KR20200083824A - 감 탄닌발효액과 이의 제조방법 및 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물 - Google Patents

감 탄닌발효액과 이의 제조방법 및 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감 탄닌발효액과 이의 제조방법 및 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물에 관한 것으로서, 떫은 감에서 추출한 수용성 감 탄닌액과 감 탄닌 내성 유산균주 Lactobacillus plantarum DU.LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP)으로 발효 배양하여 얻어지는 감 탄닌발효액과 이의 제조방법 및 이를 포함하는 음료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 감 탄닌발효액과 이의 제조방법 및 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물에 의하면, 떫은 감으로부터 분리한 수용성 탄닌을 기본 배양액으로 하여 탄닌 내성을 갖는 유산균 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU. LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP) 균주를 접종 및 배양하여 발효시킨 수용성 감 탄닌발효액을 제조하여 감의 활용성을 높이고, 감 탄닌이 갖는 효능을 가지며, 동시에 기호도가 높아 상시적으로 용이하게 음용할 수 있는 효과가 있다.

Description

감 탄닌발효액과 이의 제조방법 및 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물{Fermentation Liquor of Persimmon Tannin and Manufacturing Method thereof and Beverage Composition Comprising Fermentation Liquor of Persimmon Tannin}
본 발명은 감 탄닌발효액과 이의 제조방법 및 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물에 관한 것으로서, 떫은 감에서 추출한 수용성 감 탄닌액과 감 탄닌 내성 유산균주 Lactobacillus plantarum DU.LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP)으로 발효 배양하여 얻어지는 감 탄닌발효액과 이의 제조방법 및 이를 포함하는 음료 조성물에 관한 것이다.
감나무는 감(Diospyros kaki L), 감 나무목과(Ebenales), 감 나무과(Ebenaceae), 감 나무속(Diospyros)에 속하며, 학명은 Diospyros kaki Thunb. 이다.
감은 우리나라에서 재배 면적으로나 생산량으로 볼 때 매우 중요한 위치를 차지하고 있는 과실로서 재배에 큰 어려움 없이 생산 농가의 소득에 일조하고 있는 작목이다.
감은 포도당, 과당 등의 당류와 비타민 A와 C가 풍부한 알칼리성 식품으로 장의 수축과 장 분비를 촉진하고 기침을 멎게 하는 효능 등이 알려져있으며, 약리작용에 대한 효능은 동의보감과 본초강목 등의 여러 고문헌에서 고혈압, 동맥경화, 심장 및 신장병 등의 순환기 질환에 효능과 비타민 A, C, D 및 엽록소를 풍부하게 함유하고 그 외 B1, 판토텐산, 엽산의 함유량도 많아 위궤양, 십이지장 및 당뇨병 등 만성질환 및 암 예방 효과가 있다고 알려져 있다.
감의 탄닌은 탄수화물과 단백질을 강하게 결합하는 비교적 높은 분자량을 가진 페놀성 대사산물의 독특한 그룹으로, 탄닌의 화학 구조식 또는 탄닌의 용해도나 추출능으로 구별한다. 탄닌의 구조는 매우 복잡하며, 갈산(gallic acid)이나 엘라직산(ellagic acid) 등으로 된 가수분해형 탄닌과 중합하여 물에 불용성인 플로바펜(plobaphene)을 형성하는 축합형 탄닌으로 분류된다. 가수분해형 탄닌에는 갈산(gallic acid)과 당이 결합하여 이루어진 갈로탄닌(gallotannin)이나 엘라직산(ellagic acid)과 당이 결합한 헥사하이드로시디페닉산(hexahydroxydiphenic acid)으로 이루어진 엘라직탄닌(ellagitannin)이 있다. 감에 함유되는 탄닌은 에피카테킨(epicatechin), 카테킨-3-갈레이트(catechin-3-gallate), 에피갈로카테킨( epigallocatechin), 갈로카테킨(gallocatechin-3-gallate)이 1:1:2:2의 비로 결합한 고분자 화합물로 과실 내 탄닌 세포에 대량 함유되어 있다.
최근 감의 떫은맛을 내는 탄닌은 수렴성이나 지혈작용 등의 약리적 효과와 강장 작용, 피부보호 작용, 항암 작용뿐만 아니라 지질의 과산화를 방지하는 항산화능, 아질산염 제거능 및 항균효과가 뚜렷하고 항종양작용 및 중금속 제거능과 같은 식품이 갖는 생리활성의 보고 외에도 소취, 피부미용 효과 및 항균 작용 등의 효과가 알려짐으로써 관련한 천연물 내 탄닌의 분리와 관련제품 생산이 요구되고 있다.
감 탄닌에 관한 특허문헌으로 한국등록특허 제10-0758236호는 감에 알코올류의 유기용매와 유기산을 이용하여 탄닌을 분리하는 방법을 제시하고 있으며, 한국등록특허 제10-1475328호에서는 축합형 탄닌을 함유하는 염료를 제조하는 방법과 천연염료 조성물 및 분말화 공정을 제시하고 있다.
한편, 유산균은 젖산을 대사산물로 생성하여 장내 해로운 균의 번식을 억제하고, 유익균의 증식을 활성화하여 장 건강을 이롭게 하는 것으로 알려져 있다. 또한 장내 독소를 제거하여 장 질환 억제와 면역기능 강화, 콜레스테롤 저하 및 간기능 항진 작용 등의 건강 증진 기능이 보고되고 있다.
상기의 수용성 탄닌을 유산균 발효에 적용하되 그 효과가 최대가 되도록 하고 이를 상시적으로 복용할 수 있도록 위한 음료의 연구 개발의 결과로 발명으로서 이에 대한 기술은 고지된 바 없다.
본 발명자는 감과 감 껍질 등에서 탄닌 성분을 별도로 분리하여 특정의 방법으로 수용성 탄닌 성분이 고농도로 함유되어 제조되는 액상의 제품에 관한 발명을 출원한 바 있으며(출원번호 10-2017-0154644), 상기 방법을 이용하여 감으로부터 수득된 수용성 탄닌액을 기본 배양물로하여 탄닌에서 뛰어난 성장 능력을 지닌 별도 분리한 유산균으로 발효 배양하여 발효물의 제조하고, 이로부터 수득된 발효물을 기반으로 한 음료 조성물을 개발하여 본 발명에 이르게 되었다.
한국등록특허 제10-0758236호(감으로부터 탄닌의 분리방법) 한국등록특허 제10-1475328호(축합형탄닌을 함유하는 천연염료 제조방법)
상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 떫은 감에서 추출한 수용성 감 탄닌액과 감 탄닌 내성 유산균주 Lactobacillus plantarum DU.LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP)으로 발효 배양하여 얻어지는 감 탄닌발효액과 이의 제조방법 및 이를 포함하는 음료 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 감 탄닌발효액의 제조방법은 감에서 수용성 탄닌액을 수득하는 수용성 감 탄닌액 수득단계(S100);와 상기 수용성 감 탄닌액에 탄네이즈를 처리하여 수용성 감 탄닌 분해물을 수득하는 수용성 감 탄닌 분해물 수득단계(S200);와 수용성 감 탄닌 분해물에 대하여 혼합과즙액을 첨가 및 여과하고, 가열처리하여 효소 불활성화 및 살균처리된 수용성 감 탄닌배양액을 제조하는 수용성 감 탄닌배양액 제조단계(S300);와 수용성 감 탄닌배양액에 탄닌 내성 유산균주인 Lactobacillus plantarum DU.LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP)를 접종 및 배양하여 감 탄닌발효액을 제조하는 감 탄닌발효액 제조단계(S400);를 포함한다.
상기 수용성 감 탄닌액 수득단계(S100)는 감 분말을 정제수에 넣어 초고압추출한 후 비스코자임, 펙티넥스 울트라 SP-L 및 이들의 조합 중 어느 하나의 효소를 이용하여 가수분해하는 것을 특징으로 한다.
상기 수용성 감 탄닌 분해물 수득단계(S200)에서는 탄네이즈 1~500 U/g, 반응시간 0.5~10시간, 반응온도 20~60℃ 하에서 처리되는 것을 특징으로 한다.
상기 수용성 감 탄닌배양액 제조단계(S300)에서는 수용성 감 탄닌 분해물 100중량부에 대하여 혼합과즙액을 0.5~30 중량부 첨가 및 여과 후, 60~90℃, 5분~30분간 가열하여 효소 불활성화 및 살균처리하는 것을 특징으로 한다.
상기 감 탄닌발효액 제조단계(S400)는 수용성 감 탄닌배양액 100 v%에 대하여, (상업용 MRS 액체배지에)전배양한 유산균 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU. LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP)을 0.1~20 v%접종한 후, 25~45℃에서 12~120시간 발효한 발효물을 60~100℃에서 10~60분간 저온살균 후, 0.5 내지 3㎛의 여과필터로 여과하는 것을 특징으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 감 탄닌발효액은 상술된 감 탄닌발효액의 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물은 전체 음료조성물 100중량% 중 감 탄닌발효액을 0.1-99.9 중량% 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물은 감 탄닌발효액 100중량부에 대하여, 1 내지 90브릭스의 과일농축액 3~80중량부, 첨가제 0.01~60중량부, 정제수 50~200 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는
감 탄닌발효액을 포함하는 것을 특징으로 한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 감 탄닌발효액과 이의 제조방법 및 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물에 의하면, 떫은 감으로부터 분리한 수용성 탄닌을 기본 배양액으로 하여 탄닌 내성을 갖는 유산균 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU. LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP) 균주를 접종 및 배양하여 발효시킨 수용성 감 탄닌발효액을 제조하여 감의 활용성을 높이고, 감 탄닌이 갖는 효능을 가지며, 동시에 기호도가 높아 상시적으로 용이하게 음용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 분리 유산균의 수용성 탄닌 함유배지에서의 균 성장도의 비교.
