KR20200105198A - 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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KR20200105198A
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Abstract

본 발명은 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그 용매화물을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 파라옥소나제를 포함한 여러 효소의 기능을 향상 또는 보호시킬 수 있는 약학적 조성물을 제공한다.

Description

신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF NEUROLOGICAL DISEASES}
본 발명은 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
신경계는 신체 내·외부의 자극과 신호를 받아들여 다른 부위로 전달하고 반응을 일으키는 기관이다. 신경계는 신체의 활동을 상황에 맞게 조절·통제하는 역할을 하며, 뇌와 척수로 구성된 중추신경계와 말초신경으로 구성된 말초신경계로 이루어져 있다. 이런 신경계에 문제가 생기면 치명적인 질환에 걸릴 수 있다. 신경계 질환은 대개 완치가 어려워 주의가 필요하다. 한편, 활성 산소종 증가, 산화적 스트레스로 인한 단백질, 지질 및 DNA의 손상은 급성 및 만성 신경계 질환의 유발에 매우 중요한 역할을 한다는 것은 널리 알려져 있다.
인체에서 형성된 활성 산소가 입힌 손상을 복구하는 과정에는 여러 효소가 관여한다. 이러한 효소 중 하나가 파라옥소나제(paraoxonase; PON)이다. 파라옥소나제로는 PON1, PON2 및 PON3 3가지가 알려져 있고, 이 중 PON1 및 PON2는 산화적 스트레스로부터 세포 등을 보호하는 항산화 효소로 작용하여, 산화 방지 효과 및 항염증 효과를 보인다는 것이 잘 알려져 있다. PON3 역시 비슷한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다.
PON1 및 PON2의 기능이 저하된 경우에는 혈청이나 대식 세포의 산화적 스트레스가 증가하는 현상이 관찰되었고 산화적 스트레스로부터 유도된 독성이 발생하는 현상이 관찰되었다. 또한, PON1 및 PON2가 제거된(Knock out) 또는 부족한 동물을 통하여 파라옥소나제가 신경 보호 역할을 한다는 것이 보고 되고 있다. 따라서, PON1 및 PON2가 산화 방지 및 항염증 효과를 통하여 신경 보호에 관여한다는 사실이 잘 알려져 있다.
이에, 신경계 질환을 예방하고 치료하기 위하여 파라옥소나제를 포함한 여러 효소의 기능을 향상 또는 보호시킬 수 있는 약학적 조성물이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2018-0002539호 대한민국 공개특허 제10-2015-0075030호
Modulation of PON2 in mouse brain_Neuroprotection mechanism by quercetin (Neurochem Research 2013 (38) 1809~1818.) PON2 in brain and its potential role in neuroprotection (Neurotoxicology 2014 (43) 3~9.) DJ-1 interacts with and regulates Paraoxonase 2 for neuronal survival in response to ROS (PLOS one 2014 (9) e106601) PON2 has the neuroprotective role in the mouse central nervous system (Toxicology and Applied Pharmacology 2011 (256) 369~378.) PON2 has the potential neuro-protecting effect against oxidative stress in vivo and in vitro (Neurochemcal Research 2013 (38) 1809~1818; Neurotoxicology 2014 (43) 3~9)
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 신경계 질환의 예방 또는 치료 효능이 우수한 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다만, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시상태는 하기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그 용매화물을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pat00001
상기 화학식 I에서,
점선은 선택적 이중결합이고,
R1은 수소 원자; 및 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이며,
R2는 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 및 히드록시기 중 어느 하나이고,
OR1 및 R2 중 적어도 하나는 히드록시기이며,
R3은 수소 원자; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 치환 또는 비치환 C6-C12 아릴옥시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 티오알킬기; 및 할로겐 원자 중 어느 하나이고,
R4는 수소 원자; 메틸; 에틸; 메톡시 또는 에톡시이며,
R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 원자; 및 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이고,
상기 치환 알킬기, 치환 알콕시기, 치환 알릴옥시기, 치환 아릴옥시기 및 치환 티오알킬기의 경우, 상기 치환기는 할로겐 원자; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알킬기; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알콕시기; 및 직쇄 또는 분지쇄 C1-C3 티오알킬기 중 어느 하나이다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그 용매화물을 포함하는 약학적 조성물은 알츠하이머병, 혈관성 치매, 파킨슨병, 뇌수막염, 뇌전증, 뇌졸중, 뇌종양, 근신경계 질환, 신경계 감염, 유전성 신경 질환, 척수 질환, 이상운동 질환 등 신경계 질환의 예방 및 치료 효능이 우수하다.
도 1은 정상 대조군, DIO 대조군, 화학식 III-1의 화합물 투여군에서 (a) PON2 mRNA의 상대적인 발현 정도 및 (b) Actin에 대한 PON2의 상대적인 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실험예 3-2에 따른 세포 생존력 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 3-3에 따른 ATP 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 3-4에 따른 DCF의 농도 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 3-5에 따른 Mito-SOX의 농도 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 6a는 RAW264.7 세포에서 실험예 4-2에 따른 iNOS와 COX-2의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 BV2 세포에서 실험예 4-2에 따른 iNOS와 COX-2의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7a는 RAW264.7 세포에서 실험예 4-2에 따른 NO의 생성도를 나타낸 그래프이다.
도 7b는 RAW264.7 세포에서 실험예 4-2에 따른 PGE2의 생성도를 나타낸 그래프이다.
도 7c는 BV2 세포에서 실험예 4-2에 따른 NO의 생성도를 나타낸 그래프이다.
도 7d는 BV2 세포에서 실험예 4-2에 따른 PGE2의 생성도를 나타낸 그래프이다.
도 8a는 RAW264.7 세포에서 실험예 4-3에 따른 IL-1β의 mRNA 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8b는 RAW264.7 세포에서 실험예 4-3에 따른 IL-6의 mRNA 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8c는 RAW264.7 세포에서 실험예 4-3에 따른 TNF-α의 mRNA 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8d는 BV2 세포에서 실험예 4-3에 따른 IL-1β의 mRNA 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8e는 BV2 세포에서 실험예 4-3에 따른 IL-6의 mRNA 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8f는 BV2 세포에서 실험예 4-3에 따른 TNF-α의 mRNA 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9a는 RAW264.7 세포에서 실험예 4-4에 따른 NF-ĸB 단백질의 p65와 p50의 핵 내부로의 전사 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 BV2 세포에서 실험예 4-4에 따른 NF-ĸB 단백질의 p65와 p50의 핵 내부로의 전사 정도를 나타낸 그래프이다.
