KR20190121326A - 생체 조직의 치료를 위한 제품 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사이클로덱스트린, 바람직하게는 에탄올과 관련된 생체 조직의 치료에 관한 것이다.

Description

생체 조직의 치료를 위한 제품 및 방법

본 발명은 생체 인공 조직, 특히 심혈관 생체인공삽입물에 사용되는 생물학적 조직의 치료에 관한 것이다.

석회화는 글루타르알데히드로 전처리된 소 심막 또는 돼지 대동맥 판막에서 유래한 생체 인공 심장 판막(bioprosthetic heart valves)의 실패의 주요 원인 중 하나이다.1-3. 이러한 전처리는 예를 들어 미국 특허 5,931,969(Baxter)에 개시되어있다. 이 유형의 병리학 석회화의 메커니즘은 불완전하게 이해된다. 동물 모델에서, 초기 칼슘 결정핵 생성 부위는 세포막, 핵, 및 세포 내 소기관, 예컨대 약화된 세포들(devitalized cells)의 미토콘드리아인 것으로 밝혀졌다. 이식 기간이 증가함에 따라, 세포-연관 석회 침전물은 크기 및 수가 증가한다. 첨판(cusps)에서의 직접적인 콜라겐 석회화 및 대동맥 벽에서의 엘라스틴 석회화가 이후에 일어난다. 수용자의 나이와 같은 다양한 숙주 인자 및 글루타르알데히드 고정과 같은 이식 인자는 또한 석회화 사건을 악화시킨다.

생물학적 조직은 현재 장기(long-term) 이식을 위해 주로 심혈관 분야에서 생체인공삽입물(bioprosthesis) 제조에 주로 사용된다. 일반적으로 심혈관 생체인공삽입물에 사용되는 생물학적 조직은 주로 소 또는 돼지 조직에서 유래한 이종 이식편 (예: 고유 판막, 심낭, 혈관, 힘줄 등)으로 표시된다. 이러한 생체 조직은 생체인공삽입물 제조에 사용되기 이전에 이식된 후 이물질 또는 면역상 조직 반응을 피하거나 완화하기 위해 화학적으로 처리해야 한다.

전형적으로 이 연구 분야에서, 생물학적 조직은 콜라겐과 엘라스틴 섬유를 함께 결합시키고 세포 외 기질을 안정화시키는 것을 목표로 하는 "가교" 라는 화학 반응에 의해 화학적으로 안정화된다. 가교 처리는 또한 필요한 장기 내구성을 부여하기 위해 조직의 기계적 특성을 증가시키는 이점을 갖는다. 이 마지막 양상은 대동맥, 이첨판(mitral), 삼첨판(tricuspid) 또는 폐 질환 인간 판막을 대체하는 심장 판막 생체인공삽입물을 조립하는데 사용되는 심낭 조직 또는 타고난 동물 판막의 첨판에 대해 특히 중요하다.

가교 화학 반응은 지난 50년 동안 많은 연구의 문제였다. 다른 분자를 사용하는 여러 가지 방법이 적용되어 왔지만 그러나 오늘날에도 여전히 사용되고 있으며 심장 판막 제조업체가 주로 사용하는 것은 글루타르알데히드이다.

그러나, 글루타르알데히드 가교 결합 또는 고정 반응은 글루타르알데히드의 유리 알데히드 그룹, 인지질, 지방산 및 콜레스테롤 사이의 화학적 과정 및 생물학적 조직의 잔류 항원성으로 인해 이영양성 석회화를 촉진한다^1,2,3. 기초 연구를 통해 수년에 걸쳐 상당한 노력이 글루타르알데히드-고정 이종 이식편 조직에서 석회화를 방지(anticalcification)하기 위한 조직 치료 과정을 개발하는데 집중되어 왔다. 주요 석회화 방지 전략은 지질을 추출하거나⁴ 독성 알데히드 잔류물을 중화하는 것이다⁵. 글루타르알데히드-고정 이종 이식편은 세포성/체액성 거부를 가지며 2차적으로 석회화된다³. 조직 판막 석회화는 또한 주로 치명적인 잔류 세포 내에서 시작된다¹.

사이클로덱스트린

사이클로덱스트린의 구조적 측면

사이클로덱스트린은 α,1-4 글루코시딜 결합과 함께 결합되고 폐쇄되어 원뿔형 환상면 형상을 형성하는 D-(+) 글루코피라노스의 6, 7 또는 8개의 모노머로 구성된 환형(cyclic) 천연 올리고당이다(도 1). 가장 일반적인 세 가지 형태는 α-CD(6 유닛), ß-CD(7 유닛) 및 γ-CD(8 유닛)이다.

이러한 고분자는 분자-내 수소 결합의 형성 덕분에 CH₂OH 그룹을 포함하는 외부 표면과 소수성 특성을 갖는 내부 공동(cavity)을 갖는 환상면 형태의 삼차원 강성 구조(rigid structure)를 가정한다. 이 마지막 크기는 사이클로덱스트린을 구성하는 단위 수에 따라 치수가 다르다⁶.

친수성 알콜 작용성으로부터 유래하는 물에서의 용해도와 함께 공동의 존재는 사이클로덱스트린에 수용액에서의 착화(complexation) 능력을 부여한다. 실온에서 사이클로덱스트린은 부드러운 단 맛이 나는 무취의 결정성 백색 분말의 양상을 갖는다.

3차원 구조는 외부 경계에서 히드 록 실기를 제한하는 반면, 공동에는 수소 및 산소 결합 만 존재한다. 이 조건은 외부 표면이 친수성인 동안 중앙 공동의 소수성 특성을 생성한다. 이러한 방식으로, 사이클로덱스트린은 공동 내부에 소수성 분자를 호스트(host)할 수 있는 가능성을 얻고 동시에 물에 용해될 수 있다. 반대로, 외부 표면에 존재하는 히드록실기는 결국 용액에 존재하는 알데하이드 그룹과 연결될 수 있다.

