KR101548803B1

KR101548803B1 - ３（６（４（트리플루오로메톡시）페닐아미노）피리미딘４일）벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101548803B1
Application number: KR1020130107934A
Authority: KR
Inventors: 이인규; 카루나카란 우다야쿠마르; 김명옥; 정지윤; 오창주; 전도연; 심태보; 윤지혜
Original assignee: 경북대학교병원; 한국과학기술연구원
Priority date: 2013-09-09
Filing date: 2013-09-09
Publication date: 2015-09-01
Also published as: WO2015034169A1; KR20150029802A

Abstract

본 발명은 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병(diabetes)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 제 1형 당뇨병 및 제 2형 당뇨병을 포함한 당뇨병의 치료에 효과적으로 사용될 수 있으며, 상기 화합물은 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품의 용도로서도 사용될 수도 있다.

Description

３（６（４（트리플루오로메톡시）페닐아미노）피리미딘４일）벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION OR TREATMENT OF DIABETES COMPRISING 3-(6-(4-(TRIFLUOROMETHOXY)PHENYLAMINO)PYRIMIDIN-4-YL)BENZAMIDE OR PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALTS THEREOF AS AN EFFECTIVE COMPONENT}

본 발명은 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병(diabetes)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

생체 내 티로신 키나아제 신호 경로(tyrosine kinase signaling pathway)는 세포 증식, 분화, 신진 대사, 세포 이동 조절 기전에 중요하며, 이 경로의 이상은 암과 같은 질환의 발생과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다.

특히, Chronic myelogeneous leukemia(CML) 치료에 있어 Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitors(TKI)인 imatinib(Gleevec 또는 Glivec)가 획기적인 치료제로 알려지면서 TKI 개발은 암 정복과 관련하여 다양하게 연구개발되었다.

GNF-2로 알려진 3-(6-(4-(trifluoromethoxy)phenylamino)pyrimidin-4-yl)benzamide는 non-ATP-competitive inhibitors로 Bcr-Abl inhibitor로 알려져 있다(Mian et al., 2012). TKI의 대표적인 약물로는 Imatinib, Nilotinib과 Dasatinib 등이 있으며, Imatinib을 중심으로 알려진 이들 TKI의 작용기전은 Bcr-Abl kinase와 결합하여 Bcr-Abl oncoprotein의 자가인산화와 기질인산화를 억제한다고 알려져 있다(Mokhtari and Welsh, 2010). 현재까지 알려진 TKI 타겟으로는 Arg(Abl-related gene), SCF(stem cell factor) recptor c-Kit, PDGFR(platelet-derived growth factor receptor), DDR1/2(discoidin domain receptor 1/2) 및 oxidoreductase NQO2(NADPH dehydrogenase quinone 2) 등이 보고되었다(Hantschel et al., 2008).

Imatinib를 포함하는 대부분의 TKI 약물은 CML의 치료제로 탁월할 뿐 아니라 gastrointestinal stromal tumiors(GISTs)를 비롯하여 다양한 암세포 증식을 억제하는 것으로 확인되었다. 특히, CML 환자 중 제 2형 당뇨병을 수반하는 chronic myeloid leukemia 환자에 Imatinib를 투여하였을 때 CML뿐 만 아니라 당뇨도 개선된다는 연구 보고(Breccia et al., 2004; Veneri et al., 2005) 이 후에 TKI의 항당뇨 활성에 주목하게 되었다. Imatinib의 항당뇨 활성에 대한 연구 보고에 따르면, STZ-induced diabetes에 대한 보호활성, NOD(non-obese diabetic) mice 뿐만 아니라 db/db mice에서의 당뇨 개선 등이 확인되어 보고되었다(Han et al., 2009).

이후, Nilotinib, Sunitinib, Dasatinib, Erlotinib 와 Fasudil와 같은 TKI에서도 제 1형 당뇨 또는 제 2형 당뇨의 개선이 beta-cell의 세포사멸 억제 및 insulin resistance 감소와 연관이 있다고 보고되어 TKI가 당뇨 치료에도 탁월하다고 인식하게 되었다. TKI의 항당뇨 효과에 대한 작용기전에 대한 연구는 Imatinib 연구를 통하여 protein kinase C(PKC) delta 활성화 억제와, stress-activated protein kinase 경로 차단을 통해 pancreatic beta-cell의 세포사멸로부터 보호하여 항당뇨활성이 있다고 알려지게 되었다(Hagerkvist et al., 2006).

CML 치료에 사용되는 Bcr-Abl을 타겟하는 Imatinib, Nilotinib 및 Dasatinib는 초기 CML 치료에는 효과적이었으나, advanced disease stages CML 환자의 치료에는 한계가 있다. 특히, Abl 키나아제 도메인의 ATP 결합부위에 점돌연변이가 있으면 이들 변이 Bcr-Abl에 작용하지 못해 이들 약물의 치료 효능은 감소되어 이들 약제에 대한 내성이 문제되고 있다. 즉, 이들 약물(Imatinib, Nilotinib, Dasatinib)은 Abl 티로신 키나아제의 ATP 결합부위를 공략하므로, ATP 경쟁적인 Abl 티로신 키나아제의 저해제들이다.

한편, ATP 비경쟁적인, 알로스테릭 Bcr-Abl 티로신 키나아제 저해제로서 3-(6-(4-(trifluoromethoxy)phenylamino)pyrimidin-4-yl)benzamide(GNF-2)가 보고(Nat Chem Biol. 2006 Feb;2(2):95-102)되었다. GNF-2는 Abl 티로신 키나아제가 형질전환 세포에 매우 효과적이라고 보고(Adrian et al., 2006)되었다. GNF-2와 ATP 경쟁적인 Bcr-Abl 키나아제 저해제(Imatinib/Nilotinib)의 병용투여는 Bcr-Abl-T3151과 같은 TKI 내성 CML 치료에도 탁월한 효과가 있다고 보고(Nature. 2010 Jan 28;463(7280):501-6.)되었다. 상기한 바와 같이, Bcr-Abl 키나아제인 Imatinib의 항당뇨 효과가 보고(Breccia et al., 2004; Veneri et al., 2005)되었고, 또한 GNF-2가 Bcr-Abl 키나아제 저해제로 보고(Nat. Chem. Biol. 2006 Feb;2(2):95-102; J, Biol. Chem. 2009 Oct;284(42):29005-29014)되었다.

또한, 당뇨병 발생 기전에 산화적 스트레스(oxidative stress)가 중요하게 관여한다는 것은 당뇨병 유발에 사용되는 streptozotocin(STZ)과 alloxan 약제의 기전 연구에서도 언급되었으며, Kubisch 등이 생체 항산화 방어기구인 Cu/Zn superoxide dismutase의 과발현을 유도하였을 때 당뇨발생이 억제되었다는 보고와 당뇨병 환자와 vitamin C와 Vitamin E와의 상관관계 임상 연구보고에서도 알려지게 되었다. 이는 생체에서 고혈당에 의한 산화적 스트레스가 glycation 증가, polyol 경로로의 전환에 따른 세포내 삼투압 상승과 변성 유발, pro-inflammatory와 inflammatory cytokine 유전자의 발현 촉진을 유도하는 protein kinase C의 활성화와 연관 있음이 알려지게 되었다.

US

2012-0329798

A

Allosteric inhibition enhances the efficacy of ABL kinase inhibitors to target unmutated BCR-ABL and BCR-ABL T315I, Afsar Ali Mian et al., BMC Cancer 2012, 12:411 The Ins and Outs of Bcr-Abl Inhibition, E. Premkumar Reddy et al., Genes & Cancer 3(5-6) 447-454

본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병(diabetes)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 과제는 상기 화합물을 포함하는 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병(diabetes)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 당뇨병은 제 1형 당뇨병(type 1 diabetes) 또는 제 2형 당뇨병(type 2 diabetes)인 것이 바람직하다.

상기 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 췌장 β-세포의 세포사멸을 억제하는 것이 바람직하다.

상기 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 ROS(reactive oxygen species)의 생성을 억제하는 것이 바람직하다.

상기 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 JNK 인산화를 억제하는 것이 바람직하다.

상기 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 PKCδ의 활성화를 억제하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드를 포함하는 당뇨병(diabetes)의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 제 1형 당뇨병 및 제 2형 당뇨병을 포함한 당뇨병의 치료에 효과적으로 사용될 수 있으며, 상기 화합물은 당뇨병의 예방 또는 개선용 건강기능식품의 용도로서도 사용될 수도 있다.

도 1은 GNF-2의 rat pancreatic β-cell의 보호 작용을 확인한 결과이다.
도 2는 GNF-2의 ROS 생성에 대한 영향을 나타낸 결과이다.
도 3은 GNF-2의 stress-activated protein kinase(SAPK)에 대한 영향을 나타낸 결과이다.
도 4는 GNF-2의 Protein kinase C(PKC)에 의한 세포사멸에 대한 영향을 나타낸 결과이다.
도 5는 in vivo 실험을 통한 GNF-2의 항당뇨 활성을 보여주는 결과이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 ATP-비경쟁적인 알로스테릭 Bcr-Abl 키나아제 저해제인 GNF-2로 알려진 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드의 항당뇨 활성을 in vitro와 in vivo에서 확인하고, GNF-2가 당뇨병의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있음을 밝혔다.

따라서, 본 발명은 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병(diabetes)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 달리 지시되지 않는 한 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

본 발명의 화합물을 함유하는 건강기능식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다. 또한, 당뇨성 질환의 예방 효과를 목적으로 식품류 또는 음료에 첨가될 수도 있다. 이때, 식품류 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품류 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 음료는 100㎖를 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강기능식품은 지시된 바람직한 비율의 상기 화합물을 함유하는 외의 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 식품류 또는 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 및 합성 향미제를 유리하게 사용할 수도 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수도 있다. 그 밖에 본 발명의 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100중량부 당 0 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하에서는, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[ 실시예 ]

1. 재료 및 방법

본 연구에서 세포실험과 동물실험을 수행하였으며, 먼저 세포실험은 rat pancreatic β-cell line(INS-1)에 streptozotocin(STZ)을 처리하여 oxidative stress에 의한 세포사멸에 대한 GNF-2의 rat pancreatic β-cell line(INS-1)의 세포사멸로부터의 보호활성을 조사하였다.

알로스테릭 Bcr-Abl 타이로신 키아나제 제해제인 3-(6-(4-(trifluoromethoxy)phenylamino)pyrimidin-4-yl)benzamide의 세포보호 활성이 스트레스에 의해 활성화되는 SAPK 경로 중 JNK의 인산화 억제, 또는 단백질 키나아제 델타(protein kinase delta)의 활성화와 케스파아제-3(caspase-3)의 관계 여부를 웨스터블롯(Western blot)을 이용하여 각 단백질의 발현과 인산화 경향을 비교 조사하였다.

동물실험의 경우 마우스(C57BL/6)에 GNF-2(30mg/kg)를 먹인 그룹과 먹이지 않은 그룹에 STZ 150mg/kg 단회 투여로 당뇨를 유발시킨 후 체중변화와 혈당변화를 측정하여 비교하였다.

2. 결과 및 고찰

2.1. GNF -2의 rat pancreatic β- cell 보호작용

GNF-2는 알로스테릭 Bcr-Abl 키나아제 저해제로서 Imatinib, Nilotinib 및 Dasatinib와 달리 ATP-비경쟁적이다. Bcr-Abl 키나아제인 Imatinib의 항당뇨 효과가 보고되었고, GNF-2가 Bcr-Abl 키나아제 저해제로 보고되었으며, 또한 여러 TKI가 항당뇨 활성을 가진다고 임상보고에 따라 GNF-2의 항당뇨 활성도를 rat pancreatic β-cell line(Ins-1)과 C57BL/6J mice 실험계를 이용하여 검정하였다.

먼저 GNF-2의 INS-1 세포에 대한 세포독성을 측정하였다. 도 1의 A에서 보는 바와 같이, STZ 처리에 의해 INS-1 세포가 STZ에 의해 사멸되는데 반해 GNF-2를 7.5μM로 1시간 전처리한 세포는 STZ에 의한 세포손상으로부터 많이 보호됨을 알았다. 이는 PI 와 DAPI 염색으로도 확인할 수 있었다(도 1의 B).

2.2. GNF -2의 ROS ( reactive oxygen species ) 생성에 대한 영향

생체의 대사를 통해 활성산소가 생성되며 이 활성산소는 불안정하여 주변 세포의 DNA와 단백질에 작용하여 변이나 변성을 유발하여 세포손상을 유발하여 세포 사멸을 유도하게 된다.

STZ은 강력한 DNA methylating agent로 췌장에 free radical donor로 작용하는 것으로 알려져 있다(Larsen and Grude, 1978; Newsholme et al ., 2007). 즉, STZ 처리에 의해 유발되는 당뇨 모델은 STZ에 의해 ROS가 생성되고, 생성된 ROS가 pancreatic β-cell를 공격하여 β-cell 세포사멸을 유도하여 인슐린 결핍상태로 만들어 당뇨을 유발한다고 알려져 있다. 따라서, INS-1 세포를 STZ로부터 보호하는 GNF-2의 세포보호활성이 STZ에 의해 유도되는 ROS 생성을 저해하는 것과 연관 있는지를 DHCF-DA의 fluorescent form인 DCF 생성에 대한 저해 활성으로 조사하였다.

도 2에서와 같이, streptozotocin 처리에 의하여 생성되는 ROS를 100%로 하였을 때 streptozotocin처리 전 GNF-2를 1시간 전처리하였을 때 ROS 생성이 73.4% 저해됨을 확인하였다.

2.3. GNF -2의 stress - activated protein kinase ( SAPK )에 대한 영향

Apoptosis는 세포가 외부로부터 스트레스에 노출되면 plasma membrane의 변형에 이어 세포 수축, mitochondria depolarization, 단백질 분해, 염색체 응축 및 DNA 단편화되어 세포가 사멸하는 기구이다. 이와 같은 세포사멸 신호전달계로는 mitogen-activated protein kinase family(MAPK)와 protein kinase C(PKC)가 관여한다고 알려져 있다.

먼저, MAPK 경로는 크게 extracellular signal-regulated kinases(ERK1/2), c-Jun NH₂-terminal kinases(JNK-1/2/3) 및 p38 MAPK proteins(p38α/β/γ/δ)로 구분된다. 이중 c-Jun NH₂-terminal kinases(JNK-1/2/3)와 p38 MAPK proteins(p38α/β/γ/δ)는 세포가 UV light, γ-irradiation, DNA damage, heat 및 osmotic shock 또는 oxidative stress를 받을 때 유도되는 세포사멸 경로이다(English et al., 1999; Hagemann and Blank, 2001; Huang et al., 1999).

Bcr-Abl의 인산화는 stress-activated protein kinase(JNK와 p38 MAP-kinases)의 활성화를 유도하여 caspase 9 활성화시켜 세포사멸을 유도한다고 알려져 있으며, nonreceptor protein kinase c-Abl의 인산화를 억제하는 것으로 알려진 Imatinib도 stress-activated protein kinase 중 JNK 인산화를 저해시켜 pancreatic β-cell의 세포사멸을 보호하여 항당뇨 활성을 가진다고 보고되었다(Hagerkvist et al., 2006). 그리고, 이와 같은 Imatinib의 세포보호 활성은 panceatic β-cell 뿐만 아니라 myotubes의 H₂O₂ 에 의한 oxidative stress 하에서도 JNK의 인산화와 c-jun 인산화 억제를 통해 세포사멸을 억제한다고 확인되어 TKI는 Bcr-Abl 활성화에 따른 하류 신호전달계 JNK 경로 차단으로 세포사멸을 억제한다고 보고되었다(Hagerkvist et al., 2006). 따라서 Bcr-Abl 키나아제 저해제인GNF-2의 JNK 경로에 대한 영향을 조사하였다.

도 3에서 보는 것과 같이, INS-1 세포를 1mM STZ로 8시간 처리하면 total JNK의 변화는 거의 없으나 JNK-1과 -2의 인산화가 급격히 유도되었으며, 이와 같은 JNK의 활성화는 GNF-2를 7.5μM로 1시간 전처리하거나 JNK inhibitor인 SP600125 을 처리하면 급격히 억제됨을 확인하였다. 이 결과로부터 GNF-2도 Imatinib처럼 JNK 인산화를 억제하여 세포사멸을 저해하는 것으로 확인되었다.

2.4. GNF -2의 protein kinase C delta 에 의한 세포사멸에 대한 영향

세포가 genotoxic stress를 받으면 그 손상 정도에 따라 세포생존과 사멸을 결정하여 회복되든지 세포사를 통해 제거된다. 현재까지 아직 이에 대한 완전한 기전은 알려져 있지 않으나 apoprotic cell death에 protein kinase Cδ isoform이 c-Abl의 인산화에 의해 활성화되고, 이어 활성화된 caspase-3에 의해 cleavage된 PKCδ가 핵 내로 이동하여 apoptosis를 유도한다고 보고되었다(Ghayur et al., 1996).

따라서, INS-1 세포에 streptozotocin 처리에 따른 PKCδ cleavage와 caspase-3의 변화를 조사한 결과 도 4에서와 같이 STZ 1mM로 8시간 처리하였을 때 cleaved PKCδ와 caspase 3가 활성화되었으며, 이들의 활성화는 GNF-2에 의해 저해됨을 알았다.

이상의 연구 결과를 종합해 보면, GNF-2는 INS-1 세포에 있어 STZ 처리에 의해 생성되는 oxidative stress에 의한 세포 사멸에 대하여 JNK의 인산화와 PKCδ의 활성화를 억제하여 pancreatic β-cell의 세포사멸을 억제하는 것으로 확인되었다.

2.5. In vivo 실험을 통한 GNF -2 에 의한 항당뇨 활성 검정

In vitro 실험 결과, GNF-2는 STZ에 의한 genotoxic stress에 대하여 JNK 활성화, PKCδ와 caspase 3 활성화를 억제하여 INS-1 세포의 세포사멸을 저해하는 것으로 확인되었다.

따라서, 이와 같은 pancreatic β-세포의 산화적 스트레스 보호활성과 연관하여 항당뇨 활성이 있는지를 C57BL/6J mice를 이용하여 in vivo 실험을 행하였다. 먼저, C57BL/6J mice 에 PBS에 녹인 GNF-2(30mg/kg)를 gavage하고, gavage 2시간 후에 streptozotocin을 150mg/kg으로 투여하여 당뇨를 유발하였다. 같은 방법으로 GNF-2 대신 동일량의 PBS와 Imatinib를 gavage한 group를 각각 음성과 양성대조군으로 하여 항당뇨 활성을 비교 조사하였다. 첫 gavage 이후 14일간 매일 동일한 양의 PBS, GNF-2 및 Iamtinib를 1회 gavage하였으며, gavage 후 2시간 후 혈당 농도를 One Touch glucometer(Lifescan, Milpitas, CA)로 체크함과 동시에 몸무게를 측정하였다.

도 5의 A에서 보는 바와 같이 몸무게의 변화는 대조군에 있어서 14일간 큰 변동이 없는 반면, GNF-2 처리군은 gavage 후 6일 때 일시적인 체중 감소를 보이다가 회복되었다. 이때 양성대조군으로 Imatinib를 처리한 군 역시 GNF-2 처리군과 같이 6일 전후로 체중 감소를 보였으나 GNF-2와는 달리 체중이 회복되지는 않았다.

GNF-2의 항 당뇨 활성은 도 5의 B에서 보는 바와 같이 대조군인 streptozotocin 처리로 4일 이후부터 400이상으로 올라간 혈당이 600으로 유지되는데 반해, GNF-2 투여군은 GNF-2 투여 5일째부터 혈당이 200 전후로 조절되었다. 이 때 Imatinib 투여구는 투여 7일째 대조군 혈당이 600일 때 혈당이 400수준으로 혈당이 개선되었으나 GNF-2의 항당뇨 활성에는 미치지 못하였다.

이상의 연구 결과를 요약하면, 알로스테릭 Bcr-Abl 키나아제인 GNF-2도 Bcr-Abl을 타겟하는 Imatinib, Nilotinib 및 Dasatinib와 같이 oxidative stress에 대해 세포사멸을 유도하는 JNK의 인산화와 PKCδ 활성화를 억제하여 pancreatic β-cell의 세포사멸을 억제하는 것으로 확인되었으며, 이와 같은 pancreatic β-cell의 세포사멸로부터의 보호 작용은 STZ 처리로 유발되는 당뇨, 특히 제 1형 당뇨에 대해 탁월한 효과가 있음을 알 수 있다.

Claims

3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병(diabetes)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 당뇨병은 제 1형 당뇨병(type 1 diabetes)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 췌장 β-세포의 세포사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 ROS(reactive oxygen species)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 JNK 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 PKCδ의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3-(6-(4-(트리플루오로메톡시)페닐아미노)피리미딘-4-일)벤자미드를 포함하는 당뇨병(diabetes)의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제 7항에 있어서, 상기 당뇨병은 제 1형 당뇨병(type 1 diabetes)인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.