CN114736959A - 轻度认知功能损害诊断标志物、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种阿尔茨海默病前驱期阶段即轻度认知功能损害(Mild cognitiveimpairment，MCI)的外周血辅助诊断标志物，所述的标志物为血浆CircRNA，所述的血浆CircRNA包括circ‑0004738、circ‑0001490、circ‑0003362、circ‑0008289和circ‑0074719。本发明还涉及该标志物的应用及相应的试剂盒。本发明的有益效果在于：发现了对阿尔茨海默病前驱期阶段即轻度认知功能损害具有较高诊断价值的外周血浆CircRNA生物标志物，丰富了MCI外周血非编码RNA诊断标志物谱，有利于对MCI的早期诊断和早期干预。
Description
技术领域
本发明涉及阿尔茨海默病前驱期即轻度认知功能损害的技术领域，特别涉及诊断标志物技术领域，具体是指一种轻度认知功能损害诊断标志物及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种严重的神经退行性疾病，引发患者进行性、持续性认知功能损害，最终丧失工作和生活能力，是继心脑血管疾病和恶性肿瘤之后老年人致残致死的第三大疾病，好发于60岁以上人群。我国第七次全国人口普查结果中显示，全国60岁及以上人口约有2.64亿，占全国人口的18.70％[任汝静，殷鹏，诊断学理论与实践,2021,20(04):317-337]，其中60岁以上的老年人患有痴呆症者约有1507万，患有阿尔茨海默病者约有983万，年新增发病人数超过了180万，是世界上痴呆症患者人数最多的国家[Jia L,Du Y,Lancet Public Health,2020,5(12):e661-e671.]。数据显示，2015年我国阿尔茨海默病患者人均每年花费高达13万元，导致的社会经济负担总额约11406亿元，为患者家庭和社会医疗保健系统带来了巨大的负担[黄磊,孟令昊,现代预防医学,2021,48(14):2515-2519+2537.]。因此，积极开展AD的早期预防、早期诊断和早期治疗，从而减轻医疗护理负担是老龄化社会必须解决的医疗卫生和社会经济课题。
在2011年美国国立衰老研究所和阿尔茨海默病协会新修订的诊断标准(NIA-AA)中[Mckhann G M,Knopman D S,Alzheimers Dement,2011,7(3):263-9]，对AD病理生理过程与其所致的临床症状进行了重新定义，正式确定无症状期AD(preclinical AD)、AD前驱期即AD所致轻度认知功能损害期(mild cognitive impairment due to AD)和AD所致痴呆期(dementia due to AD)三个不同阶段的诊断标准。流行病学研究表明，MCI的患病率约为15％～17％，每年有10％～15％进展为AD，正常老人的年发病率约为1％。MCI是早期干预的高危人群，也是早期预防干预的最佳切入点[Petersen R C,Roberts R O,Arch Neurol,2009,66(12):1447-55.]。目前对AD的诊断方式多依赖于临床医生的专业评估、影像学老年斑成像、脑脊液病理标志物检测以及血液Aβ、tau标志物检测。但是，老年斑成像检测极为昂贵，脑脊液检查有创操作难以被患者及家属接受，而且老年斑成像、脑脊液标志物和血液标志物检查也无法有效的早期识别轻度认知功能损害阶段的特征性变化，因此实际上国内并无临床上可推广实际应用的MCI临床生物标志物早期诊断方法。
目前，已上市的针对AD病理机制的药物仅有两种，包括靶向AD病理Aβ沉积的单克隆抗体Aduhelm(aducanumab)和靶向脑肠轴通过多途径改善AD病理的药物九期一(甘露特钠胶囊，GV-971)。在Aduhelm(aducanumab)Ⅲ期试验中发现，服用aducanumab的患者出现了多种不良反应，其中有35％患者出现了脑水肿，包括1例治疗后死亡事件[Salloway S,Chalkias S,JAMA Neurol,2022,79(1):13-21.]，其有效性和安全性有待进一步的试验验证。九期一(GV-971)目前用于改善轻中度患者的认知功能，有逆转AD患者的神经损伤的潜力，国际Ⅲ期临床试验仍在进行中。临床上尚无确定有效的治疗方法可以阻止或逆转AD，仅可通过药物改善其症状，因此早期诊断变得尤为重要。
有研究发现，阿尔茨海默病患者脑组织皮层环状RNA表达异常，且与临床痴呆严重程度和神经病理严重程度呈显著相关[Chen L L,Dube U,Del-Aguila J L,Nat Neurosci,2019,22(11):1903-1912；Li X,Yang L,Chen L L,Mol Cell,2018,71(3):428-442.]。环状RNA(CircRNA)是一种新的稳定的非编码RNA，它没有5'帽和3'多聚腺苷化尾巴，呈共价闭合的连续环，对核酸外切酶具有更高的耐受性，在各种组织中稳定表达[Nat Rev Mol CellBiol,2016,17(4):205-11.]。CircRNAs可以充当RNA海绵的角色结合miRNA，减少miRNA对mRNA的靶向抑制，调控基因的表达[Moreno-García L,López-Royo T,Int J Mol Sci,2020,21(24).]。此外CircRNAs也可以与RNA结合蛋白直接相互作用,调节mRNA的稳定性和基因的转录[Meng S,Zhou H,Mol Cancer,2017,16(1):94.]。研究显示，在大多数情况下大脑中产生环状RNA的表达比例显著高于其他组织[You X,Vlatkovic I,Nat Neurosci,2015,18(4):603-610.]，这表明环状RNA产生的调控具有神经特异性，可能对神经系统具有调控作用。目前多项研究结果显示circCwc27[Song C,Zhang Y,Cell Death Differ,2021.]、ciRS-7[Shi Z,Chen T,Febs j,2017,284(7):1096-1109.]、circHDAC9[Lu Y,TanL,Neurosci Bull,2019,35(5):877-888.]、circNF1-419[Diling C,Yinrui G,Aging(Albany NY),2019,11(24):12002-12031.]等CircRNAs均在AD发病过程中发挥作用，可以调节AD病理的发生发展。
在人体生物标本中，血液是最容易获取、操作最简单、创伤最小、患者承担风险和创伤最轻的样本之一。血液被认为是最适合用于筛选AD高危人群，对AD进行早期发现、诊断和治疗干预随访的生物样本[Teunissen C E,Verberk I M W,Lancet Neurol,2022,21(1):66-77.]。CircRNA已被证明在人血浆或血清中稳定存在，它的神经特异性以及免受核酸外切酶的影响的独特环状结构使其具有成为稳定的AD诊断血液标志物的潜力[Su L,LiR,Ageing Res Rev,2021,73:101497.]。
发明内容
本发明的目的克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够廉价、便捷和有效的辅助诊断轻度认知功能损害，优化轻度认知功能损害临床诊断策略的诊断标志物、试剂盒及其应用。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种轻度认知功能损害诊断标志物，具有如下构成：
所述的标志物为血浆CircRNA，所述的血浆CircRNA包括circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719。
本发明还提供了一种轻度认知功能损害诊断标志物在制备轻度认知功能损害诊断试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种轻度认知功能损害诊断试剂盒，所述的试剂盒用于测定血浆中的circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719的含量。
