CN115595363A - 轻度认知功能损害诊断标志物、试剂盒及其应用 - Google Patents

轻度认知功能损害诊断标志物、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种阿尔茨海默病(俗称老年性痴呆)前驱期阶段即遗忘型轻度认知功能损害(Amnesia mild cognitive impairment，aMCI)的外周血辅助诊断标志物，所述的标志物为血浆miRNA，所述的血浆miRNA包括hsa‑miR‑1185‑2‑3p、hsa‑miR‑22‑5p、hsa‑miR‑134‑3p、hsa‑miR‑93‑5p、hsa‑miR‑107和hsa‑miR‑1909‑3p。本发明还涉及该标志物的应用及相应的试剂盒。本发明的有益效果在于：发现了对阿尔茨海默病前驱期阶段即遗忘型轻度认知功能损害具有更高诊断价值的外周血浆miRNA生物标志物，有利于对MCI的早期诊断和早期干预。

Description

轻度认知功能损害诊断标志物、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及阿尔茨海默病(老年性痴呆)前驱期即遗忘型轻度认知功能损害的技术领域，特别涉及诊断标志物技术领域，具体是指一种遗忘型轻度认知功能损害诊断标志物及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种严重的神经退行性疾病，引发患者进行性、持续性认知功能损害，最终丧失工作和生活能力，是继心脑血管疾病和恶性肿瘤之后老年人致残致死的第三大疾病。我国第七次全国人口普查结果中显示，全国60岁及以上人口约有2.64亿，占全国人口的18.70％[任汝静，殷鹏，诊断学理论与实践,2021，20(04):317-337]，其中60岁以上的老年人患有痴呆症者约有1507万，患有阿尔茨海默病者约有983万，年新增发病人数超过了180万，是世界上痴呆症患者人数最多的国家[Jia L，DuY，Lancet Public Health,2020，5(12):e661-e671.]。数据显示，2015年我国阿尔茨海默病患者人均每年花费高达13万元，导致的社会经济负担总额约11406亿元，为患者家庭和社会医疗保健系统带来了巨大的负担[黄磊,孟令昊,现代预防医学,2021，48(14):2515-2519+2537.]。因此，积极开展AD的早期预防、早期诊断和早期治疗，从而减轻医疗护理负担是老龄化社会必须解决的医疗卫生和社会经济课题。
在2011年美国国立衰老研究所和阿尔茨海默病协会新修订的诊断标准(NIA-AA)中[Mckhann G M，Knopman D S,Alzheimers Dement,2011，7(3):263-9]，对AD病理生理过程与其所致的临床症状进行了重新定义，正式确定无症状期AD(preclinical AD)、AD前驱期即AD所致轻度认知功能损害期(mild cognitive impairment due to AD)和AD所致痴呆期(dementia due to AD)三个不同阶段的诊断标准。流行病学研究表明，MCI的患病率约为15％～17％，每年有10％～15％进展为AD，正常老人的年发病率约为1％。MCI是早期干预的高危人群，也是早期预防干预的最佳切入点[Petersen R C，Roberts R O,Arch Neurol,2009，66(12):1447-55.]。目前对AD的诊断方式多依赖于临床医生的专业评估、影像学老年斑成像、脑脊液病理标志物检测以及血液Aβ、tau标志物检测。但是，老年斑成像检测极为昂贵，脑脊液检查有创操作难以被患者及家属接受，而且老年斑成像、脑脊液标志物和血液标志物检查也无法有效的早期识别遗忘型轻度认知功能损害阶段的特征性变化，因此实际上国内并无临床上可推广实际应用的MCI临床生物标志物早期诊断方法。
目前，已上市的针对AD病理机制的药物仅有两种，包括靶向AD病理Aβ沉积的单克隆抗体Aduhelm(aducanumab)和靶向脑肠轴通过多途径改善AD病理的药物九期一(甘露特钠胶囊，GV-971)。在Aduhelm(aducanumab)Ⅲ期试验中发现，服用aducanumab的患者出现了多种不良反应，其中有35％患者出现了脑水肿，包括1例治疗后死亡事件[Salloway S，Chalkias S，JAMA Neurol,2022，79(1):13-21.]，其有效性和安全性有待进一步的试验验证。九期一(GV-971)目前用于改善轻中度患者的认知功能，有逆转AD患者的神经损伤的潜力，国内第二个Ⅲ期临床试验启动过程中。临床上尚无确定有效的治疗方法可以阻止或逆转AD，仅可通过药物改善其症状，因此早期诊断变得尤为重要。
