KR20210046700A - 히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합 및 이의 약제학적 용도 - Google Patents

히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합 및 이의 약제학적 용도 Download PDF

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Abstract

종양의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서 히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합의 용도, 활성 성분으로서 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 단백질 키나제 억제제를 포함하는 약제학적 조성물, 및 히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제를 조합하여 암을 치료 또는 예방하는 방법.

Description

히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합 및 이의 약제학적 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 중국 특허청에 2018년 8월 17일에 출원된 "히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합 및 이의 약제학적 용도"라는 제목의 중국 특허 출원 번호 제201810943005.6호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 전문에 본원이 참조로 포함된다.
분야
본 발명은 소분자 표적 항-종양 약물의 기술 분야에 관한 것으로, 구체적으로 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 히스톤 데아세틸라제 억제제와 키나제 억제제의 조합의 용도, 및 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 키나제 억제제를 활성 약제학적 성분으로서 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 특히 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 치다마이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 활성 성분으로서 함유하는 약제학적 조성물, 및 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 치다마이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 조합을 사용하여 암을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다.
암은 인간 건강을 위협하는 주요 질환이다. 암 치료는 전 세계의 관심을 끌었다. 기존의 화학요법 약물은 비특이적으로 세포 분열을 차단하여 세포 사멸을 유발하지만, 정상적인 인간 세포도 손상시키면서 종양 세포를 사멸시킨다. 또한, 많은 세포독성 약물은 치료 범위가 제한되어 있고 부작용을 유발하기 쉬워 장기간 투여 후 약물 내성이 증가할 수 있다.
다양한 유형의 항-종양 약물이 선행 기술에서 개발되었으며, 그 중에서 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제는 중요한 부류의 항-종양 화합물이다.
히스톤 데아세틸라제 (HDAC)는 염색체의 구조적 변형 및 유전자 발현의 조절에 중요한 역할을 하는 프로테아제의 한 부류이다. 일반적으로, 히스톤 아세틸화는 DNA와 히스톤 8량체의 해리 및 뉴클레오솜 구조 이완을 촉진하여 다양한 전사 인자와 협동적 전사 인자가 DNA 결합 부위에 특이적으로 결합하여 유전자 전사를 활성화할 수 있다. 핵에서, 히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화는 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HAT) 및 HDAC에 의해 조절되는 동적 평형상태에 있다. HAT는 아세틸 그룹을 아세틸-CoA에서 히스톤의 아미노 말단에 있는 특정 라이신 잔기로 전달한다. HDAC는 히스톤을 탈아세틸화시키고 음전으로 하전된 DNA에 단단히 결합하여 염색질이 더 조밀하고 구부러져 전사 억제가 발생한다. 암 세포에서, HDAC의 과발현은 탈아세틸화를 증가시킨다. 히스톤의 양전하를 복원함으로써, DNA와 히스톤 간의 상호작용이 증가하고 느슨한 뉴클레오솜이 조밀해져서 이는 일부 종양 억제 유전자를 포함하는 특정 유전자의 발현에 불리하다. 새로운 부류의 항-종양 약물로서 HDAC 억제제는 염색질의 특정 영역에서 히스톤 아세틸화를 증가시켜 세포 아폽토시스 및 분화와 관련된 단백질의 발현 및 안정성을 조절하고 세포 아폽토시스 및 분화를 유도할 수 있다. HDAC 억제제는 다양한 혈액 종양 및 고형 종양에 대해 우수한 치료 효과를 가질뿐만 아니라 종양 세포에 대한 상대적으로 높은 선택성과 낮은 독성의 이점을 가지고 있다.
문헌은 HDAC의 활성을 억제하는 것이 종양 세포의 성장, 전이 및 침입을 효과적으로 억제할 수 있음을 나타내었다. HDAC 억제제는 중요한 항-종양 후보가 되었다. 연구는 HDAC 억제제가 종양 세포의 증식을 효과적으로 억제하고, 종양 세포 아폽토시스 및 분화 뿐만 아니라 항-혈관형성을 유도하고, 종양 세포 이동, 침입 및 전이에 대한 억제 효과를 가질 수 있음을 나타내었다.
HDAC 억제제는 히스톤의 N-말단에서 라이신 잔기의 아세틸화 및 탈아세틸화를 조절하여 종양 억제 유전자를 활성화하여 종양 세포 성장을 억제하고 종양 세포 아폽토시스를 유도한다 (참조: Apoptosis on hepatoma cells but not on primary hepatocytes by histone deacetylase inhibitors valproate and ITF2357. J Hepatol, 2005, 42: 210-217). Yindong Kang 등은 2009년 수지상 세포를 통한 히스톤 데아세틸라제 억제제의 면역조절 효과에 대한 연구 리뷰를 발표하였다 (참조: Yindong Kang et al., Studies on the Immunomodulation Effect of Histone Deacetylase Inhibitors through Dendritic Cells, Chinese Journal of Transplantation, Volume 3, Issue 2, 2009). 이 리뷰는 히스톤 데아세틸라제 억제제와 수지상 세포 (DC) 뿐만 아니라 면역 조절 간의 관계를 설명했다. HDAC 억제제는 고농도에서 강력한 항-종양 활성을 나타내고, 저농도에서 다양한 면역조절 효과를 나타낸다. HDAC 억제제가 DC에 직접 작용하면, 이들은 성숙 동안 DC가 케모카인 CCL19로 이동하는 능력을 약화시켜 DC가 이들의 항원-제시 기능을 발휘하기 위해 림프 기관에 도달하고 들어가는 것을 제한한다. HDAC 억제제는 DC의 분화, 성숙 및 이동에 영향을 미치고, 항원-특이적 T 림프구의 활성화에 중요한 역할을 하는 가장 중요한 항원-제시 세포로서 DC의 항원 제시 과정을 방해한다.
최근, HDAC의 기능에 대한 연구가 빠르게 진행되고 있다. 선택적 HDAC 억제제를 개발하기 위해 점진적으로 이 분야의 연구 핫스팟이 되었다. 현재, 다양한 HDAC 억제제, 예를 들어, 보리노스타트, 치다마이드가 이미 국내외에서 시판되고 있다. 그러나, 기존 HDAC 억제제는 활성, 효능, 약물 대사 및 부작용 측면에서 여전히 개선될 필요가 있다. 사람들의 증가하는 건강 요구를 충족시키기 위해, 더 강력한 효능과 더 나은 효과를 갖는 항-종양 약물이 선행 기술에서 시급히 요구되고 있다.
요약
본 발명자들은 히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합이 상승적인 항-종양 효과를 달성할 수 있다는 것을 연구에서 예기치 않게 발견하였다.
일 양태에서, 본 발명은 종양의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서 히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 단백질 키나제 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 종양을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
단백질 키나제는 단백질에서 특정 잔기의 인산화를 촉매하는 효소 계열이다. 이들은 티로신과 세린/트레오닌-단백질 키나제로 크게 분류되는데, 이는 다양한 세포 과정을 조절하고 세포 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 단백질의 큰 계열을 나타낸다. 단백질 키나제는 ATP의 말단 포스페이트가 단백질의 티로신, 세린 및/또는 트레오닌 잔기의 하이드록실 그룹으로 전달되는 것을 촉매하는 신호 전달 경로와 관련된 효소이다. 포유류에서 정상 또는 돌연변이 단백질 키나제의 과발현 또는 부적절한 발현은 광범위하게 연구되었으며 암을 포함한 많은 질환의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 이들 키나제는 부분적으로 비-수용체 티로신 키나제, 예를 들어, 야누스 키나제 계열 (Jak1, Jak2, Jak3 및 Tyk2); 수용체 티로신 키나제, 예를 들어, 혈소판-유래된 성장 인자 수용체 키나제 (PDGFR); 및 세린/트레오닌-단백질 키나제, 예를 들어, b-RAF를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 비정상적인 키나아제 활성은 양성 및 악성 증식 장애와 면역 및 신경계의 부적절한 활성화에 의해 야기된 질환을 포함한 많은 질환에서 관찰된다.
구조적으로 관련된 효소의 큰 계열로서, 단백질 키나제는 세포에서 다양한 신호 전달 과정을 제어하는 역할을 한다 (예를 들어, 문헌 (Hardie and Hanks, The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, Calif., 1995) 참조). 단백질 키나제는 이들의 구조와 촉매 기능의 보존으로 인해 조상 유전자로부터 진화한 것으로 생각된다. 거의 모든 키나제는 250 내지 300개의 아미노산을 가진 유사한 촉매 도메인을 함유한다. 키나제는 이들의 인산화 수용체 (예를 들어, 단백질-티로센, 단백질-세린/트레오닌, 지질 등)에 의한 상이한 계열로 분류될 수 있다. 일반적으로 이들 계열 각각에 상응하는 서열 모티프가 확인되었다 (예를 들어, 문헌 (Hanks and Hunter, (1995), FASEB J.9:576-596; Knighton etc., Science, (1991) 253:407-414; Hiles etc., Cell, (1992), 70:419-429; Kunz etc., Cell (1993), 73:585-596; Garcia-Bustos etc., EMBO J., (1994), 13:2352-2361) 참조).
많은 질환은 돌연변이, 과발현 또는 부적절한 조절, 비정상적인 조절 또는 조절장애 뿐만 아니라 암 및 기타 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 성장 인자 또는 사이토 카인의 과잉 생산 또는 과소 생산에 의해 야기된 부적절한 키나제 활성과 관련된다. 단백질 키나제는 치료적 개입을 위한 표적으로서 중요한 효소의 한 부류가 되었다. 특히, 티로신 키나제 cKit 과활성화는 혈액 종양과 관련이 있으며 암 치료요법의 표적이다 (참조: Heinrich, Griffith etc., Blood 2000, 96 (3): 925-32). 유사하게, JAK3 신호전달은 백혈병과 림프종에 관여하며, 이는 현재 잠재적인 치료 표적으로서 사용된다 (참조: Heinrich, Griffith etc., 2000). 단백질 키나제는 또한 세포-주기 조절에 중요한 역할을 한다. 다양한 종류의 암을 포함한 다양한 질환이 신호 전달 경로의 다양한 구성요소의 결함에 의해 야기될 수 있음이 밝혀졌다 (참조: Gaestel et al., Current Medicinal Chemistry, (2007) 14: 2214-2234). 최근, 발암 신호 전달 경로와 관련된 단백질 키나제는 많은 유형의 암을 포함한 다양한 질환의 치료에서 중요한 약물 표적이 되었다. 다양한 단백질 키나제 억제제 또한 항-종양 약물로서 사용되었다.
본 발명에서, 바람직하게는, 이의 단백질 키나제 억제제는 세린 키나제 억제제, 트레오닌 키나제 억제제 및 티로신 키나제 억제제로부터 선택된다. 바람직하게는, 이의 단백질 키나제 억제제는 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명에서, 바람직하게는, 이의 히스톤 데아세틸라제 억제제는 치다마이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
본 발명의 특히 바람직한 한 양태에서, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 치다마이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이고, 키나제 억제제는 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 보다 바람직하게는, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 치다마이드이고, 키나제 억제제는 치아우라닙이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 단백질 키나제 억제제를 활성 약제학적 성분으로서 포함하고, 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물에서, 바람직하게는, 단백질 키나제 억제제는 세린 키나제 억제제, 트레오닌 키나제 억제제 및 티로신 키나제 억제제로부터 선택된다. 특히 바람직하게는, 이의 단백질 키나제 억제제는 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다. 특히 바람직하게는, 활성 약제학적 성분은 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 치다마이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진다. 특정 구현예에서, 활성 약제학적 성분은 치아우라닙 및 치다마이드로 이루어진다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 약제학적 조성물은 5 내지 100 mg의 치다마이드 및 5 내지 100 mg의 치아우라닙을 포함하는 단위 투여 형태로 제공된다. 보다 바람직하게는, 치다마이드 및 치아우라닙의 양은 각각 5 내지 60 mg 및 10 내지 100 mg이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 약제학적 조성물에서, 이의 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체는 포비돈, 코포비돈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스 및 폴리비닐 카프랄락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체 (예를 들어, Soluplus®)를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체는 미세결정질 셀룰로스, 포비돈, 코포비돈, 락토스, 만니톨, 크로스포비돈 및 나트륨 카복시메틸 셀룰로스를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 과립, 고체 분산체, 캡슐 또는 정제의 형태이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 단백질 키나제 억제제를 활성 성분으로 포함하는 암 또는 종양 치료 또는 예방용 키트를 제공하며, 여기서, 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 단백질 키나제 억제제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있는, 치다마이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 활성 성분으로서 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명의 키트는 활성 성분으로서 첫 번째로 투여되는 치다마이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 두 번째로 투여되는 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 단백질 키나제 억제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여함을 포함하는, 종양을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 예상치 않게 히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합이 누드 마우스 실험에서 확인된 상당한 상승적인 항-종양 효과를 가지며, 두 성분의 조합된 투여는 상승적으로 암 세포의 아폽토시스를 유도하고 상승적으로 종양 세포의 콜로니 형성을 억제할 수 있음을 보여준다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 예상치 않게 히스톤 데아세틸라제 억제제를 사용한 전처리가 단백질 키나제 억제제에 대한 세포의 민감도를 증가시키고 단백질 키나제 억제제의 항-종양 효과를 보다 효과적으로 향상시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
MTS, 콜로니 형성, 유세포 분석에서의 세포주기 분석, Caspase 3/7 및 본 개시 내용의 다른 실험에서 히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합된 투여가 간세포 암종 세포주, 예를 들어, Bel-7404 및 Bel-7402의 세포주기 억제 및 아폽토시스를 상승적으로 유도할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합에 의한 그러한 상승적인 항-종양 효능은 누드 마우스에서 Bel-7404 세포 이종이식 모델에 의해서도 입증되었다.
도 1은 히스톤 데아세틸라제 억제제 (치다마이드)에 의해 상승적으로 감작된 단백질 키나제 억제제 (치아우라닙)의 항-종양 효능을 나타낸다;
도 2는 히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합이 크리스탈 바이올렛 검정 (crystal violet assay)에서 나타난 바와 같이 종양 세포 클론생성을 상승적으로 억제할 수 있음을 나타낸다;
도 3은 히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합이 요오드화 프로피듐 (PI)을 사용한 유세포 분석 분석에 의해 시험된 종양 세포 주기의 억제를 향상시킬 수 있음을 나타낸다;
도 4는 히스톤 데아세틸라제 억제제와 단백질 키나제 억제제의 조합이 Caspase 3/7 검정에 의해 시험된 종양 아폽토시스의 유도를 향상시킬 수 있음을 나타낸다;
도 5는 히스톤 데아세틸라제 억제제 (치다마이드)를 사용한 전처리가 순차적 투여 실험에서 단백질 키나제 억제제 (치아우라닙)의 항-종양 효과를 향상시킬 수 있음을 나타낸다;
도 6은 누드 마우스 모델에서 히스톤 데아세틸라제 억제제 (치다마이드)와 단백질 키나제 억제제 (치아우라닙)의 조합의 상승적인 항-종양 효능을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a" 및 "the"는, 문맥상 명확한 표시가 없는 한, 복수 형태를 포함하도록 의도된다. 또한, 본 발명의 명세서 및/또는 청구범위에서 용어 "포함하다 (include)", "포함하다 (comprise)", "함유하다 (contain)" 또는 이의 변형은 용어 "포함하다 (comprise)"와 유사한 방식으로 사용되도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "완화하다" 및 "개선하다"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 이러한 용어는 유익하거나 예상되는 효과 (치료적 이점 및/또는 예방적 이점을 포함하지만 이에 제한되지 않음)와 관련된 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항-종양"은 "종양 상태"의 치료, 완화 또는 개선을 지칭한다. 용어 "종양 상태"는 제어되지 않은 증식, 무한 증식, 전이 가능성, 빠른 성장 및 높은 증식 속도, 무질서한 발암 신호전달 및 특정 고유 모폴로지와 같은 비정상적인 성장 특성을 가진 세포의 존재를 지칭한다. 이는 다음 세포의 성장을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: (1) 히스톤 데아세틸라제, 티로신 또는 세린/트레오닌-단백질 키나제의 과발현과 관련된 양성 또는 악성세포 (예를 들어, 종양 세포); (2) 히스톤 데아세틸라제, 티로신 또는 세린/트레오닌-단백질 키나제의 비정상적으로 높은 활성과 관련된 양성 또는 악성세포 (예를 들어, 종양 세포).
당업자는 본 발명의 약물 조합 또는 약제학적 조성물에서 활성 약제학적 성분이 유효량 또는 치료학적 유효량으로 사용된다는 것을 이해할 수 있다. 용어 "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은 아래에 정의된 바와 같은 의도된 결과 (질환 치료에서의 적용을 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 달성하기에 충분한 본원에 기재된 억제제의 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 의도된 적용 (시험관내 또는 생체내), 또는 치료되는 대상체 및 질환 상태, 예컨대 대상체의 체중 및 연령, 질환 중증도, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 용어는 또한 표적 세포에서 특정 반응 (예를 들어, 증식 감소 또는 표적 단백질 활성의 하향-조절)을 유도할 수 있는 용량에도 적용된다. 특정 투여량은 선택된 특정 화합물, 따라야 할 투여 용법, 다른 화합물과 함께 투여되는지 여부, 투여 시기, 투여될 조직 및 이를 운반하기 위한 물리적 전달 시스템에 따라 달라질 수 있다.
"상승작용" 또는 "상승 효과"는 하나의 활성 약제학적 성분이 유효량의 또 다른 활성 약제학적 성분 또는 또 다른 치료요법과 조합될 때, 이들 각각을 단독으로 사용하는 것보다 더 나은 효과를 생성함을 의미한다. 일부 구현예에서, 유효 치료량 또는 치료요법에서 활성 약제학적 성분의 상승적인 사용은 단독으로 사용될 때 2개의 활성 약제학적 성분 또는 치료요법 각각의 부가 효과보다 더 나은 효과를 생성한다.
용어 "억제제"는 표적 단백질의 활성 또는 발현을 억제함으로써 표적 단백질의 생물학적 기능을 억제할 수 있는 화합물을 지칭한다. 억제제의 생물학적 활성은 종양의 발생, 성장 또는 확산 또는 자가면역 질환에서 원치않는 면역 반응과 관련이 있다.
용어 "조합된 투여", "공동-투여" 및 이의 문법적 동등물은 약제학적 활성 성분 및/또는 이의 대사산물이 동물에 동시에 존재할 수 있도록 2개 이상의 약제학적 활성 성분을 대상체에 적용하는 것을 포함한다. 조합된 투여는 활성 성분을 분리된 조성물로서 동시에 또는 상이한 시간에 투여하는 것, 또는 이의 2개의 활성 성분을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 공동-투여된 활성 약제학적 성분은 동일한 제제, 또는 상이한 제제, 또는 동일한 제품, 예를 들어, 키트 형태로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료 효과"는 상기 기재된 바와 같은 치료 및/또는 예방 이점을 포함한다. 예방 효과는 질환 또는 병태의 출현을 지연 또는 제거, 질환 또는 병태의 발병을 지연 또는 제거, 질환 또는 병태의 진행을 늦추거나, 중지 또는 역전시키거나, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 당업계에 잘 알려진 다양한 유기 및 무기 반대이온으로부터 유도된 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적으로 허용되는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 무기 산 및 유기 산으로 형성될 수 있다. 이로부터 염을 유도할 수 있는 무기 산은, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 포함한다. 이로부터 염을 유도할 수 있는 유기 산은, 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 석신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 살리실산 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염기 부가 염은 무기 및 유기 염기로 형성될 수 있다. 이로부터 염을 유도할 수 있는 무기 염기는, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 등을 포함한다. 이로부터 염을 유도할 수 있는 유기 염기는, 예를 들어, 1차 아민, 2차 아민 및 3차 아민, 천연 치환된 아민, 사이클릭 아민, 염기성 이온 교환 수지 등을 포함한 치환된 아민, 특히, 예컨대 이소프로필 아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민 및 에탄올아민을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 염기 부가 염은 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염으로부터 선택된다.
"약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장 조절제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 사용되는 이러한 매질 및 제제는 당업계에 잘 알려져있다. 활성 성분과 비상용성인 것들을 제외하고, 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 본 발명의 치료 조성물에 사용될 수 있다. 보충 활성 성분이 또한 이의 조성물에 혼입될 수 있다.
본 발명에서, 종양은 다음과 같은 질환 또는 병태를 포함한다: 유방암; 난소암; 자궁암; 자궁경부암; 전립선암; 방광암; 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모발상 세포 백혈병, 골수이형성증, 골수 증식성 질환, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 비만세포증, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 다발성 골수종 (MM) 및 골수이형성 증후군 (MDS)을 포함한 백혈구 증가증; 골암; 폐암; 기저 세포 암종, 흑색종 및 편평-세포 암종을 포함한 피부암; 망막모세포종; 피부 또는 안내 (안구) 흑색종; 원발성 간 암종; 신장 암종; 갑상선 암종; AIDS-관련 림프절종, 예컨대 미만성 거대 B-세포 림프종, 면역모세포 B-세포 림프종 및 작은 비절단 세포 림프종; 카포시 육종; 신경교종을 포함한 원발성 뇌 종양과 같은 중축 신경계 암; 신경섬유종증 및 신경초종, 악성 섬유성 세포 종양, 악성 섬유성 조직구종, 악성 수막종, 악성 중피종 및 악성 혼합 물러리안 (mullerian) 종양을 포함한 말초 신경계 암; 구강 및 구인두암; 위암; 고환암; 흉선 암종; 직장암 및 결장암.
본 개시 내용에 따른 조합 치료는 넓은 투여 범위에서 효과적이다. 예를 들어, 성인 치료에 사용되는 경우, 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 단백질 키나제 억제제의 1일 용량은 각각 1 내지 100 mg, 바람직하게는 5 내지 100 mg일 수 있다. 특정 구현예에서, 치다마이드와 치아우라닙의 조합이 사용되며, 여기서, 치다마이드의 1일 투여량은 각각 5 내지 60 mg이고, 치아우라닙의 1일 용량은 10 to 100 mg이다. 정확한 용량은 선택된 활성 약제학적 성분, 투여 경로, 투여될 화합물의 형태, 치료될 대상체, 치료될 대상체의 체중, 및 의사의 선호도 및 경험에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조합은 또한 항-종양 활성을 갖는 다른 활성 약제학적 성분과 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 키트는 항-종양 활성을 갖는 다른 활성 약제학적 성분(들)을 추가로 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, 과립, 캡슐 또는 정제의 형태로 경구 투여에 적합할 수 있다. 경구 투여에 적합한 본 발명의 약제학적 조성물은 캡슐 또는 정제, 액체 또는 분무와 같은 분산된 투여 형태일 수 있으며, 각각은 액체 투여 형태 (예컨대, 현탁액 또는 슬러리) 및 경구 고체 투여 형태 (예컨대 정제 또는 벌크 분말)를 포함하는, 수성 또는 비-수성 액체, 수중유 에멀젼 또는 유중수 액체 에멀젼에 분말로서 또는 과립, 용액 또는 현탁액으로 미리 결정된 양의 활성 성분을 함유한다. 본원에 사용된 "정제"는 일반적으로 정제, 캐플릿, 캡슐 (연질 젤라틴 캡슐 포함), 및 로젠지를 지칭한다. 경구 투여 형태는 치료될 개체 또는 환자에 의해 경구로 복용하는, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐, 에멀젼, 친유성 및 친수성 현탁액, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제공될 수 있다. 그러한 투여 형태는 임의의 약제학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 충전제, 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당; 셀룰로스 제제, 예컨대 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)일 수 있다. 일반적으로, 조성물은 활성 성분을 액체 담체 또는 미세하게 분쇄된 고체 담체 또는 이 둘 다와 균일하고 단단하게 혼합한 다음, 필요한 경우 제품을 원하는 형태로 성형함으로써 제조된다. 예를 들어, 임의로 하나 이상의 보조 성분으로 압축 또는 성형하여 정제로 제조될 수 있다. 또한 적절한 기계를 사용하여 분말 또는 과립과 같은 자유-유동 형태로 활성 성분을 압축하여 정제로 제조될 수 있다. 이의 활성 성분은 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제 및/또는 계면활성제 또는 분산제와 같은 부형제와 혼합된다. 성형된 정제는 적합한 기계에서 불활성 액체 희석제로 적신 분말화된 화합물의 혼합물을 성형하여 제조될 수 있다. 담체는 투여에 필요한 제제 형태에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 조성물이 경구 투여 형태로 제조되는 경우, 임의의 통상적인 약제학적 매질이 담체로 사용될 수 있다. 경구 액체 제제 (예컨대 현탁액, 용액 및 엘릭시르)의 경우 또는 물, 글리콜, 오일, 알코올, 향미제, 방부제, 착색제 등과 같은 에어로졸은 담체로 사용될 수 있다. 경구 고형 제제의 경우, 락토스가 사용되지 않는 일부 구현예에서, 예를 들어, 전분, 당, 미세결정질 셀룰로스, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제 및 붕해제가 담체로 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체 경구 제제에 적합한 담체는 분말, 캡슐 및 정제를 포함한다. 필요한 경우, 정제는 표준 수성 또는 비-수성 기술로 코팅될 수 있다.
조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 첨가제 및 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 첨가제 및 부형제는 접착 방지제, 소포제, 완충제, 중합체, 산화방지제, 방부제, 킬레이트제, 점도 조절제, 강장제, 향미제, 착색제, 향미 증강제, 불투명화제, 현탁제, 결합제, 충전제, 가소제, 윤활제 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
실험
실험 재료
인간 간암 세포주 Bel-7402 및 Bel-7404는 Shanghai Institutes for Biological Sciences, CAS의 Cell Resource Center로부터 구입했으며, 10% 소 태아 혈청 (FBS; Gibco)과 1% 페니실린-스트렙토마이신 (HyClone)을 함유하는 RPMI-1640 (Gibco)의 배양 배지에서 5% CO2하에 37℃에서 일상적으로 배양되었다. 트립신은 Gibco에서 구입하였다. 크리스탈 바이올렛, RNase A (10 mg/mL) 용액, 요오드화 프로피듐 (PI), Triton X-100은 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.로부터 구입하였다. MTS 세포 생존력 검정 키트, Caspase-Glo 3/7 검정 키트는 Promega로부터 구입하였다. 누드 마우스는 Guangdong Medical Laboratory Animal Center로부터 구입하였다.
실시예 1. MTS 검정
실험 방법
Bel-7402, Bel-7404 세포주를 트립신으로 분해하고 수집하고 계수한 다음, 96-웰 세포 배양 플레이트에 각 웰당 3,000개 세포/180 μL의 밀도로 씨딩하고, 5% CO2하에 37℃에서 배양하였다. 밤새 배양한 후, 세포는 도 1에 나타낸 그룹화 및 최종 농도에 따라 투여되었다 (투여 후 각각의 웰의 최종 체적은 200 μL였다). 각각의 그룹에 대한 용량은 3개의 복제 웰로 배열되었다. 세포를 120시간 동안 약물로 처리한 후, 96-웰 플레이트에서 배양 배지를 폐기하고, 89.5 μL 페놀 레드-프리 RPMI-1640, 10 μL MTS 및 0.5 μL PMS를 함유하는 세포 생존력 검정을 검출하기 위한 100 μL MTS 시약을 각 웰에 첨가하고, 세포 생존력 검정을 검출하기 위한 동일한 체적의 MTS 시약을 검출 배경 (OD490-BLK)으로서 세포를 씨딩하지 않고 웰에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 항온처리한 후, 각 웰의 흡광도는 마이크로플레이트 판독기로 490 nm 파장에서 판독되었다. 투여된 각각의 웰의 OD490-T 값과 배경 차감 후 음성 대조군 웰의 OD490-T0 값은 각각의 웰의 흡광도 판독 값으로부터 OD490-BLK를 빼서 얻어졌다.
투여된 각 웰에서 세포의 상대적 생존율은 다음 식에 따라 계산되었다:
생존율 = OD490-T/OD490-T0 Х 100%
실험 결과
도 1에 나타낸 바와 같이, Bel-7402 및 Bel-7404 세포주에서, 치아우라닙의 단일치료와 치다마이드의 단일치료 둘 다는 용량 의존적인 종양 세포 증식에 대한 특정 억제 효과를 나타내었다. Bel-7402에서, 치아우라닙의 효과 용량이 3 μM에 도달하고 치다마이드의 효과 용량이 0.5, 1 또는 2 μM에 각각 도달했을 때, 두 약물이 상당한 상승적인 효과를 나타냈다는 점에 유의해야 하는데, 즉, 동일한 용량에서 두 약물의 조합 효능이 별도로 사용된 두 단일 약물의 효능을 합한 것보다 낫다. Bel-7404에서, 치아우라닙의 효과 용량이 3 μM에 도달하고 치다마이드의 효과 용량이 0.5 또는 1 μM에 도달했을 때 두 약물은 Bel-7402보다 더 상당한 상승적인 효과를 나타냈다.
실시예 2. 콜로니 형성 검정
실험 방법
로그 기 단계에서 SMMC-7721, Bel-7404 세포주를 트립신으로 분해하고 수집하고 계수한 다음, 6-웰 세포 배양 플레이트에 각각의 웰당 500개 세포/1.8 mL의 밀도로 씨딩하고, 5% CO2하에 37℃에서 배양하였다. 밤새 배양한 후, 세포는 도 2에 나타낸 그룹화 및 최종 농도 투여량에 따라 투여되었다 (투여 후 각각의 웰의 최종 체적은 2 mL였다). 배양 시스템과 각각의 웰에 대한 투여량을 안정적으로 유지하기 위해 배양 배지와 약물을 3일마다 교체하였다.
2 내지 3주 동안 배양한 후, 배양 플레이트에 세포 콜로니가 보이면 배양을 종료하였다. 상청액을 버리고 플레이트를 PBS로 2회 조심스럽게 세척하였다. 1 mL의 75% 에탄올 용액을 각각의 웰에 첨가하여 세포를 고정시키고, 고정 용액은 15분 후에 버렸다. 이어서, 각각의 웰에 1 mL의 크리스탈 바이올렛 용액을 첨가하여 세포를 15분 동안 염색하고, 염색 용액을 흐르는 물로 서서히 세척하고, 공기 건조시켰다. 배양 플레이트의 각각의 웰에서 염색된 양성 세포 콜로니를 사진 촬영하여 밀도를 비교하였다.
실험 결과
도 2에 나타낸 바와 같이, SMMC-7721에서, 치다마이드가 0.5 또는 1 μM의 용량으로 세포에 단일처리되는 경우, 세포 콜로니의 형성에 유의한 영향을 미치지 않았다. 두 웰에서 크리스탈 바이올렛으로 염색된 양성 콜로니의 밀도는 동일한 체적의 DMSO 용매가 첨가된 대조군 웰의 밀도와 동일하였다. 그러나, 5 μM 용량의 치아우라닙 단일치료는 세포 콜로니의 형성에 상대적으로 유의한 영향을 미쳤다. 0.5 또는 1 μM 용량의 치다마이드를 치아우라닙과 함께 그러한 용량으로 첨가하는 경우, 세포 콜로니의 형성이 더욱 유의하게 억제되었으며 억제는 치다마이드의 용량과 양의 상관 관계가 있었다. Bel-7404에서, 치다마이드가 0.5 또는 1 μM의 용량으로 세포에 단일처리되거나, 치아우라닙이 3 μM의 용량으로 세포에 단일처리되는 경우, 이들은 모두 세포 콜로니의 형성에 어느 정도 영향을 미치는 반면, 두 약물이 세포에 결합됨에 따라 세포 콜로니 형성이 더 유의하게 억제되었다. 따라서, 치다마이드와 치아우라닙의 조합은 SMMC-7721 및 Bel-7404의 콜로니 억제에 상승적인 감작 효과를 가졌다.
실시예 3. PI 염색을 사용한 유세포 분석 검정에 의해 분석된 세포 주기
실험 방법
로그 기 단계에서 Bel-7404 세포를 트립신으로 분해하고 수집하고 계수하였다. 세포를 총 18개 웰에서 웰당 106개 세포의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 정상적으로 밤새 배양한 후, 시딩된 세포를 6개 그룹, 즉 용매 대조군, 3 μM 치아우라닙 그룹, 0.5 μM 치다마이드 그룹, 1 μM 치다마이드 그룹, 3 μM 치아우라닙과 0.5 μM 치다마이드 그룹의 조합, 및 3 μM 치아우라닙과 1 μM 치다마이드 그룹의 조합으로 나누었다. 각각의 그룹은 3개의 반복 웰을 배열하고 상응하는 화합물을 상기 최종 농도에 따라 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후, 트립신 처리로 세포 샘플을 수집하고 800 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 각 샘플을 300 μL 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 완전히 재현탁하고 700 μL 사전-냉각된 절대 에탄올에 적가한 다음, 부드러운 역전으로 수회 균일하게 혼합하여 세포를 분산하고 고정하였다. 고정된 샘플을 4℃에서 12시간 초과 동안 방치하고 1주일 이내에 유세포 분석 검정으로 분석하였다.
PBS, 10 mg/mL PI 스톡 용액, 10 mg/mL RNase A 용액 및 Triton X-100을 1000:5:2:1의 비로 혼합하여 작업 염료 용액을 형성하였다. 고정된 세포 샘플을 4℃, 1000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 상청액을 완전히 버리고 PBS로 2회 세척하였다. 각각의 샘플은 300 μL의 상기 작업 염료 용액에 재현탁되었다. 어둠 속에서 30분 동안 37℃에서 배양한 후, 세포를 200-메쉬 스테인리스 스틸 스크린으로 여과하였다. 여액은 유세포 분석 검정 (각각의 샘플이 20,000개 세포로 계수됨)에 의해 세포 주기에 대해 분석되었다.
실험 결과
도 3에 나타낸 바와 같이, Bel-7404에서, 용매 대조군과 비교하여 0.5μM 치다마이드 그룹의 세포 주기는 거의 영향을 받지 않았다. G2/M 기에서의 세포 및 배수체 세포는 1 μM 치다마이드 그룹과 3 μM 치아우라닙 그룹에서 약간 증가하였다. 3 μM 치아우라닙을 0.5 μM 또는 1 μM 치다마이드와 조합하는 경우, 세포는 더 유의한 G2/M 기 정지와 배수체 세포의 비율 증가를 가졌으며, 이는 치다마이드와 치아우라닙의 조합이 세포 주기 억제를 상승적으로 향상시키고 세포 배수화를 상승적으로 촉진하는 항-종양 효과를 가짐을 나타낸다.
실시예 4. Caspase 3/7 검정에 의해 분석된 세포 아폽토시스
실험 방법
로그 기 단계에서 Bel-7404 세포를 트립신으로 분해하고 수집하고 계수하였다. 세포를 총 18개 웰에서 웰당 2000개 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 정상적으로 밤새 배양한 후, 시딩된 세포를 6개 그룹, 즉 블랭크 그룹, 용매 대조군, 3 μM 치아우라닙 그룹, 0.5 μM 치다마이드 그룹, 3 μM 치아우라닙과 0.5 μM 치다마이드 그룹의 조합 및 양성 대조군으로 나누었다. 각각의 그룹은 3개의 반복 웰을 배열하고 상응하는 화합물을 상기 최종 농도에 따라 첨가하고 48시간 동안 공동 배양하였다.
기질로서 Caspase-Glo3/7 완충액 및 Caspase-Glo3/7 동결건조된 분말을 18 내지 22℃로 평형화시켰다. 이어서, Caspase-Glo3/7 완충액을 Caspase-Glo3/7 기질을 함유하는 갈색 병에 부어넣고 기질이 완전히 용해되어 Caspase-Glo 시약이 형성될 때까지 볼텍싱 또는 반전시켜 혼합하였다.
처리된 세포를 포함하는 96-웰 플레이트를 항온처리에서 꺼내 실온으로 평형화시켰다. 70 μL Caspase-Glo 시약 (배양 배지: Caspase-Glo 시약 = 1:1)을 70 μL의 블랭크 대조군, 용매 대조군, 약물 처리군 및 양성 대조군을 포함하는 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 각각의 웰의 내용물은 플레이트 진탕기를 사용하여 300 내지 500 rpm에서 30초 동안 온화하게 혼합하였다. 세포를 실온 (18 내지 22℃)에서 30분 내지 3시간 동안 배양하였다. 각각의 샘플의 형광 값은 루미노미터로 측정하였다. 형광 값은 각각의 웰에서 세포 아폽토시스 세포의 비율을 직접 반영할 수 있으며 상이한 그룹의 세포 생존력을 계산하고 비교하는 데 사용할 수 있다.
실험 결과
도 4에 나타낸 바와 같이, Bel-7404에서, 세포를 0.5 μM 치다마이드 단독으로 처리한 후, 아폽토시스 세포의 비율은 동일한 체적의 DMSO를 가진 용매 대조군과 유의한 차이가 없었다. 3 μM 치아우라닙을 사용한 단일치료는 아폽토시스 세포의 비율을 어느 정도로 증가시켰다. 상기 용량의 두 약물을 결합하여 세포를 치료하는 경우, 아폽토시스 세포의 비율은 유의하게 증가하였으며, 이는 두 단일 약물에 의해 개별적으로 증가된 아폽토시스 비율의 합보다 유의하게 높았다. 두 약물은 종양 세포 아폽토시스를 상승적으로 촉진하였다. 따라서, 조합은 두 약물 각각을 단독으로 사용함으로써 야기된 억제의 합보다 유의하게 더 큰 종양 세포 활성의 억제를 야기하였다.
실시예 5. 순차적 투여 실험
실험 방법
로그 기 단계에서 Bel-7404의 세포를 트립신으로 분해하고 수집하고 계수하고 각각의 웰에 5,000개 세포/180 μL의 밀도로 96-웰 세포 배양 플레이트에 시딩하고 37℃에서 5% CO2하에 배양하였다. 세포를 밤새 배양한 후, 도 5에 나타낸 바와 같이 0 내지 48시간 동안 그룹화 및 최종 농도에 상응하는 약물을 첨가하고 각각의 웰의 최종 체적은 200 μL에 도달하였다. 세포를 48시간 동안 배양한 후, 배양 배지를 96-웰 플레이트에서 조심스럽게 흡인하였다. 각 웰에서, 180 μL의 신선한 배양 배지와 도 5에 나타낸 바와 같이 48 내지 96시간 동안 그룹화 및 최종 농도에 상응하는 약물을 (각 웰의 최종 체적이 200 μL에 도달하도록) 첨가하였다. 세포를 추가로 48시간 동안 배양한 후, 즉 약물 처리의 총 시간이 96시간에 도달한 후, 배양 배지를 96-웰 플레이트에 버리고 세포 생존력 검정용 MTS 시약을 첨가하여 각각의 웰에서 세포 생존율을 검출하고 계산하였다.
실험 결과
도 5에 나타낸 바와 같이, Bel-7404에서, 처음 48시간 이건 다음 48시간 이건, 2개의 약물을 동시에 첨가하여 야기된 세포에 대한 억제 효과는 2개 약물을 각각 개별적으로 첨가했을 때보다 더 컸다.
처음 48 시간에 치다마이드 단일요법으로 세포를 전처리한 다음, 치다마이드를 중단한 후 다음 48시간에 치아우라닙 단일요법으로 세포를 치료하는 것은 처음 48시간에 치아우라닙 단일요법으로 세포를 전처리 한 다음, 치아우라닙 중단 후 다음 48시간에 치다마이드 단독 요법으로 세포를 치료하는 것과 크게 달랐다는 것에 주목해야 한다.