较佳地，所述的试剂盒中包括circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719的引物和探针。
较佳地，所述的试剂盒中含有内参GAPDH。
较佳地，所述的试剂盒所测定血浆中的circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719的含量，需采用三种及以上的CircRNA排列组合，其中，代入的计算公式为：
(1)使用ΔCT值进行诊断：
(i)纳入全部5个标志物：
Logit(p＝MCI)＝167.021-13.263*circ-0004738-7.713*circ-0001490-9.728*circ-0003362-1.225*circ-0008289+4*circ-0074719；
(ii)纳入4个标志物：
Logit(p＝MCI)＝199.626-18.641*circ-0001490-10.679*circ-0003362-3.857*circ-0008289-0.555*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝192.097-16.729*circ-0004738-11.154*circ-0003362-6.349*circ-0008289+1.009*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝172.919-17.036*circ-0004738-7.019*circ-0001490-2.206*circ-0008289-0.824*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝166.461-13.91*circ-0004738-7.993*circ-0001490-10.041*circ-0003362+4.149*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝171.706-11.729*circ-0004738-8.152*circ-0001490-5.905*circ-0003362-2.5*circ-0008289；
(iii)纳入3个标志物：
Logit(p＝MCI)＝170.812-13.272*circ-0004738-8.546*circ-0001490-6.166*circ-0003362；
Logit(p＝MCI)＝173.032-16.947*circ-0004738-7.142*circ-0001490-2.929*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝172.093-18.069*circ-0004738-7.427*circ-0001490-1.353*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝191.305-16.328*circ-0004738-9.234*circ-0003362-7.287*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝194.298-22.151*circ-0004738-11.07*circ-0003362+0.125*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝193.302-17.438*circ-0004738-11.332*circ-0008289-2.797*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝199.138-19.032*circ-0001490-10.64*circ-0003362-3.888*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝200.165-21.359*circ-0001490-11.238*circ-0003362-0.999*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝227.092-21.637*circ-0001490-10.234*circ-0008289-5.203*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝329.403-4.751*circ-0003362-36.842*circ-0008289-17.196*circ-0074719；
(2)使用2-ΔΔCT值进行诊断：
(i)纳入全部5个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-44.857+7.145*circ-0004738+3.941*circ-0001490+7.871*circ-0003362+3.444*circ-0008289-2.203*circ-0074719；
(ii)纳入4个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-48.792+9.266*circ-0004738+4.911*circ-0003362+6.637*circ-0008289+1.684*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-43.586+9.628*circ-0004738+2.833*circ-0001490+4.277*circ-0008289+1.444*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-42.822+8.397*circ-0004738+5.062*circ-0001490+7.414*circ-0003362-2.144*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-44.789+6.352*circ-0004738+4.38*circ-0001490+5.688*circ-0003362+3.848*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝-53.671+7.792*circ-0001490+5.685*circ-0003362+9.391*circ-0008289+2.913*circ-0074719；
(iii)纳入3个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-42.627+7.425*circ-0004738+5.89*circ-0001490+5.456*circ-0003362；
Logit(p＝MCI)＝-43.351+9.687*circ-0004738+2.975*circ-0001490+5.266*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝-41.728+10.447*circ-0004738+4.519*circ-0001490+1.932*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-51.374+9.036*circ-0004738+8.928*circ-0003362+6.473*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝-47.379+13.249*circ-0004738+6.302*circ-0003362+2.143*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-48.119+9.661*circ-0004738+8.668*circ-0008289+2.686*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-51.638+10.31*circ-0001490+6.977*circ-0003362+7.391*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝-49.598+13.844*circ-0001490+7.409*circ-0003362+2.583*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-56.864+8.784*circ-0001490+11.099*circ-0008289+5.66*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-83.831+4.988*circ-0003362+23.788*circ-0008289+14.896*circ-0074719。