이는 소수성 물질의 수용성을 증가시키는 사이클로덱스트린의 능력을 설명한다. 적절한 극성 및 치수의 분자가 내부 사이클로 덱스트린 공동 내로 호스팅되면 초분자 포접 화합물(inclusion complex)이 생성된다. 포접을 발생시키는 추진력은 입체 피팅, 소수성 효과, 반데르발스 상호 작용, 정전기 상호 작용 및 수소 연결과 같은 다양한 기여를 포함한다. 사이클로덱스트린의 공동에 호스팅되는 물질은 "게스트"라고 하며 사이클로덱스트린은 "호스트"라고 한다.

포접 화합물 형성의 두 번째 이점은 약물 안정성, 생체 이용률, 경구 투여 및 생물학적 막 또는 세포와의 약물 상호 작용을 개선하는 것과 같은 많은 방식으로 관심 분자의 특성 (우리의 경우보다 정확하게 "약물")을 크게 변형시키는 것이다. 이 후자의 이점은 사이클로덱스트린이 많은 관심을 끌었던 이유를 쉽게 설명할 수 있으며 식품, 화장품, 환경 공학에서 화학, 제약 생산 및 개발에 이르기까지 많은 산업 분야에서 전 세계적으로 판매되었다.

사이클로덱스트린 중에서 가장 많이 사용되는 것은 β 계열이며 α 계열은 공동이 너무 작고 γ 계열은 매우 효과적임에도 불구하고 제조 비용이 매우 높기 때문이다.

β-사이클로덱스트린(도 3)은 경구 투여시 독성이 없기 때문에 제약 분야에서 사용될 수 있다. 이 분야에서 이들은 종종 일부 약물의 불쾌한 풍미를 가리고, 고체의 액체 화합물을 은폐하고, 특히 수용성 증가로 인해 많은 약물의 생체 이용률 프로파일을 개선하는 호스트 능력 덕분에 자주 사용된다.

천연 β-사이클로덱스트린은 신 독성(nephrotoxic)이므로 비경구 투여에 사용할 수 없다. 그러나 이들 사이클로덱스트린(상업적으로 카바솔(Cavasol)®로 알려져 있음) 및 사이클로덱스트린의 히드록시프로필 유도체(HP β-CD) 및 α-사이클로덱스트린은 독성을 나타내지 않고 수중에 불용성인 약물의 제형을 허용하기 때문에 비경구 투여에 사용될 수 있다(도 2).

반대로, 메틸화된 β-사이클로덱스트린(M β-사이클로덱스트린)은 친수성 사이클로덱스트린 유도체보다 막과 더 쉽게 상호 작용하지만, 다소 무작위로 친유성인 β-사이클로덱스트린은 친유성 막에 쉽게 침투하지는 않지만 비경구 투여에는 적합하지 않다.

설포부틸 에테르₇ β-사이클로덱스트린(SBE₇ β-CD)⁷은 보다 최근에 합성된 또 다른 β-사이클로덱스트린이다. SBE₇ β-CD는 캡티솔(Captisol)®로 시판되는 β-사이클로덱스트린의 고 수용성 유도체이다. SBE₇ β-CD의 수용성(25℃에서~70g/100ml)은 모(parent) β-사이클로덱스트린(25℃에서 1.85g/100ml)보다 현저히 높다. 이미 비경구용으로 승인되었으며 높은 용해도 덕분에 HP β-CD보다 훨씬 효과적일 수 있다. 따라서, SBE₇ β-사이클로덱스트린은 HP β-사이클로덱스트린에 대한 유망한 대안일 수 있다. 아래 도 4에서 SBE₇ β-사이클로덱스트린의 3가지 이성질체 구조의 구조가 도시되어 있다.

사이클로덱스트린 및 유도체의 독성 프로파일이 광범위하게 평가되었다⁹. 경구 투여시, 사이클로덱스트린은 일반적으로 장 장벽을 통과하지 않기 때문에 안전하다고 간주되나, 동일한 사이클로덱스트린의 경우, 투여 경로는 동물에서 경구 투여후 제한된 독성을 나타내는 천연 β-사이클로덱스트린에 대해 입증된 바와 같이 그의 독성을 변형시킬 수 있고, 이는 허용되는 일일 섭취량은 국제 화학 물질 안전 프로그램(IPCS; WHO 식품 첨가물 시리즈 32)에 의해 체중의 5 mg/kg으로 제한되는 반면, 고용량의 비경구 또는 피하 주사는 근위 세뇨관에 영향을 미치는 신 독성을 얻는다. 유기체로부터 사이클로덱스트린의 제거 방식은 또한 투여 경로에 의존한다. 예를 들어, HP β-사이클로덱스트린은 주로 신장에서 사구체 여과에 의해 제거되고, 쥐(rat)에 정맥 주사 후 소변으로 배설되는 반면, 경구 투여는 주로 쥐 및 개에서 배설물을 통해 배설된다.

요약하면, 모든 독성 연구에서 경구 투여된 사이클로덱스트린은 위장관으로부터의 흡수 부족으로 인해 실질적으로 비독성인 것으로 밝혀졌다. 또한 수많은 안전성 평가 결과에 따르면 γ-사이클로덱스트린, 2-히드록시프로필 β-사이클로덱스트린, 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린, 황산화된 β-사이클로덱스트린 및 말토실 β-사이클로덱스트린은 비경구 투여시에도 안전한 것으로 보인다⁸.

