JP2022508304A - Ａｄ誘発ｍｃｉの診断マーカーとその応用 - Google Patents
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Abstract
本発明の有益な効果は次のとおりである。AD誘発 MCIに対して高い診断値を有するバイオマーカーを最初に発見した。簡便に、AD誘発MCIの末梢血漿診断マーカーなしの窮境を打破する。これは一般に老人性痴呆として知られるアルツハイマー病の早期診断と早期介入に役に立つ。【解決手段】本発明は、AD誘発MCIの診断マーカーに関する。前記マーカーは血漿miRNAである。前記血漿miRNAは、hsa-miR-1185-2-3pとhsa-miR-22-5pとhsa-miR-134-3pとhsa-miR-1909-3pとhsa-miR-107とを含む。本発明は更に、その診断マーカーの応用及び相応診断キットに関する。【選択図】図２
Description
本願は、2018年9月26日に中国に出願された出願番号CN 201811126537.7号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
本発明は、アルツハイマー病の前駆期の技術分野、特に診断マーカーの技術分野に関し、具体的にAD誘発MCIの診断マーカーとその応用を指す。
一般に老人性痴呆として知られるアルツハイマー病（Alzheimer's disease，AD）は、脳内のアミロイドタンパク質（amyloidβ-protein，Aβ）の沈着と高度にリン酸化されたタウタンパク質によって誘起される微小管の構造乱れからなる神経原繊維の縺れを主な病理学的特徴とする神経変性疾患である。ADは、高齢者の一般的な疾患、多発性疾患及び高負担の疾患になっている。ADは、慢性や非感染性や加齢性の複雑な原因によって引き起こされる神経変性疾患である。ドイツの精神科医者アルツハイマーが1906年に最初にこの病気を報告してから100年以上で、この病気は希少又は希な病気から最も一般的な種類の老人性痴呆になり、老人性痴呆の約50％～70％を占め、高齢化社会における4つの主要な死因の1つである。疫学研究によると、60歳以上の高齢者の有病率は、3～5％であり、有病率は5歳ごとに2倍になり、80歳以上では最大20％、90歳以上では最大50％になる。控えめに見積もっても、中国には現在少なくとも600万人のAD患者がおり、2020年までに1,000万人以上の患者となるであろう。ADの医療・介護の負担は非常に重く、直接的・間接的な医療費は非常に高い。例えば、米国の各AD患者の平均年間医療費は5万米ドルにも上り、ADのない高齢者の医療費より2倍高くする。統計によると、2010年の全世界の痴呆症の医療費は6,040億米ドルにも上り、同期間の全世界の国民総生産の1％を占めていた。中国の高齢化の加速、特に高齢者の絶対数の増加に伴い、ADによる医療と経済的負担はますます深刻になるであろう。したがって、ADの早期予防、早期診断、早期治療を積極的に行って医療の負担を軽減することは、高齢化社会において解決しなければならない医療・健康・社会経済の課題になる。
過去20年間で、ADの診断研究は大きな進展を遂げた。研究によると、脳老人斑イメージングや脳脊髄液の病理学的マーカー検出などの最新の診断・治療技術を使用すると、ADの明らかな臨床症状が現われる20年以上前に脳の神経生化学的及び神経病理学的変化を検出できることが、示された。しかし、老人斑による画像検出は非常に高価であり、中国で臨床応用が行われたことはない。同時に、伝統的な概念及び比較的重大な侵襲的手術のため、脳脊髄液の検査は実際に臨床早期診断に応用することはできない。さらに、脳構造画像の検査によりAD誘発MCIの特徴的な変化を早期に検出することはできない。したがって、実際に中国で臨床バイオマーカーの臨床的に適用可能な早期診断方法はない。2011年に、米国国立老化研究所とアルツハイマー病協会が新たに改訂した診断基準（NIA-AA）には、ADの病態生理学的プロセスとそれによって誘起された臨床症状を再定義し、無症候性の期間（preclinical AD）、AD誘発軽度認知障害の期間（mild cognitive impairment due to AD）及びAD誘発痴呆症の期間（dementia due to AD）という3つの異なる段階の診断基準を正式に確立した。疫学研究により、MCIの有病率は毎年約15％～17％、ADに至るのは10％～15％であり、正常な高齢者の年間有病率は約1％である。MCIは、早期介入を必要とする高リスク集団であり、早期予防介入の最適な突破口になるポイントである。