本发明还提供了一种所述轻度认知功能损害诊断试剂盒的使用方法，包括步骤：
(1)从待测试样品中提取总RNA；
(2)将提取得到的总RNA使用CircRNA逆转录试剂盒进行逆转录反应，得到相应的cDNA；
(3)将得到的cDNA进行实时荧光定量PCR，并以GAPDH为内参，检测结果以△Ct表示，其中，目标CircRNA的△Ct值＝目标CircRNA的Ct值-同一样本GAPDH的Ct值；
(4)将得到的结果代入公式，
(A)使用ΔCT值进行诊断：
(Ai)纳入全部5个标志物：
Logit(p＝MCI)＝167.021-13.263*circ-0004738-7.713*circ-0001490-9.728*circ-0003362-1.225*circ-0008289+4*circ-0074719，将计算值与界值12.6066比较；
(Aii)纳入4个标志物：
Logit(p＝MCI)＝199.626-18.641*circ-0001490-10.679*circ-0003362-3.857*circ-0008289-0.555*circ-0074719，将计算值与界值11.4858比较；
Logit(p＝MCI)＝192.097-16.729*circ-0004738-11.154*circ-0003362-6.349*circ-0008289+1.009*circ-0074719，将计算值与界值10.1673比较；
Logit(p＝MCI)＝172.919-17.036*circ-0004738-7.019*circ-0001490-2.206*circ-0008289-0.824*circ-0074719，将计算值与界值11.9835比较；
Logit(p＝MCI)＝166.461-13.91*circ-0004738-7.993*circ-0001490-10.041*circ-0003362+4.149*circ-0074719，将计算值与界值14.6597比较；
Logit(p＝MCI)＝171.706-11.729*circ-0004738-8.152*circ-0001490-5.905*circ-0003362-2.5*circ-0008289，将计算值与界值11.7350比较；
(Aiii)纳入3个标志物：
Logit(p＝MCI)＝170.812-13.272*circ-0004738-8.546*circ-0001490-6.166*circ-0003362，将计算值与界值12.8923比较；
Logit(p＝MCI)＝173.032-16.947*circ-0004738-7.142*circ-0001490-2.929*circ-0008289，将计算值与界值11.6406比较；
Logit(p＝MCI)＝172.093-18.069*circ-0004738-7.427*circ-0001490-1.353*circ-0074719，将计算值与界值9.5392比较；
Logit(p＝MCI)＝191.305-16.328*circ-0004738-9.234*circ-0003362-7.287*circ-0008289，将计算值与界值11.7093比较；
Logit(p＝MCI)＝194.298-22.151*circ-0004738-11.07*circ-0003362+0.125*circ-0074719，将计算值与界值8.7683比较；
Logit(p＝MCI)＝193.302-17.438*circ-0004738-11.332*circ-0008289-2.797*circ-0074719，将计算值与界值11.0774比较；
Logit(p＝MCI)＝199.138-19.032*circ-0001490-10.64*circ-0003362-3.888*circ-0008289，将计算值与界值10.4940比较；
Logit(p＝MCI)＝200.165-21.359*circ-0001490-11.238*circ-0003362-0.999*circ-0074719，将计算值与界值9.3941比较；
Logit(p＝MCI)＝227.092-21.637*circ-0001490-10.234*circ-0008289-5.203*circ-0074719，将计算值与界值10.4739比较；
Logit(p＝MCI)＝329.403-4.751*circ-0003362-36.842*circ-0008289-17.196*circ-0074719，将计算值与界值69.2305比较；
(B)使用2-ΔΔCT值进行诊断：
(Bi)纳入全部5个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-44.857+7.145*circ-0004738+3.941*circ-0001490+7.871*circ-0003362+3.444*circ-0008289-2.203*circ-0074719，将计算值与界值6.1603096比较；
(Bii)纳入4个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-48.792+9.266*circ-0004738+4.911*circ-0003362+6.637*circ-0008289+1.684*circ-0074719中，将计算值与界值5.2557427比较；
Logit(p＝MCI)＝-43.586+9.628*circ-0004738+2.833*circ-0001490+4.277*circ-0008289+1.444*circ-0074719中，将计算值与界值4.4671113比较；
Logit(p＝MCI)＝-42.822+8.397*circ-0004738+5.062*circ-0001490+7.414*circ-0003362-2.144*circ-0074719中，将计算值与界值5.0039019比较；
Logit(p＝MCI)＝-44.789+6.352*circ-0004738+4.38*circ-0001490+5.688*circ-0003362+3.848*circ-0008289中，将计算值与界值6.9459679比较；
Logit(p＝MCI)＝-53.671+7.792*circ-0001490+5.685*circ-0003362+9.391*circ-0008289+2.913*circ-0074719中，将计算值与界值6.8558784比较；
(Biii)纳入3个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-42.627+7.425*circ-0004738+5.89*circ-0001490+5.456*circ-0003362中，将计算值与界值5.6728826比较；
Logit(p＝MCI)＝-43.351+9.687*circ-0004738+2.975*circ-0001490+5.266*circ-0008289中，将计算值与界值4.3994561比较；
Logit(p＝MCI)＝-41.728+10.447*circ-0004738+4.519*circ-0001490+1.932*circ-0074719中，将计算值与界值3.9375577比较；
Logit(p＝MCI)＝-51.374+9.036*circ-0004738+8.928*circ-0003362+6.473*circ-0008289中，将计算值与界值5.6764800比较；