본 명세서에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시상태는 하기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그 용매화물을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 I]
Figure pat00002
상기 화학식 I에서,
점선은 선택적 이중결합이고,
R1은 수소 원자; 및 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이며,
R2는 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 및 히드록시기 중 어느 하나이고,
OR1 및 R2 중 적어도 하나는 히드록시기이며,
R3은 수소 원자; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 치환 또는 비치환 C6-C12 아릴옥시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 티오알킬기; 및 할로겐 원자 중 어느 하나이고,
R4는 수소 원자; 메틸; 에틸; 메톡시 또는 에톡시이며,
R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 원자; 및 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이고,
상기 치환 알킬기, 치환 알콕시기, 치환 알릴옥시기, 치환 아릴옥시기 및 치환 티오알킬기의 경우, 상기 치환기는 할로겐 원자; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알킬기; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알콕시기; 및 직쇄 또는 분지쇄 C1-C3 티오알킬기 중 어느 하나이다.
상기한 "선택적 이중결합"이라 함은 경우에 따라 단일결합이거나 이중결합일 수 있음을 의미한다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 상기 화학식 I의 피라노 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그 용매화물을 포함하는 약학적 조성물은 신경계 질환 특히 뇌 질환의 예방 및 치료 효능이 우수하다. 구체적으로, 신경 변성 질환, 신경 세포 염증, 미토콘드리아 기능 장애의 예방 및 치료 효능이 우수하다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 R1은 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기이고, 상기 R2는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, iso-프로필기, n-부틸기, iso-부틸기, tert-부틸기, 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, iso-프로폭시기, n-부톡시기, iso-부톡시기, tert-부톡시기 또는 히드록시기이며, 상기 R3 및 R4는 각각 수소 원자이고, 상기 R5 및 R6은 각각 메틸기일 수 있다. 상기 R1 내지 R6가 상기한 물질인 경우 상기 화학식 I의 피라노 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그 용매화물을 포함하는 약학적 조성물은 화학적으로 안정하고, 뇌 질환의 예방 및 치료에 있어서 우수한 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물은 하기 화학식 II의 화합물인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다:
[화학식 II]
Figure pat00003
상기 화학식 II에서,
R1은 수소 원자; 및 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이며,
R2는 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 및 히드록시기 중 어느 하나이고,
OR1 및 R2 중 적어도 하나는 히드록시기이며,
R3은 수소 원자; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 치환 또는 비치환 C6-C12 아릴옥시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 티오알킬기; 및 할로겐 원자 중 어느 하나이고,
R4는 수소 원자; 메틸; 에틸; 메톡시 또는 에톡시이며,
R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 원자; 및 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이고,
상기 치환 알킬기, 치환 알콕시기, 치환 알릴옥시기, 치환 아릴옥시기 및 치환 티오알킬기의 경우, 상기 치환기는 할로겐 원자; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알킬기; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알콕시기; 및 직쇄 또는 분지쇄 C1-C3 티오알킬기 중 어느 하나이다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 화학식 II의 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나일 수 있다:
[화학식II-1]
Figure pat00004
4-(8,8-dimethyl-2,8-dihydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)benzene-1,3-diol
[화학식II-2]
Figure pat00005
2-(8,8-dimethyl-2,8-dihydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-propoxyphenol.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물은 하기 화학식 III의 화합물일 수 있다:
[화학식 III]
Figure pat00006
상기 화학식 III에서,
R1은 수소 원자; 및 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이며,
R2는 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 및 히드록시기 중 어느 하나이고,
OR1 및 R2 중 적어도 하나는 히드록시기이며,
R3은 수소 원자; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 치환 또는 비치환 C6-C12 아릴옥시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 티오알킬기; 및 할로겐 원자 중 어느 하나이고,
R4는 수소 원자; 메틸; 에틸; 메톡시 또는 에톡시이며,
R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 원자; 및 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이고,
상기 치환 알킬기, 치환 알콕시기, 치환 알릴옥시기, 치환 아릴옥시기 및 치환 티오알킬기의 경우, 상기 치환기는 할로겐 원자; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알킬기; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알콕시기; 및 직쇄 또는 분지쇄 C1-C3 티오알킬기 중 어느 하나이다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 화학식 III의 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나일 수 있다:
[화학식 III-1]
Figure pat00007
2-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-ethoxyphenol
[화학식 III-2]
Figure pat00008
4-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-3-ethoxyphenol
[화학식 III-3]
Figure pat00009
2-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-ethylphenol
[화학식 III-4]
Figure pat00010
2-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-propylphenol.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물은 하기 화학식 IV의 화합물일 수 있다:
[화학식 IV]
Figure pat00011
상기 화학식 IV에서,
R1은 수소 원자; 및 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이며,
R2는 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 및 히드록시기 중 어느 하나이고,
OR1 및 R2 중 적어도 하나는 히드록시기이며,
R3은 수소 원자; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 치환 또는 비치환 C6-C12 아릴옥시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 티오알킬기; 및 할로겐 원자 중 어느 하나이고,
R4는 수소 원자; 메틸; 에틸; 메톡시 또는 에톡시이며,
R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 원자; 및 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이고,
상기 치환 알킬기, 치환 알콕시기, 치환 알릴옥시기, 치환 아릴옥시기 및 치환 티오알킬기의 경우, 상기 치환기는 할로겐 원자; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알킬기; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알콕시기; 및 직쇄 또는 분지쇄 C1-C3 티오알킬기 중 어느 하나이다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 화학식 IV의 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나일 수 있다:
[화학식IV-1]
Figure pat00012
(R)-2-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-ethoxyphenol
[화학식IV-2]
Figure pat00013
(R)-2-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-propoxyphenol
[화학식IV-3]
Figure pat00014
(R)-2-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-propylphenol
[화학식IV-4]
Figure pat00015
(R)-2-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-butoxyphenol.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물은 하기 화학식 V의 화합물일 수 있다:
[화학식 V]
Figure pat00016
상기 화학식 V에서,
R1은 수소 원자; 및 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이며,
R2는 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 및 히드록시기 중 어느 하나이고,
OR1 및 R2 중 적어도 하나는 히드록시기이며,
R3은 수소 원자; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 치환 또는 비치환 C6-C12 아릴옥시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 티오알킬기; 및 할로겐 원자 중 어느 하나이고,
R4는 수소 원자; 메틸; 에틸; 메톡시 또는 에톡시이며,
R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 원자; 및 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이고,
상기 치환 알킬기, 치환 알콕시기, 치환 알릴옥시기, 치환 아릴옥시기 및 치환 티오알킬기의 경우, 상기 치환기는 할로겐 원자; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알킬기; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알콕시기; 및 직쇄 또는 분지쇄 C1-C3 티오알킬기 중 어느 하나이다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 화학식 V의 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나일 수 있다:
[화학식V-1]
Figure pat00017
(S)-2-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-ethoxyphenol
[화학식V-2]
Figure pat00018
(S)-2-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-propoxyphenol
[화학식V-3]
Figure pat00019
(S)-2-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-propylphenol
[화학식V-4]
Figure pat00020
(S)-2-(8,8-dimethyl-2,3,4,8,9,10-hexahydropyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-5-butoxyphenol.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 화학식 I의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 상기 화학식 I의 화합물이 유리산과 함께 염을 형성하여, 산 부가염으로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 상기 화학식 1의 화합물은 당해 기술분야에서 공지된 통상의 방법에 따라 약학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 상기 유리산으로는 유기산 또는 무기산을 사용할 수 있고, 상기 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산 또는 인산 등을 사용할 수 있고, 상기 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 약학적 조성물은 상기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그 용매화물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀롤로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 있어서, 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물은 대한민국 특허공개번호 10-2015-0075030 및 10-2018-0002539에 기재된 방법과 동일한 방법으로 제조될 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 신경계 질환은 크게 중추신경계 질환과 말초신경계 질환으로 분류할 수 있으며, 중추신경계 질환의 예로 뇌 질환, 척수 질환을 들 수 있다. 신경계 질환은 신경 변성, 신경세포 염증, 미토콘드리아 기능 장애 등에 의하여 발병되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따른 약학적 조성물은 상기 화학식 I의 화합물이 특히 PONase 활성제로 작용하여 다양한 항염증 지표 및 미토콘드리아 기능을 개선시키는데 기여하므로, 신경계 질환의 예방 또는 치료에 사용 가능하다. 본 발명의 일 실시상태에 따른 약학적 조성물은 예를 들어, 알츠하이머병, 혈관성 치매, 파킨슨병, 뇌수막염, 뇌전증, 뇌졸중, 뇌종양, 근신경계 질환, 신경계 감염, 유전성 신경 질환, 척수 질환 및 이상운동 질환 중 어느 하나의 신경계 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 그리고, 신경계 질환으로 인하여 발생하는 두통, 어지러움증, 통증 등의 예방 또는 치료에도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 상기 약학적 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 제형은 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제 및 경비투여제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있다. 바람직하게는 경구 투여용 제제 및 주사제로 제제화될 수 있다.
상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약학적으로 허용 가능한 담체를 부가하여 제조할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 약학적 활성 성분을 제외한 임의의 구성 성분을 지칭하기 위해 사용된다. "약학적으로 허용 가능한"이란 조성물 중에 존재하는 다른 구성 성분들과 상호작용하여(예를 들면, 담체들 상호 간 또는 약학적 활성 성분과 담체 간의 상호작용) 약학적으로 바람직하지 않은 변화를 야기하지 않는 성질을 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체의 선택은 특정한 투여 제형의 특성, 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 상기 담체의 효과와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일 실시상태에 따르면, 경구 투여용 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용 가능한 담체는 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제(또는 윤활제), 흡착제, 안정화제, 용해 보조제, 감미제, 착색제 및 착향제 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
희석제(diluent)는 조성물의 부피를 증량하여 제형에 따른 적절한 크기로 만들기 위해 첨가되는 임의의 부형제를 지칭한다. 상기 희석제는, 전분(예를 들면, 감자전분, 옥수수전분, 밀전분, 전젤라틴화 전분), 미세결정성 셀룰로오스 (예를 들면, 저수화 미결정셀룰로오스), 유당(예를 들면, 유당 일수화물, 무수유당, 분무유당), 포도당, 소르비톨, 만니톨, 수크로오스, 알기네이트, 알칼리토금속류염, 클레이, 폴리에틸렌글리콜 디칼슘포스페이트, 무수인산수소칼슘 및 이산화규소 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 희석제는 상기 약학적 조성물 총량에 대해 5 중량% 내지 50 중량% 범위로 사용될 수 있다. 예를 들면, 정제화 및 품질 유지를 위해 조성물 총량에 대해 10 중량% 내지 35 중량%로 사용될 수 있다.
결합제(binder)는 분말상의 물질에 점착성을 부여하여 압착을 용이하게 하고 유동성을 개선하기 위해 사용되는 물질을 지칭한다. 상기 결합제는 전분, 미세결정성 셀룰로오스, 고분산성 실리카, 만니톨, 락토스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스 유도체 (예를 들면, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스), 천연검, 합성검, 포비돈, 코포비돈 및 젤라틴 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 결합제는 상기 약학적 조성물 총량에 대해 2 중량% 내지 15 중량%로 사용될 수 있다. 예를 들면, 정제화 및 품질 유지를 위해 1 중량% 내지 3 중량%로 사용될 수 있다.
붕해제(disintegant)는 생체 투여 후 고체 제형의 붕괴 또는 붕해를 용이하게 하기 위해 첨가되는 물질을 지칭한다. 상기 붕해제는 나트륨전분글리콜레이트, 옥수수전분, 감자전분 또는 전젤라틴화전분과 같은 전분 또는 변성전분, 벤토나이트, 몬모릴로나이트, 비검(veegum)과 같은 클레이(clay), 미세결정성셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스, 알긴산나트륨 또는 알긴산과 같은 알긴류, 크로스카르멜로스(croscarmellose) 나트륨과 같은 가교 셀룰로오스, 구아검, 잔탄검과 같은 검, 가교 폴리비닐피롤리돈(crospovidone)과 같은 가교 중합체, 중탄산나트륨, 시트르산과 같은 비등성 제제를 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 붕해제는 상기 약학적 조성물 총량에 대해 2 중량% 내지 15 중량% 범위로 사용될 수 있다. 예를 들면, 정제화 및 품질 유지를 위해 4 중량% 내지 10 중량%로 사용될 수 있다.
활택제(glidant) 또는 윤활제(lubricant)는 압착 설비에 대한 분말의 부착을 방지하고 과립의 유동을 개선시키는 기능을 수행하는 물질을 지칭한다. 상기 활택제는 경질 무수 규산, 탈크, 스테아린산, 스테아린산의 금속염(마그네슘염 또는 칼슘염 등), 라우릴설페이트나트륨, 수소화식물성오일, 나트륨벤조에이트, 푸마르산스테아릴나트륨, 글리세릴비헤네이트, 글리세릴모노스테아레이트 또는 폴리에틸렌글리콜을 단독 또는 혼합 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 활택제는 상기 약학적 조성물 총량에 대해 0.1 중량% 내지 5 중량%로 사용될 수 있다. 예를 들면, 정제화 및 품질 유지를 위해 1 중량% 내지 3 중량%로 사용될 수 있다.
흡착제(adsorbant)는 함수이산화규소, 경질무수규산, 콜로이달실리콘디옥사이드, 메타규산알루민산마그네슘, 미결정셀룰로오스, 유당 또는 가교 폴리비닐피롤리돈을 단독 또는 혼합 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
안정화제(stabilizer)는 부틸히드록시아니솔, 부틸히드록시톨루엔, 카로틴, 레티놀, 아스코르빈산, 토코페롤, 토코페롤폴리에틸렌글리콜 숙신산 또는 프로필갈레이트와 같은 항산화제, 사이클로덱스트린, 카르복시에틸 사이클로덱스트린, 히드록시프로필 사이클로덱스트린, 술포부틸에테르 또는 사이클로덱스트린과 같은 당류의 환상화합물, 인산, 젖산, 초산, 구연산, 주석산, 숙신산, 말레인산, 푸마르산, 글리콜산, 프로피온산, 글루콘산 또는 글루쿠론산과 같은 유기산 중에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
선택적으로, 상기 약학적 조성물에는 미각을 돋구어 기호성을 증진시키기 위한 공지의 첨가제가 포함될 수 있다. 예를 들면, 수크랄로오스, 수크로오스, 프럭토오스, 에리스리톨, 아세설팜 칼륨, 당 알코올, 벌꿀, 소르비톨 또는 아스파르탐과 같은 감미제를 첨가하여, 쓴맛을 보다 효과적으로 은폐시키고 제제의 안정성 및 품질을 유지할 수 있다. 또한, 구연산, 구연산나트륨과 같은 산미제, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소가 사용될 수 있다.
상기 경구 투여용 약학적 조성물은 경구 투여를 위한 고형 제제, 반고형 제제 또는 액상 제제일 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 또는 연질 캡슐제, 산제, 세립, 과립, 용액 또는 현탁액 재구성용 분말, 로젠지, 웨이퍼, 구강필름(oral strip) 드라제(dragee), 츄잉검(chewable gum) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 경구 투여를 위한 액상 제제는 액제, 현탁제, 에멀젼, 시럽제, 엘릭서제, 주정제, 방향수제, 레모네이드제, 엑스제, 침전제, 틴크제 및 약유제를 포함한다. 반고형 제제는 에어로졸, 크림, 겔(gel) 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 약학적 조성물은 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다.
상기 언급된 제제에 사용되는 담체와 제제의 제조방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 바에 따라 선택하고 제조할 수 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량 및 투여시기는 투여대상의 나이, 성별, 상태, 체중, 투여경로, 투여 횟수, 약의 형태에 따라서 달라질 수 있다. 일일 투여량은 약 0.1 내지 1000 mg/kg이고, 바람직하게는 1 내지 100 mg/kg 이다. 상기 투여량은 질환의 종류, 질환의 진행 정도, 투여 경로, 성별, 나이, 체중 등에 따라 적절히 증감될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 목적하는 효과를 얻기 위하여, 유효성분으로서 성인을 기준으로 1 일 총 투여량이 화합물로서 0.1 내지 1000 ㎎/㎏이 되도록 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 상기 화학식 Ⅰ의 화합물을 전체 조성물 총 중량에 대해 약 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 함유할 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 기술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물이 신경계 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있는지 여부를 살펴보기 위하여 하기 실험을 진행하였다.
대한민국 특허공개번호 10-2015-0075030 및 10-2018-0002539에 기재된 방법을 이용하여 제조된 화학식 III-1, IV-1, V-1, IV-2, V-2, II-1, III-4, IV-3, V-3, III-2, IV-4, V-4, II-2, III-3의 화합물에 대하여 하기 실험을 수행하였다. 또한, 글라브리딘(대촌화학, 대한민국)을 구입하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제한 것을 사용하였다.
실험예 1: 스트레스 상황 하에서 PON1(Paraoxonase 1)의 활성 억제 방지 확인 실험
PON1에 산화된 리놀렌산을 처리하면 PON1의 활성이 저해되는 것을 이용하여, PON1의 활성 억제 방지 확인 실험을 수행하였다. PON1의 활성은 TBBL(5-thiobutyl butyrolactones)을 기질로 하여 확인하였다.
구체적으로, 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube) 12 개에 각각 1 mM CaCl2를 포함하는 50 mM Tris-HCl 9.6 ㎕를 첨가한 후, 화학식 III-1, IV-1, V-1, IV-2, V-2, II-1, IV-3, V-3, III-2, IV-4, V-4, II-2, III-3의 화합물 및 글라브리딘을 각각의 튜브에 0.2 ㎕씩 첨가하여 농도가 30 μM이 되도록 하였다. 상기 12개 튜브에 각각 rePON1(RP-75678, Thermo社) 0.2 ㎕를 첨가하고 혼합하였다. 그 후 상온에서 30 분 동안 반응시키고, rePON1의 활성을 억제하기 위하여 DMSO에 녹인 1 mM 산화된 리놀렌산(OX-LA) 0.5 ㎕를 각각 첨가한 후 상온에서 2 시간 동안 반응시켜 용액(I)을 제조하였다.
384 well plate의 well에 1 mM CaCl2를 포함하는 50 mM Tris-HCl에 녹인 0.5 mM DTNB을 25 ㎕씩 분주한 후, 상기 용액(I)을 각각 10 ㎕씩 분주하고, 1 mM CaCl2를 포함하는 50 mM Tris-HCl에 녹인 2 mM TBBL을 각각 20 ㎕씩 첨가하여 시료를 준비하였다. 스펙트로미터(SpectraMax M2)를 이용하여 1시간 동안 2분마다 37 ℃, 420 nm에서 시료들의 흡광도를 측정하였다.
또한, 용액 제조 시 화학식 III-1, IV-1, V-1, IV-2, V-2, II-1, IV-3, V-3, III-2, IV-4, V-4, II-2, III-3의 화합물 및 글라브리딘 대신 DMSO를 0.2 ㎕ 첨가한 것을 제외하고 상기한 방법과 동일한 방법으로 음성 대조군을 준비하였고, 용액 제조 시 상기한 화합물 및 글라브리딘 대신 DMSO를 0.2 ㎕ 첨가한 것 및 산화된 리놀렌산을 첨가하지 않은 것을 제외하고 상기한 방법과 동일한 방법으로 정상 대조군을 준비하여 각각의 흡광도를 측정하였다.
SoftMax Pro software를 이용하여 상기 흡광도로부터 PON1의 활성도를 하기 식 1과 같이 계산하였고, 하기 표 1에 그 결과를 나타내었다.
[식 1]
활성도 = (흡광도시료-흡광도blank)/(흡광도PON1-흡광도blank) * 100
활성도 (%)
정상 대조군 100
음성 대조군 73.64