치다마이드를 사용한 전처리는 세포를 치아우라닙에 더 민감하게 만들었지만, 치아우라닙을 사용한 전처리는 세포가 치다마이드 단일요법의 후속 효과에 민감하게 만들지 않았고 이는 두 약물의 조합으로 인한 상승적인 감작 메커니즘은 치다마이드에 의한 세포의 후성적 변형이 치아우라닙의 약리학적 효과에 대한 세포의 민감도를 변화시켰다는 것을 나타낸다.
실시예 6. 누드 마우스에서 종양 세포 이종이식 모델 실험
실험 방법
Bel-7404의 세포를 다량으로 노출되도록 배양하였고 log 기 상태를 유지하였다. 세포수가 필요한 양에 도달한 후, 이들을 트립신으로 분해하고 수집하고 많은 양의 PBS로 2회 세척하여 트립신과 혈청을 제거하고 800 rpm에서 10분 동안 실온에서 원심 분리하고 세포 상청액을 버렸다. 세포를 FBS가 없는 RPIM-1640 배양 배지에 재현탁하고 세포 밀도를 107/300 μL로 조정하였다.
무균 조건하에, 각각의 누드 마우스에 누드 마우스당 1회 주사, 300 μL/주사로 등에 피하 주사하였다. 주사용 1 mL 일회용 의료용 주사기를 사용했고, 주사 부위와 방향은 각각의 누드 마우스에 대해 대략 동일하였다.
세포 이식 1일 후, 누드 마우스를 무작위로 4개의 그룹 (즉, 용매 대조군, 치아우라닙 2.5 mg/kg 그룹, 치다마이드 20 mg/kg 그룹 및 조합된 투여 그룹)으로 나누고, 표시 후 별도의 케이지에 보관하고, 그룹에 투여하고, 각각의 마우스의 종양 형성을 매일 관찰하였다. 투여 전 각각의 누드 마우스의 체중을 측정하여, 누드 마우스에 체중 킬로그램당을 기준으로 한 투여량, 즉 용매 대조군의 경우 체중 그램당 10 μL의 CMC-Na 용액, 치아우라닙 2.5 mg/kg 그룹의 경우 체중 그램당 10 μL의 0.25 mg/mL 치아우라닙-CMC-Na 현탁액, 치다마이드 20 mg/kg 그룹의 경우 체중 그램당 10 μL의 2 mg/mL 치다마이드-CMC-Na 현탁액, 및 조합된 투여 그룹의 경우 체중 그램당 밀리리터당 0.25 mg의 치아우라닙과 2 mg의 치다마이드를 함유하는 10 μL의 CMC-Na 현탁액으로 위내 투여하였다. 2일마다, 버니어 캘리퍼로 종양의 가장 긴 직경 (길이)과 가장 긴 지름에 수직인 가장 넓은 직경 (너비)을 측정하였다. 종양 체적은 식 TS = 길이×(폭)2/2에 의해 계산되고 기록되었다. 각각의 누드 마우스는 하루에 1회 위내로 정기적으로 투여되었다. 실험은 33일에 마지막 투여 후 종료되었다.
실험 결과
도 6에 나타낸 바와 같이, 용매 대조군과 비교하여, 2.5 mg/kg 치아우라닙 또는 20 mg/kg 치다마이드의 단일 약물을 투여한 두 그룹에서, 종양-보유 누드 마우스의 종양 체적은 어느 정도 억제된 반면, 복합 투여 그룹의 최종 종양 억제율은 단일 약물을 투여한 두 그룹의 종양 억제율의 합보다 높았다. 이것은 두 약물이 종양-보유 누드 마우스에서 항-종양 활성을 상승적으로 감작했음을 입증하였다.
실시예 7. 화합물 약제학적 조성물 1 (과립 또는 캡슐)의 제조 (1,000 단위로)
치다마이드 고체 분산체 제형
Figure pct00001
화합물 과립 제형
Figure pct00002
제조 과정
(1) 치다마이드 고체 분산체 제형에서 성분의 양을 기준으로, 치다마이드, 포비돈 및 의약용 에탄올을 칭량하고, 혼합하고, 모든 성분이 80℃에서 완전히 용해될 때까지 교반하여 투명한 용액을 수득하였다. 용액을 회전 증발 또는 분무 건조하여 백색 분말, 즉 치다마이드 고체 분산체를 제조하였다;
(2) 화합물 과립 제형에서 성분의 양을 기준으로, 치다마이드 고체 분산체, 치아우라닙, 포비돈, 미세결정질 셀룰로스 및 락토스를 칭량하였다. 습식 과립기에서 부형제를 첨가하고 균일하게 혼합한 다음, 의약용 에탄올을 첨가하여 습식 과립화로 과립을 수득하였다. 수득된 과립을 오븐 또는 유동층 건조기에서 건조시키고, 20 메쉬 스크린으로 체질하여 약제학적 보조 물질을 함유하는 과립을 수득하였다.
(3) 단계 (2)에서 수득된 과립을 스테아르산 마그네슘과 비율로 2분 동안 혼합하여 총 혼합된 과립을 수득하였다.
(4) 단계 (3)에서 수득된 총 혼합된 과립을 패캐징하여 과립을 수득하거나 수득된 캡슐에 중공 캡슐을 채웠다.
실시예 8. 화합물 약제학적 조성물 2 (과립, 캡슐 또는 정제)의 제조 (1,000 단위로)
치다마이드 고체 분산체 제형
Figure pct00003
화합물 과립 제형
Figure pct00004
제조 과정
(1) 치다마이드 고체 분산체 제형에서 성분의 양을 기준으로, 치다마이드, 포비돈 및 의약용 에탄올을 칭량하고, 혼합하고, 모든 성분이 80℃에서 완전히 용해될 때까지 교반하여 투명한 용액을 수득하였다. 용액을 회전 증발 또는 분무 건조하여 대략 백색 분말, 즉 치다마이드 고체 분산체를 제조하였다.
(2) 화합물 과립 제형에서 성분의 양을 기준으로, 치다마이드 고체 분산체, 치아우라닙, 크로스포비돈, 미세결정질 셀룰로스 및 만니톨을 칭량하였다. 부형제를 3-차원 혼합기에 첨가하고, 균일하게 혼합하여 건식 과립으로 과립을 제조하였다. 수득된 과립을 20 메쉬 스크린으로 체질하여 약제학적 보조 물질을 함유하는 과립을 수득하였다.
(3) 단계 (2)에서 수득된 과립을 스테아르산 마그네슘과 비율로 2분 동안 혼합하여 총 혼합된 과립을 수득하였다.