Logit(p＝MCI)＝-47.379+13.249*circ-0004738+6.302*circ-0003362+2.143*circ-0074719中，将计算值与界值3.5794307比较；
Logit(p＝MCI)＝-48.119+9.661*circ-0004738+8.668*circ-0008289+2.686*circ-0074719中，将计算值与界值4.9378166比较；
Logit(p＝MCI)＝-51.638+10.31*circ-0001490+6.977*circ-0003362+7.391*circ-0008289中，将计算值与界值4.9543415比较；
Logit(p＝MCI)＝-49.598+13.844*circ-0001490+7.409*circ-0003362+2.583*circ-0074719中，计算值与界值3.5684099比较；
Logit(p＝MCI)＝-56.864+8.784*circ-0001490+11.099*circ-0008289+5.66*circ-0074719中，将计算值与界值6.5327602比较；
Logit(p＝MCI)＝-83.831+4.988*circ-0003362+23.788*circ-0008289+14.896*circ-0074719中，计算值与界值16.8425025比较。
采用本发明的有益效果在于：通过严谨的试验和统计分析，首次发现了对轻度认知功能损害具有极高诊断价值的生物标志物circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719五个核酸分子的不同组合。通过对CircRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，丰富了MCI外周血非编码RNA诊断标志物谱，有利于对MCI的早期诊断和早期干预。同时以上标志物具有极高的作为新型靶向药物作用位点的潜在价值，为AD早期MCI阶段治疗药物的基因干预研发提供科学依据和临床支撑。
附图说明
图1为本发明的血浆CircRNA组合芯片筛选火山图。
图2为本发明的CircRNA组合分析和验证研究流程图。
图3为本发明的对照组和MCI患者组5种CircRNA相对表达量(ΔCT值)示意图。
图4为本发明的对照组和MCI患者组5种CircRNA相对表达量(2-△△CT值)示意图。
图5为本发明的circ-0004738判别MCI患者与正常对照老人的ROC曲线示意图。
图6为本发明的circ-0001490判别MCI患者与正常对照老人的ROC曲线示意图。
图7为本发明的circ-0003362判别MCI患者与正常对照老人的ROC曲线示意图。
图8为本发明的circ-0008289判别MCI患者与正常对照老人的ROC曲线示意图。
图9为本发明的circ-0074719判别MCI患者与正常对照老人的ROC曲线示意图。
具体实施方式
为了能够更清楚地描述本发明的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一步的描述。
以下结合图1～图9，对本发明提供的轻度认知功能损害诊断标记物的筛选、验证等的具体实施例进行说明。
一、研究对象
受试者为在上海社区评估纳入的50例轻度认知功能损害患者，对照组为年龄、性别、受教育年数匹配的健康老人。
二、研究方法
1.CircRNA芯片筛选
(1)使用TRIzol LS Reagent提取受试者血浆样本RNA，用
ND-1000测定RNA浓度和纯度。
(2)抽提合格的RNA用Rnase R(Epicentre,Inc.)处理消化线性RNA。富集的CircRNA用Arraystar Super RNA Labeling Kit(Arraystar Inc.)进行PCR扩增并反转录为荧光标记的cRNA。使用RNasey Mini Kit(QIAGEN)纯化后的cRNA，用
ND-1000测定浓度和活性。随后每1ug标记的cRNA加入5ul10×Blocking Agent和1ul 25×Fragmentation Buffer，60℃加热混合物30min，最后加入25ul杂交缓冲液稀释。取稀释后的50ul cRNA杂交到Arraystar Human CircRNAV2(Arraystar Inc.)芯片上，并在杂交炉中65℃孵育17小时，完成后使用Wash buffer kit清洗芯片。
(3)使用Agilent Scanner G2505C芯片扫描仪检测各标本Cy3荧光强度。扫描所得图像用Agilent Feature Extraction software(version 11.0.1.1)进行分析，用R软件包对数据归一化处理获得CircRNA在样本中表达数据。(见图1)
2.实时定量PCR分析集及验证集
CircRNA芯片筛选后，挑选与对照组比较显著上调的CircRNA进行实时定量PCR验证，具体实施方法如下：
(1)使用TRIzol LS Reagent提取受试者血浆样本RNA，用
ND-1000测定RNA浓度和纯度。
(2)由于CircRNA为环状结构，不具有polyA尾的结构，采用随机引物对提取的总RNA进行反转录，合成cDNA。配制如下反转录反应体系：RNA 300ng，随机引物1ul，逆转录缓冲液2ul，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1ul，无RNA酶水加至10ul。轻弹管底混匀，短暂离心后立即进行反转录反应。37℃温育15分钟，接着85℃5秒灭活酶的活性，结束反应。
(3)将所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。反应体系如下：2×MasterMix5μl，10uM正、反向特异引物各0.5μl，无RNA酶水加至10ul，轻弹管底将溶液混合，短暂离心。将PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。所有的指标均按以下程序进行：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))，每个反应包含三个复孔。CircRNA的相对定量采用2-△△CT法进行分析，以GAPDH作为参照，对PCR产物的拷贝数进行标准化(目标CircRNA的△Ct值＝目标CircRNA的Ct值-同一样本GAPDH的Ct值)，△△Ct＝实验组△Ct-对照组△Ct，取各样本2-△△CT即为相对表达量。
三、研究结果
芯片筛选阶段纳入经老年斑成像确诊的5例AD所致MCI患者和匹配的5例正常老人，AD所致MCI组中circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719的表达水平显著高于正常对照组，研究流程见图2，具体数据如下表3所示：
表3：正常对照组(NC)及轻度认知障碍(MCI)组CircRNA表达差异水平
实时定量PCR验证阶段，MCI组中circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719的表达水平显著高于正常对照组，分析集数据见表4，验证集数据见表5、图3、图4所示：
表4-1：分析集NC及MCI组CircRNA表达水平(△CT值)
表4-2：分析集NC及MCI组CircRNA表达水平(2-△△CT值)
表5-1：验证集NC及MCI组CircRNA表达水平(△CT值)
表5-2：验证集NC及MCI组CircRNA表达水平(2-△△CT值)
ROC曲线分析显示，circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719五种CircRNA作为生物标记物对轻度认知功能损害具有较高的诊断价值(见图5～图9)。
以上述五种CircRNA为自变量，使用三种及以上的CircRNA进行排列联合，并对联合预测概率为因变量进行Logistic二项回归拟合，计算得到预测概率值，将该计算模型(计算模型1-16)所得的数值再次进行ROC曲线分析，结果显示，计算模型所得数值依然具有较高的诊断价值。
