ES2936112T3 - Método para el tratamiento de tejidos bioprotésicos - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al tratamiento de tejidos bioprotésicos con ciclodextrina, preferiblemente en asociación con etanol. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para el tratamiento de tejidos bioprotésicos

Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento de tejidos bioprotésicos, en particular de tejidos biológicos que se usan en bioprótesis cardiovasculares.

Estado de la técnica

La calcificación es una de las principales causas del fallo de las válvulas cardíacas bioprotésicas derivadas de pericardio bovino pretratado con glutaraldehído o válvulas aórticas porcinas.1-3. Este pretratamiento se divulga, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos 5.931.969 (Baxter). El mecanismo de este tipo de calcificación patológica no se entiende completamente. En modelos animales, se ha demostrado que los sitios de nucleación de calcio iniciales son membranas celulares, el núcleo y orgánulos intracelulares, tales como las mitocondrias de células desvitalizadas. Con el incremento de la duración de la implantación, los depósitos de calcio asociados a las células incrementan en tamaño y número. Posteriormente se produce la calcificación directa de colágeno en las cúspides y la calcificación de elastina en la pared aórtica. Diversos factores de huésped, tales como la edad joven de un receptor, y factores de implante, tales como la fijación de glutaraldehído, también agravan los eventos de calcificación.

Los tejidos biológicos se utilizan actualmente en gran medida para la fabricación de bioprótesis, principalmente en el campo cardiovascular, para implantes a largo plazo. Típicamente, los tejidos biológicos usados para bioprótesis cardiovasculares se representan por xenoinjertos (por ejemplo, válvulas nativas, sacos pericárdicos, vasos sanguíneos, tendones, etc.) originados principalmente a partir de tejidos bovinos o porcinos. Estos tejidos biológicos, antes de utilizarse para la fabricación de bioprótesis y posteriormente implantados, se deben tratar químicamente para evitar o mitigar cualquier respuesta de cuerpo extraño o tejido inmunológico.

Típicamente, en este campo de investigación, los tejidos biológicos se estabilizan químicamente por medio de una reacción química llamada "reticulación" destinada a unir las fibras de colágeno y elastina y estabilizar la matriz extracelular. El tratamiento de reticulación tiene también la ventaja de incrementar las propiedades mecánicas de los tejidos con el fin de garantizar su necesaria durabilidad a largo plazo. Este último aspecto es de particular interés para los tejidos pericárdicos o para las cúspides de válvulas animales nativas usadas para montar bioprótesis de válvulas cardíacas que reemplazan las válvulas humanas aórticas, mitrales, tricúspide o pulmonares enfermas.

La reacción química de reticulación ha sido objeto de muchos estudios desde los últimos 50 años. Se han aplicado varios métodos que usan diferentes moléculas, pero el que hoy en día todavía se usa y se aplica en gran medida por el fabricante de válvulas cardíacas es el glutaraldehído.

Sin embargo, la reacción de reticulación o fijación de glutaraldehído promueve la calcificación distrófica debido al proceso químico entre los grupos aldehído libres de glutaraldehído, fosfolípidos, ácidos grasos y colesterol y antigenicidad residual de los tejidos biológicos123. Se han dirigido esfuerzos considerables durante muchos años a través de investigación básica hacia el desarrollo de un proceso de tratamiento de tejido para prevenir la calcificación en tejido de xenoinjerto fijado con glutaraldehído. Las principales estrategias de anticalcificación tienen como objetivo extraer los lípidos4 o neutralizar los residuos de aldehídos tóxicos5. Los xenoinjertos fijados con glutaraldehído tienen rechazo celular/humoral y calcifican secundariamente3. La calcificación de válvula de tejido también se inicia principalmente dentro de las células residuales que se han desvitalizado1.

Ciclodextrinas

Aspectos estructurales de ciclodextrinas

Las ciclodextrinas son oligosacáridos naturales cíclicos constituidos por 6, 7 u 8 monómeros de D-(+) glucopiranosa unidos entre sí con un enlace a,1-4 glucosidal y cerrados que dan como resultado una forma cónica-toroidal (figura 1). Las tres formas más comunes son a-CD (6 unidades), p-CD (7 unidades) y y-CD (8 unidades).

Estas macromoléculas, gracias a la formación de enlaces de hidrógeno intramoleculares, asumen una estructura rígida tridimensional de tipo toroidal, con una superficie externa que contiene grupos CH² OH y una cavidad interna con características hidrófobas. Este último tiene dimensiones, que dependen del número de unidades que constituyen la Ciclodextrina6.

La presencia de la cavidad junto con la solubilidad en agua, derivada de las funcionalidades alcohólicas hidrófilas, confiere a las ciclodextrinas la capacidad de complejación en soluciones acuosas. A temperatura ambiente, las ciclodextrinas tienen el aspecto de un polvo blanco cristalino, inodoro con un sabor dulce suave.

La estructura tridimensional restringe los grupos hidroxilo en los bordes externos, mientras que en la cavidad solo están presentes enlaces de hidrógeno y oxígeno. Esta condición crea una característica hidrófoba de la cavidad central en tanto que la superficie externa es hidrófila. De esta manera, las ciclodextrinas adquieren la posibilidad de alojar moléculas hidrófobas dentro de la cavidad y ser, al mismo tiempo, solubles en agua. Por el contrario, los grupos hidroxilo presentes en la superficie externa son capaces de unirse con grupos aldehído eventualmente presentes en la solución.

Esto explica la capacidad de las ciclodextrinas de incrementar la solubilidad en agua de sustancias hidrófobas. Cuando se aloja una molécula de polaridad y dimensión oportunas en la cavidad interna de ciclodextrina se crea un complejo de inclusión supramolecular. La fuerza de empuje que genera la inclusión implica diversas contribuciones tales como ajuste estérico, efectos hidrófobos, interacciones de van der Waals, interacciones electrostáticas y enlace de hidrógeno. Las sustancias alojadas en la cavidad de las ciclodextrinas se llaman "anfitrión", en tanto que las ciclodextrinas se llaman "huésped".

La segunda ventaja de la formación de complejos de inclusión consiste en modificar en gran medida las propiedades de la molécula de interés (más precisamente "fármacos" en nuestro caso) de muchas maneras tales como mejorar la estabilidad del fármaco, biodisponibilidad, administración oral e interacción del fármaco con membranas o células biológicas. Esta última ventaja puede explicar fácilmente la razón por la que las ciclodextrinas han atraído tanta atención y se han comercializado en todo el mundo en muchas áreas de la industria, desde alimentos, cosméticos, ingeniería ambiental hasta producción y desarrollo químico y farmacéutico.

Entre las ciclodextrinas, la más utilizada es la familia 3 porque la familia a tiene una cavidad demasiado pequeña, en tanto que la familia y, a pesar de ser muy efectiva, tiene costos de fabricación muy altos.

La p-ciclodextrina (figura 3) se puede usar en el campo farmacéutico gracias a su ausencia de toxicidad cuando se administra por vía oral. En este campo, se usan a menudo gracias a su capacidad del huésped para enmascarar el sabor desagradable de algunos fármacos, para cubrir compuestos líquidos en los sólidos y, además, para mejorar el perfil de biodisponibilidad de muchos fármacos, especialmente gracias a la mayor solubilidad en agua.

Las p-ciclodextrinas naturales no se pueden utilizar para la administración parenteral porque son nefrotóxicas, sin embargo, los derivados de hidroxipropilo (HP p-CD) de estas ciclodextrinas (conocidas comercialmente como Cavasol®) y las a-ciclodextrinas se pueden utilizar para la administración parenteral porque no muestran ninguna toxicidad y permiten la formulación de fármacos totalmente insolubles en agua (figura 2).

Por el contrario, la p-ciclodextrina metilada (M p-ciclodextrina) no es adecuada para la administración parenteral, incluso la p-ciclodextrina aleatoriamente algo lipófila no permea fácilmente las membranas lipófilas, aunque interactúa más fácilmente con las membranas que los derivados de ciclodextrina hidrófilos.

La sulfobutil éter p-ciclodextrina⁷ (SBE⁷ p-CD)⁷ es otra p-ciclodextrina que se ha sintetizado más recientemente. SBE⁷ p-CD es un derivado altamente soluble en agua de p-ciclodextrina que está disponible comercialmente como Captisol®. La solubilidad en agua de SBE⁷ p-CD (~70 g/100 ml a 25 °C) es significativamente mayor que la p-ciclodextrina original (1,85 g/100 ml a 25 ° C). Ya ha sido aprobada para uso parenteral y gracias a su mayor solubilidad podría ser aún más efectivo que el HP p-CD. Por lo tanto, la SBE⁷ p-ciclodextrina podría ser una alternativa prometedora a la HP p-ciclodextrina. A continuación, en la figura 4, se representa la estructura de 3 estructuras isoméricas de SBE⁷ p-ciclodextrina.

El perfil de toxicidad de las ciclodextrinas y sus derivados se ha evaluado ampliamente9. Al administrarse por vía oral, las ciclodextrinas se consideran generalmente seguras, ya que no cruzan la barrera intestinal; sin embargo, para la misma ciclodextrina, la vía de administración puede modificar su toxicidad como se demostró para la p-ciclodextrina nativa, que presenta una toxicidad limitada después de la administración oral en animales, ya que la ingesta diaria aceptable se ha limitado a 5 mg/kg de peso corporal por el Programa Internacional de Seguridad Química (IPCS; Serie de Aditivos Alimentarios de la OMS 32), mientras que las inyecciones parenterales o subcutáneas a dosis más altas se vuelven nefrotóxicas que afectan a los túbulos proximales. El modo de eliminación de ciclodextrinas de los organismos también depende de la vía de administración. Por ejemplo, la HP p-ciclodextrina se elimina principalmente por filtración glomerular en los riñones y se excreta en la orina después de la inyección intravenosa en ratas, mientras que la administración oral se excreta principalmente a través de las heces en ratas y perros.

En resumen, todos los estudios de toxicidad han demostrado que las ciclodextrinas administradas por vía oral son prácticamente no tóxicas, debido a la falta de absorción del tracto gastrointestinal. Además, varias evaluaciones de seguridad han demostrado que la Y-ciclodextrina, la 2-hidroxipropil p-ciclodextrina, la sulfobutil éter p-ciclodextrina, la pciclodextrina sulfatada y la maltosil p-ciclodextrina parecen ser seguras incluso cuando se administran por vía parenteral8.

Modo de acción de las ciclodextrinas

En el campo farmacéutico, se están desarrollando constantemente nuevas tecnologías basadas en ciclodextrina de interés comercial que favorecen los rendimientos biológicos de las ciclodextrinas principalmente con respecto a la administración de fármacos, la seguridad biológica y la eficiencia terapéutica9. Estas nuevas ciclodextrinas se derivan principalmente de p-ciclodextrina nativa y sus propiedades dependen principalmente de su grado de sustitución (figura 5). Estos involucran los derivados de p-ciclodextrina metilados, tal como las p-ciclodextrinas metiladas aleatoriamente (RAMEp y KLEPTOSE® CRYSMEp que muestran 12,6 y cuatro grupos metilo, respectivamente), la HP-p-ciclodextrina con grupos hidroxipropilo sustituidos aleatoriamente en la molécula de p-ciclodextrina, y también la sulfobutiléter-7-p-ciclodextrina (SBE7-pcidodextrina) que actualmente se evalúan para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos y aterosclerosis. Además, las Y-ciclodextrinas han demostrado ser muy útiles en terapia, ya que no han mostrado ninguna reacción de hipersensibilidad, a diferencia de Sugammadex. Esta ciclodextrina modificada utilizada en anestesia para revertir el efecto de los fármacos bloqueadores neurovasculares ha estado implicada en la respuesta alérgica en algunos pacientes. Como agentes terapéuticos, el modo de acción de las ciclodextrinas y sus derivados puede ocurrir de dos maneras. La primera implica la acción biológica directa de las ciclodextrinas sobre las membranas celulares, mientras que la segunda es bastante indirecta usando la potencialidad de encapsulación de las ciclodextrinas como vehículos de fármacos.

La acción directa de las ciclodextrinas sobre las células consiste en extraer lípidos (colesterol y fosfolípidos), así como algunas proteínas de las membranas celulares que modifican la composición molecular de las bicapas lipídicas y, por lo tanto, sus propiedades (figura 5). Se ha descrito que la a-ciclodextrina elimina los fosfolípidos, la p-ciclodextrina extrae los fosfolípidos y el colesterol, mientras que la Y-ciclodextrina es menos selectiva a los lípidos que otras ciclodextrinas.

En la segunda, las ciclodextrinas se usan ampliamente como vehículo de administración de fármacos a través de mucosas nasales, barreras pulmonares, oculares, dérmicas, intestinales y cerebrales, ya que estas moléculas mejoran la administración y la biodisponibilidad de fármacos hidrófilos, hidrófobos y lipófilos.

Las ciclodextrinas también se han usado ampliamente para mejorar la biocompatibilidad y mejorar la biodisponibilidad, cuando se incorporan en complejos con compuestos farmacológicos activos, mejorando así la eficacia del fármaco. La combinación de ciclodextrinas y compuestos farmacológicos en complejos se ha aplicado en investigaciones para el tratamiento de la aterosclerosis y enfermedades neurodegenerativas tales como las enfermedades de Alzheimer y Parkinson. Además, las ciclodextrinas se pueden usar como un vehículo que permite la unión selectiva a biomoléculas de interés, como se informa, por ejemplo, para la detección de cristales de colesterol en aterosclerosis.

Por lo tanto, el modo de acción directa de las ciclodextrinas ha demostrado efectos en las células, promoviendo una extracción efectiva de colesterol y fosfolípidos de la balsa lipídica de las membranas celulares. El modo de acción indirecta destaca la capacidad de complejación de las ciclodextrinas que permite una eliminación aún más eficaz de los lípidos y los grupos aldehído.

Etanol

El etanol se ha utilizado, desde hace varios años, para el tratamiento de tejidos bioprotésicos, tal como cúspides protésicas aórticas, tejido pericárdico bovino o porcino, con el objetivo de mitigar el proceso de calcificación distrófica cuando se implanta a largo plazo.

El etanol se ha aplicado en tratamientos solos o asociados con otras sustancias en general después de un tratamiento de reticulación obtenido con glutaraldehído.

En lo siguiente se presenta una revisión científica sobre los diferentes tratamientos bioprotésicos de tejidos a base de Etanol (solo o combinado con otras moléculas). Se ha analizado el posible mecanismo de acción y eficacia del Etanol, como método de anticalcificación.

El pretratamiento con etanol al 80,0 % de las cúspides reticuladas con glutaraldehído extrajo casi todo el colesterol y los fosfolípidos de las muestras de cúspides10. Se ha planteado la hipótesis de que los fosfolípidos presentes en las células desvitalizadas de las bioprótesis son una fuente inicial de fósforo en la calcificación de las válvulas cardíacas debido a la hidrólisis de los fosforésteres. Otros estudios también han analizado la conexión entre el colesterol y la calcificación en las placas ateroscleróticas. Se ha demostrado que los niveles de colesterol incrementan progresivamente con la edad, correlacionándose directamente con el riesgo de enfermedad de las arterias coronarias. El colesterol también altera el tránsito de calcio a través de las membranas celulares, los niveles de calcio cistólico y la fluidez de membrana en las células del músculo liso arterial. El mecanismo por el cual el contenido de colesterol de la membrana celular se correlaciona con la calcificación intracelular permanece incompletamente entendido.

Estos datos sugieren fuertemente que los cambios provocados por el pretratamiento con etanol en la conformación de colágeno son estables y pueden ser importantes para explicar el mecanismo de anticalcificación. Este cambio conformacional puede ser responsable de la adsorción de cúspide reducida observada de lípidos o proteínas debido al pretratamiento con etanol. Esto también justifica una mayor investigación sobre las interacciones proteína-proteína y proteína-lípido con respecto al colágeno y sus funciones en la calcificación bioprotésica de la válvula cardíaca10.

Los cambios conformacionales de colágeno de cúspide inducidos por el tratamiento con etanol fueron persistentes. Además, hubo resistencia a la digestión por colagenasa. Por lo tanto, se puede plantear la hipótesis de que el efecto de anticalcificación y el cambio conformacional de colágeno provocado por el pretratamiento con etanol podrían dar como resultado una bioprótesis más duradera10.

La preincubación con etanol de bioprótesis de válvula aórtica porcina reticulada con glutaraldehído es un pretratamiento altamente eficaz para prevenir la calcificación de las cúspides de válvula aórtica porcina tanto en implantes subdérmicos de rata de 60 días como en reemplazos de válvula mitral de oveja (150 días). Se eligió etanol como agente de anticalcificación debido a su conocida interferencia en el metabolismo celular de calcio en células de línea ósea, así como en fibroblastos1112. Se ha demostrado que la presencia de etanol descompone las membranas celulares y desordena las cadenas de acilo de los fosfolípidos que afectan muchas actividades celulares13. Además, se ha demostrado que el etanol inhibe significativamente la nucleación de fosfato de calcio y las transformaciones de fase debido a sus interacciones con el agua14. En una publicación anterior15 relativa a la inhibición de etanol de la calcificación bioprotésica de cúspides de válvulas cardíacas, el pretratamiento con etanol al 80,0 % extrajo casi todos los fosfolípidos y colesterol de las cúspides reticuladas con glutaraldehído.

Para comprender el mecanismo de acción del etanol en la prevención de la calcificación de válvulas cardíacas bioprotésicas, se analizaron muestras de valvas para determinar el contenido total de lípidos y colesterol antes y después del pretratamiento.

El etanol con una concentración superior a 50,0 % fue un extractor muy eficiente tanto de colesterol como de fosfolípidos, con una extracción casi completa de ambos15 como se describe en la figura 6. Se considera que los fosfolípidos unidos a la membrana son donantes de fósforo en las etapas iniciales de mineralización de válvulas cardíacas bioprotésicas debido a la hidrólisis por fosfatasa alcalina. La eliminación completa de los fosfolípidos, que son sitios iniciales de calcificación, puede explicar parcialmente el mecanismo de acción del etanol. Sin embargo, los resultados con el tratamiento con cloroformo-metanol (2:1) demostraron que este régimen de deslipidación dio como resultado la extracción completa tanto de colesterol total como de fosfolípido (

Tabla 1).

En el modelo subdérmico de rata, la duración del implante se extendió a 60 días. Los controles se calcificaron severamente (nivel de calcio, 236 ± 6,1 |jg/mg de tejido). El pretratamiento con etanol a 80,0 % (pH 7,4 durante 24 horas) fue el más eficaz, con inhibición completa de la calcificación con los niveles de calcio comparables al tejido bioprotésico no implantado (nivel de calcio, 1,87 ± 0,29 jg/mg de tejido), mientras que el pretratamiento con etanol a 60,0 % fue parcialmente eficaz (nivel de calcio, 28,5 ± 12,0 jg/mg de tejido). Por lo tanto, se encontró que el pretratamiento con etanol a 80,0 % es la mejor condición para prevenir la calcificación de valvas en los modelos subdérmicos de ratas de 21 y 60 días.

Las bioprótesis de válvula aórtica porcina tratadas con etanol e implantadas en modelo de oveja durante 150 días mostraron una reducción significativa en la acumulación de calcio de valvas con respecto al control (valvas fijadas con glutaraldehído) como se describe en la tabla 2.

Tabla1

Por lo tanto, estos datos indican que aunque la extracción de lípidos puede desempeñar un papel en el mecanismo de acción del etanol, la extracción de lípidos por sí sola no puede explicar completamente la eficacia de anticalcificación del etanol, y el metanol puede estar alterando los otros factores que influyen en la mineralización.

Tabla 2

Las características de deformación por estrés de los tejidos tratados con etanol se evaluaron en la válvula aórtica de las cúspides de tejidos porcinos16. Este estudio compara las propiedades de deformación por estrés uniaxiales de las cúspides aórticas porcinas no tratadas con las de la cúspide tratada con glutaraldehído y aquellas de la incubación con etanol después del glutaraldehído.

Las cúspides no tratadas proporcionaron el control (C) en tanto que las cúspides tratadas con glutaraldehído (G) y las cúspides tratadas con etanol después de la fijación con glutaraldehído (G+A) representaron las muestras de prueba.

Hubo diferencia significativa entre los grupos (C), (G+A) para el parámetro carga máxima (p=0,002). Para el parámetro estrés máximo, hubo diferencia significativa entre los grupos (G+A) y ambos grupos (G) y (C), el valor de p que es 0,047 y 0,007 respectivamente. El grupo (G+A) también mostró una mayor capacidad de alargamiento por estrés, (desplazamiento máximo), en comparación con ambos grupos (G) y (C) {p=0,025 y p=0,049 respectivamente}. El grupo (G+A) también mostró una deformación máxima significativamente mayor en comparación con ambos grupos (G) y (C) {p=0,006 y p=0,027 respectivamente.

El tratamiento con etanol del tejido curtido con glutaraldehído no solo conserva la resistencia a la tracción, que se incrementa después del curtido con glutaraldehído, sino que también mejora la extensibilidad en las pruebas uniaxiales en la dirección circunferencial. Este cambio en las características físicas puede ayudar a preservar la durabilidad de las cúspides aórticas. La reducción en la propensión a calcificarse y la capacidad del tejido cúspide para alargarse con el estrés podría ayudar a prevenir la disfunción estructural. Sin embargo, sería apropiado considerar estudios de durabilidad in vivo a largo plazo de válvulas aórticas porcinas curtidas con glutaraldehído tratadas con alcohol in vivo para probar esta hipótesis.

En otro estudio, se evaluó el efecto de anticalcificación del etanol en relación con la reticulación de glutaraldehído. Los autores afirman que los alcoholes de bajo peso molecular (metanol, etanol e isopropanol) fueron eficaces en la mitigación de calcio de las cúspides de válvula aórtica porcina. El almacenamiento de tejidos en glutaraldehído después del tratamiento con etanol permitió un retorno parcial de la calcificación, lo que sugiere un papel de la interacción etanolglutaraldehído en la prevención de la calcificación del tejido. Sin embargo, cuando las cúspides porcinas se almacenaron en glutaraldehído etanólico, el efecto de anticalcificación del etanol persistió17.

En otro estudio, Carpentier, en 2001, estudió el efecto de los tratamientos con etanol, éter y surfactante en muestras de pericardio pretratadas con glutaraldehído a 0,6 %18. Se usaron etanol, éter o el surfactante Tween 80, y combinaciones de los mismos, para llevar a cabo la extracción de lípidos. Los tejidos tratados se implantaron por vía subcutánea en 50 ratas jóvenes durante 4 y 6 meses. Después de 6 meses de implantación, solo en los grupos de etanol con surfactante y éter con surfactante, el nivel de calcio fue significativamente menor que en el grupo de control. En estudios anteriores se demostró que el etanol es bastante efectivo en la extracción de fosfolípidos y que juegan un papel importante en el proceso de calcificación10. Por el contrario, los análisis mostraron que la extracción con etanol no elimina completamente los triglicéridos en el pericardio bovino, mientras que la extracción con éter eliminó totalmente los triglicéridos. El contenido de calcio de estos dos grupos, sin embargo, no fue significativamente diferente después de 6 meses de implantación, lo que implica que el papel de los triglicéridos en la deposición de calcio no es significativo. En conclusión, los tratamientos con etanol o éter solo o surfactante solo son menos eficientes que la combinación de estos tratamientos. El hecho de que la combinación de tratamientos sea más eficiente que cualquiera de los tratamientos individuales tiende a demostrar que el mecanismo de extracción y los productos extraídos por cada tratamiento son ligeramente diferentes. Como conclusión práctica de este trabajo, se podría decir que en el procedimiento utilizado actualmente para la preservación de válvula bioprotésica, podría ser beneficioso incrementar la concentración de etanol o su duración de incubación o añadir tratamiento con éter al tratamiento con surfactante.

Los pretratamientos más eficientes fueron la combinación de etanol y surfactante (contenido de calcio: 15,5 ± 6,8 |jg/mg de tejido seco después de 6 meses de implantación) o la combinación de etanol, éter y surfactante (13,1 ± 6,2 jg/mg de tejido seco) en comparación con surfactante solo (42,9 ± 12,7 jg/mg de tejido seco).

El efecto de anticalcificación del etanol es bien evidente en una serie de publicaciones científicas. A pesar de la eficacia del tratamiento con etanol tanto en las cúspides aórticas porcinas como en el tejido pericárdico, todavía estaban presentes algunas calcificaciones residuales menores y sugirieron a los investigadores la exploración de tratamientos combinados adicionales para mitigar aún más la deposición distrófica calcificada en los tejidos.

Connoly19 evaluó el post-tratamiento con borohidruro de sodio de cúspides aórticas porcinas tratadas con etanol. El pretratamiento con etanol inhibió significativamente la calcificación en comparación con los controles (13,3 /- 5,6 versus 119,2 /- 6,6 Ca jg/mg de tejido; p < 0,001). Sin embargo, la reducción de borohidruro de sodio en condiciones optimizadas combinada con pretratamiento con etanol redujo óptimamente la calcificación (1,16 /- 0,1 Ca jg/mg; p < 0,05), mientras que los niveles después del tratamiento con cianoborohidruro de sodio (23,6 /- 10,4 Ca jg/mg) no fueron significativamente diferentes a los de después de etanol solo. Ninguno de los agentes reductores fue eficaz para inhibir la calcificación sin pretratamiento con etanol.

Algunos otros autores20 adoptaron el etanol como solvente de fosfolípidos junto con otros aminoácidos para desintoxicar el tejido pericárdico. Los grupos de muestras de pericardio bovino se fijaron con 0,5 % de GA. Se usaron urazol y glutamato para neutralizar el aldehído libre y algunos disolventes (etanol con octanol u octanodiol) para reducir el contenido de fosfolípidos en el tejido pericárdico bovino. El urazol y el glutamato solos disminuyeron significativamente las concentraciones de Ca2+ y fósforo inorgánico (IP) (sin ningún tratamiento contra la calcificación, Ca2+: 277,85 ± 17,51 jg/mg; IP: 147,07 ± 8,32 jg/mg), pero cuando se usa con solventes orgánicos, las concentraciones de Ca2+ y fósforo inorgánico fueron las más bajas (Ca2+ : 0,05 ± 0,04 jg/mg; IP: 3,36 ± 0,61 jg/mg).

El propósito del estudio publicado por Kim21 fue evaluar el sinergismo sincronizado del uso de L-arginina y borohidruro de sodio (NaBH4), en comparación con etanol y L-lisina, en pericardio porcino tratado con glutaraldehído desde el punto de vista de calcificación y elasticidad tisular. El pericardio porcino se fijó en glutaraldehído al 0,625 % (7 días a temperatura ambiente después de 2 días a 4° C). Un paso intermedio de etanol (80 %; 1 día a temperatura ambiente) o L-lisina (0,1 M; 2 días a 37°C) o L-arginina (0,1 M; 2 días a 37°C) fue seguida por la finalización de la fijación de glutaraldehído. El pretratamiento con L-lisina y NaBH4 (183,8 ± 42,6 |jg/mg, p=0,804), y el pretratamiento con L-arginina y NaBH4 (163,3 ± 27,5 jg/mg, p=0,621) no inhibieron significativamente la calcificación en comparación con el control (175,5 ± 45,3 jg/mg), pero el pretratamiento con etanol y NaBH4 sí lo hizo (38,5 ± 37,3 jg/mg, p=0,003). Finalmente, el pretratamiento con NaBH4 pareció disminuir la calcificación del pericardio porcino fijado con glutaraldehído, pero solo con etanol.

Otro estudio22 se mejoró para evaluar la eficiencia del cloruro de aluminio en aislamiento o asociado con etanol para prevenir la calcificación y la reacción inflamatoria con fragmentos de pared aórtica porcina fijados en glutaraldehído e implantados subdérmicamente en ratas jóvenes. Se implantaron muestras de pared aórtica porcina en el tejido subdérmico. Los especímenes se sometieron previamente a tres métodos diferentes de tratamiento: I (glutaraldehído), II (glutaraldehído aluminio), III (glutaraldehído etanol aluminio). La espectroscopía de absorbancia atómica mostró niveles de calcio similares para ambos Grupos II y III, pero significativamente menores que en el Grupo I. El tratamiento con cloruro de aluminio inhibe la calcificación de especímenes de pared aórtica después de la implantación y reduce la reacción inflamatoria. El uso combinado de etanol con cloruro de aluminio es más eficiente para inhibir la calcificación y también para disminuir la reacción inflamatoria.

La revisión de la bibliografía analizada anteriormente indica de manera clara que el tratamiento con etanol de tejidos bioprotésicos es normalmente altamente eficaz en la prevención de la calcificación distrófica del tejido después de implantes a largo plazo en modelos animales. La reducción de contenido de calcio tisular versus el control siempre es significativa cuando los biomateriales se pretratan con etanol y se reticulan con glutaraldehído.

El etanol es eficaz para solubilizar y extraer la balsa lipídica (colesterol y fosfolípidos) de las membranas celulares identificadas como las principales responsables de desencadenar la calcificación. La mejor eficiencia en términos de extracción de lípidos se obtiene a concentraciones de 80 %, pero ya es visible una buena reducción de la calcificación tisular con concentraciones de 50 %15.

La aplicación de tratamientos de reticulación de tejido alternativos (triglicidilamina, genipina, neomicina) o tratamientos posteriores, tales como urazol, glutamato, borohidruro de sodio, cloruro de aluminio u otros, están reduciendo adicionalmente la propensión a la calcificación solo cuando se asocian con etanol.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere en general a un uso novedoso y original de ciclodextrina en el tratamiento de tejidos bioprotésicos. La presente invención se refiere a un método para tratar tejidos bioprotésicos para prótesis cardiovasculares; el método que comprende el paso de eliminar fosfolípidos de los tejidos bioprotésicos al usar una ciclodextrina que es capaz por sí misma de eliminar fosfolípidos de tejidos bioprotésicos.

El uso de una ciclodextrina en este tratamiento proporciona a los tejidos bioprotésicos una durabilidad mecánica y biológica a largo plazo, después del implante. Estas propiedades son especialmente críticas para las bioprótesis de válvulas cardíacas.

Las ciclodextrinas pertenecen a una gran familia de moléculas, pero para la presente invención las más acreditadas son las de la familia p. Las p-ciclodextrinas funcionalizadas y en particular la HP p-ciclodextrina y las SBE p-ciclodextrinas se han aprobado para uso parenteral. Por lo tanto, están expresando toda la acción química deseada sin ningún daño para los órganos excretores, incluso si están presentes en trazas.

Ventajosamente, la ciclodextrina se usa en combinación con etanol.

El tratamiento de tejido basado en etanol en concentración acuosa, superior a 50 %, ha demostrado ser altamente eficaz en la extracción de los fosfolípidos. La eficacia del etanol está estrechamente relacionada con la reticulación de glutaraldehído de tejidos bioprotésicos. El mecanismo no está claro, pero el tratamiento con etanol parece ser más efectivo cuando se aplica después de un proceso de reticulación basado en glutaraldehído.

