116716389A (zh) 检测TRPC6 mRNA水平的引物组、试剂盒、检测方法及在阿尔兹海默病诊断中的用途
Vachev et al. Alterations of miR-320 family members as a novel diagnostic biomarkers in peripheral blood of schizophrenia patients
Wu The role of peripheral blood microRNA as a biomarker of Alzheimer’s disease
Bradley-Smith A population-based study of cognitive decline and peripheral inflammatory gene expression

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant