BR112019017295A2

BR112019017295A2 - Produto e método para o tratamento de tecidos bioprotéticos

Info

Publication number: BR112019017295A2
Application number: BR112019017295-5A
Authority: BR
Inventors: Pasquino Enrico; Scorsin Marcio
Original assignee: Epygon
Priority date: 2017-02-22
Filing date: 2017-11-30
Publication date: 2020-03-31
Also published as: RU2019127523A; ES2936112T3; SG11201907695WA; EP3585451B1; CN110494171A; RU2019127523A3; WO2018153525A1; CA3054091A1; AU2017400910B2; AU2017400910A1; JP2020508193A; US20210213169A1; EP3366324A1; EP3585451A1; US11660375B2; KR20190121326A; IL268865A

Abstract

a presente invenção refere-se ao tratamento de tecidos bioprotéticos com uma ciclodextrina, preferivelmente em associação com etanol.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ’’PRODUTO E MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE TECIDOS BIOPROTÉTICOS”.

Campo da invenção [001 ] A presente invenção refere-se ao tratamento de tecidos bioprotéticos, em particular de tecidos biológicos que são utilizados em biopróteses cardiovasculares.

Estado da técnica [002] A calcificação é uma das principais causas da insuficiência de válvulas cardíacas bioprotéticas derivadas do pericárdio bovino prétratado com glutaraldeído ou válvulas aórticas suínas. 1--3. Tais prétratamentos são descritos, por exemplo, na patente US 5.931.969 (Baxter). O mecanismo deste tipo de calcificação patológica é incompletamente compreendido. Em modelos animais, mostrou-se que os sítios de nucleação de cálcio iniciais são membranas celulares, o núcleo e as organelas intracelulares, tais como a mitocôndria de células desvitalizadas. Com o aumento da duração do implante, os depósitos calcificados associados à célula aumentam em tamanho e número. A calcificação direta de colágeno em cúspides e a calcificação de elastina na parede aórtica subsequentemente ocorrem. Vários fatores do hospedeiro, tais como a idade jovem de um receptor, e fatores de implante, tais como a fixação de glutaraldeído, também agravam os eventos de calcificação.

[003] Os tecidos biológicos são atualmente utilizados de forma ampla para a fabricação de biopróteses, principalmente no campo cardiovascular, para implantes de longo prazo. Tipicamente, os tecidos biológicos utilizados para biopróteses cardiovasculares são representados por xenoenxertos (por exemplo, válvulas nativas, sacos pericárdicos, vasos sanguíneos, tendões, etc.) principalmente originados de tecidos bovinos ou suínos. Estes tecidos biológicos, antes de serem

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2/25 utilizados para a fabricação de biopróteses e depois disso implantados devem ser quimicamente tratados a fim de evitar ou mitigar qualquer corpo estranho ou resposta imunológica do tecido.

[004] Tipicamente neste campo de pesquisa, os tecidos biológicos são quimicamente estabilizados por meio de uma reação química denominada reticulação direcionada para a ligação das fibras de colágeno e elastina entre si e estabilização da matriz extracelular. O tratamento de reticulação também possui a vantagem de aumentar as propriedades mecânicas dos tecidos de modo a conceder a sua durabilidade a longo prazo necessária. Este último aspecto é de interesse particular para os tecidos pericárdicos ou para as cúspides de válvulas animais nativas utilizadas para montar biopróteses de válvula cardíaca que substituem as válvulas humanas doentes mitrais, tricúspides ou pulmonares.

[005] A reação química de reticulação tem sido assunto de muitos estudos desde os últimos 50 anos. Vários métodos que utilizam diferentes moléculas têm sido aplicados, mas o que hoje em dia ainda está em uso e amplamente aplicado pelo fabricante de válvula cardíaca é o Glutaraldeído.

[006] No entanto, a reação de reticulação ou fixação de Glutaraldeído promove a calcificação distrófica por causa do processo químico entre grupos de aldeído livres de glutaraldeído, fosfolipídios, ácidos graxos e colesterol e antigenicidade residual dos tecidos biológicos¹·²’³. Esforços consideráveis durante muitos anos através de pesquisas básicas foram direcionados para o desenvolvimento de um processo de tratamento de tecido para prevenir a calcificação em tecido de xenoenxerto fixado por glutaraldeído. As estratégias principais de anticalcificação são direcionadas para extrair a lipídeos ou para neutralizar resíduos tóxicos de aldeído⁵. Os xenoenxertos fixados com glutaraldeído possuem uma rejeição celular/humoral e calcificam de forma secundá

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3/25 ria³. A calcificação da valvula de tecido também é iniciada principalmente dentro de células residuais que foram desvitalizadas¹.

Ciclodextrinas

Aspectos Estruturais de Ciclodextrinas [007] As Ciclodextrinas são oligossacarídeos naturais cíclicos constituídos por 6, 7 ou 8 monômeros de D-(+) Glicopiranose unida juntamente com uma ligação de o, 1-4 glicosidal e obstruídos, resultando em uma forma cônico-toroidal (Figura 1). As três formas mais comuns são o-CD (6 unidades), β-CD (7 unidades) e γ-CD (8 unidades).

[008] Estas macromoiécuias, graças à formação de ligações de hidrogênio intramolecular, assumem uma estrutura rígida tridimensional do tipo toroidal, com uma superfície externa contendo grupos de CH2OH e uma cavidade interna com características hidrofóbicas. Esta última possui dimensões que dependem do número de unidades que constituem a Ciclodextrina⁶.