1.以三种及以上CircRNA的△CT值为变量的线性拟合模型汇总：
(1)五种CircRNA联合：
计算模型1：
Logit(p＝MCI)＝167.021-13.263*circ-0004738-7.713*circ-0001490-9.728*circ-0003362-1.225*circ-0008289+4*circ-0074719；
AUC为1，界限值为12.6066，敏感度为100％，特异度为100％。
(2)四种CircRNA联合：
计算模型2：
Logit(p＝MCI)＝199.626-18.641*circ-0001490-10.679*circ-0003362-3.857*circ-0008289-0.555*circ-0074719；
AUC为1，界限值为11.4858，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型3：
Logit(p＝MCI)＝192.097-16.729*circ-0004738-11.154*circ-0003362-6.349*circ-0008289+1.009*circ-0074719；
AUC为1，界限值为10.1673，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型4：
Logit(p＝MCI)＝172.919-17.036*circ-0004738-7.019*circ-0001490-2.206*circ-0008289-0.824*circ-0074719；
AUC为1，界限值为11.9835，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型5：
Logit(p＝MCI)＝166.461-13.91*circ-0004738-7.993*circ-0001490-10.041*circ-0003362+4.149*circ-0074719；
AUC为1，界限值为14.6597，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型6：
Logit(p＝MCI)＝171.706-11.729*circ-0004738-8.152*circ-0001490-5.905*circ-0003362-2.5*circ-0008289；
AUC为1，界限值为11.7350，敏感度为100％，特异度为100％。
(3)三种CircRNA联合：
计算模型7：
Logit(p＝MCI)＝170.812-13.272*circ-0004738-8.546*circ-0001490-6.166*circ-0003362；
AUC为1，界限值为12.8923，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型8：
Logit(p＝MCI)＝173.032-16.947*circ-0004738-7.142*circ-0001490-2.929*circ-0008289；
AUC为1，界限值为11.6406，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型9：
Logit(p＝MCI)＝172.093-18.069*circ-0004738-7.427*circ-0001490-1.353*circ-0074719；
AUC为1，界限值为9.5392，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型10：
Logit(p＝MCI)＝191.305-16.328*circ-0004738-9.234*circ-0003362-7.287*circ-0008289；
AUC为1，界限值为11.7093，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型11：
Logit(p＝MCI)＝194.298-22.151*circ-0004738-11.07*circ-0003362+0.125*circ-0074719；
AUC为1，界限值为8.7683，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型12：
Logit(p＝MCI)＝193.302-17.438*circ-0004738-11.332*circ-0008289-2.797*circ-0074719；
AUC为1，界限值为11.0774，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型13：
Logit(p＝MCI)＝199.138-19.032*circ-0001490-10.64*circ-0003362-3.888*circ-0008289；
AUC为1，界限值为10.4940，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型14：
Logit(p＝MCI)＝200.165-21.359*circ-0001490-11.238*circ-0003362-0.999*circ-0074719；
AUC为1，界限值为9.3941，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型15：
Logit(p＝MCI)＝227.092-21.637*circ-0001490-10.234*circ-0008289-5.203*circ-0074719；
AUC为1，界限值为10.4739，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型16：
Logit(p＝MCI)＝329.403-4.751*circ-0003362-36.842*circ-0008289-17.196*circ-0074719；
AUC为1，界限值为69.2305，敏感度为100％，特异度为100％。
2.以三种及以上CircRNA的2-△△CT值为变量的线性拟合模型汇总：
(1)五种CircRNA联合
计算模型1：
Logit(p＝MCI)＝-44.857+7.145*circ-0004738+3.941*circ-0001490+7.871*circ-0003362+3.444*circ-0008289-2.203*circ-0074719；
AUC为1，界限值为6.1603096，敏感度为100％，特异度为100％。
(2)四种CircRNA联合
计算模型2：
Logit(p＝MCI)＝-48.792+9.266*circ-0004738+4.911*circ-0003362+6.637*circ-0008289+1.684*circ-0074719；
AUC为1，界限值为5.2557427，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型3：
Logit(p＝MCI)＝-43.586+9.628*circ-0004738+2.833*circ-0001490+4.277*circ-0008289+1.444*circ-0074719；
AUC为1，界限值为4.4671113，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型4：
Logit(p＝MCI)＝-42.822+8.397*circ-0004738+5.062*circ-0001490+7.414*circ-0003362+-2.144*circ-0074719；
AUC为1，界限值为5.0039019，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型5：
Logit(p＝MCI)＝-44.789+6.352*circ-0004738+4.38*circ-0001490+5.688*circ-0003362+3.848*circ-0008289；
AUC为1，界限值为6.9459679，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型6：