화학식 III-1 89.03
화학식 IV-1 95.01
화학식 V-1 80.71
화학식 IV-2 93.50
화학식 V-2 89.40
화학식 II-1 85.90
화학식 IV-3 90.60
화학식 V-3 95.10
화학식 III-2 83.80
화학식 IV-4 94.10
화학식 V-4 94.90
글라브리딘 82.78
표 1로부터, 화학식 III-1, IV-1, V-1, IV-2, V-2, II-1, IV-3, V-3, III-2, IV-4, V-4, II-2 또는 III-3의 화합물 및 rePON1을 포함하는 용액에 산화된 리놀렌산을 첨가한 경우, 산화된 리놀렌산에 의한 rePON1의 활성 억제가 방지되는 것을 확인할 수 있다. 그리고, 글라브리딘 및 rePON1을 포함하는 용액에 산화된 리놀렌산을 첨가한 경우보다, 화학식 III-1, IV-1, V-1, IV-2, V-2, II-1, IV-3, V-3, III-2, IV-4, V-4, II-2 또는 III-3의 화합물 및 rePON1을 포함하는 용액에 산화된 리놀렌산을 첨가한 경우 rePON1의 활성 억제를 방지하는 정도가 큰 것을 확인할 수 있다.
실험예 2: PON2(Paraoxonase 2)의 발현 확인 실험
14주령 C57BL/6J DIO(Diet Induced Obesity) 마우스(The Jackson Laboratory, USA)를 구입하여, 정상 대조군은 10 % 지방 식이, DIO 대조군은 60 % 지방 식이를 3주 동안 먹였다. 그리고, 화학식 III-1의 화합물 투여군은 60 % 지방 식이를 3 주 동안 먹인 후, 매일 1회 6주 동안 화학식 III-1의 화합물을 100 mg/kg 경구투여하였다.
상기 정상 대조군, DIO 대조군, 화학식 III-1의 화합물 투여군의 쥐를 희생시키고, 간 조직을 적출하여 PIC(protease inhibitor cocktail)가 포함된 PBS 용액으로 세척하고, 0.2 내지 0.5 g 크기로 절편을 만들어 실험 전까지 - 196 ℃에 보관하였다.
상기 정상 대조군, DIO 대조군, 화학식 III-1의 화합물 투여군의 간 조직 절편을 이용하여 하기 실험을 수행하였다.
- PON2 mRNA의 상대적인 발현 정도 확인
Real-time PCR을 이용하여 PON2 mRNA의 상대적인 발현 정도를 확인하였다. 구체적으로, 상기 간 조직에 트리졸(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 첨가한 후 균질기를 이용하여 분쇄한 후, 총 RNA를 추출하였다. 1 μg의 총 RNA에 올리고 Dt17 프라이머(oligo Dt17 proimer) 100 pmol을 첨가하고, 74 ℃에서 10 분동안 인큐베이션 한 후, 30 U RNasin(RNase inhibitor), 10 U AMV-RT(avian myeloblastosis virus reverse transcriptase), AMV-RT 버퍼(프로메가社, 이스라엘)을 첨가한 뒤, 42 ℃에서 2 시간, 52 ℃에서 1 시간동안 반응시켜, 간 조직에서 추출한 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. cDNA는 (주)타카라 바이오社의 SYBR Premix Ex Taq 키트와 어플라이드 바이오시스템社의 StepOnePlus Real-time PCR 시스템을 이용하여 증폭시켰다.
프라이머 시퀀스는 인테그레이티드 DNA 테크놀로지社의 프라이머 퀘스트 소프트웨어를 이용하여 디자인하였다. 사용된 프라이머 시퀀스는 표 2와 같다.
프라이머 프라이머 시퀀스 서열번호
PON2 Forward 5'-GGT AAA CAG GTC TGC GGC CTC G-3' 서열번호 1
Reverse 5'-CCT AGG AGT CAC TTC CCG CCT CA-3' 서열번호 2
GAPDH
(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)		 Forward 5'-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3' 서열번호 3
Reverse 5'-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TGA T-3' 서열번호 4
어닐링(annealing) 온도는 60 ℃로 하였다.
GAPDH는 어떠한 조건에 관계없이 모든 조직에서 일정하게 발현되는 하우스키핑 유전자로, GAPDH 프라이머는 같은양의 RNA가 실험에 사용되었다는 것을 확인하기 위한 용도로 사용되었다.
- 웨스턴블랏 분석을 통한 PON2의 상대적인 발현 정도 확인
상기 간 조직에 protease inhibitor cocktail을 첨가한 lysis 버퍼(CelLyticTM MT Cell Lysis Reagent, 시그마알드리치社)를 첨가하고 균질기를 이용하여 분쇄한 후, 0 ℃에서 30 분동안 인큐베이션 하고, 4 ℃, 14,000 rpm 조건으로 15 분동안 원심분리하여 상등액을 얻었다. 단백질의 농도를 Bradford법을 이용하여 정량한 후, 동량의 단백질을 10 % SDS-PAGE에서 전기영동하여 단백질을 분리하고, 글리신-메탄올 버퍼에서 PVDF 막(polyvinylidene difluoride membrane, Pall Corporation, USA)으로 단백질을 전사하였다. PVDF 막을 5 % 무지방유가 포함된 블로킹 용액에서 블로킹한 후, PON2 항체(Abcam, UK)로 밤새 인큐베이션시켰다. 다시 2차 항체를 반응시킨 후, ECL 용액(Thermo Fisher Scientific, USA)을 PVDF 막 위에 가하여 발광시키고 암실에서 X-선 필름에 감광한 후 현상하였다.
액틴은 하우스키핑 유전자로, 같은양의 RNA가 실험에 사용되었다는 것을 확인하기 위한 용도로 사용되었다.
도 1은 정상 대조군, DIO 대조군, 화학식 III-1의 화합물 투여군에서 (a) PON2 mRNA의 상대적인 발현 정도 및 (b) Actin에 대한 PON2의 상대적인 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 1로부터 화학식 III-1의 화합물 투여군의 경우, DIO 대조군에 비하여 PON2의 발현이 높을 뿐만 아니라, 정상 대조군에 비해서도 PON2 mRNA 및 PON2의 발현이 높은 것을 확인할 수 있다.
실험예 3: 뉴로블라스토마 세포( SH - SY5Y 세포)의 손상된 미토콘드리아 기능 회복 확인 실험
3-1. 미토콘드리아 기능 저하 유도 및 세포 배양
37 ℃, 5% 탄산가스 및 95 % 공기 조건의 10 % FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 1:1 DMEM/F12 배지에서 인간 신경세포인 SH-SY5Y 세포를 배양하였다. 상기 배양한 세포를 2 * 104 세포/웰 밀도로 96 웰 세포 배양 플레이트에 옮기고 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 혈청 제한 배지(0.5 % FBS를 포함하는 1:1 DMEM/F12 배지)로 교체하고 16 시간 동안 배양한 후, 1 mM MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium)로 상기 배양한 세포를 처리하고 24 시간 동안 배양하여 세포에 미토콘드리아 기능 저하를 유도하였다.
이후 각각의 웰에 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1 또는 1 μM의 농도가 되도록 화학식 III-1의 화합물을 첨가한 후 24 시간 동안 배양하였다.
3-2. 미토콘드리아 손상에 따른 세포 사멸 억제 효능 확인
3-1에서 수득된 배양물을 각각 0.2 mg/ml 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드(3-(4,5-dimehtylthiozol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, MTT; 시그마알드리치社)로 처리하여 4 시간 동안 배양하고, 살아있는 세포에 의해 형성된 MTT 포르마잔(formazan) 침전물을 0.04N 염산/이소프로판올(isopropanol) 100 ㎕에 용해하여, ELISA 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices社)로 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
MMP+ 및 화학식 III-1의 화합물 대신 DMSO를 첨가한 시료(정상 대조군); 및 화학식 III-1의 화합물을 첨가하지 않은 시료(음성 대조군);를 사용한 것을 제외하고, 상기한 방법과 동일한 방법으로 대조군의 흡광도를 측정하였다.
흡광도로부터 세포 생존력(cell viability) 백분율을 구하였다.
도 2는 실험예 3-2에 따른 세포 생존력 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 2에 나타난 바와 같이, 화학식 III-1의 화합물을 첨가하는 경우 MPP+에 의해 손상된 미토콘드리아의 기능이 회복되는 것을 확인할 수 있다.
3-3. 미토콘드리아 손상에 따른 세포 내 ATP 생성량 감소에 대한 회복 확인
3-1에서 수득된 배양물의 세포 파쇄물 100 ㎕ 를 ATP 생물발광 체세포시험 키트인 생물발광성 체세포 분석키트(bioluminescent somatic cell assay kit, 시그마알드리치社)를 사용하여 100 ㎕ 루시페린-루시퍼라제(luciferin-luciferase) 반응 완충액과 혼합하고, 20 ℃ 에서 10 분 동안 반응시켰다. 그 후, 상등액을 얻고 LB 9501 루매트 루미노미터(Lumat-Luminometer)로 형광세기를 측정하여, 미토콘드리아 손상에 따른 세포 내 ATP 생성량 감소에 대한 회복을 확인하였다.
MMP+ 및 화학식 III-1의 화합물 대신 DMSO를 첨가한 시료(정상 대조군); 및 화학식 III-1의 화합물을 첨가하지 않은 시료(음성 대조군);를 사용한 것을 제외하고, 상기한 방법과 동일한 방법으로 대조군의 형광세기를 측정하였다.