過去10年間で、ADの病理学的メカニズムに関するいくつかの治療研究は大変に挫折した。人目を引いているAβモノクローナル抗体Bapineuzumab及びSolanezumab等を含む薬物と抗タウタンパク質の薬物LMTXの第III相臨床試験は、すべて失敗に終わった。上記の結果は、AD病因の複雑さを示しており、AD病因のメカニズムに関する研究に大きな好機があることも示唆している。我々は、Aβの病理学的剪断過程の中におけるBACE1の重要な役割に気づき、近年、研究により、Aβの沈着は痴呆症の発症よりもはるかに早いことがわかる。我々の研究は、微小なRNA（microRNA，miRNA）の異常な遺伝的調節がそれと重要な繋がりがあることを示唆する。hsa-miRは、真核生物の19～23ヌクレオチドによって構成された小さな一本鎖RNAの一種であり、非コードRNA（non-coding RNA）の最大ファミリーに属し、転写後遺伝子発現レベルを調節できる重要な小分子であり、脳組織だけでなく、脳脊髄液、血漿、血清サンプルにも安定して存在し、神経系の発育と神経連接の可塑性の形成に重要な役割を果たしている。hsa-miRは一次転写産物（pri-miRNA）から生成され、pri-miRNAはRNase III Droshaによってステムループ構造を含む前駆体miRNA（pre-miRNA）に処理された後、Dicer（RNase IIIの一種）の作用下でヘアピン様のpre-miRNAを細胞質中にさらに切断し、成熟したmiRNAを生成する。これらの成熟したmiRNAは、他のタンパク質と一緒になってmiRNA-タンパク質複合体（miRNP）を形成する。miRNAは、miRNPを誘導してターゲットmRNAに到達し、遺伝子調節機能を働かせる。
研究によると、hsa-miRの異常な機能がADの病理学的過程の開始と進行に関連することが示された。hsa-miRはAD標的遺伝子の3'UTRと結合して、翻訳開始を制限したり、標的遺伝子を切断したりすることにより、転写後発現を制限する。ADの発生及び発展におけるhsa-miRの調節と機能に関する研究の大部分は、βサイトAPP切断酵素1（BACE1）の3'UTR領域を標的遺伝子座として採用される。死体の脳の研究の結果は、特定のhsa-miRsの発現変化がそれらの標的を介してアルツハイマー病の病理学的経路に関連することを示している。更に、研究により、BACE1は、APPを切断して酵素機能を活かすだけでなく、細胞がタンパク質キナーゼA（PKA）（細胞代謝を導く脳内のタンパク質）を生成するために必要な他の分子を破壊して神経機能を損傷する可能性がある。特に近年、研究によりAβの沈着は痴呆症の発症よりもはるかに早いことがわかる。これは、AβがADの発病過程に関与するだけでなく、ADの発生の種子と誘因であることを示す。BACE1の発現又は活性の変化を誘導する際のhsa-miRの役割は特に顕著である。さまざまな段階のAD患者の脳組織に対してRNA分析を行うと、ADの発病過程にmiRNA107の発現がさまざまな程度で減少し、BACE1の発現が増加して対応病理学的変化が生じることがわかる。この研究は、miRNA107が標的遺伝子BACE1mRNAの3'UTR領域に結合することにより、BACE1の発現を調節して関連タンパク質の生成に影響を与える可能性があることを示唆する。更に、さまざまな研究者の研究結果は、ADの発病過程におけるmiRNA124、micRNA15、miRNA195、miRNA19、miRNA298、miRNA328などのmiRNAsの役割にそれぞれ集中し、これらのmiRNAsも病理学的発生及び発展を部分的に調節することを示す。
人体の生物学的標本の中で、血液は最も入手しやすく、操作が最も簡単で、外傷性が最も少なく、患者が最軽度のリスクと痛みを負うサンプルの1つである。血液は、ADの高リスク集団をふるいにかけ、ADの早期発見、診断及び治療的介入を行うための最も適切な生物学的サンプルであると考えられている。hsa-miRは、ヒトの血漿または血清中に非常に安定した形で存在することが、示されている。その構造は、内因性のRNase酵素活性の影響を免れて検出され、安定したAD診断血漿マーカーになる能力を与える。出願人のhsa-miR研究結果は、末梢血におけるいくつかの遺伝子マーカーhsa-miRの発現が、AD誘発MCIと正常対照（Normal Control, NC）の間に明らかな異なりがあり、血漿miRNAの発現レベルの検出をADの検査診断の常法として臨床AD診断法を最適化することができる。