[009] A presença da cavidade juntamente com a solubilidade em água, que deriva das funcionalidades alcoólicas hidrófilas, confere às Ciclodextrinas a capacidade de complexação em soluções aquosas.

[0010] Na temperatura ambiente, as Ciclodextrinas possuem 0 aspecto de um pó branco cristalino, inodoro com um sabor doce suave.

[0011] A estrutura tridimensional restringe os grupos de hidroxila nas bordas externas, enquanto que na cavidade estão presentes apenas as ligações de hidrogênio e oxigênio. Esta condição cria uma característica hidrofóbica da cavidade central enquanto que a superfície externa é hidrófila. Deste modo, as Ciclodextrinas adquirem a possibilidade de hospedar moléculas hidrofóbicas dentro da cavidade e serem, ao mesmo tempo, solúveis em água. Ao contrário, os grupos de hidroxila presentes na superfície externa são capazes de ligar-se com grupos de aideído eventualmente presentes na solução.

[0012] Isto explica a capacidade das Ciclodextrinas de aumentar a

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4/25 solubilidade em água de substâncias hidrofóbicas. Quando uma molécula de polaridade e dimensão apropriadas é acomodada dentro da cavidade interna da ciclodextrina, cria-se um complexo de inclusão supramolecular. A força de impulsão que gera a inclusão envolve várias contribuições tais como ajuste esférico, efeitos hidrofóbicos, interações de van der Waals, interações eletrostáticas e ligação de hidrogênio. As substâncias acomodadas na cavidade das ciclodextrinas são denominadas convidadas, enquanto que as ciclodextrinas são denominadas hospedeiras.

[0013] A segunda vantagem da formação de complexo de inclusão consiste em grandemente modificar as propriedades da molécula de interesse (mais precisamente fármacos em nosso caso) de muitas maneiras, tais como melhorar a estabilidade do fármaco, a biodisponibilidade, administração oral e a interação medicamentosa com membranas ou células biológicas. Esta última vantagem pode explicar facilmente a razão pela qual as ciclodextrinas têm atraído tanta atenção e têm sido comercializadas em todo o mundo em muitas áreas industriais de alimento, cosmética e engenharia ambiental para a produção e desenvolvimento de produtos químicos e farmacêuticos.

[0014] Entre as ciclodextrinas, a mais utilizada é a família β porque a família α possui uma cavidade muito pequena, enquanto que a família γ a despeito de ser muito eficaz, tem custos de fabricação muito altos.

[0015] A β-Ciclodextrina (Figura 3) pode ser utilizada no campo farmacêutico graças à sua ausência de toxicidade quando administrada por via oral. Neste campo, muitas vezes são utilizadas graças à sua capacidade de hospedeiro para mascarar o aroma desagradável de alguns fármacos, para converter compostos líquidos em sólidos e, além disso, melhorar o perfil de biodisponibiiidade de muitos fármacos, especiaimente graças à soiubilidade aumentada em água.

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5/25 [0016] As β-Ciclodextrinas naturais não podem ser utilizadas para administração parenteral porque elas são nefrotóxicas, no entanto, os derivados de hidroxipropila (HP β-CD) destas ciclodextrinas (comercialmente conhecidos como Cavasol®) e as α-Ciclodextrinas podem ser utilizadas para administração parenteral porque elas não apresentam qualquer toxicidade e permitem a formulação de fármacos totalmente insolúveis em água (Figura 2).

[0017] Ao contrário, a β-Ciclodextrina Metilada (M β-Ciclodextrina) não é adequada para administração parenteral, mesmo que a Μ βCiclodextrina aleatoriamente um pouco iipofílica não permeie facilmente com as membranas lipofílicas, embora ela interaja mais facilmente com membranas do que com os derivados de ciclodextrina hidrófilos.

[0018] A β-Ciclodextrina de Éter? Sulfobutílico (SBE? β-CD)⁷ é outra β-Ciclodextrina que foi mais recentemente sintetizada. A SBE? βCD é um derivado altamente solúvel em água de β-Ciclodextrina que é comercialmente disponível como Captisol®. A solubilidade em água de SBE? β-CD (-~70g/100 ml a 25°C) é significativamente maior do que a β-Cidodextrina de origem (1,85 g/100 ml a 25°C). Eia já foi aprovada para uso parenteral e graças à sua maior solubilidade poder ser ainda mais eficaz do que a HP β-CD. Portanto, a SBE? β-Ciclodextrina pode ser uma alternativa promissora para a HP β-Ciclodextrina. Aqui abaixo na Figura 4, a estrutura das 3 estruturas isoméricas da SBE? βCiclodextrina são representadas.

[0019] O perfil de toxicidade das Ciclodextrinas e derivados tem sido extensivamente avaliado⁹. Quando administradas por via oral, as Ciclodextrinas são geralmente consideradas seguras quando elas não cruzam a barreira intestinal, no entanto, para a mesma Ciclodextrina, a via de administração pode modificar a sua toxicidade conforme demonstrado para a β-Ciciodextrina nativa, que apresenta uma toxicidade limitada após a administração oral em animais, visto que a ingestão

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6/25 diária aceitável foi limitada a 5 mg/kg de peso corporal pelo International Program on Chemical Safety (IPCS; WHO Food Additives Series 32), enquanto que as injeções parenteraís ou subcutâneas em doses mais elevadas tornam-se nefrotóxicas que afetam os túbulos proximais. O modo de depuração das Ciclodextrinas dos organismos também depende da via de administração. Por exemplo, a HP βCiclodextrina é eliminada principalmente através da filtração glomerular nos rins e excretada na urina após a injeção intravenosa em ratos, enquanto que a administração oral é principalmente excretada através das fezes em ratos e cães.

[0020] Em resumo, todos os estudos de toxicidade demonstraram que as Ciclodextrinas administradas por via oral são praticamente atóxicas, devido à falta de absorção do trato gastrintestinal. Além disso, várias avaliações de segurança mostraram que a y-Cíclodextrina, 2hidroxipropil β-Ciclodextrina, β-Ciclodextrina de Éter Sulfobutílico, βCiclodextrina Sulfatada e Maltosil β-Ciclodextrina parecem ser seguras mesmo quando administradas por via parenteral⁸.

Modo de ação das Ciclodextrinas [0021] No campo farmacêutico, novas tecnologias à base de Ciciodextrina de interesse comercial estão constantemente sendo desenvolvidas favorecendo os desempenhos biológicos das ciclodextrinas principalmente em relação à liberação de fármaco, segurança biológica e eficiência terapêutica⁹. Estas novas Ciclodextrinas são principalmente derivadas de β-Ciclodextrina nativa e suas propriedades dependem principalmente do seu grau de substituição (Figura 5). Estas envolvem os derivados de β-Ciclodextrina metilados tais como as β~ Ciclodextrinas aleatoriamente metiladas (RAMEp e KLEPTOSE® CRYSMEp que apresentam 12,6 e quatro grupos de metila, respectivamente), a ΗΡ-β-Ciclodextrina com grupos de hidroxipropila aleatoriamente substituídos na molécula de β-ciclodextrina e também a 7-β

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Ciclodextrina de éter sulfobutíiico (SBE7-p-Ciclodextrina) que são atualmente avaliados para o tratamento de distúrbios neurodegenerativos e aterosclerose. Adicionalmente, as γ-Ciclodextrinas provaram ser muito úteis na terapia, já que elas não apresentaram qualquer reação de hipersensibilidade, ao contrário da Sugammadex. Esta Ciclodextrina modificada utilizada em anestesia para reverter o efeito de fármacos de bloqueio neurovascular foi envolvida na resposta alérgica em alguns pacientes. Como agentes terapêuticos, o modo de ação das Ciclodextrinas e seus derivados pode ocorrer de duas maneiras. O primeiro implica na ação biológica direta das Ciclodextrinas nas membranas celulares, enquanto que o segundo é um tanto indireto utilizando a potencialidade de encapsulação das Ciclodextrinas como veículos de fármacos.

[0022] A ação direta das Ciclodextrinas sobre as células consiste na extração de lipídeos (colesterol e fosfolipídios) assim como algumas proteínas das membranas celulares que modificam a composição molecular das bicamadas Hpídicas e assim as suas propriedades (Figura 5). Foi descrito que a o-Ciclodextrina remove fosfolipídios, a βCiclodextrina extrai fosfolipídios e colesterol, enquanto que a yCiclodextrina é menos seletiva a lipídeo do que as outras Ciclodextrinas.

[0023] No segundo modo as Ciclodextrinas são amplamente utilizadas como veículos de liberação de fármacos através das mucosas nasal, barreiras pulmonares, oculares, dérmicas, intestinais e cerebrais, já que estas moléculas melhoram a liberação e bíodisponibilidade de fármacos hidrófilos, hidrofóbicos assim como lipofílicos.

[0024] As ciclodextrinas também têm sido extensivamente utilizadas para melhorar a biocompatibilidade e a biodisponibilidade aumentada, quando incorporadas em complexos com compostos de fármaco ativos, aumentando assim a eficácia do fármaco. A combinação de Ci

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8/25 clodextrinas e compostos de fármaco em complexos tem sido aplicada em pesquisas para o tratamento de aterosclerose e doenças neurodegenerativas, tais como as doenças de Alzheimer e de Parkinson. Além disso, as Ciclodextrinas podem ser utilizadas como um veículo que permite a ligação seletiva nas biomoléculas de interesse, conforme relatado, por exemplo, para a detecção de cristais de colesterol na aterosclerose.

[0025] Portanto, o modo de ação direta das Ciclodextrinas provou ter efeitos sobre as células, promovendo assim uma extração eficaz de colesterol e fosfolipídios a partir da grande quantidade de lipídeos das membranas celulares. O modo de ação indireta realça a capacidade de complexação das Ciclodextrinas permitindo assim uma remoção ainda mais eficaz de lipídeos e grupos aldeído.

Etanol [0026] O etanol tem sido utilizado desde vários anos para o tratamento de tecidos bioprotétícos, tais como as cúspides protéticas aórtícas, tecido pericárdico bovino ou suíno, com o objetivo de mitigar o processo de calcificação distrófica quando implantado a longo prazo.

[0027] O etanol foi aplicado em tratamentos isoladamente ou associados com outras substâncias em geral após um tratamento de re~ ticulação obtido com Glutaraldeído.

[0028] A seguir uma revisão científica sobre os diferentes tratamentos de tecido bioprotético com base em etanol (isoladamente ou combinado com outras moléculas) é apresentada. O possível mecanismo de ação e eficácia do etanol, como método de anticalcificação, foi analisado.

[0029] O pré-tratamento de 80,0% de etanol das cúspides reticuladas com Glutaraldeído extraiu quase todo o colesterol e os fosfolipídios das amostras de cúspide¹⁰. Foi admitida a hipótese de que os fosfolipídios presentes nas células desvitalizadas de blopróteses são uma

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9/25 fonte inicial de fósforo na caicificação da válvula cardíaca devido à hidrólise de fosforoéster. Outros estudos também analisaram a conexão entre colesterol e caicificação nas placas ateroscleróticas. Foi mostrado que os níveis de colesterol aumentam progressivamente com a idade, que se correlaciona diretamente com o risco de doença da artéria coronária. O colesterol também altera o trânsito de cálcio através das membranas celulares, níveis de cálcio cistólico e fluidez da membrana nas células do músculo liso arterial. O mecanismo pelo qual o teor de colesterol da membrana celular se correlaciona com a caicificação intracelular permanece incompletamente compreendido.

[0030] Estes dados sugerem fortemente que as mudanças efetuadas pelo pré-tratamento com etanol na conformação de colágeno são estáveis e podem ser importantes na explicação do mecanismo de anticalcificação. Tal alteração conformacional pode ser responsável pela adsorção cuspidal reduzida observada de iipídeos ou proteínas devido ao pré-tratamento com etanol. Isto também garante uma pesquisa adicional sobre as interações proteína-proteína e proteína-lipídio com relação ao colágeno e seus papéis na caicificação da válvula cardíaca bioprotética¹⁰.

[0031] As alterações conformacionais de colágeno cuspidal induzidas pelo tratamento com etanol foram persistentes. Além disso, houve resistência à digestão pela colagenase. Portanto, pode ser admitida a hipótese de que o efeito de anticalcificação e a alteração conformacional de colágeno efetuados pelo pré-tratamento com etanol podem resultar em uma bioprótese mais durável¹⁰.

[0032] A pré-incubação de etanol das biopróteses de válvula aórtica suína reticulada com glutaraldeído é um pré-tratamento altamente eficaz para a prevenção da caicificação das cúspides de válvula aórtica suína tanto em implantes subdérmicos de rato de 60 dias quanto em substituições da válvula mitral de ovelha (150 dias). O etanol foi

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10/25 selecionado como um agente anticalcificação devido à sua interferência conhecida no metabolismo celular de cálcio em células de linhagem óssea assim como em fibroblastos¹¹·¹². A presença de etanol mostrou-se quebrar as membranas celulares e as cadeias de acila desordenadas de fosfolipídeos que afetam muitas atividades celulares¹³. Além disso, o etanol mostrou-se inibir significativamente as transformações de nucleação e fase do fosfato de cálcio devido às suas interações com água¹⁴. Em uma publicação anterior¹⁵ com referência á inibição de etanol da calcificação de cúspide da válvula cardíaca bioprotética, o pré-tratamento de etanol a 80% extraiu quase todos os fosfolipídios e colesterol das cúspides reticuladas por glutaraldeído.

[0033] Para entender o mecanismo de ação do etanol na prevenção da calcificação de válvulas cardíacas bioprotéticas, as amostras de cúspide foram analisadas com relação ao teor total de lipídeo e colesterol antes e após o pré-tratamento.

[0034] Etanol com concentração maior do que 50,0% foi um extrator muito eficiente tanto de colesterol quanto de fosfolipídios, com extração quase completa de ambos os 15 como descrito na Figura 6. Os fosfolipídios ligados à membrana são considerados de serem doadores de fósforo nos estágios iniciais de mineralização das válvulas cardíacas bioprotéticas por causa da hidrólise por fosfatase alcalina. A remoção completa de fosfolipídeos, que são sítios iniciais de calcificação, pode explicar parcialmente o mecanismo de ação do etanol. No entanto, os resultados com o tratamento de clorofórmio-metanol (2:1) demonstraram que este regime de delipidação resultou na extração completa tanto do colesterol total quanto do fosfolipídeo (Tabela 1).

[0035] No modelo subdérmico de rato a duração do implante foi estendida para 60 dias. Os controles severamente calcificados (nível de cálcio, 236 ± 6,1 pg/mg de tecido). O pré-tratamento com etanol a 80,0% (pH 7,4 durante 24 horas) foi o mais eficaz, com inibição com

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11/25 pleta da calcificação com os níveis de cálcio comparáveis ao tecido bioprotético não implantado (nível de cálcio, 1,87 ± 0,29 pg/mg de tecido), enquanto que o pré-tratamento com etanol a 60,0% foi parcialmente eficaz (nível de cálcio, 28,5 ± 12,0 pg/mg de tecido) Portanto, o pré-tratamento com etanol a 80,0% foi observado de ser a melhor condição para prevenir a calcificação da cúspide nos modelos subdérmicos de rato tanto de 21 quanto de 60 dias.

[0036] As biopróteses de válvula aórtíca suína tratadas com etanol e implantadas em modelo de ovelha durante 150 dias apresentaram uma redução significativa no acúmulo de cálcio da cúspide com relação ao controle (cúspides fixadas com Glutaraldeído) conforme descrito na Tabela 2.

	Colesterel	Fosfolipídios
Controle	13,3 ±0,4	17,2 ±0,8
Etanol a 40%	13,9 ±0,7	16,5± 1,5
Etanol a 60%	0,30 ±0,05	4,93 ±1,9
Etanol a 80%	0,14 ±0,02	1,08 ± 0,1

Tabela 1 [0037] Assim, estes dados indicam que embora a extração de lipídeo possa desempenhar uma parte no mecanismo de ação do etanol, a extração de lipídeo isoladamente não pode explicar completamente a eficácia de anticalcificação do etanol, e o metanol pode estar alterando os outros fatores que influenciam a mineralização. Tabela 1.

Grupo	liillllllllllllll^
Controle	32,51 ±11,46*
Tratamento com etanol a 80%	5,22 ±2,94*
Não implantado	2,80 ±0,70

Tabela 2

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12/25 [0038] As características de tensão por estresse dos tecidos tratados com Etanol foram avaliadas na válvula aórtica de cúspides de tecidos suínos¹⁶. Este estudo compara as propriedades de tensão por estresse uniaxial das cúspides aórticas suínas não tratadas com aquelas das cúspides tratadas com glutaraldeído e aquelas da incubação com etanol após o glutaraldeído.

[0039] As cúspides não tratadas forneceram o controle (C) enquanto que as cúspides tratadas com glutaraldeído (G) e as cúspides tratadas com etanol após a fixação de glutaraldeído (G + A) representaram as amostras de teste.

[0040] Houve diferença significativa entre os grupos (C), (G + A) com relação à carga máxima de parâmetro (p ··· 0,002). Para a tensão máxima do parâmetro, houve diferença significativa entre os grupos (G + A) e ambos os grupos (G) e (C), o valor p sendo de 0,047 e 0,007, respectivamente. O grupo (G +A) também mostrou capacidade aumentada de se alongar em estresse (deslocamento máximo), em comparação com ambos os grupos (G) e (C) {p = 0,025 e p ™ 0,049 respectivamente}. O grupo (G + A) também mostrou uma tensão máxima significativamente mais elevada quando comparado com ambos os grupos (G) e (C) {p “ 0,006 e p = 0,027 respectivamente}.

[0041] O tratamento com etanol de tecido curtido com glutaraldeído não apenas preserva a força de tração, que é aumentada após o curtimento de glutaraldeído, mas também melhora a capacidade de extensão no teste uniaxial na direção circunferencial. Esta mudança nas características físicas pode ajudar na preservação da durabilidade das cúspides aórticas. A redução na capacidade de propensão de calcificar e na capacidade do tecido de cuspida! em prolongar sobre tensão pode ajudar na prevenção da disfunção estrutural. No entanto, seria apropriado considerar os estudos de durabilidade in vivo de longo prazo das válvulas aórticas suínas curtidas com glutaraldeído tratadas

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13/25 com álcool in vivo para testar esta hipótese.

[0042] Em outro estudo, o efeito anticalcificação de etanoi em conexão com a reticulação de glutaraldeído foi avaliado. Os autores afirmam que os álcoois de baixo peso molecular (metanol, etanoi e isopropanol) foram eficazes na mitigação de cálcio das cúspides de válvulas aórticas suínas. O armazenamento de tecidos em glutaraldeído após o tratamento com etanoi permitiu um retorno parcial da calcificação sugerindo um papel para a interação de etanol-glutaraldeído na prevenção da calcificação de tecido. Entretanto, quando as cúspides suínas foram armazenadas em glutaraldeído etanólico, o efeito anticalcificação do etanoi persistiu¹⁷.

[0043] Em outro estudo, Carpentier, em 2001, estudou o efeito de tratamentos com etanoi, éter e surfactante em amostras de pericárdio pré-tratadas com glutaraldeído a 0,6%¹⁸. O etanoi, o éter ou o surfactante Tween 80, e suas combinações, foram utilizados para realizar a extração de lipídeos. Os tecidos tratados foram implantados subcutaneamente em 50 ratos jovens durante 4 e 6 meses. Após 6 meses de implantação, apenas nos grupos de etanoi com surfactante e éter com surfactante o nível de cálcio foi significativamente mais baixo do que no grupo de controle. Em estudos anteriores mostrou-se que o etanoi é bastante eficaz na extração de fosfolipídios e que ele desempenha um papel importante no processo de calcificação¹⁰. Ao contrário, as análises mostraram que a extração de etanoi não elimina completamente os triglicerídeos no pericárdio bovino, enquanto que a extração por éter removeu totalmente os triglicerídeos. O teor de cálcio destes dois grupos, entretanto, não foi significativamente diferente após 6 meses de implantação, implicando que o papel de triglicerídeos na deposição de cálcio não é significativo. Em conclusão, os tratamentos por etanoi ou éter isoladamente ou surfactante isoladamente são menos eficientes do que a combinação destes tratamentos. O fato de que

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14/25 a combinação de tratamentos é mais eficiente do que qualquer um dos tratamentos isolados tende a provar que o mecanismo de extração e os produtos extraídos por cada tratamento são ligeíramente diferentes. Como uma conclusão prática deste trabalho, pode-se dizer que no procedimento atualmente utilizado de conservação de válvula bioprotética, pode ser benéfico aumentar a concentração de etanol ou seu comprimento de incubação ou adicionar tratamento com éter ao tratamento com surfactante.

[0044] Os pré-tratamentos mais eficientes foram a combinação de etanoi e surfactante (teor de cálcio: 15,5 ± 6,8 pg/mg de tecido seco após 6 meses de implantação) ou a combinação de etanol, éter e surfactante (13,1 ± 6,2 pg/mg de tecido seco) quando comparado com surfactante isoladamente (42,9 ± 12,7 pg/mg de tecido seco).

[0045] O Efeito antícalcifícação de etanol é bem evidente a partir de várias publicações científicas. A despeito da eficácia do tratamento com etanol tanto em cúspides aórticas suínas quanto no tecido pericárdico, alguma calcificação residual secundária ainda estava presente e sugeriu aos pesquisadores a exploração de tratamentos combinados adicionais a fim de mitigar ainda mais a deposição distrófica calcificada nos tecidos.

[0046] Connoly¹⁹ avaliou o pós-tratamento com boroldreto de sódio das cúspides aórticas suínas tratadas com etanol. O pré-tratamento de etanol inibiu significativamente a calcificação em comparação com os controles (13,3 +/- 5,6 versus 119,2 +/- 6,6 Ca pg/mg de tecido; p < 0,001). No entanto, a redução de boroidreto de sódio sob condições otimizadas combinadas com o pré-tratamento de etanol reduziu de forma ideal a calcificação (1,16 +/- 0,1 Ca pg/mg; p < 0,05), enquanto que os níveis após o tratamento com cianoboroidreto de sódio (23,6 +/- 10,4 Ca pg/mg) não foram significativamente diferentes daqueles após o etanol isoladamente. Nenhum agente redutor foi eficaz na inibiPetição 870190080782, de 20/08/2019, pág. 25/41

15/25 ção da calcificação sem pré-tratamento com etanol.

[0047] Alguns outros autores²⁰ adotaram etanol como solvente de fosfolipídios juntamente com outros aminoácidos para desintoxicar o tecido pericárdico. Grupos de amostras de pericárdico bovino foram fixados com GA 0,5%. Urazol e glutamato foram utilizados para neutralizar o aldeído livre e alguns solventes (etanol com octanol ou octanodiol) para reduzir o teor de fosfolipídio no tecido pericárdico bovino. Urazol e glutamato isoladamente diminuíram significativamente as concentrações de Ca²⁺ e fósforo inorgânico (IP) (sem qualquer tratamento anticalcificação, Ca²⁺: 277,85 ± 17,51 pg/mg; IP: 147,07 ± 8,32 pg/mg), mas quando utilizados com solventes orgânicos, as concentrações de Ca²⁺ e fósforo inorgânico foram as mais baixas (Ca²⁺: 0,05 ± 0,04 pg/mg; IP: 3,36 ± 0,61 pg/mg).

[0048] O propósito do estudo publicado por Kim²¹ foi avaliar o sinergismo sincronizado de uso de L-arginina e boroidreto de sódio (NaBH4), em comparação com etanol e L-lisina, em pericárdio suíno tratado com glutaraldeído a partir do ponto de vista de calcificação e elasticidade do tecido. O pericárdio de suíno foi fixado em glutaraldeído a 0,625% (7 dias na temperatura ambiente após 2 dias a 4 °C). Uma etapa intermediária de etanol (80%; 1 dia na temperatura ambiente) ou L-lisina (0,1 M; 2 dias a 37 °C) ou L-arginina (0,1 M; 2 dias a 37 °C) foi seguida pela conclusão da fixação com glutaraldeído. O prétratamento de L-lisina e NaBFL (183,8 ± 42,6 pg/mg, p ·· 0,804) e o pré-tratamento de L-arginina e NaBHL (163,3 ± 27,5 pg/mg, p = 0,621) não inibiram significativamente a calcificação em comparação com o controle (175,5 ± 45,3 pg/mg), mas o pré-tratamento com etanol e NaBHU inibiu (38,5 ± 37,3 pg/mg, p = 0,003). Finalmente o prétratamento de NaBH4 pareceu diminuir a calcificação do pericárdio suíno fixado com glutaraldeído, mas apenas com etanol.

[0049] Outro estudo²² foi intensificado a fim de avaliar a eficiência

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16/25 de cloreto de alumínio no isolamento ou associado com etanol para prevenir a calcificaçâo e reação Inflamatória com fragmentos da parede aórtica suína fixada em glutaraldeído e subdermicamente implantado em ratos jovens. Amostras da parede aórtica suína foram implantadas no tecido subdérmioo. Os espécimes foram previamente submetidos a três diferentes métodos de tratamento: I (glutaraldeído), II (glutaraldeído + alumínio), ill (glutaraldeído + etanol + alumínio). A espectroscopia de absorbância atômica mostrou níveis de cálcio similares para ambos os Grupos II e III, mas significativamente menos do que no Grupo I. O tratamento com cloreto de alumínio inibe a calcificaçâo de espécimes da parede aórtica após a implantação e reduz a reação inflamatória. O uso combinado de etanol com cloreto de alumínio é mais eficiente para inibir a calcificaçâo e também para diminuir a reação inflamatória.

[0050] A revisão da literatura debatida acima indica claramente que o tratamento com etanol de tecidos bioprotéticos é de uma forma geral altamente eficaz na prevenção da calcificaçâo distrófica do tecido após implantes de longo prazo em modelos animais. A redução do teor de cálcio do tecido versus o controle é sempre significativa quando os biomateriais são pré-tratados com etanol e reticulados com glutaraldeído.

[0051] O etanol é eficiente na solubilizaçâo e extração da grande quantidade de lipídeo (colesterol e fosfolipídios) das membranas celulares identificadas como o principal responsável por desencadear a calcificaçâo. A melhor eficiência em termos de extração de lipídeo é obtida em concentrações de 80%, mas boa redução da calcificaçâo de tecidos já é visível com concentrações de 50%¹⁵.

[0052] A aplicação de tratamentos alternativos de reticulação de tecido (Triglicidilamina, Genipina, Neomicina) ou pós-tratamentos, tais como Urazol, Glutamato, Boroidreto de Sódio, Cloreto de Alumínio ou

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17/25 outros, reduz ainda mais a capacidade de propensão de caicificação apenas quando associado ao etanol.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [0053] A presente invenção refere-se de uma forma geral a um novo e original uso de ciclodextrina no tratamento de tecidos bioprotéticos.

[0054] O uso de uma ciclodextrina neste tratamento fornece tecidos bíoprotéticos com uma durabilidade mecânica e biológica de longo prazo, após o implante. Tais propriedades são especialmente críticas para biopróteses de válvula cardíaca.

[0055] As ciclodextrinas pertencem a uma grande família de moléculas, mas para a presente invenção a maior parte da família β. As βCiclodextrinas funcionalizadas e, em particular, a HP β-Ciclodextrina e a SBE β-Ciclodextrinas foram aprovadas para o uso parenteral. Portanto, elas expressam toda a ação química desejada sem quaisquer danos para os órgãos excretores mesmo se estiverem presentes em traços.

[0056] Vantajosamente, a ciclodextrina é utilizada em combinação com etanol.

[0057] O tratamento de tecido com base em etanol em concentração aquosa, maior do que 50%, demonstrou ser altamente eficaz na extração dos fosfolipídios. A eficácia do etanol está intimamente relacionada à reticulação de glutaraldeído de tecidos bíoprotéticos. O mecanismo não é claro, mas o tratamento com etanol parece ser mais eficaz quando aplicado após um processo de reticulação à base de glutaraldeído.

[0058] A ação de ciclodextrina pode ser expressa como direta, com extração primária de moléculas lipídicas, e indireta, com a complexação das moléculas lipídicas já extraídas. É neste segundo modo de ação que as ciclodextrinas podem complexar os fosfolipídios já so

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18/25 lubilizados por etanol.

[0059] Em geral, a ação das ciclodextrinas, quando aplicadas a tecidos biológicos, pode ser explicada como uma interação estérica ou uma ligação covalente fraca entre sua cavidade hidrofóbica e as moléculas lipídicas. Em outros termos é aproximadamente uma ligação covalente fraca de ciclodextrinas e moléculas lipídicas sem ocorrer qualquer reação química.

[0060] O uso de um derivado específico de ciclodextrina para o tratamento de tecidos biológicos é descrito no pedido de patente US2002/137024. Esta técnica anterior ensina que os poliânions sulfonados e sulfatados são capazes de bloquear os sítios de nucleação de cálcio nos tecidos biológicos utilizados para dispositivos proféticos. O mecanismo de ação destes produtos químicos não é descrito, mas pode-se deduzir inequivocamente a partir do ensinamento deste documento que os grupos funcionais sulfonados e/ou sulfatados são responsáveis pelo bloqueio dos sítios de nucleação de cálcio. Na verdade, os exemplos relatados na US2002/137024 referem-se às moléculas completamente diferentes, tendo em comum apenas os grupos de sulfonato/sulfato. Alguns exemplos dos poliânions mencionados na US2002/137024 são as ciclodextrinas sulfatadas, sendo apenas um deles. E possível inferir que os grupos de sulfonato/sulfato são capazes de bloquear os sítios de nucleação de cálcio, presumivelmente por causa da afinidade entre ânions de cálcio e sulfato. Em outras palavras, um tipo de ação competitiva de ânions de sulfato/sulfonato contra os grupos de fosfato dos fosfolipídeos, que são claramente identificados na US2002/137024 como sítios de nucleação de cálcio apesar de já bem conhecidos na técnica anterior.

[0061] Em geral, as ciclodextrinas não contêm grupos de sulfonato ou sulfato funcionais. Deve-se sublinhado que as ciclodextrinas são usualmente moléculas neutras e não compostos iônicos. A ciclodextri

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19/25 na sulfatada é apenas um derivado da grande classe de ciclodextrinas e a funcionalização é direcionada para a obtenção de uma molécula mais solúvel ou tolerável para a injeção i.v. Portanto, não existe nada na US2002/137024 que sugere o uso da ciclodextrina em si como agentes de bloqueio para sítios de nucleação de cálcio. De fato, a US 2002/137024 está mesmo ensinando ao longe o uso da própria ciclodextrina como agente de bloqueio para sítios de nucleação de cálcio.

[0062] Na presente invenção, a ciclodextrina selecionada está atuando de um modo completamente diferente em relação ao que é descrito na US2002/137024. A Ciclodextrina, por si só, está removendo os fosfolipídios do tecido graças à sua cavidade hidrofóbica, que sequestraria as cadeias de gordura do fosfolipídio.

[0063] Etanol e Ciclodextrina podem ser utilizados simultânea ou separadamente, em qualquer ordem.

[0064] Os tecidos bioprotéticos (cúspides de válvula nativa, tecidos pericárdicos bovinos ou suínos) são selecionados com relação à ausência de defeitos e espessura. Os emplastros ou cúspides selecionados são submetidos a um processo de reticulação destinado a estabilizar o colágeno a fim de evitar qualquer resposta imunológica ou estranha do tecido corporal. O processo de reticulação pode ser conduzido com diferentes moléculas, mas tipicamente glutaraldeído em uma concentração que varia entre 0,1% a 1% durante um período de 12 h a 48 h ou mais é utilizado.

[0065] De preferência, o tratamento de delipidação combinado (Figura 7) é executado combinando o etanol em uma concentração entre 35% e 80% solubilizado em uma solução tamponada em pH 7,4 com 10 mM a 200 mM de β-Clclodextrina durante 2 h a 24 h em uma temperatura que varia entre 25 °C e 40 °C.

[0066] Após o tratamento de delipidação, os emplastros são montados em montagens semiacabadas ou acabadas e depois quimica

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20/25 mente esterilizados com uma solução à base de aldeído eventualmente adicionada com moléculas de álcool de cadeia curta.

[0067] Os dispositivos acabados são então armazenados em uma solução composta por aldeído em concentração de 0,1% a 1% e eventualmente adicionados com moléculas de álcool de cadeia curta em concentração de 10% a 50%.