도 2는 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LA.CABBLU-18 균주의 뉴클레오타이드 염기서열을 보여준다.
도 3은 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LA.CABBLU-18 균주의 16S rRNA의 계통수 분석한 결과를 보여준다.
도 4는 감 수용성 탄닌의 탄네이즈의 농도별 처리시 침전물의 무게 비교
도 5는 탄넨이즈 처리온도와 시간의 영향에 의한 감 수용성 탄닌 추출물내 수용성 탄닌함량 변화의 등고도와 반응표면
도 6은 탄넨이즈 처리온도와 시간의 영향에 의한 감 수용성 탄닌 추출물내 불용성 탄닌함량 변화의 등고도와 반응표면
도 7은 탄넨이즈 처리온도와 시간의 영향에 의한 가용성 탄닌 함량 및 불용성 타닌 함량의 최적화에 대한 수퍼임포즈(Superimposed)된 반응표면
도 8은 감 수용성 추출물 농도, 혼합 과즙액 첨가농도 및 발효시간에 따른 균성장 증가량(균성장 증가량: 1.2-1.5-1.8 OD. 660nm)에 대한 반응 표면도.
도 9는 감 수용성 추출물 농도, 혼합 과즙액 첨가농도 및 발효시간에 따른 산도 증가량(산도 증가량: 1.0-1.2-1.4%)에 대한 반응 표면도.
도 10은 감 수용성 추출물 농도, 혼합 과즙액 첨가농도 및 발효시간에 따른 pH 감소량(pH 감소량: 1.4-1.6-1.8)에 대한 반응 표면도.
도 11은 감 수용성 추출물 농도, 혼합 과즙액 첨가농도 및 발효시간에 따른 수용성 탄닌 증가량(수용성 탄닌 증가량: 3.0-6.0-9.0 mg/100 ml)에 대한 반응 표면도.
도 12는 감 수용성 추출물 농도, 혼합 과즙액 첨가농도 및 발효시간에 따른 불용성 탄닌 감소량(불용성 탄닌 감소량: 4.0-4.5-5.0 mg/100 ml)에 대한 반응 표면도.
도 13은 감 수용성 탄닌 추출물의 최적 유산발효조건의 설정을 위한 산도 증가량, 수용성 및 불용성 탄닌 함량 증가량의 최적화에 대한 슈퍼임포징(superimposing)된 반응표면도로써, 겹쳐진 부분(음영부분)이 최적발효조건 범위로서 예측된 것임.
도 14는 감 수용성 탄닌 추출물의 최적 유산발효조건으로 발효된 발효액을 바탕으로 부원료를 첨가하여 조성된 음료의 관능 평가 결과임.
도 15(a)는 초고압 추출한 떫은 불량 감에 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L) 효소 가수분해 조건(효소농도, 반응온도, 반응시간)에 따른 떫은 불량 감 효소분해물의 수용성 탄닌 함량을 4차원 반응표면분석 결과를 보여준다(수용성 탄닌함량: 600-700-800 mg/100 g).
도 15(b)은 초고압 추출한 떫은 불량 감에 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra
SP-L) 효소 가수분해 조건(효소농도, 반응온도, 반응시간)에 따른 떫은 불량 감 효소분해물의 불용성 탄닌 함량을 4차원 반응표면분석 결과를 보여준다(불용성 탄닌함량: 120-150-180 mg/100 g).
도 15(c)는 초고압 추출한 떫은 불량 감에 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultraSP-L) 효소 가수분해 조건(효소농도, 반응온도, 반응시간)에 따른 떫은 불량 감 효소분해물의 갈산 함량을 4차원 반응표면분석 결과를 보여준다(갈산 함량: 20-21-22 mg/100 g).
도 15(d)는 초고압 추출한 떫은 불량 감에 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L) 효소 가수분해 조건(효소농도, 반응온도, 반응시간)에 따른 떫은 불량 감 효소분해물의 수용성 탄닌 및 갈산 함량 최적화를 위한 슈퍼임포징(superimposing)된 반응표면분석 결과를 보여준다.
도 16(a)은 초고압 추출한 감 껍질에 비스코자임 L(Viscozyme L) 효소 가수분해조건(효소농도, 반응온도, 반응시간)에 따른 감 껍질 효소분해물의 수용성 탄닌 함량을 4차원 반응표면분석 결과를 보여준다(수용성 탄닌 함량: 530-570-610 mg/100g).
도 16(b)은 초고압 추출한 감 껍질에 비스코자임 L(Viscozyme L) 효소 가수분해조건(효소농도, 반응온도, 반응시간)에 따른 감 껍질 효소분해물의 불용성 탄닌 함량을 4차원 반응표면분석 결과를 보여준다(불용성 탄닌 함량: 300-320-340 mg/100g).
도 16(c)은 초고압 추출한 감 껍질에 비스코자임 L(Viscozyme L) 효소 가수분해조건(효소농도, 반응온도, 반응시간)에 따른 감 껍질 효소분해물의 갈산 함량을 4차원 반응표면분석 결과를 보여준다(갈산 함량: 14-16-18 mg/100 g).
도 16(d)는 초고압 추출한 감 껍질에 비스코자임 L(Viscozyme L) 효소 가수분해조건(효소농도, 반응온도, 반응시간)에 따른 감 껍질 효소분해물의 수용성 탄닌 및 갈산 함량 최적화를 위한 슈퍼임포징(superimposing)된 반응표면분석 결과를 보여준다.
본 발명의 구체적 특징 및 이점들은 이하에서 첨부도면을 참조하여 상세히 설명한다. 이에 앞서 본 발명에 관련된 기능 및 그 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 구체적인 설명을 생략하기로 한다.
본 발명의 감 탄닌발효액의 제조방법은 감에서 수용성 탄닌액을 수득하는 수용성 감 탄닌액 수득단계(S100)와 상기 수용성 감 탄닌액에 탄네이즈를 처리하여 수용성 감 탄닌 분해물을 수득하는 수용성 감 탄닌 분해물 수득단계(S200)와 수용성 감 탄닌 분해물에 대하여 혼합과즙액을 첨가 및 여과하고, 가열처리하여 효소 불활성화 및 살균처리된 수용성 감 탄닌배양액을 제조하는 수용성 감 탄닌배양액 제조단계(S300)와 수용성 감 탄닌배양액에 탄닌 내성 유산균주인 Lactobacillus plantarum DU.LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP)를 접종 및 배양하여 감 탄닌발효액을 제조하는 감 탄닌발효액 제조단계(S400)를 포함한다.
수용성 감 탄닌액 수득단계(S100)에서는 감에서 수용성 탄닌액을 수득하게 되며, 감을 건조 및 분쇄한 감 분말을 정제수에 넣어 초고압추출한 후 비스코자임, 펙티넥스 울트라 SP-L 및 이들의 조합 중 어느 하나의 효소를 이용하여 가수분해하여 수득하게 된다. 이때, 본 발명의 원료 '감'은 떫은 감, 감껍질을 포함한다.
수용성 감 탄닌액 수득단계(S100)는 (a) 떫은 감 또는 감 껍질을 건조한 후 분쇄하여 감 분말을 제조하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 제조한 감 분말에 물을 첨가한 혼합물을 초고압 추출하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 초고압 추출한 추출물에 효소를 첨가한 후 가수분해하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계의 가수분해한 추출물을 가열한 후 원심분리한 상등액을 살균 및 여과하는 단계를 포함한다.
보다 상세하게는, 상기 (a)단계의 감 분말은 바람직하게는 떫은 감 또는 감 껍질을 45~55℃에서 44~52시간 동안 건조한 후 분쇄하여 제조할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 떫은 감 또는 감 껍질을 50℃에서 48시간동안 건조한 후 분쇄하여 제조할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 감 분말을 제조하여 이후 단계인 초고압 추출에 적합한 상태로 감을 전처리할 수 있다.
상기 (b)단계는 바람직하게는 감 분말에 물을 8~12배량(v/w) 첨가한 혼합물을 80~120 MPa 및 45~55℃에서 3~7시간 동안 초고압 추출할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 감 분말에 물을 10배량(v/w) 첨가한 혼합물을 100 MPa 및 50℃에서 5시간 동안 초고압 추출할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 초고압 처리함으로써, 추출물의 추출 수율 및 탄닌 함량을 더욱 향상시킬 수 있다.
상기 (c)단계의 효소는 바람직하게는 비스코자임(Viscozyme) 또는 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)일 수 있다.
상기 비스코자임은 Novozyme사의 복합효소제로서 아라바나아제 (arabanase), 셀룰라아제(cellulase), β-글루카나아제(β-glucanase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase) 및 자일라나아제(xylanase)를 함유하는 효소이며, 상기 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)는 아스퍼질러스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus) 유래 효소로, 폴리갈락투로나아제 (polygalacturonase) 및 엔도-β-1,4-갈락타나아제(endo-β-1,4-galactanase)의 특
성을 갖는 효소이다.
상기 (c)단계의 효소 처리는 떫은 감을 초고압 추출한 추출물일 경우, 바람직하게는 추출물에 18,000~30,000 PG/ml 농도의 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 추출물 부피대비 2.4~2.8% 첨가한 후 50~60℃에서 7~9시간 동안 가수분해할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 추출물에 26,000 PG/ml 농도의 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 추출물 부피대비 2.6% 첨가한 후 55℃에서 8시간 동안 가수분해할 수 있다.
한편, 감 껍질을 초고압 추출한 추출물일 경우 효소 처리조건은, 바람직
하게는 추출물에 80~120 FBG/ml 농도의 비스코자임(Viscozyme)을 추출물 부피대비
2.5~2.7% 첨가한 후 50~60℃에서 8~9시간 동안 가수분해할 수 있으며, 더욱 바람직
하게는 추출물에 100 FBG/ml 농도의 비스코자임(Viscozyme)을 추출물 부피대비
2.6% 첨가한 후 54℃에서 8.5시간 동안 가수분해할 수 있다.
상기 (d)단계는 바람직하게는 가수분해한 추출물을 80~90℃에서 10~20분 동안 가열한 후 7,000~9,000 rpm으로 원심분리한 상등액을 60~100℃에서 10~60분 동안 살균한 후 여과할 수있으며, 더욱 바람직하게는 가수분해한 추출물을 85℃에서 15분 동안 가열한 후 8,000 rpm으로 원심분리한 상등액을 80℃에서 30분 동안 살균한 후 여과할 수 있다. 상기와 같은 처리공정을 통해 효소를 불활성화 시키고, 불용성 탄닌을 분리하고 수용성 탄닌을 고농도로 함유하는 추출물로 제조할 수 있다.
상기 수용성 감 탄닌 분해물 수득단계(S200)에서는 탄네이즈 1~500 U/g, 반응시간 0.5~10시간, 반응온도 20~60℃ 하에서 처리하며, 더욱 바람직하게는 감 수용성 탄닌 추출액에 탄네이즈 50 U/g의 농도로 42~45℃, 3.8~4.8시간을 처리한다.
상기 수용성 감 탄닌배양액 제조단계(S300)에서는 수용성 감 탄닌 분해물 100중량부에 대하여 혼합과즙액을 0.5~30 중량부 첨가 및 여과 후, 60~90℃, 5분~30분간 가열하여 효소 불활성화 및 살균처리하는 것을 특징으로 한다.
상기 혼합과즙액은 바나나 농축액, 사과농축액, 복숭아 농축액, 토마토 농축액 및 이들의 조합 중 어느 하나의 과즙액을 포함할 수 있으며, 과즙액이라면 한정하는 것은 아니다.
이때, 상기 혼합과즙액은 상기 수용성 감 탄닌 분해물 100중량부에 대하여 0.5~30 중량부의 농도로 첨가되며, 바람직하게는, 1~5중량부의 농도로 첨가될 수 있다.
상기 감 탄닌발효액 제조단계(S400)는 수용성 감 탄닌배양액 100 v%에 대하여, 전배양한 유산균 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU. LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP)을 0.1~20 (w/v)%로 접종하며, 더욱 바람직하게는 1~3%를 접종하여 25~45℃에서 12~120시간, 더욱 바람직하게는 발효온도 30~40℃, 발효시간 36~90시간 발효한 발효물을 60~100℃에서 10~60분간 저온살균 후, 0.5 내지 3㎛의 여과필터로 여과하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 감 탄닌발효액은 상술된 감 탄닌발효액의 제조방법에 의해 제조되며, 이에 관한 설명은 생략하도록 한다.
본 발명의 감 탄닌발효액을 포함하는 음료의 제조방법은 감에서 수용성 탄닌액을 수득하는 수용성 감 탄닌액 수득단계(S100);와 상기 수용성 감 탄닌액에 탄네이즈를 처리하여 수용성 감 탄닌 분해물을 수득하는 수용성 감 탄닌 분해물 수득단계(S200);와 상기 수용성 감 탄닌 분해물에 대하여 혼합과즙액을 첨가 및 여과하고, 가열처리하여 효소 불활성화 및 살균처리된 수용성 감 탄닌배양액을 제조하는 수용성 감 탄닌배양액 제조단계(S300);와 상기 수용성 감 탄닌배양액에 탄닌 내성 유산균주인 Lactobacillus plantarum DU.LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP)를 접종 및 배양하여 감 탄닌발효액을 제조하는 감 탄닌발효액 제조단계(S400);와 상기 감 탄닌발효액에 과일농축액, 첨가제, 정제수를 투입 및 혼합하는 혼합단계(S500)를 포함하며, 감 탄닌액 수득단계(S100)에서 감 탄닌발효액 제조단계(S400)까지의 제조공정은 상술된 감 탄닌발효액의 제조방법과 동일한 바, 이에 관한 설명은 생략하도록 한다.
혼합단계(S500)에서는 감 탄닌발효액 100중량부에 대하여, 1 내지 90브릭스의 과일농축액 3~80중량부, 첨가제 0.01~60중량부, 정제수 50~200 중량부를 혼합하게 된다.
이때, 상기 과일농축액은 1~90브릭스를 갖는 것을 사용하며, 감 농축액, 레드 그레이프 푸르트 농축액, 배 농축액 및 이들의 조합 중 어느 하나를 포함할 수 있으며, 상기 과일농축액의 종류는 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 첨가제는 슈크랄로스, 에리스리톨, 폴리덱스트로스 및 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 음료 조성물에 첨가할 수 있는 것이라면 한정하지 않는다. 상기 첨가제의 예로는 감미료, 보존료, 착색제, 증점제, 안정화제, 탄산, pH 조절제, 유기산, 비타민 등을 포함하며, 이에 한정하는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 음료조성물은 음료조성물 총중량기준 감 탄닌발효액 5-50중량%, 감 농축액(1~90브릭스) 1~20부중량%, 레드 그레이프 푸르트 농축액(1~90브릭스) 0.5-10중량%, 배 농축액(1~90브릭스) 0.1~10 중량%, 슈크랄로스 0.001~10 중량%, 에리스리톨 0.01~10 중량%, 폴리덱스트로스 0.01~10 중량% 및 물(정제수) 20-90 중량% 포함하여 구성된다.
제조된 음료 조성물은 60~100℃에서 10~60분간 가열 살균 처리한 후 1.0㎛ 필터 여과기를 통과시켜 여과시키는 공정을 거칠 수 있다.
본 발명에 따른 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물은 전체 음료조성물 100중량% 중 상술된 감 탄닌발효액을 0.1-99.9 중량% 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물은 상술된 음료 조성물의 제조방법에 의해 제조된다.
본 발명에 따른 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물은 감 탄닌발효액, 과일농축액, 첨가제, 정제수 중량부를 포함하며, 더욱 상세하게는, 상술된 감 탄닌발효액 100중량부에 대하여, 1 내지 90브릭스의 과일농축액 3~80중량부, 첨가제 0.01~60중량부, 정제수 50~200 중량부를 포함한다.
이때, 상기 과일농축액은 1~90브릭스를 갖는 것을 사용하며, 감 농축액, 레드 그레이프 푸르트 농축액, 배 농축액 및 이들의 조합 중 어느 하나를 포함할 수 있으며, 상기 과일농축액의 종류는 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 첨가제는 슈크랄로스, 에리스리톨, 폴리덱스트로스 및 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 음료 조성물에 첨가할 수 있는 것이라면 한정하지 않는다. 상기 첨가제의 예로는 감미료, 보존료, 착색제, 증점제, 안정화제, 탄산, pH 조절제, 유기산, 비타민 등을 포함하며, 이에 한정하는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 음료조성물은 음료조성물 총중량기준 감 탄닌발효액 5-50중량%, 감 농축액(1~90브릭스) 1~20부중량%, 레드 그레이프 푸르트 농축액(1~90브릭스) 0.5-10중량%, 배 농축액(1~90브릭스) 0.1~10 중량%, 슈크랄로스 0.001~10 중량%, 에리스리톨 0.01~10 중량%, 폴리덱스트로스 0.01~10 중량% 및 물(정제수) 20-90 중량% 포함하여 구성될 수 있다.
이하, 본 발명을 바람직한 일 실시예를 참조하여 다음에서 구체적으로 상세하게 설명한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것이며, 이것만으로 한정하는 것은 아니다.
제조예 1. 수용성 탄닌 추출물
떫은 불량 감을 이용한 고농도 수용성 탄닌 함유 감 추출물
수용성 탄닌 추출물은 본 발명자 등이 기출원한(출원번호 10-2017-0154644) 떫은 감 또는 감 껍질 분말에서 방법으로 추출한 수용성 탄닌을 기본 배양액으로 하여 발효 과정 등 다음의 절차에 사용하였다.
(a) 세척한 후 이물질을 제거한 떫은 불량 감(부위: 과육+껍질, 품종: 청도산 반시)을 건조기(OF-12GW, JEIO TECH, Korea)를 이용하여 50℃에서 48시간 동안 건조한 후 분쇄기(SMX-30WS, Shinil, Korea)로 분쇄하여 감 분말을 제조하였다.
(b) 상기 (a)단계의 제조한 감 분말에 물을 10배량(v/w) 첨가한 혼합물을 비닐 팩에 넣어 공기가 들어가지 않도록 밀봉과 동시에 초고압 추출장치(TFS-SL, TOYO KOTASU Co, LTD, Japan)를 이용하여 100 MPa 및 50℃에서 5시간 동안 초고압 추출하였다.
(c) 상기 (b)단계의 초고압 추출한 추출물에 26,000PG(Polygalacturonase Units)/ml 농도의 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SPL)을 추출물 부피대비 2.6% 첨가한 후 55℃에서 8시간 동안 가수분해하였다.
(d) 상기 (c)단계의 가수분해한 추출물을 85℃에서 15분 동안 가열하여 효소를 불활성화하고, 8,000 rpm으로 원심분리한 상등액을 80℃에서 30분 동안 살균한 후 1.0 마이크로 필터기를 통과시켜 여과하였다.
감 껍질을 이용한 고농도 수용성 탄닌 함유 감 추출물
(a) 세척한 후 이물질을 제거한 감 껍질(품종: 청도산 반시)을 건조
기(OF-12GW, JEIO TECH, Korea)를 이용하여 50℃에서 48시간 동안 건조한 후 분쇄
기(SMX-30WS, Shinil, Korea)로 분쇄하여 감 분말을 제조하였다.
(b) 상기 (a)단계의 제조한 감 분말에 물을 10배량(v/w) 첨가한 혼합물을 비닐 팩에 넣어 공기가 들어가지 않도록 밀봉과 동시에 초고압 추출장치(TFS-SL, TOYO KOTASU Co, LTD, Japan)를 이용하여 100 MPa 및 50℃에서 5시간동안 초고압 추출하였다.
(c) 상기 (b)단계의 초고압 추출한 추출물에 100 FBG(Fungal Beta-
Glucanase Units)/ml 농도의 비스코자임(Viscozyme L)을 추출물 부피대비 2.6% 첨
가한 후 54℃에서 8.5시간 동안 가수분해하였다.
(d) 상기 (c)단계의 가수분해한 추출물을 85℃에서 15분 동안 가열하여 효소를 불활성화하고, 8,000 rpm으로 원심분리한 상등액을 80℃에서 30분 동안 살균한 후 1.0 마이크로 필터기를 통과시켜 여과하였다.
비교예 1- 무처리 감 분말
세척한 후 이물질을 제거한 떫은 불량 감 또는 감 껍질을 건조기(OF-12GW, JEIO TECH, Korea)를 이용하여 50℃에서 48시간 동안 건조한 후 분쇄기(SMX-30WS, Shinil, Korea)로 분쇄하여 떫은 감 분말 또는 감 껍질 분말을 제조하였다.
탄닌 함량 및 통계처리
탄닌 함량
시료 05 mL에 1% K3F3(CN)6 1 mL와 1% FeCl3 1 mL를 첨가하여 혼합한 후 실온에서 5분 동안 반응시킨 후 720 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 탄닌산(tannic acid, Sigma Chemical Co USA)을 이용하여 표준 검량 곡선을 작성한 후, 탄닌산 등가물(mg TE/100 g)로 나타내었다. 갈산(Gallic acid) 함량은 시료 용액을 0.45 ㎛ 막여과지(membrane filter)로 여과한 후, HPLC(Alliance e2695, Waters Co, Milford, MA, USA)로 분석하였고, 분석조건은 표 1(갈산(gallic acid)의 HPLC 분석조건)에 나타내었다. 표준품은 갈산(gallic acid, Sigma Chemical Co)을 이용하여 표준 검량선을 작성한 후 각각의 함량을 계산하였다.
Figure pat00001
통계처리
모든 시험은 3회 반복하여 평균값과 표준편차로 결과값을 나타내었으
며, 결과의 통계는 SAS(statistical analysis system, Version 9.3) 프로그램을 이
용하여 반응표면분석(response surface methodology, RSM)으로 실시하였다. 또한,
매스매티카 프로그램(Mathematica program)을 이용하여 4차원 반응표면분석을 해석
하였다. 각 실험군에 대한 유의차 검정은 분산분석한 후 p<0.05 수준에서 Duncans multiple test에 따라 분석하여 비교하였다.
떫은 감의 초고압 추출 처리에 의한 탄닌 함량 비교
비교예 1의 무처리 떫은 감 분말 및 감 껍질 분말과, 비교예 1의 무
처리 감 분말에 (b)단계의 조건으로 초고압 처리한 시료의 탄닌함량을 측정하여 그 결과를 표 2(떫은 감과 감 껍질의 초고압 처리에 의한 탄닌 함량 비교)에 나타내었다. 떫은 불량 감의 경우, 수용성 탄닌 함량은 비교예 1의 258.66±6.03 mg/100 g에 비하여 초고압 처리 시료는 353.29±5.26 mg/100 g으로 36.6% 이상 높았고, 불용성 탄닌 함량도 비교예 1의 78.01±0.48 mg/100 g에 비하여 초고압 처리 시료 97.17±0.48 mg/100 g으로 24.6% 이상 높게 나타났다.
또한, 감 껍질의 경우, 수용성 탄닌 함량은 비교예 1의 356.06± 5.53 mg/100 g에 비하여 초고압 처리 시료는 457.15±3.19 mg/100 g으로 28.4% 이상 높게 나타났고, 불용성 탄닌 함량도 비교예 1의 153.38±1.82 mg/100 g에 비하여 초고압 처리 시료 194.64±0.42 mg/100 g으로 26.9% 이상 높게 나타나 초고압 처리가 탄닌의 함량을 증대시키는 것으로 나타났다.
Figure pat00002
불량 떫은 감과 감 껍질 분말을 초고압 처리하여 얻어진 추출물에 최적의 효소를 결정하게 위하여 시판용 상업 효소를 선별 시험하였다. 사용된 시판용 상업효소로서 노보자임사(Novo Nordisk Co.)의 셀루클라스트(Celluclast 1.5L), 비스코자임(Viscozyme L), 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L), 펙티넥스XXL(Pectinex XXL), 알카라아제(Alcalase 2.4 L), 플라보르자임(Flavourzyme 500 MG), 뉴트라제(Neutrase 0.8 L), 프로타멕스(Protamex)를 사용하였다. 효소처리는 초고압 추출 시료 100 mL에 상기의 상업효소를 각각 2%씩 첨가하여 50℃에서 6시간 동안 처리하였다. 처리가 끝난 즉시 효소처리 시료를 85℃에서 15분간 열처리하여 효소를 불활성화하고 원심분리한 후 상등액을 취하여 수용성 탄닌 함량을 측정하였으며, 잔여물에 1% 염산(HCl)이 포함된 80% 메탄올(methanol)을 가하여 충분히 혼합 후 실온에서 2시간 방치 후 원심분리하여 상징액을 불용성 탄닌 시험용액으로 사용하여 측정한 결과는 표 3(떫은 불량 감과 감 껍질의 초고압 처리물의 각종 상업용 효소처리에 의한 탄닌 함량 비교)과 같다.
떫은 불량 감 분말을 초고압 처리하여 얻은 추출물에 효소를 처리하여 얻은 가수분해물의 수용성 탄닌 함량은 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L)의 처리구에서 629.44±4.93 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타내었으며 사용된 효소 간에 유의적인 차이를 보였다. 펙티넥스 울트라 SP-L 효소처리된 가수분해물의 수용성 탄닌 함량은 629.44±4.93 mg/100 g으로 무처리 떫은 감 분말(비교예 1)의 258.66±6.03 mg/100 g보다 약 243.3% 이상 증가하였고, 초고압 처리 시료의 353.29±5.26 mg/100 g보다 78.2% 이상 증가하였다. 불용성 탄닌 함량 또한 펙티넥스(Pectinex Ultra SP-L)의 처리구에서 다른 효소 처리구에 비해 유의적인 차이를 보이며 높은 함량을 나타내었다. 이상의 결과로 펙티넥스 울트라 SPL(
Pectinex Ultra SP-L)로 가수분해시킨 떫은 불량 감 가수분해물의 탄닌 함량이
높은 것으로 나타나 적절한 효소제라 것으로 판단되어 초고압 처리한 떫은 불량 감
의 최적 효소제로 선정하여 최적 조건을 설정하기 위하여 다음 단계의 실시예에 사용하였다.
또한, 초고압 처리된 감 껍질 추출물을 시판용 각 효소로 처리하여
얻은 가수분해물의 수용성 탄닌 함량은 비스코자임(Viscozyme L)의 처리구에서
595.69±6.14 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타내었고 효소 종류 간의 유의적인
차이를 보였다. 불용성 탄닌 함량 또한, 비스코자임(Viscozyme L)의 처리구에서 다
른 효소 처리구에 비해 유의적인 차이를 보이며 높은 함량을 나타내었다. 초고압
처리된 감껍질 추출물을 비스코자임(Viscozyme L) 효소처리된 가수분해물의 수용성
탄닌 함량은 595.69±6.14 mg/100 g으로 무처리 감 껍질 분말(비교예 1)의 356.06
±5.53 mg/100 g 보다 약 67.3% 이상 증가하였고 초고압 처리 시료의 457.15±3.19
mg/100 g보다 30.3% 이상 증가하였다. 이상의 결과로 비스코자임(Viscozyme L)으로
가수분해시킨 감 껍질 가수분해물의 탄닌 함량이 높게 나타나 적절한 효소제로 판
단되어 초고압 처리한 감 껍질의 최적 효소제로 선정하여 다음 단계의 실시예에 사
용하였다.