本発明の目的は、先行技術の上記の欠点を克服し、ＡＤを有効的に検査診断し、臨床ＡＤ診断法を最適化できるAD誘発MCIの診断マーカーとその応用を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明は、一方で以下の組成を有するAD誘発MCIの診断マーカーを提供する。
前記マーカーは血漿miRNAである。前記血漿miRNAは、hsa-miR-1185-2-3pとhsa-miR-22-5pとhsa-miR-134-3pとhsa-miR-1909-3pとhsa-miR-107とを含む。
本発明は、AD誘発MCIの診断キットの製造へのAD誘発MCIの診断マーカーの応用を更に提供する。
本発明は、AD誘発MCIの診断キットの製造へのAD誘発MCIの診断マーカーの応用を更に提供する。
本発明は、AD誘発MCIの診断キットを更に提供する。前記診断キットは、血漿中のhsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p及びhsa-miR-107の含有量を測定する。
好ましくは、前記診断キットは、hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p及びhsa-miR-107のプライマー及びプローブを含む。
好ましくは、前記診断キットは、内部標準has-miR-93-5pを含む。
好ましくは、前記診断キットによって測定された血漿中のhsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p及びhsa-miR-107の含有量を代入する計算式は7.341－0.029×hsa-miR-134-3p－0.150×hsa-miR-22-5p－0.604×hsa-miR-1185-2-3p－5.321×hsa-miR-1909-3p－1.372×hsa-miR-107である。
AD誘発MCIの診断キットの使用方法は、下記のステップを含む。
（1）被試験サンプルから総ＲＮＡを抽出する。
（2）得られた総RNAに対して逆転写反応をmiRNA逆転写キットで行い、対応cDNAを取得する。
（3）得られたcDNAに対してリアルタイム蛍光定量PCRを行い、has-miR-93-5pを内部標準として検出された結果を△Ctで表し、ここで、△Ct = Ct microRNA-Ct has-miR-93- 5pである;
（4）得られた結果を下記の公式に代入する。
7.341－0.029×hsa-miR-134-3p－0.150×hsa-miR-22-5p－0.604×hsa-miR-1185-2-3p－5.321×hsa-miR-1909-3p－1.372×hsa-miR-107。
計算値を0.174と比較する。
（1）被試験サンプルから総ＲＮＡを抽出する。
（2）得られた総RNAに対して逆転写反応をmiRNA逆転写キットで行い、対応cDNAを取得する。
（3）得られたcDNAに対してリアルタイム蛍光定量PCRを行い、has-miR-93-5pを内部標準として検出された結果を△Ctで表し、ここで、△Ct = Ct microRNA-Ct has-miR-93- 5pである;
（4）得られた結果を下記の公式に代入する。
7.341－0.029×hsa-miR-134-3p－0.150×hsa-miR-22-5p－0.604×hsa-miR-1185-2-3p－5.321×hsa-miR-1909-3p－1.372×hsa-miR-107。
計算値を0.174と比較する。
本発明を採用する有益な効果は次のとおりである。広範な文献に対する閲覧及び要約により、一方では、AD誘発 MCIの早期臨床診断と鑑別診断の価値を有する可能なマーカーを公開文献からスクリーニングし、他方では、厳密なテストと統計分析により、hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p及びhsa-miR-107というAD誘発MCIに対して高い診断値を有するバイオマーカーの5つの核酸分子の組み合わせを最初に発見した。microRNAマーカー及び診断キットの開発と応用により、便利なAD誘発MCIの末梢血漿診断マーカーなしの窮境を打破する。これは一般に老人性痴呆として知られるアルツハイマー病の早期診断と早期介入に役に立つ。また、これにより、科学的根拠と臨床的支援を提供する潜在的な治療的価値を有する新型の抗AD治療薬標的の発見を大いに促進することが期待されている。