我们注意到BACE1在Aβ病理性剪切过程中的重要作用，近年来研究发现，Aβ的沉积远远早于痴呆症状的产生，我们的研究提示微小RNA(microRNA，miRNA)的遗传调控异常是其中的关键环节。miRNA是真核生物中一类19-23个核苷酸组成的小分子单链RNA，隶属于非编码RNA(non-coding RNA)大家族。成熟的miRNA是由初级转录物(pri-miRNA)经RNase IIIDrosha加工为含茎-环结构的前体miRNA(pre-miRNA)，之后在Dicer(一种RNase III)的作用下，发夹状的pre-miRNA在细胞质中进一步切割生成。这些成熟的miRNA与其他蛋白质一起组成miRNA-蛋白质复合体(miRNP)。miRNA引导miRNP到达它们的靶mRNA，然后发挥遗传调节功能。
已有研究表明，miRNA不仅在脑组织中含量丰富，亦可稳定存在于脑脊液及血浆、血清样本中，对神经系统的发育和突触可塑性的形成起着重要的作用。miRNA可与AD目标基因的3’UTR结合后通过限制翻译启动或促使目标基因裂解而限制了转录后表达，从而影响AD病理过程的启动及进展。相关miRNA在AD发生发展中的调节与功能研究大多以β淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site APP cleaving enzyme 1，BACE1)的3’端UTR区为靶基因位点。尸体脑研究结果表明某些miRNA的表达变化通过其靶目标与与阿尔茨海默病的病理通路相联系。此外，研究发现BACE1除了剪切APP发挥酶功能外还能够破坏细胞生成蛋白激酶A(PKA)——脑中一种引导细胞代谢的蛋白——功能所需的其他分子，损伤神经元功能。特别是近年来研究发现，Aβ的沉积远远早于痴呆症状的产生，这表明Aβ不仅仅参与了AD的发展过程，更是AD发生的种子和诱因。miRNA诱导BACE1的表达或活性产生变化在其中的作用尤其突出。对于不同阶段AD患者脑组织RNA进行分析，发现AD疾病进程中miRNA107表达不同程度的减少，BACE1表达增加，从而出现相应的病理改变。该研究认为miRNA107可通过与靶基因BACE1mRNA的3’端UTR区结合调控BACE1的表达，进而影响相关蛋白生成。另有不同研究者的研究结果分别聚焦于miRNA124、micRNA15、miRNA195、miRNA19、miRNA298、miRNA328等miRNAs在AD发病过程中的作用，认为这些miRNAs也部分调控了AD病理的发生发展。
在人体生物标本中，血液是最容易获取、操作最简单、创伤最小、患者承担风险和痛苦最轻的样本之一。血液被认为是最适合用于筛选AD高危人群，对AD进行早期发现、诊断和治疗干预随访的生物样本。miRNA已被证明在人血浆或血清中能够以非常稳定的形式存在，它的结构赋予了它免受内源性RNase酶活性的影响而被检测到并成为稳定的AD诊断血浆标志物的能力。申请人的miRNA研究结果提示外周血数个遗传标志物miRNA表达在aMCI与正常对照(Normal Control，NC)之间存在明显的差异，可以将检测血浆miRNA的表达水平作为一种筛查性早期诊断AD的常规手段，优化临床AD诊断策略。
发明内容
本发明的目的克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够廉价、便捷和有效的辅助诊断遗忘型轻度认知功能损害，优化遗忘型轻度认知功能损害临床诊断策略的诊断标志物、试剂盒及其应用。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种轻度认知功能损害诊断标志物，具有如下构成：
所述的标志物为血浆miRNA，所述的血浆miRNA包括hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-107和hsa-miR-1909-3p。
本发明还提供了一种检测轻度认知功能损害诊断标志物的含量的试剂在制备老年性痴呆前驱期轻度认知功能损害诊断试剂盒中的应用。
较佳地，所述的老年性痴呆前驱期轻度认知功能损害具体为遗忘型轻度认知功能损害。
本发明还提供了一种轻度认知功能损害诊断试剂盒，所述的试剂盒用于测定血浆中的hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-107和hsa-miR-1909-3p的含量。
较佳地，所述的试剂盒中包括hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-107和hsa-miR-1909-3p的引物和探针。
较佳地，所述的试剂盒中含有内参hsa-miR-1909-3p。