사이클로덱스트린의 작용 방식

제약 분야에서, 상업적 관심이 있는 새로운 사이클로덱스트린 기반 기술은 약물 전달, 생물학적 안전성 및 치료 효율과 관련하여 사이클로덱스트린의 생물학적 성능에 유리하게 지속적으로 개발되고 있다⁹. 이 새로운 사이클로덱스트린은 주로 천연 β-사이클로덱스트린에서 유래하며 그 특성은 주로 치환 정도에 따라 달라진다(도 5). 여기에는 무작위 메틸화된 β-사이클로덱스트린(각각 12.6 및 4개의 메틸기를 나타내는 RAMEβ 및 KLEPTOSE® CRYSMEβ)과 같은 메틸화된 β-사이클로덱스트린 유도체, β-사이클로덱스트린 분자 상에 임의로 치환된 히드록시 프로필기를 갖는 HP-β-사이클로덱스트린, 및 현재 신경 퇴행성 장애 및 죽상 경화증(atherosclerosis)의 치료에 대해 평가된 설포부틸에테르-7-β-사이클로덱스트린(SBE7-β-사이클로덱스트린)를 포함한다. 또한, γ-사이클로덱스트린은 수감마덱스(Sugammadex)와 달리 과민 반응을 나타내지 않았기 때문에 치료에 매우 유용한 것으로 입증되었다. 신경 혈관 차단 약물의 효과를 역전시키기 위해 마취에 사용되는 이 변형된 사이클로덱스트린은 일부 환자에서 알레르기 반응에 관여되어 있다. 치료제로서, 사이클로덱스트린 및 이의 유도체의 작용 방식은 두 가지 방식으로 발생할 수 있다. 첫 번째는 세포막에 대한 사이클로덱스트린의 직접적인 생물학적 작용을 의미하는 반면, 두 번째 것은 사이클로덱스트린의 캡슐화 잠재력을 약물 운반체로 사용하여 오히려 간접적이다.

세포에 대한 사이클로덱스트린의 직접적인 작용은 지질(콜레스테롤 및 인지질) 뿐만 아니라 지질 이중층의 분자 구성을 변경하는 세포막에서 일부 단백질과 그 특성을 추출하는 것이다(도 5). α-사이클로덱스트린은 인지질을 제거하고, β-사이클로덱스트린은 인지질 및 콜레스테롤을 추출하는 반면, γ-사이클로덱스트린은 다른 사이클로덱스트린보다 지질-선택성이 덜한 것으로 설명된다.

두 번째 것의 사이클로덱스트린은 비점막, 폐-, 눈-, 피부-, 장- 및 뇌 장벽을 통한 약물 전달 운반체로 널리 사용되고 이들 분자는 친수성, 소수성 및 친유성 약물의 전달 및 생체 이용률을 향상시킨다.

사이클로덱스트린은 또한 활성 약물 화합물과의 복합체에 혼입될 때 생체 적합성 및 향상된 생체 이용률을 개선하여 약물 효능을 향상시키기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 사이클로 덱스트린 및 약물 화합물의 복합체로의 조합은 동맥 경화증 및 알츠하이머 병 및 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 질환의 치료 연구에 적용되어 왔다. 또한, 사이클로덱스트린은 예를 들어 죽상 동맥 경화증에서 콜레스테롤 결정 검출을 위해 보고된 바와 같이 관심있는 생체 분자에 대한 선택적 결합을 가능하게 하는 운반체로서 사용될 수 있다.

따라서, 사이클로덱스트린의 직접 작용 방식은 세포 막의 지질 뗏목(lipids raft)으로부터 콜레스테롤 및 인지질의 효과적인 추출을 촉진하여 세포에 대한 효과를 입증 하였다. 간접 작용 모드는 사이클로덱스트린의 착화 능력을 강조하여 지질 및 알데히드기를 더욱 효과적으로 제거한다.

에탄올

에탄올은 대동맥 보철 첨판, 소 또는 돼지 심낭 조직과 같은 생체 보철 조직의 치료를 위해 수년 동안 사용되어 왔고 장기 이식시 이영양성 석회화 과정을 완화시키는 것을 목표로 한다.

에탄올은 글루타르알데히드로 수득된 가교 처리 후 단독으로 또는 일반적으로 다른 물질과 관련된 처리에 적용되었다.

다음에는 에탄올(단독 또는 다른 분자와 결합)을 기반으로 한 다양한 생체 조직 치료에 대한 과학적 검토가 제시된다. 석회화 방지 방법으로서 에탄올의 가능한 작용 메커니즘 및 효능이 분석되었다.

글루타르알데히드-가교 첨판의 80.0% 에탄올 전처리는 첨판 샘플로부터 거의 모든 콜레스테롤 및 인지질을 추출하였다. 생체인공삽입물의 약화된 세포에 존재하는 인지질은 포스포에스테르 가수 분해로 인한 심장 판막 석회화의 초기 인 공급원인 것으로 가정되었다. 다른 연구에서도 죽상 경화성(atherosclerotic) 플라그에서 콜레스테롤과 석회화 사이의 관련성을 살펴보았다. 콜레스테롤 수치는 연령에 따라 점진적으로 증가하여 관상 동맥 질환의 위험과 직접적으로 관련이 있는 것으로 나타났다. 콜레스테롤은 또한 동맥 평활근 세포에서 세포막, 수축기 칼슘 수준 및 막 유동성을 가로 지르는 칼슘 이동을 변경한다. 세포막의 콜레스테롤 함량이 세포 내 석회화와 상관되는 메커니즘은 불완전하게 이해되어 있다.

이러한 데이터는 콜라겐 형태에서 에탄올 전처리에 의해 야기된 변화가 안정하고 석회화 방지 메커니즘을 설명하는데 중요할 수 있음을 강력하게 시사한다. 이러한 입체형태 변화는 에탄올 전처리로 인한 지질 또는 단백질의 관찰된 감소된 첨판의 흡착을 담당할 수 있다. 이것은 또한 콜라겐에 대한 단백질-단백질 및 단백질-지질 상호 작용에 대한 추가 연구와 생체인공 심장 판막 석회화에서의 역할에 대한 추가 연구를 보장한다¹⁰.