本発明の技術的内容をより明確に説明できるために、特定の実施形態と併せて以下に更なる説明を行う。
図1－3を参照して、本発明によって提供されたＡＤ誘発ＭＣＩの診断マーカーの検出及び検証を具体的に説明する。
一.研究対象
受験者は上海の長寧区と徐匯区のコミュニティで募集された50例のAD誘発MCIの高齢者であり、対照群は年齢、性別、教育年数の一致する健康な高齢者である。
受験者は上海の長寧区と徐匯区のコミュニティで募集された50例のAD誘発MCIの高齢者であり、対照群は年齢、性別、教育年数の一致する健康な高齢者である。
二．研究方法
1．チップ検出
（1） RNAをTRIzol法で抽出し、RNasey Mini Kit（QIAGEN）で精製する。NanoDrop ND-1000で精製済のRNAの濃度を測定し、電気泳動で完全なRNAを検出する。
（2) 抽出したRNAが品質検査に合格した後、miRCURYTM Array Power Labeling kit（Cat # 208032-A, Exiqon）でmiRNAを標識する。標識が完了した後、サンプルはmiRCURYTM LNA Array（v.19.0）（Exiqon）チップとハイブリダイズし、総反応量は50ul（25ulのサンプルと25ulのハイブリダイゼーションバッファー）であり、95℃で変性を2分間行い、氷上に2分間置き、56℃でチップと16～20時間ハイブリダイズする（ハイブリダイゼーションシステムは、Nimblegen Systems, Inc, Madison, WI, USAである）。ハイブリダイゼーションが完了した後、Wash buffer kit（Exiqon）でチップを洗浄する。
（3）Axon GenePix4000Bチップスキャナーでチップを走査する。
1．チップ検出
（1） RNAをTRIzol法で抽出し、RNasey Mini Kit（QIAGEN）で精製する。NanoDrop ND-1000で精製済のRNAの濃度を測定し、電気泳動で完全なRNAを検出する。
（2) 抽出したRNAが品質検査に合格した後、miRCURYTM Array Power Labeling kit（Cat # 208032-A, Exiqon）でmiRNAを標識する。標識が完了した後、サンプルはmiRCURYTM LNA Array（v.19.0）（Exiqon）チップとハイブリダイズし、総反応量は50ul（25ulのサンプルと25ulのハイブリダイゼーションバッファー）であり、95℃で変性を2分間行い、氷上に2分間置き、56℃でチップと16～20時間ハイブリダイズする（ハイブリダイゼーションシステムは、Nimblegen Systems, Inc, Madison, WI, USAである）。ハイブリダイゼーションが完了した後、Wash buffer kit（Exiqon）でチップを洗浄する。
（3）Axon GenePix4000Bチップスキャナーでチップを走査する。
2．1回目のリアルタイム定量的PCR検証
チップを検出した後、リアルタイム定量PCR検証を行うために、対照群と比較して大幅に下がったmicroRNAを選択する。具体的な実施方法は次のとおりである。
（1）RNAをTRIzol法で抽出し、RNasey Mini Kit（QIAGEN）で精製する。NanoDrop ND-1000で精製済のRNAの濃度を測定する。
（2）抽出したRNAが品質検査に合格した後、逆転写反応を行う。総反応量は20ul（総RNAは300ngであり、逆転写特異的プライマーは0.3ulであり、RNA酵素阻害剤は0.3ulであり、バッファーは2ulであり、MMLV逆転写酵素は0.3ulであり、dNTPは2ulであり、ヌクレアーゼフリー水を20ulまで添加する）であり、異なる温度（16℃、42℃、85℃）でさまざまな時間（30分間、40分間、5分間）かけて反応を行う。逆転写特異的プライマーの情報を下記の表1に示す。
チップを検出した後、リアルタイム定量PCR検証を行うために、対照群と比較して大幅に下がったmicroRNAを選択する。具体的な実施方法は次のとおりである。
（1）RNAをTRIzol法で抽出し、RNasey Mini Kit（QIAGEN）で精製する。NanoDrop ND-1000で精製済のRNAの濃度を測定する。