Logit(p＝MCI)＝-53.671+7.792*circ-0001490+5.685*circ-0003362+9.391*circ-0008289+2.913*circ-0074719；
AUC为1，界限值为6.8558784，敏感度为100％，特异度为100％。
(3)三种CircRNA联合
计算模型7：
Logit(p＝MCI)＝-42.627+7.425*circ-0004738+5.89*circ-0001490+5.456*circ-0003362；AUC为1，界限值为5.6728826，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型8：
Logit(p＝MCI)＝-43.351+9.687*circ-0004738+2.975*circ-0001490+5.266*circ-0008289；AUC为1，界限值为4.3994561，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型9：
Logit(p＝MCI)＝-41.728+10.447*circ-0004738+4.519*circ-0001490+1.932*circ-0074719；AUC为1，界限值为3.9375577，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型10：
Logit(p＝MCI)＝-51.374+9.036*circ-0004738+8.928*circ-0003362+6.473*circ-0008289；AUC为1，界限值为5.6764800，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型11：
Logit(p＝MCI)＝-47.379+13.249*circ-0004738+6.302*circ-0003362+2.143*circ-0074719；AUC为1，界限值为3.5794307，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型12：
Logit(p＝MCI)＝-48.119+9.661*circ-0004738+8.668*circ-0008289+2.686*circ-0074719；AUC为1，界限值为4.9378166，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型13：
Logit(p＝MCI)＝-51.638+10.31*circ-0001490+6.977*circ-0003362+7.391*circ-0008289；AUC为1，界限值为4.9543415，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型14：
Logit(p＝MCI)＝-49.598+13.844*circ-0001490+7.409*circ-0003362+2.583*circ-0074719；AUC为1，界限值为3.5684099，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型15：
Logit(p＝MCI)＝-56.864+8.784*circ-0001490+11.099*circ-0008289+5.66*circ-0074719；AUC为1，界限值为6.5327602，敏感度为100％，特异度为100％。
计算模型16：
Logit(p＝MCI)＝-83.831+4.988*circ-0003362+23.788*circ-0008289+14.896*circ-0074719；AUC为1，界限值为16.8425025，敏感度为100％，特异度为100％。
分析方法说明：使用SPSS 20.0软件包进行数据分析，对于两组之间的比较，首先进行方差齐性检验，对于方差齐性的两组数据，采用student’s t-test进行比较分析；对于方差不齐的两组数据，采用Welch校正分析。P＜0.05被认为差异具有统计学意义。将具有统计学差异的数据进行二元Logistic回归，得出预测概率值，并将预测概率值用于后续ROC曲线分析。ROC曲线分析用于评价CircRNA在轻度认知功能损害诊断中的价值，曲线下面积(AUC)越接近1则说明该指标的诊断价值越高。图5～图9为单一CircRNA判别ROC曲线。
四、本发明的突出有益效果
目前轻度认知功能损害的生物学诊断依靠昂贵且国内无知识产权的大脑老年斑PET-CT检查和有创而不被传统观念接受的腰椎穿刺脑脊液检查，无确切有效微创的外周血浆检查早期诊断技术。
本发明的有益效果在于：一方面本发明涉及阿尔茨海默病前驱期阶段即轻度认知功能损害的外周血辅助诊断标志物，所述的标志物为血浆CircRNA，所述的血浆CircRNA包括circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719。另一方面本发明还涉及该标志物的应用及相应的试剂盒。通过对CircRNA标志物和诊断试剂盒的研制和应用，发现了对阿尔茨海默病前驱期阶段即轻度认知功能损害具有较高诊断价值的外周血浆CircRNA生物标志物，丰富了MCI外周血非编码RNA诊断标志物谱，有利于对MCI的早期诊断和早期干预。此外，本发明具有极高的作为新型靶向药物作用位点的潜在价值，为AD及AD前驱期阶段治疗药物的开发提供科学依据和临床支撑。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
Claims (7)
1.一种轻度认知功能损害诊断标志物，其特征在于，所述的标志物为血浆CircRNA，所述的血浆CircRNA包括circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719。
2.一种权利要求1所述的轻度认知功能损害诊断标志物在制备轻度认知功能损害诊断试剂盒中的应用。
3.一种轻度认知功能损害诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于测定血浆中的circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719的含量。
4.根据权利要求3所述的轻度认知功能损害诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719的引物和探针。
5.根据权利要求4所述的轻度认知功能损害诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有内参GAPDH。
6.根据权利要求3所述的轻度认知功能损害诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒所测定血浆中的circ-0004738、circ-0001490、circ-0003362、circ-0008289和circ-0074719五种circ的含量，需采用三种及以上的CircRNA排列组合，其中，代入的计算公式为：
(1)使用ΔCT值进行诊断：
(i)纳入全部5个标志物：
Logit(p＝MCI)＝167.021-13.263*circ-0004738-7.713*circ-0001490-9.728*circ-0003362-1.225*circ-0008289+4*circ-0074719；
(ii)纳入4个标志物：