La acción de la ciclodextrina se puede expresar como directa, con extracción primaria de moléculas lipídicas, e indirecta con complejación de las moléculas lipídicas ya extraídas. Es en este segundo modo de acción que las ciclodextrinas pueden complejar los fosfolípidos ya solubilizados por etanol.

En general, la acción de las ciclodextrinas, cuando se aplican a tejidos biológicos, se puede explicar como una interacción estérica o un enlace covalente débil entre su cavidad hidrófoba y las moléculas lipídicas. En otros términos, se trata de un enlace covalente débil de ciclodextrinas y moléculas lipídicas sin que ocurra ninguna reacción química.

El uso de un derivado específico de ciclodextrina para el tratamiento de tejidos biológicos se divulga en la solicitud de patente US2002/137024. Esta técnica anterior enseña que los polianiones sulfonados y sulfatados son capaces de bloquear los sitios de nucleación de calcio en tejidos biológicos usados para dispositivos protésicos. El mecanismo de acción de estos productos químicos no se describe, pero se puede deducir inequívocamente de la enseñanza de este documento que los grupos funcionales sulfonados y/o sulfatados son responsables del bloqueo de los sitios de nucleación de calcio. De hecho, los ejemplos presentados en el documento US2002/137024 se refieren a moléculas completamente diferentes, que tienen en común solo los grupos sulfonato/sulfato. Algunos ejemplos de los polianiones mencionados en el documento US2002/137024 son ciclodextrinas sulfatadas que son solo uno de ellos. Es posible inferir que los grupos sulfonato/sulfato son capaces de bloquear los sitios de nucleación de calcio, presumiblemente debido a la afinidad entre los aniones calcio y sulfato. En otras palabras, una especie de acción competitiva de aniones sulfato/sulfonato contra los grupos fosfato de los fosfolípidos, que se identifican claramente en US2002/137024 como sitios de nucleación de calcio a pesar de que ya se conocen bien en la técnica anterior.

En general, las ciclodextrinas no contienen grupos sulfonato o sulfato funcionales. Se debe subrayar que las ciclodextrinas son habitualmente moléculas neutras y no compuestos iónicos. La ciclodextrina sulfatada es solo un derivado de la gran clase de ciclodextrinas y la funcionalización está dirigida a obtener moléculas más solubles o tolerables para inyección i.v. Por lo tanto, no hay nada en US2002/137024 que sugiera el uso de la propia ciclodextrina como agentes de bloqueo para sitios de nucleación de calcio. De hecho, US 2002/137024 enseña incluso el uso de ciclodextrina por sí misma como agente de bloqueo para sitios de nucleación de calcio.

En la presente invención, la ciclodextrina seleccionada actúa de una manera completamente diferente con respecto a lo descrito en el documento US2002/137024. La ciclodextrina por sí misma está eliminando fosfolípidos del tejido gracias a su cavidad hidrófoba, que secuestraría las cadenas grasas de fosfolípidos.

El etanol y la ciclodextrina se pueden usar simultáneamente o por separado, en cualquier orden.

Los tejidos bioprotésicos (cúspides valvulares nativas, tejidos pericárdicos bovinos o porcinos) se seleccionan por ausencia de defectos y espesor. Los parches o cúspides seleccionados se someten a un proceso de reticulación destinado a estabilizar el colágeno para evitar cualquier respuesta inmunológica o de tejido de cuerpo extraño. El proceso de reticulación se puede llevar a cabo con diferentes moléculas, pero típicamente se usa glutaraldehído a una concentración que varía entre 0,1 % y 1 % durante un período de 12 h a 48 h o más.

Preferiblemente, el tratamiento de deslipidación combinado (figura 7) se realiza combinando etanol a una concentración de entre 35 % y 80 % solubilizado en una solución amortiguada a pH 7,4 con p-ciclodextrina 10 mM a 200 mM durante 2 h a 24 h a una temperatura que varía entre 25 °C y 40 °C.

Después del tratamiento de deslipidación, los parches se montan en montajes semiacabados o terminados y luego se esterilizan químicamente con una solución a base de aldehído a la que finalmente se añaden moléculas de alcohol de cadena corta.

Los dispositivos terminados luego se almacenan en una solución compuesta por aldehído a una concentración de 0,1 % a 1 % y eventualmente se añaden moléculas de alcohol de cadena corta en una concentración de 10 % a 50 %.

Con el fin de añadir un proceso de desintoxicación de tejido, destinado a eliminar las moléculas libres de aldehído de la bioprótesis antes del implante, se realiza un procedimiento de enjuague previo a la implantación.

Este enjuague previo a la implantación se realiza con tres partes alícuotas de 500 ml de una solución de p-ciclodextrinas a una concentración de 10 mM a 200 mM a una temperatura de 15 °C a 30 °C.

En otra realización, la extracción de fosfolípidos se puede realizar, después de la reticulación tisular, de manera disociada en dos fases (figura 8). Primero se realiza el tratamiento con etanol seguido de la p-ciclodextrina. Ambos tratamientos se realizaron a las mismas concentraciones y condiciones descritas en la figura 7.

La extracción de fosfolípidos, como se describe en la figura 8, se puede realizar de manera invertida anticipando la exposición a p-ciclodextrina seguido de tratamiento con etanol a las mismas concentraciones y condiciones.