（2）抽出したRNAが品質検査に合格した後、逆転写反応を行う。総反応量は20ul（総RNAは300ngであり、逆転写特異的プライマーは0.3ulであり、RNA酵素阻害剤は0.3ulであり、バッファーは2ulであり、MMLV逆転写酵素は0.3ulであり、dNTPは2ulであり、ヌクレアーゼフリー水を20ulまで添加する）であり、異なる温度（16℃、42℃、85℃）でさまざまな時間（30分間、40分間、5分間）かけて反応を行う。逆転写特異的プライマーの情報を下記の表1に示す。
（3）リアルタイム定量PCR増幅の総量は10ulであり、反応は合計40サイクル循環し、各反応を3回繰り返す。hsa-miR-93-5pを内部標準として、試験結果を2-△△CTで表し、2-△△CTの値が小さいほど発現レベルは低くなる。PCR用プライマーの情報は下記の表2に示す。
3．2回目のリアルタイム定量的PCR検証
1回目のリアルタイム定量的PCR検証を行った後、対照群よりも発現レベルが大幅に下がったmicroRNAを選択し、以前にアルツハイマー病群で発現の大幅な減少を既に確認したHsa-miR-107を追加して再検証する。具体的な実施方法は次のとおりである。
1回目のリアルタイム定量的PCR検証を行った後、対照群よりも発現レベルが大幅に下がったmicroRNAを選択し、以前にアルツハイマー病群で発現の大幅な減少を既に確認したHsa-miR-107を追加して再検証する。具体的な実施方法は次のとおりである。
三．研究結果
チップ検出の段階で、MCI群のhsa-miR-134-3p、hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-1909-3p、hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-569及びhsa-miR-5691の発現レベルは、正常な対照群よりも大幅に低くなっている。具体的なデータを下記の表3に示す。
チップ検出の段階で、MCI群のhsa-miR-134-3p、hsa-miR-34b-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-1909-3p、hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-569及びhsa-miR-5691の発現レベルは、正常な対照群よりも大幅に低くなっている。具体的なデータを下記の表3に示す。
リアルタイム定量的PCR検証の段階で、MCI群のhsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p及びhsa-miR-107の発現レベルは、正常な対照群よりも大幅に低くなっている。具体的なデータを下記の表4に示す。
ROC曲線分析により、hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p及びhsa-miR-107という5つのmicroRNAは、バイオマーカーとしてAD誘発MCIに対して高い診断価値を有する（AUCは0.901であり、敏感度と特異度はそれぞれ80.00％と85.00％である）。
上記の5種類のmicroRNAを独立変数として、5種類のmicroRNA連携予測確率を従属変数として線形回帰を行って、予測確率値を算出する。その計算モデル（計算モデル1）によって得られた値に対してROC曲線分析を行い、結果は、その計算モデルによって得られた値が依然として高い診断値を有し、AUCが0.901であり、限界値が0.174であり、敏感度と特異度それぞれ80.00％と82.50％であることを示す。結果を表5及び表6に示す。
計算モデル1は次のとおりである。
Logit(p=MCI)=7.341-0.029×hsa-miR-134-3p-0.150×hsa-miR-22-5p-0.604×hsa-miR-1185-2-3p-5.321×hsa-miR-1909-3p－1.372×hsa-miR-107。
Logit(p=MCI)=7.341-0.029×hsa-miR-134-3p-0.150×hsa-miR-22-5p-0.604×hsa-miR-1185-2-3p-5.321×hsa-miR-1909-3p－1.372×hsa-miR-107。
分析方法の説明： SPSS20.0ソフトウェアパッケージでデータ分析を行う。2つのグループ間で比較して、最初に等分散性検定を行う。等分散性のある2セットのデータの場合、スチューデントのt検定(Student’s t-test)で比較分析を行い、不等分散性異分散性のある2セットのデータの場合、ウェルチ(Welch)の補正方法で分析を行う。P <0.05は統計的に有意であると見なされる。統計的に異なるデータに対してバイナリロジスティック回帰を行って予測確率値を取得し、予測確率値を後続のROC曲線分析に使用する。ROC曲線分析は、AD誘発MCIの診断においてmicroRNAの価値を評価するのに用いられる。曲線下面積（AUC）が1に近いほど、この指標の診断価値は高くなる。