에탄올 처리에 의해 유도된 첨판의 콜라겐 입체형태 변화는 지속적이었다. 또한 콜라겐 분해효소에 의한 소화 내성이 있었다. 따라서 에탄올 전처리에 의해 발생하는 석회화 방지 효과 및 콜라겐 형태 변화는 보다 내구성있는 생체인공삽입물을 초래할 수 있다고 가정될 수 있다¹⁰.

글루타르알데히드-가교 돼지 대동맥 판막 생체인공삽입물의 에탄올 예비 배양은 60일 쥐 피하 이식 및 양 이첨판 교체(150 일)에서 돼지 대동맥 판막 교합의 석회화를 방지하기 위한 매우 효과적인 전처리이다. 에탄올은 골 세포 뿐만 아니라 섬유아세포에서 칼슘의 세포 대사에 알려진 간섭으로 인해 석회화 방지제로 선택되었다^11,12. 에탄올의 존재는 많은 세포 활성에 영향을 미치는 인지질의 세포막과 장애 아실 사슬을 분해하는 것으로 나타났다¹³. 또한, 에탄올은 물과의 상호 작용으로 인산 칼슘 핵 생성 및 상 변환을 현저히 억제하는 것으로 나타났다¹⁴. 생체인공 심장 판막 석회화의 에탄올 억제에 관한 이전 간행물¹⁵에서, 80.0% 에탄올 전처리는 글루타르알데히드-가교 첨판으로부터 거의 모든 인지질 및 콜레스테롤을 추출하였다.

생체인공 심장 판막 석회화를 방지하는 에탄올의 작용 메커니즘을 이해하기 위해, 전처리 전후의 판막첨(leaflet) 샘플을 총 지질 및 콜레스테롤 함량에 대해 분석하였다.

농도가 50.0%보다 높은 에탄올은 콜레스테롤과 인지질 모두에서 매우 효율적인 추출기였으며, 도 6에 설명된 대로 거의 15개를 거의 완전히 추출했다. 막-경계 인지질은 알칼리성 포스파타제에 의한 가수 분해로 인해 생체인공 심장 판막의 무기화(mineralization)의 초기 단계에서 인을 제공하는 것으로 간주된다. 석회화의 초기 위치 인 인지질의 완전한 제거는 에탄올의 작용 메커니즘을 부분적으로 설명할 수 있다. 그러나 클로로포름-메탄올 (2:1) 처리 결과는 이 탈지 요법이 총 콜레스테롤과 인지질 모두를 완전히 추출함을 보여 주었다(표 1).

쥐 피하 모델에서 이식 기간은 60일로 연장되었다. 대조군은 심각하게 석회화되었다(칼슘 수준, 236±6.1 μg/mg 조직). 80.0% 에탄올 (24시간 동안 pH 7.4) 전처리는 이식되지 않은 생체 조직(칼슘 수준, 1.87±0.29 μg/mg 조직)에 필적하는 칼슘 수준으로 석회화를 완전히 억제함으로써 가장 효과적이었고, 반면 60.0% 에탄올 전처리는 부분적으로 효과적이었다(칼슘 수준, 28.5±12.0 μg/mg 조직). 따라서, 80.0% 에탄올 전처리는 21일- 및 60일- 쥐 피하 모델 모두에서 첨판 석회화를 방지하기 위한 최상의 조건인 것으로 밝혀졌다.

에탄올로 처리하고 150일 동안 양 모델로 이식한 돼지 대동맥 판막 생체인공삽입물은 표 2에 기술된 바와 같이 대조군(글루타르알데히드 고정 판막첨)과 관련하여 판막첨 칼슘 축적이 상당히 감소된 것으로 나타났다.

그룹	콜레스테롤	인지질
대조군	13.3±0.4	17.2±0.8
40% 에탄올	13.9±0.7	16.5±1.5
60% 에탄올	0.30±0.05	4.93±1.9
80% 에탄올	0.14±0.02	1.08±0.1

따라서, 이들 데이터는 지질 추출이 에탄올의 작용 메커니즘에서 일부 역할을 할 수 있지만, 지질 추출만으로는 에탄올의 석회화 방지 효과를 완전히 설명할 수 없으며, 메탄올은 무기화에 영향을 미치는 다른 요인을 변경시킬 수 있음을 나타낸다 표 1.

그룹	Ca
대조군	32.51±11.46*
80% 에탄올 처리	5.22±2.94*
이식되지 않음	2.80±0.70

에탄올로 처리된 조직의 응력 변형(stress strain) 특성을 돼지 조직 첨판의 대동맥 판막에서 평가했다¹⁶. 이 연구는 처리되지 않은 돼지 대동맥 교두의 일축의 응력 변형 특성을 글루타르알데히드 처리된 첨판의 특성 및 글루타르알데히드에 따른 에탄올 배양의 특성과 비교한다.

처리되지 않은 첨판은 대조군 (C)을 제공하고 반면, 글루타르알데히드 처리된 첨판 (G) 및 글루타르알데히드 고정 후 에탄올 처리된 첨판(G+A)으로 시험 샘플을 나타냈다.

파라미터 최대 하중 (p=0.002)에 대해 그룹 (C), (G+A)간에 유의한 차이가 있었다. 파라미터 최대 응력의 경우, 그룹 (G + A)과 그룹 (G) 및 (C) 사이에 유의한 차이가 있었고, p 값은 각각 0.047 및 0.007이다. 그룹 (G+A)는 또한 그룹 (G) 및 (C) 모두 p=0.025 및 p=0.049와 비교하여 응력에 대한 신장 능력(최대 변위)을 증가시켰다. 그룹 (G+A)는 또한 그룹 (G) 및 (C) p=0.006 및 p=0.027 각각에 비해 상당히 높은 최대 변형을 나타냈다.