(4) 단계 (3)에서 수득된 총 혼합된 과립을 패캐징하여 속방성 과립을 수득하거나, 중공 캡슐을 충전하여 캡슐을 수득하거나, 수득된 정제로 압축하였다.
실시예 9. 화합물 약제학적 조성물 3 (과립 또는 정제)의 제조 (1,000 단위로)
치다마이드 고체 분산체 제형
Figure pct00005
화합물 과립 제형
Figure pct00006
제조 과정
(1) 치다마이드 고체 분산체 제형에서 성분의 양을 기준으로, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스를 칭량하고, 제형 양으로 물에 용해시키고, 이어서 치다마이드를를 첨가하고 80℃에서 용해될 때까지 교반하여 투명한 용액을 수득하였다. 용액을 회전 증발 또는 분무 건조하여 회백색 분말, 즉 치다마이드 고체 분산체를 제조하였다.
(2) 화합물 과립 제형에서 성분의 양을 기준으로, 치다마이드 고체 분산체, 치아우라닙, 크로스포비돈, 미세결정질 셀룰로스 및 락토스를 칭량하였다. 부형제를 3-차원 혼합기에 첨가하고, 균일하게 혼합하여 건식 과립으로 과립을 제조하였다. 수득된 과립을 20 메쉬 스크린으로 체질하여 약제학적 보조 물질을 함유하는 과립을 수득하였다.
(3) 단계 (2)에서 수득된 과립을 스테아르산 마그네슘과 비율로 2분 동안 혼합하여 총 혼합된 과립을 수득하였다.
(4) 단계 (3)에서 수득된 총 혼합된 과립을 패캐징하여 속방성 과립을 수득하거나, 수득된 정제로 압축하였다.
실시예 10. 화합물 약제학적 조성물 4 (캡슐)의 제조 (1,000 단위로)
치다마이드용 약물 코팅 용액의 제형
Figure pct00007
치아우라닙용 약물 코팅 용액의 제형
Figure pct00008
환제 코어 제형
Figure pct00009
제조 과정
(1) 치다마이드용 약물 코팅 용액의 제형에서 성분의 양을 기준으로, 치다마이드, 포비돈 및 의약용 에탄올을 칭량하고, 혼합하고, 모든 성분이 80℃에서 완전히 용해될 때까지 교반하여 투명한 용액, 즉 치아우라닙용 코팅 용액을 수득하였다.
(2) 치아우라닙용 약물 코팅 용액의 제형에서 성분의 양을 기준으로, 포비돈 및 의약용 에탄올을 칭량하였다. 포비돈은 에탄올에 용해되었다. 치아우라닙을 포비돈 용액에 균일하게 분산시켜 치아우라닙용 약물 코팅 용액을 수득하였다.
(3) 코팅: 블랭크 환제 코어를 정확하게 칭량하고, 치다마이드용 약물 코팅 용액과 치아우라닙용 약물 코팅 용액을 유동층에 개별적으로 분무하여 약물을 적용하였다; 분무 후 환제 코어를 칭량하여 약물 적용 속도를 계산하여 치다마이드와 치아우라닙을 함유하는 조합된 약물 펠릿을 수득하였다.
(4) 단계 (3)에서 코팅에 의해 수득된 펠릿을 수득된 캡슐에 중공 캡슐을 채웠다.
실시예 11. 화합물 약제학적 조성물 5 (캡슐)의 제조 (1,000 단위로)
치다마이드 및 치아우라닙용 조합된 약물 코팅 용액의 제형
Figure pct00010
환제 코어 제형:
Figure pct00011
제조 과정
(1) 치다마이드와 치아우라닙용 조합된 약물 코팅 용액의 제형에서 성분의 양을 기준으로, 치다마이드, 포비돈 및 의약용 에탄올을 칭량하고, 혼합하고, 이들이 80℃에서 완전히 용해될 때까지 교반하여 투명한 용액을 수득하였다. 치아우라닙은 치다마이드의 투명한 용액에 균일하게 분산하여 치다마이드 및 치아우라닙용 조합된 약물 코팅 용액을 수득하였다.
(2) 코팅: 블랭크 환제 코어를 정확하게 칭량하고, 유동층에 치다마이드 및 치아우라닙 코팅액의 조합을 분무하여 약물을 적용하였다; 분무 후 환제 코어를 칭량하여 약물 적용 속도를 계산하여 치다마이드와 치아우라닙을 함유하는 조합된 약물 환제를 수득하였다.
(3) 코팅에 의해 단계 (2)에서 수득된 펠릿을 수득된 캡슐에 중공 캡슐을 채웠다.
중화 인민 공화국 2015년 판 약전에 따르면 상기 제조된 제형은 0.1 mol/L 염산 배지에서 시험관내 약물 용해에 대해 시험되었다. 그 결과, 약물의 85% 초과가 15분 이내에 용해되어 방출 요건을 충족하였다.

Claims (14)

  1. 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 단백질 키나제 억제제의 조합의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 키나제 억제제는 세린 키나제 억제제, 트레오닌 키나제 억제제 및 티로신 키나제 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 히스톤 데아세틸라제 억제제는 치다마이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 키나제 억제제는 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인, 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히스톤 데아세틸라제 억제제는 치다마이드이고, 상기 단백질 키나제 억제제는 치아우라닙인, 용도.
  6. 활성 약제학적 성분으로서 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 단백질 키나제 억제제, 및 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 활성 약제학적 성분은 치아우라닙 및 치다마이드로 이루어진, 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체는 포비돈, 코포비돈, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스 및 폴리비닐 카프랄락탐-폴리비닐 아세테이트-폴리에틸렌 글리콜 그래프트 공중합체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 단위 투여량으로, 치다마이드의 양은 각각 5 내지 100 mg이고, 치아우라닙의 양은 5 내지 100 mg이고, 바람직하게는 각각 5 내지 60 mg의 치다마이드 및 10 내지 100 mg의 치아우라닙인, 약제학적 조성물.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 과립, 고체 분산체, 캡슐 또는 정제 형태인, 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 미세결정질 셀룰로스, 포비돈, 코포비돈, 락토스, 만니톨, 크로스포비돈 및 나트륨 카복시메틸 셀룰로스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 약제학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  12. 암 치료 또는 예방용 키트로서, 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 단백질 키나제 억제제를 활성 성분으로서 포함하고, 상기 히스톤 데아세틸라제 억제제 및 상기 단백질 키나제 억제제는 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 암 치료 또는 예방용 키트.
  13. 제12항에 있어서, 치다마이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 활성 성분으로서 포함하고, 상기 치다마이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 키트.
  14. 제13항에 있어서, 활성 성분으로서 첫 번째로 투여되는 치다마이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 두 번째로 투여되는 치아우라닙 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 키트.
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