現在、AD誘発MCIの生物学的診断は、高価且つ国内の知的財産権がない脳老人斑PET-CT検査と、侵襲的であって従来の概念に受け入れられない腰椎穿刺及び脳脊髄液検査に依存するため、便利且つ低侵襲の末梢血漿検査の早期診断技術はない。
本発明の有益な効果は次のとおりである。広範な文献に対する閲覧及び要約により、一方では、AD誘発 MCIの早期臨床診断と鑑別診断の価値を有する可能なマーカーを公開文献からスクリーニングし、他方では、厳密なテストと統計分析により、 hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p及びhsa-miR-107というAD誘発 MCIに対して高い診断値を有するバイオマーカーの5つの核酸分子の組み合わせを最初に発見した。
microRNAマーカー及び診断キットの開発と応用により、便利なAD誘発MCIの末梢血漿診断マーカーなしの窮境を打破する。これは一般に老人性痴呆として知られるアルツハイマー病の早期診断と早期介入に役に立つ。また、これにより、科学的根拠と臨床的支援を提供する潜在的な治療的価値を有する新型の抗AD治療薬標的の発見を大いに促進することが期待されている。
本明細書で、特定の実施形態を参照して本発明を説明したが、明らかに、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正及び変更を行うことができる。したがって、説明と図面は、限定的なものではなく、例示的なものと見なすべきである。
Claims (7)
- AD誘発MCIの診断マーカーであって、前記マーカーは血漿miRNAである。前記血漿miRNAは、hsa-miR-1185-2-3pとhsa-miR-22-5pとhsa-miR-134-3pとhsa-miR-1909-3pとhsa-miR-107とを含む診断マーカー。
- AD誘発MCIの診断キットの製造への請求項1に記載のAD誘発MCIの診断マーカーの応用。
- AD誘発MCIの診断キットであって、血漿中のhsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p及びhsa-miR-107の含有量を測定するためのAD誘発MCIの診断キット。
- hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p及びhsa-miR-107のプライマー及びプローブを含むことを特徴とする、請求項3に記載のAD誘発MCIの診断キット。
- 内部標準has-miR-93-5pを含むことを特徴とする、請求項4に記載のAD誘発MCIの診断キット。
- 前記診断キットによって測定された血漿中のhsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-134-3p、hsa-miR-1909-3p及びhsa-miR-107の含有量を計算する計算式が7.341－0.029×hsa-miR-134-3p－0.150×hsa-miR-22-5p－0.604×hsa-miR-1185-2-3p－5.321×hsa-miR-1909-3p－1.372×hsa-miR-107であることを特徴とする、請求項3に記載の診断キット。
- （1）被試験サンプルから総ＲＮＡを抽出すること、
（2）得られた総RNAに対して逆転写反応をmiRNA逆転写キットで行い、対応cDNAを取得すること、
（3）得られたcDNAに対してリアルタイム蛍光定量PCRを行い、has-miR-93-5pを内部標準として検出された結果を△Ctで表し、ここで、△Ct = Ct microRNA-Ct has-miR-93- 5pであること、
（4）得られた結果を下記の公式に代入し、
7.341－0.029×hsa-miR-134-3p－0.150×hsa-miR-22-5p－0.604×hsa-miR-1185-2-3p－5.321×hsa-miR-1909-3p－1.372×hsa-miR-107、
計算値を0.174と比較すること
を含むことを特徴とする、請求項3～6のいずれかに記載のAD誘発MCIの診断キットの使用方法。
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