글루타르알데히드 처리된 조직(Glutaraldehyde tanned tissue)의 에탄올 처리는 인장 강도를 보존할 뿐만 아니라, 글루타르알데히드 처리 후 증가된 인장 강도를 유지시킬 뿐만 아니라 원주 방향으로 단축 시험에서 신장성을 향상시킨다. 이러한 물리적 특성의 변화는 대동맥 첨판의 내구성을 유지하는데 도움이 될 수 있다. 석회화 성향의 감소 및 첨판 조직이 응력을 증가시키는 능력은 구조적 기능 장애를 예방하는데 도움이 될 수 있다. 그러나 이 가설을 시험하기 위해 생체 내에서 알코올 처리된 글루타르알데히드 처리 돼지 대동맥 판막의 장기 생체 내 내구성 연구를 고려하는 것이 적절할 것이다.

다른 연구에서 글루타르알데히드 가교와 관련한 에탄올의 석회화 방지 효과가 평가되었다. 저자는 저-분자량 알코올 (메탄올, 에탄올 및 이소프로판올)이 돼지 대동맥 판막 첨판의 칼슘 완화에 효과적이라고 언급한다. 에탄올 처리 후 글루타르알데히드에 조직의 저장은 석회화의 부분적인 복귀를 허용하여 조직 석회화를 방지하는데 에탄올-글루타르알데히드 상호 작용에 대한 역할을 시사한다. 그러나 돼지 첨판이 에탄올성 글루타르알데히드에 저장되었을 때 에탄올의 석회화 방지 효과가 지속되었다¹⁷.

또 다른 연구에서 2001년 Carpentier는 0.6% 글루다르알데히드로 전처리된 심낭 샘플에 대한 에탄올, 에테르 및 계면 활성제 처리의 효과를 연구했다¹⁸. 에탄올, 에테르 또는 트윈 80 계면활성제 및 이들의 조합을 사용하여 지질 추출을 수행하였다. 처리된 조직을 4개월 및 6개월 동안 50 마리의 어린 쥐에게 피하 이식하였다. 이식 6개월 후, 계면활성제를 가진 에탄올 그룹과 계면 활성제를 가진 에테르 그룹에서만 칼슘 수준이 대조군보다 유의하게 낮았다. 이전 연구에서 에탄올은 인지질 추출에 매우 효과적이며 석회화 과정에서 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다¹⁰.

반대로, 에탄올 추출은 소 심낭에서 트리글리세리드를 완전히 제거하지 않는 반면, 에테르에 의한 추출은 트리글리세리드를 완전히 제거하는 것으로 나타났다. 그러나, 이들 두 그룹의 칼슘 함량은 이식 6개월 후에 현저하게 다르지 않았으며, 이는 칼슘 침착에서 트리글리세리드의 역할이 중요하지 않음을 암시한다. 결론적으로, 에탄올 또는 에테르 단독 또는 계면 활성제 단독에 의한 처리는 이들 처리의 조합보다 덜 효율적이다. 처리 조합이 단일 처리보다 효율적이라는 사실은 추출 메커니즘과 각 처리로 추출된 제품이 약간 다르다는 것을 증명하는 경향이 있다. 이 연구의 실제적인 결론으로 현재 사용되는 생체인공 판막 보존 절차에서 에탄올의 농도 또는 배양 시간을 늘리거나 계면활성제 처리에 에테르 처리를 추가하는 것이 유리할 수 있다고 말할 수 있다.

가장 효율적인 전처리는 계면활성제 단독과 비교할 때 (42.9±12.7 ㎍/mg 건조 조직) 에탄올과 계면활성제(칼슘 함량: 15.5±6.8 μg/mg 건조 조직 이식 6개월 후) 또는 에탄올, 에테르 및 계면 활성제(13.1±6.2 μg/mg 건조 조직)의 조합이었다.

에탄올의 석회화 방지 효과는 많은 과학 간행물에서 잘 드러난다. 돼지 대동맥 첨판 및 심낭 조직 둘 다에 대한 에탄올 처리의 효과에도 불구하고, 일부 소량의 잔류 석회화가 여전히 존재하며, 연구자들에게 조직에서의 이영양성 석회화 침착을 추가로 완화시키기 위해 추가의 조합된 치료법의 탐색을 제안했다.

Connoly¹⁹는 에탄올의 수소화 붕소 나트륨으로 처리된 돼지 대동맥 첨판의 후-처리를 평가했다. 에탄올 전처리는 대조군과 비교하여 석회화를 유의하게 억제하였다(13.3 +/- 5.6 대 119.2 +/- 6.6 Ca ㎍/mg 조직; p<0.001). 그러나, 에탄올 전처리와 함께 최적 조건 하에서 수소화 붕소 나트륨 감소는 석회화를 최적으로 감소시켰고(1.16 +/- 0.1 Ca ㎍/mg; p<0.05), 반면 시아노 수소화 붕소 나트륨(sodium cyanoborohydride) 처리 후의 수준 (23.6 +/- 10.4 Ca ㎍/mg)은 에탄올 단독 후의 수준과 크게 다르지 않았다. 환원제는 에탄올 전처리없이 석회화를 억제하는데 효과적이지 않았다.

일부 다른 저자들은²⁰ 심낭 조직을 탈 독성시키기 위해 에탄올을 아미노산과 함께 인지질 용매로 채택했다. 소 심낭 샘플 그룹을 0.5% GA로 고정시켰다. 우라졸(Urazole) 및 글루타메이트를 사용하여 소 심낭 조직의 인지질 함량을 감소시키기 위해 유리 알데히드 및 일부 용매(옥탄올 또는 옥탄디올을 갖는 에탄올)를 중화시켰다. 우라졸과 글루타메이트만으로 Ca²⁺ 및 무기 인(IP) 농도가 현저하게 감소되었으나(어떤 석회화 방지 처리없이 Ca²⁺: 277.85±17.51 μg/mg; IP: 147.07±8.32 μg/mg), 유기 용매와 함께 사용하면 Ca²⁺ 무기 인 농도는 가장 낮았다(Ca²⁺: 0.05±0.04 ㎍/mg; IP: 3.36±0.61 ㎍/mg).