较佳地，所述的试剂盒所测定血浆中的hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-107的含量代入的计算公式为：4.078+0.299*hsa-miR-107△Ct+0.11*hsa-miR-134-3p△Ct+0.553*hsa-miR-1185-2-3p△Ct+1.818*hsa-miR-93-5p△Ct-2.067*hsa-miR-22-5p△Ct
本发明还提供了一种所述轻度认知功能损害诊断试剂盒的使用方法，包括步骤：
(1)从待测试样品中提取总RNA；
(2)将提取得到的总RNA使用miRNA逆转录试剂盒进行逆转录反应，得到相应的cDNA；
(3)将得到的cDNA进行实时荧光定量PCR，并以hsa-miR-1909-3p为内参，检测结果以△Ct表示，其中，目标miRNA的△Ct值＝目标miRNA的Ct值-同一样本内参的Ct值；
(4)将得到的结果代入公式4.078+0.299*hsa-miR-107△Ct+0.11*hsa-miR-134-3p△Ct+0.553*hsa-miR-1185-2-3p△Ct+1.818*hsa-miR-93-5p△Ct-2.067*hsa-miR-22-5p△Ct中，将计算值与0.0299比较。
采用本发明的有益效果在于：通过广泛的文献阅读、严谨的试验和统计分析，首次发现了对轻度认知功能损害具有极高诊断价值的生物标志物hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-107和hsa-miR-1909-3p组合。通过对miRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，丰富了MCI外周血非编码RNA诊断标志物谱，有利于对MCI的早期诊断和早期干预。同时以上标志物具有极高的作为新型靶向药物作用位点的潜在价值，为AD早期aMCI阶段治疗药物的基因干预研发提供科学依据和临床支撑。
附图说明
图1为血浆miRNA组合芯片筛选火山图。
图2为确定本发明的诊断aMCI患者血浆microRNA组合的主要方法步骤图。
图3为逻辑回归模型、训练集和验证集的ROC曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
结合图1～3，对本发明提供的aMCI诊断标记物的筛选、验证等进行具体说明。
一、研究对象
发现集研究共纳入5例aMCI患者和5例正常认知老人。训练集共纳入aMCI患者20例aMCI患者，对照组纳入10例正常认知老人。验证集受试者共纳入50例aMCI患者和50例正常认知老年人。对照组正常认知老人为年龄、性别、受教育年数匹配的健康老人。以上受试者均签署知情同意书。
二、研究方法
1、芯片筛选(发现集)
(1)提取血浆样本中RNA。
(2)抽提的RNA通过质检后，使用miRCURYTM Array Power Labeling kit(Cat#208032-A，Exiqon)对miRNA进行标记。标记完成后，将样品与miRCURYTM LNA Array(v.19.0)(Exiqon)芯片杂交，反应总体积为50ul(样品25ul和杂交缓冲液25ul)，95℃下变性2分钟，置于冰上2分钟，与芯片在56℃下杂交16～20小时(杂交系统为NimblegenSystems，Inc，Madison，WI，USA)。杂交完成后使用Wash buffer kit(Exiqon)清洗芯片。
(3)使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片。
2、训练集实时定量PCR
芯片筛选后，挑选与对照组比较显著下调的microRNA进行实时定量PCR验证，具体实施方法如下：
(1)提取血浆样本中RNA。
(2)抽提的RNA经过质检后，进行逆转录反应。
(3)逆转录后的cDNA在10ul体系下进行实时定量PCR。以hsa-miR-1909-3p作为内参，检测结果以△Ct表示，其中目标miRNA的△Ct值＝目标miRNA的Ct值-同一样本内参的Ct值。
3、验证集实时定量PCR
训练集实时定量PCR后，在aMCI患者和正常认知老年人中进行再次验证，具体实施方法同上。
三、研究结果
以hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-93-5p和hsa-miR-107五种microRNA的ΔCT值为自变量，五种microRNA联合预测概率为因变量进行Logistic二元回归拟合，计算得到预测概率值，将该计算模型(计算模型1)所得的数值再次进行ROC曲线分析，结果显示，该计算模型所得数值依然具有较高的诊断价值，AUC为0.9212，界限值为0.0299，敏感度和特异度分别为84.00％和88.00％。结果见表1和图3。
表1：以五种microRNA△Ct值为变量的二元逻辑回归模型
Figure BDA0003933339240000061
计算模型1为：