Figure pat00003
반응표면분석법을 이용한 떫은 불량 감의 효소분해 최적화
떫은 불량 감 분말을 초고압 처리하여 얻은 추출물에 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L)의 최적 효소처리 조건을 설정하기 위해 효소농도,
반응온도 및 반응시간을 독립변수로 하여 중심합성계획에 의해 표 4(떫은 불량 감 및 감 껍질의 최적 효소처리조건을 위한 중심합성 계획에 의한 실험계획)와 같이 설계된 20구의 효소처리조건에서 얻어진 탄닌 함량은 표 5(중심합성계획법으로 설계된 반응표면분석에 의한 초고압 처리된 떫은 불량감 분말 추출물의 펙티넥스 울트라 SP-L 효소처리 조건에 따른 분해물의 수용성 탄닌, 불용성 탄닌 및 갈산 함량의 실험 데이터)와 같다. 표 5의 각각의 결과를 이용하여 반응표면분석을 실시하고, 각 종속변수 즉, 수용성 탄닌, 불용성 탄닌, 갈산(gallic acid) 함량에 대한 회귀식을 얻었다(표 6: 떫은 불량 감의 펙티넥스 울트라 SP-L 효소처리조건을 위한 반응표면분석 프로그램으로 계산된 다항식) 또한, 변수별 최적 효소처
리조건과 각 효소분해물의 특성 값을 예측하여 표 7(능선분석에 의한 떫은 불량 감의 펙티넥스 울트라 SP-L 효소 최적처리조건의 예측된 값)에 나타내었으며, 이들의 4차원 반응표면을 효소농도, 반응온도 및 반응시간을 독립변수로 하여, 도 15(a)~(c)에 나타내었다.
Figure pat00004
그 결과, 떫은 불량 감을 초고압 처리 후 펙티넥스 울트라 SPL(Pectinex Ultra SP-L)의 효소처리 조건에 따른 효소분해물의 수용성 탄닌 함량은 308.41~720.67 mg/100 g의 범위로 나타났으며(표 5), 이를 바탕으로 한 수용성 탄닌 함량의 회귀식은 표 6와 같고 R2 값은 0.9272으로 1% 이내의 수준에서 유의성이 확인되었다. 효소처리 조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석결과 임계점이 안장점으로 나타났으며, 능선분석을 하여 최적점을 산출한 결과 최대값은 809.10 mg/100 g이며, 이때의 효소처리 조건은 효소농도 2.37 g/100 mL, 반응온도 59.02℃ 및 반응시간 6.87시간으로 나타났다(표 7) 4차원 반응표면을 통한 효소분해 조건에 따른 불량 감 효소분해물의 수용성 탄닌 함량의 변화는 도 2와 같이 반응 온도가 높을수록 증가하는 것으로 나타났다. 효소분해 처리조건에 대한 영향은 표 8(떫은 불량 감의 펙티넥스 울트라 SP-L 효소 최적처리조건 회귀분석)에서와 같이 반응온도의 영향이 가장 크며, 반응시간, 효소농도 순으로 영향을 받는 것으로 나타났다.
떫은 불량 감을 초고압 처리 후 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L)의 효소를 사용하여 조건별로 처리된 효소분해물의 불용성 탄닌 함량은 65.63~181.50 mg/100 g의 범위로 나타났으며(표 5), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표6와 같다. 불용성 탄닌 함량에 대한 R2값은 0.9515으로 높은 신뢰도를 보였으며, p값은 1% 이내 유의수준을 보였다. 효소처리 조건에 대한 영향에서 불용성 탄닌 함량의 경우 효소처리 온도와 시간에 영향을 크게 받는 것으로 나타났으나, 설정된 범위 내에서 효소농도에 대한 영향은 거의 나타나지 않았다(표 8) 효소처리에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 안장점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 불용성 탄닌 함량의 최대값은 209.23 mg/100 g이고 이때의 발효조건은 효소농도 1.98 g/100 mL, 반응온도 58.18℃ 및 반응시간 8.29시간으로 나타났다(표 7) 실험조건에 따라 얻은 효소분해물의 불용성 탄닌 함량에 대한 반응표면은 도 15(b)에 나타내었으며, 반응온도가 높고, 반응시간이 길수록 증가하는 것으로 나타났다.
떫은 불량 감을 초고압 처리 후 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L)의 효소를 사용하여 처리 조건에 따른 불량 감 효소분해물의 갈산(gallic acid) 함량은 18.51~23.75 ㎍/mL의 범위로 나타났으며(표 5), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 6과 같으며, 이 모델에 대한 회귀식의 R2값은 0.8858로 1% 이내의 유의성이 인정되었다. 갈산의 함량은 효소농도, 반응시간, 반응온도의 효소처리조건 모두에서 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 효소농도와 반응온도가 높고, 효소처리 시간이 길어질수록 갈산 함량이 증가하는 것으로 나타났다(표 8) 표 7과 같이 갈산 함량의 예측된 정상점은 최대점으로 최대값이 22.65 ㎍/mL이었고, 이때 효소농도 2.73 g/100 mL, 반응온도 56.71℃ 및 반응시간 6.54시간이었다. 효소분해 물의 불용성 탄닌 함량의 효소처리 조건에 따른 4차원 반응표면에서 볼 때 효소농도와 반응온도가 높고 반응시간이 길어질수록 함량이 증가하는 것으로 나타났다(도 15(c))
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
떫은 불량 감을 초고압 처리 후 펙티넥스 울트라 SP-L 최적 효소 처리조건을 설정하기 위하여 수용성 탄닌, 갈산 함량 모두 만족시켜주는 최적 효소처리조건을 얻고자 각 반응표면을 슈퍼임포징(superimposing)하여 도 15(d)의 겹쳐진 부분으로 나타내었고 표 9(떫은 불량 감의 펙티넥스 울트라 SP-L 효소의 최적처리조건을 위한 수용성 탄닌, 갈산의 반응표면의 슈퍼임포징(superimposing)에 의한 최대 반응값을 위한 최적의 효소처리 조건)에 최적 조건을 나타내었다. 불량 감 효소처리 최적 조건범위는 효소농도 2.4~2.8 g/100 mL, 반응온도 50~60℃ 및 반응시간 7~8시간으로 나타났다.
Figure pat00009
따라서 이와 같은 예측 결과에 대한 모델식의 신뢰성을 확인하기 위하여 예측된 최적 조건 범위 내에서 임의의 조건 즉, 효소농도 2.6 g/100 mL, 반응온도 55℃ 및 반응시간 8시간을 대입하여 실제 효소 처리를 실시하고, 효소분해물의 탄닌 함량 및 갈산 함량을 측정한 결과 예측된 값들과 유사한 수준으로 비교되었다(표 10: 최적처리조건에서 예측값과 실제값의 비교)
Figure pat00010
반응표면분석법을 이용한 감 껍질 효소분해 최적화
감 껍질을 초고압 처리하여 얻은 추출물에 비스코자임(Viscozyme
L)의 최적 효소처리 조건을 설정하기 위해 효소농도, 반응온도 및 반응시간을 독립
변수로 하여 표 4와 같이 중심합성계획에 의해 설계된 20구의 효소 처리조건에서
얻어진 탄닌 함량은 표 11(중심합성계획법으로 설계된 반응표면분석에 의한 초고압 처리된 감껍질 분말 추출물의 비스코자임 효소처리 조건에 따른 분해물의 수용성 탄닌, 불용성 탄닌 및 갈산 함량의 실험 데이터)과 같다. 표 11의 각각의 결과를 이용하여 반응표면분석을 실시하고, 각 종속변수 즉, 수용성 탄닌, 불용성 탄닌, 갈산(gallic acid) 함량에 대한 회귀식을 얻었다(표 12: 감 껍질의 비스코자임 효소 처리조건을 위한 반응표면분석 프로그램으로 계산된 다항식) 또한, 변수별 최적 효소처리조건과 각 효소분해물의 특성값을 예측하여 표 13(능선분석에 의한 감 껍질의 비스코자임 효소 최적 처리조건의 예측된 값)에 나타내었으며, 이들의 4차원 반응표면을 효소농도, 반응온도 및 반응시간을 독립변수로 하여 도 16(a)~(c)에 나타내었다.
Figure pat00011
초고압처리된 감 껍질 추출물의 비스코자임(Viscozme L) 효소처리 조건에 따른 감 껍질 효소분해물의 수용성 탄닌 함량은 483.44~608.93 mg/100 g의 범위로 나타났으며(표 11), 이를 바탕으로 한 수용성 탄닌 함량의 회귀식은 표 12와 같고 R2 값은 0.8912으로 1% 이내의 수준에서 유의성이 확인되었다. 효소처리 조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석결과 임계점이 최대점이 아닌 안장점으로 나타났으며, 능선분석을 하여 최적점을 산출한 결과 최대값은 631.19 mg/100 g이며, 이때의 효소처리 조건은 효소농도 2.67 g/100 mL, 반응온도 53.98℃ 및 반응시간 8.46시간으로 나타났다(표 13) 4차원 반응표면을 통한 효소분해 조건에 따른 떫은 감 효소분해물의 수용성 탄닌 함량의 변화는 도 16(a)과 같이 효소농도와 반응온도가 높아질수록, 반응시간이 길어질수록 함량이 증가하는 경향을 나타내었다. 효소분해 처리조건에 대한 영향은 표 14(감 껍질의 비스코자임 효소 최적처리조건 회귀분석)에서와 같이 효소처리 조건 모두에서 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 반응온도>반응시간>효소농도의 순으로 반응온도의 영향이 가장 크며, 효소농도의 영향이 가장 낮은 것으로 나타났다.
감 껍질을 초고압 처리후 비스코자임 효소를 사용하여 조건별로 처리된 감 껍질 효소분해물의 불용성 탄닌 함량은 212.05~351.59 mg/100 g의 범위로 나타났으며(표 11), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 12와 같다. 불용성 탄닌 함량에
대한 R2 값은 0.8952로 높은 신뢰도를 보였으며, p값은 1% 이내 유의수준을 보였다.
효소처리에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 불용성 탄닌 함량의 최대값은 353.17 mg/100 g이고, 이때의 발효조건은 효소농도 2.58 g/100 mL, 반응온도 52.35℃ 및 반응시간 9.10시간으로 나타났다(표 13) 효소처리 조건에 대한 영향에서 불용성 탄닌 함량의 경우 반응온도와 반응시간에 영향을 크게 받는 것으로 나타났다. 그러나 설정된 범위 내에서 효소농도의 영향은 거의 나타나지 않았다(표 14) 실험조건에 따라 얻은 효소 분해물의 불용성 탄닌 함량에 대한 반응표면은 도 16(b)에 나타내었다.
감 껍질을 초고압 처리 후 비스코자임(Viscozyme L) 효소를 사용하여 조건별로 처리된 감 껍질 효소분해물의 갈산의 함량은 13.28~18.66 ㎍/mL의 범위로 나타났으며(표 11), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 12와 같으며, 이 모델에 대한 회귀식의 R2값은 0.9731로 1% 이내의 유의성이 인정되었다. 표 13과 같이 갈산 함량의 예측된 정상점은 최대점으로 최대값이 19.25 ㎍/mL이었고, 이때 효소농도 2.76 g/100 mL, 반응온도 50.56℃ 및 반응시간 8.57시간이었다. 갈산 함량은 효소농도, 반응시간, 반응온도의 효소 처리조건 모두에서 영향을 받고 있는 것으로
나타났다(표 14) 효소분해물의 불용성 탄닌 함량의 효소처리 조건에 따른 4차원
반응표면에서 볼 때 효소농도와 반응온도가 높고 반응시간이 길어질수록 함량이 증
가하는 것으로 나타났다(도 16(c))
Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00014
감 껍질의 최적 효소처리조건을 설정하기 위하여 수용성 탄닌, 갈산 함량 모두 만족시켜주는 최적 효소처리 조건을 얻고자 각 반응표면을 슈퍼임포징 (superimposing)하여 도 16(d)의 겹쳐진 부분으로써 표 15(감 껍질의 비스코자임 효소의 최적처리조건을 위한 수용성 탄닌, 갈산의 반응표면의 슈퍼임포징 (superimposing)에 의한 최대 반응값을 위한 최적의 효소처리조건)에 최적 조건을 나타내었다. 감 껍질 효소처리 최적 조건 범위는 효소농도 2.5~2.7 g/100 mL, 반응온도 51~56℃ 및 반응시간 8~9시간으로 나타났다. 따라서 이와 같은 예측 결과에 대한 모델식의 신뢰성을 확인하기 위하여 예측된 최적 조건 범위 내에서 임의의 조건 즉, 효소농도 2.6 g/100 mL, 반응온도 54℃ 및 반응시간 8.5시간을 대입하여 실제 효소 처리를 실시하고, 효소분해물의 탄닌 함량, 갈산 함량을 측정한 결과 예측된 값들과 유사한 수준으로 비교되었다(표 16: 최적처리조건에서 예측값과 실제값의 비교)
Figure pat00015
Figure pat00016
실험예 1. 유산균의 선정
(1) 유산균의 분리
유산균의 분리를 위한 시료는 가정에서 먹는 각종 김치와 채소 및 과일을 수집하여 상업용 MRS(Merck, Darmstadt, Germany)액체 배지에 10%(w/v)로 접종한 후 37℃에서 48시간 배양하여 증균하였다. 증균액은 단계적으로 희석하여 사용하였으며, 희석액 100 ㎕를 0.002% BPB(bromophenol blue)가 첨가된 MRS 고체 평판배지에 도말한 후, 37℃ 배양기에서 혐기적 조건으로 48시간 배양하였다. 배양된 유산균의 집락 모양, 크기 색깔 등 형태적 특징을 관찰하여 서로 다른 균주를 0.004% bromocresol purple (BCP, Yakuri, Japan)이 첨가된 MRS고체배지를 사용하여 순수 분리하였다.
(2) 감 수용성 탄닌 추출물 함유 고체배지에서 분리 유산균의 생육능 검토
분리된 유산균주의 감 수용성 탄닌 추출액 함유 배지에서의 생육가능성 검토를 위하여 감 수용성 탄닌 추출액을 5, 10, 15, 20% 첨가한 MRS 고체배지에 각 분리균주를 tooth picking을 실시한 후 37℃ 인큐베이터에서 48 시간 배양하여 콜로니 형성과 크기를 확인하였다.
(3) 감 수용성 탄닌 추출물에서 분리 유산균의 생육능 검토
감 수용성 탄닌 추출액에 전배양한 분리한 유산균주를 2% 접종하여 37℃에서 48시 배양한 후 균성장도, pH 및 산도를 측정하였다. 균성장도는 분광광도계를 이용하여 660 nm에서 측정하였으며 pH는 pH meter로 측정하였다. 산도는 0.1 N NaOH로 pH 8.3이 될 때까지 적정하고 이때 소비된 0.1 N NaOH 양으로부터 유산계수 0.009를 곱하여 젖산 함량으로 나타내었다.
(4) 최종선별균주의 동정
최종 선별된 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자는 시퀀싱(sequencing)을 통하여 염기서열 분석을 하였으며, NCBI 데이터베이스(database)를 이용하여 분리된 균주와 데이터베이스상의 표준균주(type strain)와의 유사성(similarity, %)으로 계통분류를 확인하였다.
실험예 2. 탄네이즈(tannase)처리조건
(1) 감 수용성 탄닌 추출액의 탄네이즈 처리 농도 설정
감 수용성 탄닌 추출액에 상업용 탄네이즈(tannase, Kikkoman Corporation)를 농도별로 처리 후 여과하지 않고 4℃에서 3일, 5일 방치하였다. 이를 여과 및 건조하여 응집물의 중량을 측정하였다.
(2) 감 수용성 탄닌 추출액의 탄네이즈 처리 조건 최적화
탄네이즈 최적 처리조건은 감 수용성 탄닌 추출액에 중심합성계획법에 따라 표 17과 같은 시간(X1)과 온도(X2)를 독립변수로 설정하고, 반응표면분석으로 설정한 13가지의 처리조건으로 탄네이즈를 처리하였다(표18). 각 종속변수에 대한 회귀방정식을 얻어 탄네이즈 처리 조건에서 독립변수의 상호영향 조건을 구하였다. 탄네이즈처리 조건의 회귀식에 의한 예측은 Statistical Analysis System (SAS) program을 사용하였다. 최적 탄네이즈 처리조건과 관련된 종속변수(Yn)으로는 탄네이즈처리물의 수용성 및 불용성 탄닌 함량으로 나타내었다.
Figure pat00017
Figure pat00018
(3) 탄닌 함량 측정
감 수용성 탄닌 추출물 및 발효물에서 탄닌 함량은 시료를 원심분리(VS-24SMTI, Vision Co., Ltd., Daejeon, Korea)하여 상징액을 수용성 탄닌 시험용액으로 사용하였으며, 잔여물에 1% HCl이 포함된 80% methanol을 가하여 충분히 혼합 후 실온에서 30분간 방치 후 원심분리하여 상징액을 불용성 탄닌 시험용액으로 사용하였다. 시료 0.5 mL에 1% K3F3(CN)6 1 mL와 1% FeCl3 1 mL를 첨가하여 혼합한 후 실온에서 5분 동안 반응시킨 후 720 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 탄닌산(Tannin acid, Sigma Chemical Co. USA)를 이용하여 표준검량 곡선을 작성한 후, tannin acid equivalent(mg TE/100g)로 나타내었다.
실험예 3. 감 수용성 탄닌 추출액의 발효조건 최적화
탄네이즈를 처리한 감 수용성 탄닌 추출액을 분리 동정된 유산균인 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU. LA.CABBLU-18균주를 접종하여 발효하기 위한 발효조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 이용하여 모니터링하였다. 발효조건의 최적화를 위한 실험계획은 중심합성계획법을 사용하였으며, 독립변수로 고려되는 인자 즉, 추출액의 농도, 부원료인 과즙혼합물 첨가 농도 및 발효시간에 대한 실험범위를 설정하여 각각의 5단계로 부호화 하였으며(표 19), 중심합성계획에 따라 표 20과 같이 19구간으로 설정하여 발효실험을 하였다. 또한 이들 독립변수에 영향을 받는 종속변수로는 균성장 증가량, 산도 증가량, pH 감소량, 가용성 탄닌 증가량, 불용성 탄닌 증가량를 측정하여 회귀분석에 사용하였다. 또한 예측된 모델식을 바탕으로 Mathmeatica program (Wolfram Reserch, UK)을 이용하여 4차원 반응표면분석으로 해석하였다.
Figure pat00019
Figure pat00020
실험예 4. 수용성 감 탄닌 유산균 발효액를 이용한 음료 조성액 개발
감 수용성 탄닌 추출액을 최적 발효조건으로 발효된 발효액은 살균 처리하여 각종 부원료를 첨가하여 최종적으로 4종의 음료를 조성하고 30명의 관능검사 요원에 의하여 최종 관능검사를 실시하였다.
실시예 1. 유산균의 선정
(1) 유산균의 분리
각종 발효식품 및 과실 등에서 분리된 유산균주중 BPB 배지에서 분리원, 콜로니의 색깔, 형태 및 현미경상의 세포 형태인 구균 및 간균 등 특징이 다양한 균주 12종을 분리하였다. (표 21)
Figure pat00021
(2) 감 수용성 탄닌 추출물 함유 고체배지에서 분리 유산균의 생육능 검토
분리된 유산균주(표 21)로 감 수용성 탄닌 함유 고체배지에서의 생육가능성을 검토한 결과는 표 22와 같다. CARSKY 균주는 모든 배지에서 자라지 않았고, MANSKY 균주는 감 수용성 탄닌을 15% 첨가한 배지에서 자라지 않았다. CARSKY와 MANSKY균주를 제외한 모든 균주는 첨가된 수용성 탄닌의 모든 농도의 배지에서 생육이 가능한 것으로 나타났다.
Figure pat00022
(3) 감 수용성 탄닌 추출물에서 분리 유산균의 생육능 검토
감 수용성 탄닌 추출액의 발효에 적합한 균주를 선정하기 위해여 분리한 각 균주의 전배양액을 감 수용성 탄닌 추출액에 접종하여 균성장도를 측정한 결과는 도 1과 같다. 감 수용성 탄닌 추출액에서는 MANSKY균주가 1.876으로 가장 높은 생육도를 보였으나 CABBLU균주(1.857)와 큰 차이가 없었다. DRADBLU와 MANBLU 균주는 생육도가 1을 넘지 않아 감 수용성 탄닌 추출액 발효균주로 적합하지 않을 것으로 생각된다.
감 수용성 탄닌 추출액 발효에 적합한 균주를 선정하기 위해여 각 균주의 전배양액을 감 수용성 탄닌 추출액에 접종하여 산도와 pH를 측정한 결과는 표 23에 나타내었다. CABBLU와 MANSKY균주의 산도가 0.94%로 가장 높았고, DRADBLU, CARBLU균주는 초기산도와 거의 차이가 나지 않아 발효가 되지 않는 것으로 보인다. pH는 MANSKY균주가 3.16으로 가장 낮았으나 CABBLU균주(3.17)와 큰 차이가 나지 않았다. 이에 본 발명을 위한 유산균주로서 CABBLU균주를 선택하였다.
Figure pat00023
(4) 최종 선별균주의 동정
최종선별된 CABBLU균주를 16s rRNA 시퀸싱으로 염기서열을 분석하여 NCBI data base (National Center for Biotechnology Information, Martlans, USA)을 이용하여 분리된 균주와 type strain의 similarity(%)를 확인하였고(표 24), Bioedit program과 Clustal X program을 이용하여 염기서열을 배열(alignment)(도 2)한 후 근연관계를 조사(도 3)하여 동정 한 결과, 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum)과 99%이상의 상동성으로 확인되었다. 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.CABBLU-18로 명명하였고 국제미생물 특허기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2018년 10월 31일에 특허 기탁하였으며 기탁번호 KCTC 13694BP를 부여받았다.
Figure pat00024
실시예 2. 탄네이즈(tannase) 처리 조건 설정
(1) 감 수용성 탄닌 추출액의 탄네이즈처리 농도 설정
감 등에서 추출한 수용성 탄닌은 일정시간이 지나면 탄닌의 불용화 및 축합반응에 의하여 침전을 형성하여 수용성 탄닌으로 발효하거나 음료화하기 어려운 점이 있다. 따라서 본 발명에서 발효에 시행에 앞서 감 수용성 탄닌 축합 및 불용화를 최소화하기 위하여 탄네이즈 처리 조건을 설정한 결과는 도 4와 같다. 감 수용성 탄닌 추출액에서 탄네이즈 농도가 높아질수록 응집물의 중량 감소하였으나 50 U/g과 100 U/g의 응집물의 중량은 큰 차이가 없었다. 3일보다 5일째에 응집물의 중량이 더 무거웠으며, 50 U/g과 100 U/g의 응집물의 중량은 큰 차이가 없었다. 따라서 감 수용성 탄닌 추출액의 탄네이즈 농도를 50 U/g으로 하여 이후 탄네이즈 최적처리 조건을 설정하였다.
(2) 감 수용성 탄닌 추출액의 탄네이즈 처리 조건 최적화
탄네이즈 처리 조건에 따른 감 수용성 탄닌 추출액의 수용성 탄닌 함량은 31.72~36.80 mg/100 mL의 범위로 나타났으며(표 25), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 8과 같다. 수용성 탄닌 함량에 대한 R2 값은 0.9987으로 높은 신뢰도를 보였으며, p값은 1% 이내 유의수준을 보였다(표 26). 탄네이즈 처리조건에 대한 영향에서 시간과 온도 모두 1%이내의 유의수준을 보이는 것으로 확인되었다(표 27). 한편 lack of fit(적합결여검정) 값은 모델식의 적합도를 검정하는 통계량으로 p값이 0.05보다 클 때 모델식이 적합하다고 판단하는 통계값이다. 수용성 탄닌 함량에서 적합결여검정의 p값은 0.8249으로 나타나 모델식이 적합한 것으로 나타났다(표 28). 탄네이즈 처리조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대 점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 수용성 탄닌 함량의 최대값은 36.97 mg/100 ml이고 이때의 탄네이즈 처리조건은 온도가 46.20ㅀC, 시간은 4.27시간으로 나타났다(표 29). 이들 추출수율 값에 대한 반응표면은 도 5와 같다.
탄네이즈 처리 조건에 따른 감 수용성 탄닌 추출액의 불용성 탄닌 함량은 4.30~5.21 mg/100 ml의 범위로 나타났으며(표 25), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 24과 같다. 불용성 탄닌 함량에 대한 R2 값은 0.9559으로 높은 신뢰도를 보였으며, p값은 1% 이내 유의수준을 보였다(표 26). 탄네이즈 처리조건에 대한 영향에서 시간과 온도 모두 1%이내의 유의수준을 보이는 것으로 확인되었다(표 27). 불용성 탄닌 함량에서 lack of fit(적합결여검정)의 p값은 0.0509으로 나타나 모델식이 적합한 것으로 나타났다(표 28). 탄네이즈 처리조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최소점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 불용성 탄닌 함량의 최소값은 4.41 mg/100ml이고 이때의 탄네이즈 처리조건은 온도가 34.37℃, 시간은 4.65시간으로 나타났다(표 29). 이들 불용성 탄닌 함량 값에 대한 반응표면은 도 6과 같다.
Figure pat00025
Figure pat00026
Figure pat00027
Figure pat00028
Figure pat00029
(3) 탄네이즈 최적 처리 조건의 예측 및 실증 실험
감 수용성 탄닌 추출액의 탄네이즈 최적처리 조건을 설정하기 위하여 각 성분의 반응표면을 수퍼임포징(superimposing)하여 도 7에 나타내었다. 최적 탄네이즈 처리 조건으로 도출된 최적값의 반응 표면을 한 도면에 합한 결과, 수용성 탄닌 함량과 불용성 탄닌 함량의 반응표면그림이 완전 또는 부분적으로 적합하였고 그 일치하는 부분을 각 독립변수의 범위를 읽어 탄네이즈 최적처리조건의 범위로 설정하였다. 이 반응표면으로부터 설정 될 수 있는 감 수용성 추출물의 최적 탄네이즈 처리조건의 범위는 43.5℃(42~45℃), 4시간(3.8~4.8시간)으로 예측 되었다. 각 성분의 반응표면을 수퍼임포징(superimposing) 하여 예측된 탄네이즈 최적 처리 조건으로 처리한 감 수용성 탄닌 추출액에 대한 예측치와 실제 실험치의 비교를 통하여 모델의 정확도를 검증하였다(표 30). 불량감 수용성 탄닌 추출액의 결과 탄네이즈 최적 처리 조건에서의 수용성 탄닌 값은 예측치와 실측된 값과 유사하였으며, 불용성 탄닌 값은 실측값이 예측값보다 다소 낮게 나타났다.
Figure pat00030
실시예 3. 감 수용성 탄닌 추출액의 유산발효조건 최적화
(1) 발효 조건에 따른 균성장, 산도 및 pH 변화
발효 조건에 따른 불량감 수용성 탄닌 추출액의 균성장 증가량, 산도증가량 및 pH 감소량의 초기값은 표 31와 같다.
발효 조건에 따른 불량감 수용성 탄닌 추출액의 균성장 증가량은 1.701~0.582의 범위로 나타났으며(표 31), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 32과 같다. 균성장 증가량에 대한 R2 값은 0.9827으로 높은 신뢰도를 보였으며, p값은 1% 이내 유의수준을 보였다(표 32). 발효 조건에 대한 영향에서 가용성 탄닌 추출물의 농도, 혼합 과즙액 첨가 농도와 발효시간은 모두 1%이내의 유의수준을 보이는 것으로 확인되었다(표 33). 균성장 증가량에서 적합 결여도(lack of fit)의 p값은 0.0675으로 나타나 모델이 적합한 것으로 나타났다(표 34). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 안장점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 균성장 증가량의 최댓값은 1.82이고 이때의 발효조건은 수용성 탄닌 추출물의 농도가 4.01 °brix, 혼합 과즙액 첨가 농도가 3.43%, 발효시간은 4.03일로 나타났다(표 35). 이들 균성장 증가량 값에 대한 반응표면은 도 8과 같다.
발효 조건에 따른 수용성 탄닌 추출액의 산도 증가량은 0.61~1.00%의 범위로 나타났으며(표 31), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 32과 같다. 산도 증가량에 대한 R2 값은 0.9668으로 높은 신뢰도를 보였으며, p값은 1% 이내 유의수준을 보였다(표 32. 발효 조건에 대한 영향에서 감 수용성 탄닌 추출물의 농도, 혼합 과즙액 첨가 농도와 발효시간은 모두 1%이내의 유의수준을 보이는 것으로 확인되었다(표 33). 산도 증가량에서 적합 결여도의 검정값에서 p값은 0.0673으로 나타나 모델이 적합한 것으로 나타났다(표 34). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대 점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 산도 증가량의 최댓값은 1.03%이고 이때의 발효조건은 추출물 농도가 10.69 °brix, 혼합 과즙액첨가 농도가 4.51%, 발효시간은 4.18일로 나타났다(표 35). 이들 산도 증가량 값에 대한 반응표면은 도 9와 같다.