Kim²¹이 발표한 연구의 목적은 석회화 및 조직 탄성의 관점에서 글루타르알데히드로 처리된 돼지 심낭에서 에탄올 및 L-라이신과 비교하여 L-아르기닌 및 수소화 붕소 나트륨(NaBH₄)의 동기화된 상승 작용을 평가하는 것이었다. 돼지 심낭을 0.625% 글루타르알데히드(4℃에서 2일 후 실온에서 7일)로 고정시켰다. 에탄올 (80%; 실온에서 1일) 또는 L-라이신(0.1M; 37℃에서 2일) 또는 L-아르기닌 (0.1M; 37℃에서 2일)의 중간 단계에 이어서 글루타르알데히드 고정이 완료되었다.

L-라이신 및 NaBH₄ 전처리 (183.8±42.6 μg/mg, p=0.804) 및 L-아르기닌 및 NaBH₄ 전처리 (163.3±27.5 μg/mg, p=0.621)는 대조군(175.5±45.3 ㎍/mg)과 비교하여 석회화를 유의하게 억제하지 않았으나, 에탄올 및 NaBH₄ 전처리는 대조군과 비교하여 석회화를 유의하게 억제하였다(38.5±37.3 ㎍/mg, p=0.003). 마지막으로 NaBH₄ 전처리는 글루타르알데히드로 고정된 돼지 심낭의 석회화를 감소시키는 것으로 보였으나, 에탄올과 함께 전처리 했을 때 만이다.

글루타르알데히드에 고정되고 어린 쥐에 피하로 이식된 돼지 대동맥 벽의 단편과의 석회화 및 염증 반응을 방지하기 위해, 분리 또는 에탄올과 관련된 염화 알루미늄의 효율을 평가하기 위해 또 다른 연구²²가 개선되었다. 돼지 대동맥 벽의 샘플을 피하 조직에 이식하였다. 표본은 이전에 3가지 상이한 처리 방법, I (글루타르알데히드), II (글루타르알데히드 + 알루미늄), III (글루타르알데히드 + 에탄올 + 알루미늄)에 적용되었다. 원자 흡광 분광법은 그룹 II 및 III 둘 다에 대해 유사한 칼슘 수준을 나타내지만, 그룹 I보다 현저히 적었다. 염화 알루미늄으로 처리하면 이식 후 대동맥 벽 표본의 석회화를 억제하고 염증 반응을 감소시킨다. 에탄올과 염화 알루미늄의 병용은 석회화를 억제하고 염증 반응을 감소시키는데 더 효율적이다.

상기 논의된 문헌 검토는 생물 조직의 에탄올 처리가 동물 모델에서 장기 이식 후 조직 이영양성 석회화를 예방하는데 일반적으로 매우 효과적임을 분명히 나타낸다. 생체 물질이 에탄올로 전처리되고 글루타르알데히드와 가교될 때 조직 칼슘 함량 감소 대 대조군은 항상 중요하다.

에탄올은 석회화를 유발하는 주요 원인으로 확인된 세포막에서 지질 뗏목(콜레스테롤 및 인지질)을 가용화 및 추출하는데 효율적이다. 지질 추출 측면에서 최고의 효율은 80%의 농도에서 얻어지지만, 좋은 조직 석회화 감소는 이미 50%의 농도에서 볼 수 있다¹⁵.

대체 조직 가교 처리 (트리글리시딜아민, 게니핀(Genipin), 네오마이신(Neomicin)) 또는 후 처리 (예: 우라졸, 글루타메이트, 염화 붕소 나트륨, 염화 알루미늄 또는 기타)의 적용은 에탄올과 관련된 경우에만 석회화 경향을 더 감소시킨다.

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본 발명은 일반적으로 생체 조직의 치료에서 사이클로덱스트린의 신규하고 본래의 용도에 관한 것이다.

이 치료에 사이클로덱스트린을 사용하면 이식 후 장기적인 기계적 및 생물학적 내구성을 가진 생체 조직을 제공한다. 이러한 특성은 심장 판막 생체인공삽입물에 특히 중요하다.

사이클로덱스트린은 큰 분자 계열에 속하지만 본 발명에 있어서 가장 공인된 것은 β 계열의 것들이다. 기능화된 β-사이클로덱스트린, 특히 HP β-사이클로덱스트린 및 SBE β-사이클로덱스트린은 비경구용으로 승인되었다. 따라서 그들은 미량으로 존재하더라도 배설 기관에 대한 손상없이 원하는 모든 화학 작용을 발현하고 있다.

유리하게는, 사이클로덱스트린은 에탄올과 조합하여 사용된다.

50%보다 높은, 수성 농도의 에탄올에 기초한 조직 처리는 인지질 추출에 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 에탄올의 효과는 생체 조직의 글루타르알데히드 가교와 밀접한 관련이 있다. 메커니즘은 불분명하지만 글루타르알데히드 기반 가교 공정 후에 적용할 때 에탄올 처리가 더 효과적인 것으로 보인다.

사이클로덱스트린 작용은 지질 분자의 1차 추출과 함께 직접적으로, 및 이미 추출된 지질 분자의 착물과 함께 간접적으로 표현될 수 있다. 사이클로덱스트린이 에탄올에 의해 이미 용해된 인지질을 착화할 수 있는 것이 이 제2작용 방법에 있다.

일반적으로 사이클로덱스트린의 작용은 생물학적 조직에 적용될 때 입체 상호 작용 또는 소수성 공동과 지질 분자 사이의 약한 공유 결합으로 설명될 수 있다. 다른 말로, 화학 반응없이 사이클로덱스트린과 지질 분자의 약한 공유 결합이다.