Logit(p＝MCI)＝199.626-18.641*circ-0001490-10.679*circ-0003362-3.857*circ-0008289-0.555*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝192.097-16.729*circ-0004738-11.154*circ-0003362-6.349*circ-0008289+1.009*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝172.919-17.036*circ-0004738-7.019*circ-0001490-2.206*circ-0008289-0.824*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝166.461-13.91*circ-0004738-7.993*circ-0001490-10.041*circ-0003362+4.149*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝171.706-11.729*circ-0004738-8.152*circ-0001490-5.905*circ-0003362-2.5*circ-0008289；
(iii)纳入3个标志物：
Logit(p＝MCI)＝170.812-13.272*circ-0004738-8.546*circ-0001490-6.166*circ-0003362；
Logit(p＝MCI)＝173.032-16.947*circ-0004738-7.142*circ-0001490-2.929*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝172.093-18.069*circ-0004738-7.427*circ-0001490-1.353*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝191.305-16.328*circ-0004738-9.234*circ-0003362-7.287*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝194.298-22.151*circ-0004738-11.07*circ-0003362+0.125*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝193.302-17.438*circ-0004738-11.332*circ-0008289-2.797*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝199.138-19.032*circ-0001490-10.64*circ-0003362-3.888*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝200.165-21.359*circ-0001490-11.238*circ-0003362-0.999*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝227.092-21.637*circ-0001490-10.234*circ-0008289-5.203*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝329.403-4.751*circ-0003362-36.842*circ-0008289-17.196*circ-0074719；
(2)使用2-ΔΔCT值进行诊断：
(i)纳入全部5个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-44.857+7.145*circ-0004738+3.941*circ-0001490+7.871*circ-0003362+3.444*circ-0008289-2.203*circ-0074719；
(ii)纳入4个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-48.792+9.266*circ-0004738+4.911*circ-0003362+6.637*circ-0008289+1.684*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-43.586+9.628*circ-0004738+2.833*circ-0001490+4.277*circ-0008289+1.444*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-42.822+8.397*circ-0004738+5.062*circ-0001490+7.414*circ-0003362-2.144*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-44.789+6.352*circ-0004738+4.38*circ-0001490+5.688*circ-0003362+3.848*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝-53.671+7.792*circ-0001490+5.685*circ-0003362+9.391*circ-0008289+2.913*circ-0074719；
(iii)纳入3个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-42.627+7.425*circ-0004738+5.89*circ-0001490+5.456*circ-0003362；
Logit(p＝MCI)＝-43.351+9.687*circ-0004738+2.975*circ-0001490+5.266*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝-41.728+10.447*circ-0004738+4.519*circ-0001490+1.932*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-51.374+9.036*circ-0004738+8.928*circ-0003362+6.473*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝-47.379+13.249*circ-0004738+6.302*circ-0003362+2.143*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-48.119+9.661*circ-0004738+8.668*circ-0008289+2.686*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-51.638+10.31*circ-0001490+6.977*circ-0003362+7.391*circ-0008289；
Logit(p＝MCI)＝-49.598+13.844*circ-0001490+7.409*circ-0003362+2.583*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-56.864+8.784*circ-0001490+11.099*circ-0008289+5.66*circ-0074719；
Logit(p＝MCI)＝-83.831+4.988*circ-0003362+23.788*circ-0008289+14.896*circ-0074719。
7.一种根据权利要求3～6任一项所述轻度认知功能损害诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)从待测试样品中提取总RNA；
(2)将提取得到的总RNA使用CircRNA逆转录试剂盒进行逆转录反应，得到相应的cDNA；
(3)将得到的cDNA进行实时荧光定量PCR，并以GAPDH为内参，检测结果以△Ct表示，其中，目标CircRNA的△Ct值＝目标CircRNA的Ct值-同一样本GAPDH的Ct值；
(4)将得到的结果代入公式为：
(A)使用ΔCT值进行诊断：
(Ai)纳入全部5个标志物：
Logit(p＝MCI)＝167.021-13.263*circ-0004738-7.713*circ-0001490-9.728*circ-0003362-1.225*circ-0008289+4*circ-0074719，将计算值与界值12.6066比较；