형광세기로부터 세포 내 ATP 생성량을 정상 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
도 3은 실험예 3-3에 따른 ATP 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 3의 그래프에 나타난 바와 같이, 화학식 III-1의 화합물을 첨가하는 경우, MPP+로 인한 미토콘드리아의 손상에 따른 ATP 생성량 감소가 회복되는 것을 확인할 수 있다.
3-4. 미토콘드리아 손상에 따른 활성 산소 발생 완화 효능 확인
2',7'-다이클로로플루오로세인 디아세테이트(2',7'-dichlorofluroroscein diacetate, DCF-DA)가 활성 산소와 반응하면 형광을 띠는 DCF로 산화되는 원리를 이용하여, 활성 산소 발생 정도를 확인하였다. 3-1에서 수득된 배양물에 1 μM DCF-DA 및 0.05 μM 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33342)를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 동안 세포를 염색하였다. 그리고, 형광분석기로 여기 파장 485 nm, 방출 파장 535 nm에서 DCF의 형광세기 및 여기 파장 335 nm, 방출 파장 460 nm에서 비스벤지마이드의 형광세기를 얻어 활성 산소 발생 정도를 확인하였다.
MMP+ 및 화학식 III-1의 화합물 대신 DMSO를 첨가한 시료(정상 대조군); 및 화학식 III-1의 화합물을 첨가하지 않은 시료(음성 대조군);를 사용한 것을 제외하고, 상기한 방법과 동일한 방법으로 대조군의 형광세기를 측정하였다.
형광세기로부터 DCF의 농도를 정상 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
도 4는 실험예 3-4에 따른 DCF의 농도 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 4의 그래프에 나타난 바와 같이, 화학식 III-1의 화합물을 첨가하는 경우, MPP+를 첨가함으로써 유발되는 세포 독성으로 인하여 발생하는 세포 내 활성 산소 발생 정도가 감소하는 것을 확인할 수 있다.
3-5. 미토콘드리아 손상에 따른 미토콘드리아 내부의 활성 산소 발생 완화 효능 확인
MitoSOXTM Red reagent라는 환원되어 있는 형광 물질을 이용하여 미토콘드리아 내부 활성 산소 발생 정도를 확인하였다. MitoSOX Red는 호흡하는 세포 내로 들어가기 전까지 형광을 띠지 않으나, 세포 내로 들어가서 산화되면 선택적으로 미토콘드리아를 염색한다.
구체적으로, 3-1에서 수득된 배양물을 13 ㎕ DMSO에 녹인 50 μg의 MitoSOX Red로 처리하여 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션 시켰다. 인큐베이션 후 PBS 로 2번 세척한 뒤, 0.05 μM 비스벤지미드(bisbenzimide, Hoechst 33342) 를 처리하여 37 ℃에서 1시간 동안 염색하였다. 그리고, 형광분석기로 여기 파장 510 nm, 방출 파장 595 nm에서 형광세기를 측정하여 미토콘드리아 내부에서 생성된 활성 산소 발생 정도를 확인하였다.
MMP+ 및 화학식 III-1의 화합물 대신 DMSO를 첨가한 시료(정상 대조군); 및 화학식 III-1의 화합물을 첨가하지 않은 시료(음성 대조군);를 사용한 것을 제외하고, 상기한 방법과 동일한 방법으로 대조군의 형광세기를 측정하였다.
형광세기로부터 MitoSOX Red의 농도를 정상 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
도 5는 실험예 3-5에 따른 Mito-SOX의 농도 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 5의 그래프에 나타난 바와 같이, 화학식 III-1의 화합물을 첨가하는 경우, MPP+를 첨가함으로써 유발되는 세포 독성으로 인하여 발생하는 미토콘드리아 내부에서 생성된 활성 산소 발생 정도가 감소하는 것을 확인할 수 있다.
결과적으로, 실험예 3으로부터 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물을 포함하는 경우 미토콘드리아 기능 향상을 통하여 신경 보호 지표들이 개선되었음을 확인할 수 있다.
실험예 4: 항염증 효과 확인 실험
4-1. RAW264 .7 세포, BV2 세포의 배양 및 전 처리
RAW264.7 세포와 BV2 세포(5Х105cells/well)를 10 % heat-inactivated FBS, 페니실린 G(penicillin G) 10 IU/mL, 스트렙토마이신(streptomycin) 100 μg/mL, L-글루타민(L-glutamine) 2 mM을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO2 배양기 내에서 37 ℃의 온도로 배양하였다.
RAW264.7 세포 또는 BV2 세포에 화학식 III-3, III-4, V-3, III-1, IV-1, V-1, IV-2, V-2 또는 II-2의 화합물을 첨가하여 MTT assay를 통해 화합물들의 독성을 확인하였고, 세포 독성을 나타내지 않은 농도를 실험 가능한 농도로 정하여 하기 실험을 진행하였다.
항염증 효과 확인 실험에서 Butein은 항염증 물질로서 참고를 위하여 사용되었다.
먼저, 배양한 RAW264.7 세포 또는 BV2 세포에 하기 표 3과 같이 화합물을 각각 첨가하고 3 시간 동안 전 처리하였다.
RAW264.7 세포에 첨가한 양(μM) BV2 세포에 첨가한 양(μM)
화학식 III-3 5 10 20 2.5 5 10
화학식 III-4 2.5 5 10 2.5 5 10
화학식 V-3 1.25 2.5 5 0.625 1.25 2.5
화학식 III-1 5 10 20 2.5 5 10
화학식 IV-1 5 10 20 5 10 20
화학식 V-1 5 10 20 1.25 2.5 5
화학식 IV-2 5 10 20 5 10 20
화학식 V-2 2.5 5 10 1.25 2.5 5
화학식 II-2 2.5 5 10 5 10 20
글라브리딘 10 20 40 5 10 20
4-2. iNOS와 COX-2 단백질의 발현 정도 및 NO와 PGE 2 의 생성량 확인
4-1의 전 처리물을 LPS 1 μg/ml로 24 시간 동안 처리한 후, iNOS와 COX-2의 발현 정도를 웨스턴 블랏을 통해 관찰하였고, NO와 PGE2의 생성을 확인하였다.
도 6a, 6b는 RAW264.7 세포 또는 BV2 세포에서 실험예 4-2에 따른 iNOS와 COX-2의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 7a, 7b는 RAW264.7 세포에서 실험예 4-2에 따른 NO 또는 PGE2의 생성도를 나타낸 그래프이다.
도 7c, 7d는 BV2 세포에서 실험예 4-2에 따른 NO 또는 PGE2의 생성도를 나타낸 그래프이다.
4-3. IL- 1β , IL-6 및 TNF -α의 발현 정도 확인
4-1의 전 처리물을 LPS 1 μg/ml로 6 시간 동안 처리한 후, RT-PCR을 이용하여 염증 반응에서 생성되는 사이토카인인 IL-1β, IL-6 또는 TNF-α의 mRNA 발현 정도를 확인하였다.
도 8a, 8b, 8c는 RAW264.7 세포에서 실험예 4-3에 따른 IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8d, 8e, 8f는 BV2 세포에서 실험예 4-3에 따른 IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
4-4. NF -ĸB 단백질의 핵 내부로의 전사 억제 확인
4-1의 전 처리물을 LPS 1 μg/ml로 1 시간 동안 처리한 후, 웨스턴 블랏을 통해 NF-ĸB 단백질의 p65와 p50의 핵 내부로의 전사 정도를 확인하였다.
도 9a, 9b는 RAW264.7 세포 또는 BV2 세포에서 실험예 4-4에 따른 NF-ĸB 단백질의 p65와 p50의 핵 내부로의 전사 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6 내지 도 9로부터 화학식 III-3, III-4, V-3, III-1, IV-1, V-1, IV-2, V-2 또는 II-2의 화합물은 RAW264.7 세포, BV2 세포 각각에서 iNOS와 COX-2의 발현, NO와 PGE2의 생성, IL-6, IL-1β, TNF-α mRNA의 발현 및 NF-ĸB 단백질의 p65와 p50의 핵 내부로의 전사 정도를 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있다. 이에 비하여, 글라브리딘을 첨가한 경우에는, RAW264.7 세포 또는 BV2 세포에서 iNOS와 COX-2의 발현, NO와 PGE2의 생성, IL-6, IL-1β, TNF-α mRNA의 발현 및 NF-ĸB 단백질의 p65와 p50의 핵 내부로의 전사 정도가 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물을 첨가한 경우보다 감소되지 않는 것을 확인할 수 있다. 또한, 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물을 첨가한 경우에는, 글라브리딘을 첨가한 경우의 글라브리딘 농도보다 낮은 농도에서 글라브리딘과 동등하거나 그 이상의 항염증 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
결과적으로, 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물은 PONase 활성제로 작용하여 다양한 항염증 지표 및 미토콘드리아 기능을 개선시키는데 기여하는 것을 확인할 수 있다.
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Claims (11)