생물학적 조직의 치료를 위한 사이클로덱스트린의 특정 유도체의 사용은 특허 출원 US2002/137024에 개시되어 있다. 이 종래 기술은 설폰화 및 황산화 폴리음이온이 보철물 장치에 사용되는 생물학적 조직에서 칼슘 핵 생성 부위를 차단할 수 있음을 교시하고 있다. 이들 화학 물질의 작용 메커니즘은 기술되어 있지 않지만 설폰화 및/또는 황산화된 작용기가 칼슘 핵 생성 부위의 차단에 책임이 있다는 이 문헌의 교시로부터 명백하게 공제될 수 있다. 사실상, US2002/137024호에 보고된 실시예는 술폰산염/황산염 기 만을 갖는 완전히 상이한 분자를 언급한다. US2002/137024호에 언급된 폴리 음이온의 몇몇 예는 이들 중 하나인 황산화 사이클로덱스트린이다. 설폰산염/황산염 기는 아마도 칼슘과 황산염 음이온 사이의 친화성으로 인해 칼슘 핵 생성 부위를 차단할 수 있다고 추론할 수 있다. 다시 말해, 인지질의 포스페이트기에 대한 황산염/설폰산염 음이온의 일종의 경쟁 작용은 종래 기술에 이미 잘 알려져 있음에도 불구하고 US2002/137024호에서 칼슘 핵 생성 부위로 명확하게 식별된다.

일반적으로, 사이클로덱스트린은 기능성 설포산염 또는 황산화염 기를 함유하지 않는다. 사이클로덱스트린은 일반적으로 이온성 화합물이 아닌 중성 분자라는 점을 강조해야 한다. 황산화 사이클로덱스트린은 거대 종류의 사이클로덱스트린의 하나의 유도체일 뿐이며, 기능화는 i.v. 투여를 위한 보다 가용성이거나 허용 가능한 분자를 얻는 것을 목표로 한다. 따라서 US2002/137024호에는 사이클로덱스트린 자체를 칼슘 핵 생성 부위에 대한 차단제로서 사용하는 것을 제안하는 것이 없다. 실제로, US 2002/137024호는 심지어 칼슘 핵 생성 부위에 대한 차단제로서 사이클로덱스트린의 사용을 교시하고 있다.

본 발명에서, 선택된 사이클로덱스트린은 US2002/137024호에 기재된 것과 완전히 다른 방식으로 작용한다. 사이클로덱스트린 자체는 소수성 공동 덕분에 인지질 지방 사슬을 격리시키는 조직으로부터 인지질을 제거하고 있다.

에탄올 및 사이클로덱스트린은 임의의 순서로 동시에 또는 별도로 사용될 수 있다.

생체 조직(타고난 판막 첨판, 소 또는 돼지 심낭 조직)은 결함 및 두께의 부재를 위해 선택된다. 선택된 패치 또는 첨판은 임의의 면역학적 또는 이물질 조직 반응을 피하기 위해 콜라겐을 안정화시키는 것을 목표로 하는 가교 공정으로 제출된다. 가교 공정은 상이한 분자로 수행될 수 있지만, 전형적으로 12시간 내지 48시간 또는 그 이상의 기간 동안 0.1% 내지 1% 범위의 농도의 글루타르알데히드가 사용된다.

바람직하게는, 결합 탈지 처리(도 7)는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 2시간 내지 24시간 동안 10mM 내지 200mM의 β-사이클로덱스트린과 함께 PH 7.4의 완충 용액에 35% 및 80%의 가용화된 농도로 에탄올을 조합하여 수행된다.

탈지 처리 후 패치는 반제품 또는 완성된 조립체로 조립된 후, 최종적으로 단쇄 알코올 분자가 첨가된 알데하이드 계 용액으로 화학적으로 멸균된다.

완성된 장치는 이어서 0.1% 내지 1%의 농도의 알데히드로 구성된 용액에 저장하고 최종적으로 10% 내지 50%의 농도의 단쇄 알코올 분자를 첨가한다.

이식 전에 생체 보철물에서 알데히드 유리 분자를 제거하는 것을 목표로 하는 조직 해독 공정을 추가하기 위해, 이식 전 헹굼 과정이 수행된다.

이러한 이식 전 세정은 15℃ 내지 30℃의 온도에서 10mM 내지 200mM의 농도로 500ml의 β-사이클로덱스트린 용액의 3개의 분취량으로 수행된다.

본 발명은 일반적으로 생체 조직의 치료에서 사이클로덱스트린의 신규하고 본래의 용도에 관한 것으로, 이 치료에 사이클로덱스트린을 사용하면 이식 후 장기적인 기계적 및 생물학적 내구성을 가진 생체 조직을 제공한다. 이러한 특성은 심장 판막 생체인공삽입물에 특히 중요하다.

다른 실시 형태에서, 인지질 추출은 조직 가교 후에 2 단계로 분리된 방식으로 수행될 수 있다(도 8). 먼저 에탄올 처리가 수행되고 이어서 β-사이클로덱스트린이 수행된다. 두 처리 모두 도 7에 설명된 것과 동일한 농도 및 조건에서 수행되었다.

도 8에 기술된 바와 같이 인지질 추출은 β-사이클로덱스트린에 대한 노출을 예상 한 후 동일한 농도 및 조건에서 에탄올 처리를 거꾸로 하여 역으로 수행될 수 있다.

에탄올과 β-사이클로덱스트린의 결합된 처리는 가교 절차(도 9) 전에 생체 조직에서 β-사이클로덱스트린 처리를 직접 예상하고 에탄올 용액으로 처리하는 것을 예상하여 수행할 수 있다. 에탄올 및 β-사이클로덱스트린의 농도는 도 7에 기재된 바와 동일할 수 있다. 이 분리된 처리는 필요한 경우 역순으로 적용될 수 있다.