Logit(p＝MCI)＝4.078+0.299*hsa-miR-107△Ct+0.11*hsa-miR-134-3p△Ct+0.553*hsa-miR-1185-2-3p△Ct+1.818*hsa-miR-93-5p△Ct-2.067*hsa-miR-22-5p
分析方法说明：使用SPSS 20.0软件包进行二元Logistic回归分析，得出预测概率值，并将预测概率值用于后续ROC曲线分析。ROC曲线分析用于评价microRNA在aMCI诊断中的价值，曲线下面积(AUC)越接近1则说明该指标的诊断价值越高。
目前aMCI的生物学诊断依靠昂贵且国内无知识产权的大脑老年斑PET-CT检查和有创而不被传统观念接受的腰椎穿刺脑脊液检查，无确切有效微创的外周血浆检查早期诊断技术。
本发明的有益效果在于：通过广泛的文献阅读、严谨的试验和统计分析，首次发现了对aMCI具有较高诊断价值的生物标志物hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-107和hsa-miR-1909-3p组合。通过对microRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，突破了无便捷的aMCI的外周血浆诊断标志物的困境，有利于对阿尔茨海默病俗称老年性痴呆的早期诊断和早期干预。同时有希望极大的推进发现具有潜在治疗价值新型抗AD治疗药物靶标提供科学依据和临床支撑。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施方式作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (8)

1.一种轻度认知功能损害诊断标志物，其特征在于，所述的标志物为血浆miRNA，所述的血浆miRNA包括hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-107和hsa-miR-1909-3p。
2.一种检测权利要求1所述的轻度认知功能损害诊断标志物含量的试剂在制备阿尔茨海默病(老年性痴呆)前驱期轻度认知功能损害诊断试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的老年性痴呆前驱期轻度认知功能损害具体为遗忘型轻度认知功能损害。
4.一种轻度认知功能损害诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于测定血浆中的hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-107和hsa-miR-1909-3p的含量。
5.根据权利要求3所述的轻度认知功能损害诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-107和hsa-miR-1909-3p的引物和探针。
6.根据权利要求4所述的轻度认知功能损害诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有内参hsa-miR-1909-3p。
7.根据权利要求3所述的轻度认知功能损害诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒所测定血浆中的hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-93-5p和hsa-mi R-107的含量代入的计算公式为：4.078+0.299*hsa-miR-107△Ct+0.11*hsa-miR-134-3p△Ct+0.553*hsa-miR-1185-2-3p△Ct+1.818*hsa-miR-93-5p△Ct-2.067*hsa-miR-22-5p△Ct。
8.一种根据权利要求3～6任一项所述轻度认知功能损害诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)从待测试样品中提取总RNA；
(2)将提取得到的总RNA使用miRNA逆转录试剂盒进行逆转录反应，得到相应的cDNA；
(3)将得到的cDNA进行实时荧光定量PCR，并以hsa-miR-1909-3p为内参，检测结果以△Ct表示，其中，目标miRNA的△Ct值＝目标miRNA的Ct值-同一样本hsa-miR-1909-3p的Ct值；
(4)将得到的结果代入公式4.078+0.299*hsa-miR-107△Ct+0.11*hsa-miR-134-3p△Ct+0.553*hsa-miR-1185-2-3p△Ct+1.818*hsa-miR-93-5p△Ct-2.067*hsa-miR-22-5p△Ct。
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