El tratamiento combinado de etanol y p-ciclodextrina se puede realizar anticipando el tratamiento con p-ciclodextrina directamente en el tejido bioprotésico antes del procedimiento de reticulación (figura 9) seguido de un tratamiento con una solución de etanol. La concentración de etanol y p-ciclodextrina puede ser la misma que se describe en la Figura 7. Este tratamiento disociado se puede aplicar en orden invertido si es necesario.

La justificación para anticipar el tratamiento con p-ciclodextrina, antes del procedimiento de reticulación (figura 9), se basa en el modo activo directo de las ciclodextrinas para deslipidar directamente los tejidos bioprotésicos. Esta es la misma capacidad de extracción activa expresada por las ciclodextrinas observadas en experimentos donde estas moléculas pudieron extraer colesterol y otros lípidos de las placas ateroscleróticas en los vasos arteriales (la FDA aprobó un tratamiento con ciclodextrinas como fármaco huérfano en una enfermedad pediátrica rara donde infantes muestran una concentración plasmática anormalmente alta de colesterol con placas ateroscleróticas a los 2 - 3 años de edad).

En otra realización después de la extracción de fosfolípidos como se describe en los tratamientos previos con etanol y ciclodextrinas, el proceso podría incluir un proceso de desintoxicación adicional, basado en ciclodextrinas, destinado a eliminar, de manera efectiva, las moléculas de aldehído residuales (figura 10). Se requiere el objetivo de esta variación de tratamiento químico para almacenar la bioprótesis en una solución de almacenamiento bacteriostática libre de aldehídos. Como se describió anteriormente, es bastante importante la eliminación de aldehídos de la solución de almacenamiento, ya que se ha demostrado que el almacenamiento de la bioprótesis en glutaraldehído podría anular parcialmente el efecto de anticalcificación positivo dado por el tratamiento con etanol. Esta es la razón por la cual en las realizaciones anteriores los medios de almacenamiento, descritos en las figuras 7 a 9, donde se basan en una solución de glutaraldehído añadida con una cierta cantidad de alcoholes de cadena corta.

Un paso importante hacia adelante en el tratamiento de tejido bioprotésico se representa por la deshidratación de tejido en asociación con una esterilización de óxido de etileno. Esto se hace con el fin de almacenar más fácilmente las bioprótesis evitando la esterilización química y su manejo, especialmente cuando se deben colapsar y usar en procedimientos de transcatéter.

Las realizaciones de tratamiento anteriores presentadas previamente, como posibles variaciones, se pueden asociar al procedimiento de deshidratación de tejido. Como por ejemplo en la figura 11, después de la deslipidación, se realiza un proceso de desintoxicación con p-ciclodextrina con el objetivo de eliminar las moléculas de aldehído del tejido. Cuando se completa la desintoxicación, se puede iniciar un procedimiento de deshidratación de tejido. Este tratamiento se basa en una eliminación progresiva de agua del tejido bioprotésico obtenido con polietilenglicol (por ejemplo, PM de 100 a 800) en solución acuosa que varía de 80 % a 90 %. El tratamiento se realiza a una temperatura entre 20 °C y 50 °C durante 12 h a 48 h. Con el fin de obtener una deshidratación más eficaz, se pueden añadir alcoholes de cadena corta a una concentración de 10 % a 20 %.

El proceso de deshidratación se completa con un secado de tejido durante varias horas en un entorno limpio. Permite un almacenamiento final de las bioprótesis en un envase seco que se somete a esterilización por medio de óxido de etileno. Todos los procesos de tratamiento, descritos anteriormente, se pueden realizar en montajes semiacabados o directamente en las bioprótesis montadas finales. En este caso, los procesos se pueden aplicar como un tratamiento protésico individual.

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Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar tejidos bioprotésicos para prótesis cardiovasculares; el método que comprende el paso de eliminar fosfolípidos de los tejidos bioprotésicos al usar una ciclodextrina que es capaz por sí misma de eliminar fosfolípidos de tejidos bioprotésicos.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el paso de eliminar fosfolípidos que comprende usar la ciclodextrina de modo que las cadenas de grasa de fosfolípidos se secuestren por una cavidad hidrófoba de la ciclodextrina.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde la ciclodextrina es una p-ciclodextrina.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, 2 o 3 para reducir la calcificación de los tejidos bioprotésicos.

5. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores para reducir la toxicidad residual de tejidos bioprotésicos con el fin de almacenar la bioprótesis en solución libre de aldehídos.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en asociación con polietilenglicol para lograr una deshidratación de tejido y óxido de etileno para esterilización.

7. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un paso de enjuague donde se usa ciclodextrina para eliminar las moléculas de aldehído libres restantes del tejido.

8. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la ciclodextrina se selecciona del siguiente grupo: Y-ciclodextrina, 2-hidroxipropil p-ciclodextrina, sulfobutil éter p-ciclodextrina, maltosil p-ciclodextrina.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además el uso de etanol.

10. Método de acuerdo con la reivindicación 9, donde se usan simultáneamente etanol y la ciclodextrina.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 caracterizado por el uso sucesivo de etanol seguido de la ciclodextrina.

12. Método de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 caracterizado por el uso sucesivo de la ciclodextrina seguido de etanol.

13. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un proceso de reticulación.

14. Método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el proceso de reticulación ocurre después del uso de ciclodextrina.

15. Método de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende un segundo uso de ciclodextrina, que se produce después del proceso de reticulación.

16. Método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el proceso de reticulación ocurre antes del uso de ciclodextrina.