가교 절차(도 9) 전에 β-사이클로덱스트린 치료를 예상하는 근거는 생체 조직을 직접 전달하기 위한 사이클로덱스트린의 직접 활성 방식을 기반으로 한다. 이것은 이들 분자가 동맥 혈관의 죽상 경화성 플라그로부터 콜레스테롤 및 다른 지질을 추출 할 수 있는 실험에서 관찰된 사이클로덱스트린에 의해 발현된 동일한 활성 추출 능력이다(FDA는 영아가 2~3 세의 죽상 경화성 플라그를 가지고 비정상적으로 높은 혈장 농도의 콜레스테롤을 보이는 희귀한 소아과 질환에서 고아 약물 치료법으로 사이클로덱스트린를 승인했다).

에탄올 및 사이클로덱스트린으로의 이전 처리에서 설명된 인지질 추출 후의 다른 구체예에서, 공정은 추가 해독 공정을 포함할 수 있으며, 사이클로덱스트린을 기반으로 잔류 알데히드 분자를 효과적으로 제거하는 것을 목표로 한다(도 10). 이러한 화학적 처리 변형의 목적은 정균성(bacteriostatic) 알데히드가 없는 저장 용액에 생체인공삽입물을 저장하기 위해 필요하다. 전술한 바와 같이, 글루타르알데히드에 생체인공삽입물을 저장하는 것이 에탄올 처리에 의해 제공된 긍정적인 진통 효과를 부분적으로 무시할 수 있다는 것이 입증되었기 때문에 저장 용액으로부터 알데히드를 제거하는 것이 매우 중요하다. 이것이 이전 실시예에서 도 7 내지 도 9에 설명된 저장 매체가 글루타르알데히드 용액을 기준으로 일정량의 단쇄 알코올이 첨가된 이유이다.

생체 조직 치료에서 중요한 진전은 에틸렌 옥사이드 멸균과 관련하여 조직 탈수로 대표된다. 이는 생체인공삽입물의 화학 멸균을 피하고, 특히 생체인공삽입물이 카테터경유 절차에서 접혀서 사용해야 할 때의 취급에 있어서 생체인공삽입물을 보다 쉽게 보관하기 위해 수행된다.

이전에 제시된 이전 치료 실시예는, 가능한 변형으로, 조직 탈수 절차와 관련될 수 있다. 예를 들어, 도 11에서와 같이, 탈지 후, 조직으로부터 알데히드 분자를 제거하기 위해 β-사이클로덱스트린으로 해독 공정을 수행한다. 해독이 완료되면 조직 탈수 절차가 시작될 수 있다. 이 처리는 80% 내지 90% 범위의 수용액에서 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, MW 100 내지 800)로 수득된 생체 조직으로부터 물을 점진적으로 제거하는 것에 기초한다. 처리는 20℃ 내지 50℃의 온도에서 12시간 내지 48시간 동안 수행된다. 보다 효과적인 탈수를 얻기 위해 단쇄 알코올을 10% 내지 20%의 농도로 첨가할 수 있다.

탈수 과정은 깨끗한 환경에서 몇 시간 동안 조직 건조로 완료된다. 그것은 에틸렌 옥사이드를 사용하여 멸균에 제출되는 건식 포장에 생체인공삽입물을 최종 저장한다.

상기 기술된 모든 처리 공정은 반제품 조립체 또는 최종 조립된 생체인공삽입물에서 직접 수행될 수 있다. 이 경우, 공정은 개별 보철 치료로 적용될 수 있다.

Claims (19)

1. 생체 조직, 특히 심혈관 보철물에 사용되는 생물학적 조직의 치료 방법으로서, 상기 방법은 그 자체로 생체 조직으로부터 인지질을 제거할 수 있는 사이클로 덱스트린의 사용을 포함하는 생체 조직의 치료 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린은 β-사이클로덱스트린인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생체 조직의 석회화를 감소시키는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 조직을 알데히드가 없는 용액에 저장하기 위해 생체 조직의 잔류 독성을 감소시키는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조직 탈수를 달성하기 위한 폴리에틸렌 글리콜 및 멸균을 위한 에틸렌 옥사이드와 관련된 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 사이클로덱스트린이 조직으로부터 잔류 유리 알데하이드 분자를 제거하기 위해 사용되는 헹굼 단계를 추가로 포함하는 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린은 γ-사이클로 덱스트린, 2-히드록시프로필 β-사이클로덱스트린, 설포부틸 에테르 β-사이클로덱스트린, 황산화 β-사이클로덱스트린, 말토실 β-사이클로덱스트린의 군에서 선택되는 것인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 에탄올의 사용을 추가로 포함하는 방법.
9. 제8항에 있어서, 에탄올 및 사이클로덱스트린이 동시에 사용되는 것인 방법.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 에탄올에 이어서 사이클로덱스트린을 연속적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 사이클로덱스트린에 이어서 에탄올을 연속적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 가교 공정을 포함하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 가교 공정은 사이클로덱스트린의 사용 후에 일어나는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 가교 공정 후에 일어나는 시클로덱스트린의 두 번째 사용을 포함하는 방법.
15. 제12항에 있어서, 상기 가교 공정이 사이클로덱스트린의 사용 전에 일어나는 것인 방법.
16. 사이클로덱스트린을 포함하는, 생체 조직 특히, 심혈관 조직 치료용 제품.
17. 제16항에 있어서, 상기 사이클로덱스트린이 β-사이클로덱스트린인 제품.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 에탄올을 추가로 포함하는 제품.
19. 2개의 분리된 생성물, 즉 사이클로덱스트린을 함유하는 제1생성물 및 에탄올을 함유하는 제2생성물을 포함하는 생체 조직의 치료를 위한 키트.