  1. 하기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물, 약학적으로 허용 가능한 그의 염, 또는 그 용매화물을 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 I]
    Figure pat00021

    상기 화학식 I에서,
    점선은 선택적 이중결합이고,
    R1은 수소 원자; 및 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이며,
    R2는 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 및 히드록시기 중 어느 하나이고,
    OR1 및 R2 중 적어도 하나는 히드록시기이며,
    R3은 수소 원자; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 치환 또는 비치환 C6-C12 아릴옥시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 티오알킬기; 및 할로겐 원자 중 어느 하나이고,
    R4는 수소 원자; 메틸; 에틸; 메톡시 또는 에톡시이며,
    R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 원자; 및 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이고,
    상기 치환 알킬기, 치환 알콕시기, 치환 알릴옥시기, 치환 아릴옥시기 및 치환 티오알킬기의 경우, 상기 치환기는 할로겐 원자; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알킬기; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알콕시기; 및 직쇄 또는 분지쇄 C1-C3 티오알킬기 중 어느 하나이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 수소 원자, 메틸기 또는 에틸기이고,
    상기 R2는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, iso-프로필기, n-부틸기, iso-부틸기, tert-부틸기, 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, iso-프로폭시기, n-부톡시기, iso-부톡시기, tert-부톡시기 또는 히드록시기이며,
    상기 R3 및 R4는 각각 수소 원자이고,
    상기 R5 및 R6은 각각 메틸기인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물은 하기 화학식 II의 화합물인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 II]
    Figure pat00022