(Aii)纳入4个标志物：
Logit(p＝MCI)＝199.626-18.641*circ-0001490-10.679*circ-0003362-3.857*circ-0008289-0.555*circ-0074719，将计算值与界值11.4858比较；
Logit(p＝MCI)＝192.097-16.729*circ-0004738-11.154*circ-0003362-6.349*circ-0008289+1.009*circ-0074719，将计算值与界值10.1673比较；
Logit(p＝MCI)＝172.919-17.036*circ-0004738-7.019*circ-0001490-2.206*circ-0008289-0.824*circ-0074719，将计算值与界值11.9835比较；
Logit(p＝MCI)＝166.461-13.91*circ-0004738-7.993*circ-0001490-10.041*circ-0003362+4.149*circ-0074719，将计算值与界值14.6597比较；
Logit(p＝MCI)＝171.706-11.729*circ-0004738-8.152*circ-0001490-5.905*circ-0003362-2.5*circ-0008289，将计算值与界值11.7350比较；
(Aiii)纳入3个标志物：
Logit(p＝MCI)＝170.812-13.272*circ-0004738-8.546*circ-0001490-6.166*circ-0003362，将计算值与界值12.8923比较；
Logit(p＝MCI)＝173.032-16.947*circ-0004738-7.142*circ-0001490-2.929*circ-0008289，将计算值与界值11.6406比较；
Logit(p＝MCI)＝172.093-18.069*circ-0004738-7.427*circ-0001490-1.353*circ-0074719，将计算值与界值9.5392比较；
Logit(p＝MCI)＝191.305-16.328*circ-0004738-9.234*circ-0003362-7.287*circ-0008289，将计算值与界值11.7093比较；
Logit(p＝MCI)＝194.298-22.151*circ-0004738-11.07*circ-0003362+0.125*circ-0074719，将计算值与界值8.7683比较；
Logit(p＝MCI)＝193.302-17.438*circ-0004738-11.332*circ-0008289-2.797*circ-0074719，将计算值与界值11.0774比较；
Logit(p＝MCI)＝199.138-19.032*circ-0001490-10.64*circ-0003362-3.888*circ-0008289，将计算值与界值10.4940比较；
Logit(p＝MCI)＝200.165-21.359*circ-0001490-11.238*circ-0003362-0.999*circ-0074719，将计算值与界值9.3941比较；
Logit(p＝MCI)＝227.092-21.637*circ-0001490-10.234*circ-0008289-5.203*circ-0074719，将计算值与界值10.4739比较；
Logit(p＝MCI)＝329.403-4.751*circ-0003362-36.842*circ-0008289-17.196*circ-0074719，将计算值与界值69.2305比较；
(B)使用2-ΔΔCT值进行诊断：
(Bi)纳入全部5个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-44.857+7.145*circ-0004738+3.941*circ-0001490+7.871*circ-0003362+3.444*circ-0008289-2.203*circ-0074719，将计算值与界值6.1603096比较；
(Bii)纳入4个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-48.792+9.266*circ-0004738+4.911*circ-0003362+6.637*circ-0008289+1.684*circ-0074719中，将计算值与界值5.2557427比较；
Logit(p＝MCI)＝-43.586+9.628*circ-0004738+2.833*circ-0001490+4.277*circ-0008289+1.444*circ-0074719中，将计算值与界值4.4671113比较；
Logit(p＝MCI)＝-42.822+8.397*circ-0004738+5.062*circ-0001490+7.414*circ-0003362-2.144*circ-0074719中，将计算值与界值5.0039019比较；
Logit(p＝MCI)＝-44.789+6.352*circ-0004738+4.38*circ-0001490+5.688*circ-0003362+3.848*circ-0008289中，将计算值与界值6.9459679比较；
Logit(p＝MCI)＝-53.671+7.792*circ-0001490+5.685*circ-0003362+9.391*circ-0008289+2.913*circ-0074719中，将计算值与界值6.8558784比较；
(Biii)纳入3个标志物：
Logit(p＝MCI)＝-42.627+7.425*circ-0004738+5.89*circ-0001490+5.456*circ-0003362中，将计算值与界值5.6728826比较；
Logit(p＝MCI)＝-43.351+9.687*circ-0004738+2.975*circ-0001490+5.266*circ-0008289中，将计算值与界值4.3994561比较；
Logit(p＝MCI)＝-41.728+10.447*circ-0004738+4.519*circ-0001490+1.932*circ-0074719中，将计算值与界值3.9375577比较；
Logit(p＝MCI)＝-51.374+9.036*circ-0004738+8.928*circ-0003362+6.473*circ-0008289中，将计算值与界值5.6764800比较；
Logit(p＝MCI)＝-47.379+13.249*circ-0004738+6.302*circ-0003362+2.143*circ-0074719中，将计算值与界值3.5794307比较；
Logit(p＝MCI)＝-48.119+9.661*circ-0004738+8.668*circ-0008289+2.686*circ-0074719中，将计算值与界值4.9378166比较；
Logit(p＝MCI)＝-51.638+10.31*circ-0001490+6.977*circ-0003362+7.391*circ-0008289中，将计算值与界值4.9543415比较；
Logit(p＝MCI)＝-49.598+13.844*circ-0001490+7.409*circ-0003362+2.583*circ-0074719中，计算值与界值3.5684099比较；
Logit(p＝MCI)＝-56.864+8.784*circ-0001490+11.099*circ-0008289+5.66*circ-0074719中，将计算值与界值6.5327602比较；
Logit(p＝MCI)＝-83.831+4.988*circ-0003362+23.788*circ-0008289+14.896*circ-0074719中，计算值与界值16.8425025比较。
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