Figure pat00031
Figure pat00032
Figure pat00033
*유의성 10% 이내; **유의성 5% 이내; ***유의성 1% 이내.
Figure pat00034
Figure pat00035
발효 조건에 따른 감 수용성 탄닌 추출액의 pH 감소량은 1.38~1.84의 범위로 나타났으며(표 31), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 32과 같다. pH 감소량에 대한 R2 값은 0.9892으로 높은 신뢰도를 보였으며, p값은 1% 이내 유의수준을 보였다(표 32). 발효 조건에 대한 영향에서 수용성 탄닌 추출물의 농도, 혼합 과즙액 첨가 농도와 발효시간은 모두 1%이내의 유의수준을 보이는 것으로 확인되었다(표 33). pH 감소량에서 적합 결여도의 p값은 0.0735으로 나타나 모델이 적합한 것으로 나타났다(표 34). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대 점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 산도 증가량의 최대값은 1.79이고 이때의 발효조건은 감 수용성 탄닌 추출물 농도가 4.07 °brix, 혼합 과즙액 첨가 농도가 3.64%, 발효시간은 3.94일로 나타났다(표 35). 이들 pH 감소량 값에 대한 반응표면은 도 10과 같다.
(2) 발효 조건에 따른 탄닌 함량 변화
발효 조건에 따른 감 수용성 탄닌 추출액의 수용성 탄닌 증가량은 2.02~12.94 mg/100 ml의 범위로 나타났으며(표 36), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 37과 같다. 수용성 탄닌 증가량에 대한 R2값은 0.9669으로 높은 신뢰도를 보였으며, p값은 1% 이내 유의수준을 보였다(표 37). 발효 조건에 대한 영향에서 추출물의 농도와 발효시간은 1%이내의 유의수준을 보이는 것으로 확인되었다(표 38). 수용성 탄닌 증가량에서 적합 결여도의 p값은 0.3502으로 나타나 모델이 적합한 것으로 나타났다(표 39). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 안장점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 수용성 탄닌 증가량의 최대값은 13.30 mg/100 ml이고 이때의 발효조건은 추출물 농도가 14.90 °brix, 혼합 과즙액 첨가농도가 3.34%, 발효시간은 2.88일로 나타났다(표 40). 이들 수용성 탄닌 증가량 값에 대한 반응표면은 도 11과 같다.
발효 후 발효 조건에 따른 감 수용성 탄닌 추출액의 불용성 탄닌 증가량은 0.78~4.01 mg/100 ml의 범위로 나타났으며(표 36), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 21과 같다. 불용성 탄닌 증가량에 대한 R2 값은 0.9903으로 높은 신뢰도를 보였으며, p값은 1% 이내 유의수준을 보였다(표 37). 발효 조건에 대한 영향에서 추출물의 농도와 발효시간은 1%이내의 유의수준을 보이는 것으로 확인되었으며, 혼합 과즙액 첨가 농도는 5%이내의 유의수준을 보이는 것으로 확인되었다(표 38). 불용성 탄닌 증가량에서 적합 결여도의 p값은 0.0613으로 나타나 모델이 적합한 것으로 나타났다(표 39). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 안장점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 불용성 탄닌 증가량의 최소값은 0.64 mg/100 ml이고 이때의 발효조건은 추출물 농도가 3.14 °brix, 혼합 과즙액 첨가 농도가 2.58%, 발효시간은 0.64일로 나타났다(표 40). 이들 불용성 탄닌 증가량 값에 대한 반응표면은 도 12와 같다.
(3) 발효 조건에 따른 최적 발효조건의 예측 및 실증 실험
감 수용성 탄닌 추출액의 최적 유산 발효 조건을 설정하기 위하여 각 성분의 반응표면을 수퍼임포징(superimposing)하여 도 13에 나타내었다. 최적 발효 조건으로
Figure pat00036
Figure pat00037
Figure pat00038
*유의성 10% 이내; **유의성 5% 이내; ***유의성 1% 이내.
Figure pat00039
Figure pat00040
도출된 최적값의 반응 표면을 한 도면에 합한 결과, 산도 증가량, 수용성 탄닌 증가량 그리고 불용성 탄닌 감소량의 반응표면그림이 완전 또는 부분적으로 적합하였고 그 일치하는 부분을 각 독립변수의 범위를 읽어 최적 발효조건의 범위로 설정하였다. 이 반응표면으로부터 설정될 수 있는 불량감의 최적 발효조건의 범위는 감 수용성 탄닌 추출액의 농도는 14.5 °brix(14~15 °brix), 혼합 과즙액 첨가 농도는 3%(2~4%), 발효시간은 3일(2~3.5 일)로 예측 되었다(표 41).
각 성분의 반응표면을 superimposing 하여 예측된 감 수용성 탄닌 추출액이 최적발효조건의 예측치와 실제 실험치의 비교를 통하여 모델의 정확도를 검증하였다(표 42). 최적 발효조건에서의 균 성장 증가량, pH 감소량, 불용성 탄닌 증가량의 예측치와 실측치는 유사하였으며 산도증가량과 수용성 탄닌 증가량은 예측치보다 실측치가 높게 나타났다.
Figure pat00041
Figure pat00042
실시예 4. 감 수용성 탄닌의 유산발효액을 첨가한 음료의 관능검사
감 수용성 탄닌 추출액의 유산 발효액을 첨가하여 조성된 4종의 음료 조성물은 표 43과 같다.
Figure pat00043
위 조성물을 바탕으로 관능검사를 한 결과는 도 14의 결과를 나타내어 관능평가 결과가 가장 우수한 B 시료의 조성액으로 음료를 조성하였다.
이상과 같이 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 바람직한 실시예를 중심으로 설명하였지만 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 특허청구범위에 기재된 기술적 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 또는 변형하여 실시할 수 있다. 따라서 본 발명의 범주는 이러한 많은 변형의 예들을 포함하도록 기술된 청구범위에 의해서 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC13694BP 20181031

Claims (8)

  1. 감에서 수용성 탄닌액을 수득하는 수용성 감 탄닌액 수득단계(S100);와
    상기 수용성 감 탄닌액에 탄네이즈를 처리하여 수용성 감 탄닌 분해물을 수득하는 수용성 감 탄닌 분해물 수득단계(S200);와
    수용성 감 탄닌 분해물에 대하여 혼합과즙액을 첨가 및 여과하고, 가열처리하여 효소 불활성화 및 살균처리된 수용성 감 탄닌배양액을 제조하는 수용성 감 탄닌배양액 제조단계(S300);와
    수용성 감 탄닌배양액에 탄닌 내성 유산균주인 Lactobacillus plantarum DU.LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP)를 접종 및 배양하여 감 탄닌발효액을 제조하는 감 탄닌발효액 제조단계(S400);를 포함하는 것을 특징으로 하는
    감 탄닌발효액의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 수용성 감 탄닌액 수득단계(S100)는
    감 분말을 정제수에 넣어 초고압추출한 후 비스코자임, 펙티넥스 울트라 SP-L 및 이들의 조합 중 어느 하나의 효소를 이용하여 가수분해하는 것을 특징으로 하는
    감 탄닌발효액의 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 수용성 감 탄닌 분해물 수득단계(S200)에서는
    탄네이즈 1~500 U/g, 반응시간 0.5~10시간, 반응온도 20~60℃ 하에서 처리되는 것을 특징으로 하는
    감 탄닌발효액의 제조방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 수용성 감 탄닌배양액 제조단계(S300)에서는
    수용성 감 탄닌 분해물 100중량부에 대하여 혼합과즙액을 0.5~30 중량부 첨가 및 여과 후, 60~90℃, 5분~30분간 가열하여 효소 불활성화 및 살균처리하는 것을 특징으로 하는
    감 탄닌발효액의 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 감 탄닌발효액 제조단계(S400)는
    수용성 감 탄닌배양액 100 v%에 대하여, (상업용 MRS 액체배지에)전배양한 유산균 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU. LA.CABBLU-18(KCTC 13694BP)을 0.1~20 v%접종한 후, 25~45℃에서 12~120시간 발효한 발효물을 60~100℃에서 10~60분간 저온살균 후, 0.5 내지 3㎛의 여과필터로 여과하는 것을 특징으로 하는
    감 탄닌발효액의 제조방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 감 탄닌발효액의 제조방법에 의해 제조되는 감 탄닌발효액.
  7. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 감 탄닌발효액의 제조방법에 의해 제조되는 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물에 있어서,
    전체 음료조성물 100중량% 중 0.1-99.9 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는
    감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 감 탄닌발효액의 제조방법에 의해 제조되는 감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물에 있어서,
    감 탄닌발효액 100중량부에 대하여, 1 내지 90브릭스의 과일농축액 3~80중량부, 첨가제 0.01~60중량부, 정제수 50~200 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는
    감 탄닌발효액을 포함하는 음료 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102453633B1 (ko) * 2022-06-21 2022-10-12 (주)스마트푸릇 체내흡수율이 증가된 엘라그산과 갈산을 고함량 포함하는 석류 발효조성물과 피부미백, 주름개선 또는 항산화 기능을 갖는 용도 및 efc 공법을 이용한 그의 제조방법

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KR100758236B1 (ko) 2006-03-21 2007-09-12 인제대학교 산학협력단 감으로부터 탄닌의 분리방법
KR101475328B1 (ko) 2013-04-30 2014-12-23 주식회사 화수목 축합형탄닌을 함유하는 천연염료 제조방법

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