    상기 화학식 II에서,
    R1은 수소 원자; 및 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이며,
    R2는 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 및 히드록시기 중 어느 하나이고,
    OR1 및 R2 중 적어도 하나는 히드록시기이며,
    R3은 수소 원자; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 치환 또는 비치환 C6-C12 아릴옥시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 티오알킬기; 및 할로겐 원자 중 어느 하나이고,
    R4는 수소 원자; 메틸; 에틸; 메톡시 또는 에톡시이며,
    R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 원자; 및 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이고,
    상기 치환 알킬기, 치환 알콕시기, 치환 알릴옥시기, 치환 아릴옥시기 및 치환 티오알킬기의 경우, 상기 치환기는 할로겐 원자; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알킬기; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알콕시기; 및 직쇄 또는 분지쇄 C1-C3 티오알킬기 중 어느 하나이다.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 화학식 II의 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 II-1]
    Figure pat00023

    [화학식 II-2]
    Figure pat00024
    .
  5. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물은 하기 화학식 III의 화합물인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 III]
    Figure pat00025

    상기 화학식 III에서,
    R1은 수소 원자; 및 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이며,
    R2는 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 및 히드록시기 중 어느 하나이고,
    OR1 및 R2 중 적어도 하나는 히드록시기이며,
    R3은 수소 원자; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 치환 또는 비치환 C6-C12 아릴옥시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 티오알킬기; 및 할로겐 원자 중 어느 하나이고,
    R4는 수소 원자; 메틸; 에틸; 메톡시 또는 에톡시이며,
    R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 원자; 및 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이고,
    상기 치환 알킬기, 치환 알콕시기, 치환 알릴옥시기, 치환 아릴옥시기 및 치환 티오알킬기의 경우, 상기 치환기는 할로겐 원자; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알킬기; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알콕시기; 및 직쇄 또는 분지쇄 C1-C3 티오알킬기 중 어느 하나이다.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 화학식 III의 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 III-1]
    Figure pat00026
    Figure pat00027

    [화학식 III-2]
    Figure pat00028

    [화학식 III-3]
    Figure pat00029

    [화학식 III-4]
    Figure pat00030
    .
  7. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물은 하기 화학식 IV의 화합물인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 IV]
    Figure pat00031

    상기 화학식 IV에서,
    R1은 수소 원자; 및 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이며,
    R2는 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 및 히드록시기 중 어느 하나이고,
    OR1 및 R2 중 적어도 하나는 히드록시기이며,
    R3은 수소 원자; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 치환 또는 비치환 C6-C12 아릴옥시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 티오알킬기; 및 할로겐 원자 중 어느 하나이고,
    R4는 수소 원자; 메틸; 에틸; 메톡시 또는 에톡시이며,
    R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 원자; 및 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이고,
    상기 치환 알킬기, 치환 알콕시기, 치환 알릴옥시기, 치환 아릴옥시기 및 치환 티오알킬기의 경우, 상기 치환기는 할로겐 원자; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알킬기; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알콕시기; 및 직쇄 또는 분지쇄 C1-C3 티오알킬기 중 어느 하나이다.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 화학식 IV의 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 IV-1]
    Figure pat00032

    [화학식 IV-2]
    Figure pat00033

    [화학식 IV-3]
    Figure pat00034

    [화학식 IV-4]
    Figure pat00035
    .
  9. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 I의 피라노[2,3-f]크로멘 유도체 화합물은 하기 화학식 V의 화합물인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 V]
    Figure pat00036

    상기 화학식 V에서,
    R1은 수소 원자; 및 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이며,
    R2는 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 및 히드록시기 중 어느 하나이고,
    OR1 및 R2 중 적어도 하나는 히드록시기이며,
    R3은 수소 원자; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알킬기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6 알콕시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C6 알릴옥시기; 치환 또는 비치환 C6-C12 아릴옥시기; 치환 또는 비치환, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 티오알킬기; 및 할로겐 원자 중 어느 하나이고,
    R4는 수소 원자; 메틸; 에틸; 메톡시 또는 에톡시이며,
    R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소 원자; 및 C1-C6 알킬기 중 어느 하나이고,
    상기 치환 알킬기, 치환 알콕시기, 치환 알릴옥시기, 치환 아릴옥시기 및 치환 티오알킬기의 경우, 상기 치환기는 할로겐 원자; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알킬기; 직쇄 또는 분지쇄 C1-C5 알콕시기; 및 직쇄 또는 분지쇄 C1-C3 티오알킬기 중 어느 하나이다.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 화학식 V의 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 V-1]
    Figure pat00037

    [화학식 V-2]
    Figure pat00038

    [화학식 V-3]
    Figure pat00039

    [화학식 V-4]
    Figure pat00040
    .
  11. 제1항에 있어서,
    상기 신경계 질환은 알츠하이머병, 혈관성 치매, 파킨슨병, 뇌수막염, 뇌전증, 뇌졸중, 뇌종양, 근신경계 질환, 신경계 감염, 유전성 신경 질환, 척수 질환 및 이상운동 질환 중 어느 하나인 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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