[0068] A fim de adicionar um processo de desintoxicação de tecido, visando na remoção de moléculas livres de aldeído da bioprótese antes do implante, um procedimento de enxágue de pré-implantação é executado.

[0069] Este enxágue de pré-implantação é executado com três alíquotas de 500 ml de uma solução de β-Ciclodextrinas em uma concentração de 10 mM a 200 mM em uma temperatura de 15 °C a 30 °C.

[0070] Em outra modalidade, a extração de fosfolipídio pode ser executada, após a reticulação de tecido, em uma maneira desunida em duas fases (Figura 8). Em primeiro lugar o tratamento com etanol é executado seguido pela β-ciclodextrina. Ambos os tratamentos executados nas mesmas concentrações e condições descritas na Figura 7.

[0071] A extração de fosfolipídio, conforme descrito na Figura 8, pode ser conduzida de forma invertida antecipando a exposição à β~ ciclodextrina seguido por tratamento com etanol nas mesmas concentrações e condições.

[0072] O tratamento combinado de Etanol e β-Ciclodextrina pode ser executado antecipando o tratamento com β-Ciciodextrina diretamente sobre o tecido bioprotético antes do procedimento de reticulação (Figura 9) seguido por um tratamento com uma solução de etanol. A concentração de Etanol e β-Ciclodextrina pode ser a mesma descrita na Figura 7. Este tratamento desunido pode ser aplicado em ordem invertida se necessário.

[0073] O raciocínio para antecipar o tratamento com β

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21/25 ciclodextrina, antes do procedimento de reticulação (Figura 9), baseiase no modo ativo direto de ciclodextrinas para delipidar diretamente os tecidos bioprotéticos. Esta é a mesma capacidade de extração ativa expressa por ciclodextrinas observada em experimentos onde estas moléculas foram capazes de extrair colesterol e outros lipídios das placas ateroscleróticas em vasos arteriais (a FDA aprovou uma ciclodextrina como tratamento de fármacos órfãos em uma doença pediátrica raro onde os bebês apresentam concentração plasmática anormalmente elevada de colesterol com placas ateroscleróticas em 2 a 3 anos de idade).

[0074] Em outra modalidade, após a extração de fosfolipídios conforme descrito nos tratamentos anteriores com etanol e ciclodextrinas, o processo pode incluir um processo de desintoxicação adicional, com base em ciclodextrinas, visando a remoção, de maneira eficaz, das moléculas residuais de aldeído (Figura 10). O objetivo desta variação de tratamento químico é necessário para armazenar a bioprótese em uma solução de armazenamento livre de aldeído bacteriostática. Como anteriormente descrito, é bastante importante a remoção de aldeídos da solução de armazenamento uma vez que foi demonstrado que o armazenamento da bioprótese em glutaraldeído pode sobrepor parcialmente o efeito anticalcificação positivo dado pelo tratamento com etanol. Esta é a razão pela qual nas modalidades anteriores o meio de armazenamento, descrito nas Figuras 7 a 9, se baseia na solução de glutaraldeído adicionada com uma determinada quantidade de álcoois de cadeia curta.

[0075] Uma etapa importante adiante no tratamento de tecido bioprofético é representada pela desidratação do tecido em associação com uma esterilização de óxido de etileno. Isto é feito a fim de armazenar mais facilmente as biopróteses, evitando assim a esterilização química e sua manipulação especialmente quando elas devem ser

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22/25 contraídas e utilizadas em procedimentos transcateter.

[0076] As modalidades de tratamento anteriores apresentadas anteriormente, como possíveis variações, podem ser associadas ao procedimento de desidratação do tecido. Como, por exemplo, na Figura 11, após a delipidaçâo, um processo de desintoxicação é executado com β-ciclodextrina que é completado com o objetivo de remover moléculas de aldeído do tecido. Quando a desintoxicação é concluída, um procedimento de desidratação de tecido pode ser iniciado. Este tratamento é baseado em uma remoção progressiva de água do tecido bioprotético obtido com polietileno glicol (por exemplo, MW 100 a 800) em solução aquosa que varia de 80% a 90%. O tratamento é executado em uma temperatura entre 20 °C e 50 °C durante 12 h a 48 h. A fim de obter uma desidratação mais eficaz, álcoois de cadeia curta podem ser adicionados em uma concentração de 10% a 20%.

[0077] O processo de desidratação é concluído com uma secagem de tecido durante várias horas em um ambiente limpo. Ele permite um armazenamento final das biopróteses em um acondicionamento seco que é submetido à esterilização por meio de óxido de etileno.

[0078] Todos os processos de tratamento, acima descritos, podem ser executados em montagens semi-acabadas ou diretamente sobre as biopróteses montadas finais. Neste caso, os processos podem ser aplicados como um tratamento protético individual.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para o tratamento de tecidos bioprotéticos, em particular tecidos biológicos utilizados para próteses cardiovasculares; dito método caracterizado pelo fato de que compreende o uso de uma ciclodextrina que é capaz por si só remover fosfoiipídios de tecidos bioprotéticos.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a ciclodextrina é uma β-ciclodextrina.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para a redução da calcificação de tecidos bioprotéticos.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é para a redução da toxicidade residual de tecidos bioprotéticos a fim de armazenar a bioprótese em solução livre de aldeído.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que está em associação com polietileno glicol para obtenção de uma desidratação de tecido e com óxido de etileno para esterilização.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, além disso, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de enxágue em que a ciclodextrina é utilizada para remover as moléculas de aldeído livres remanescente do tecido.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a ciclodextrina é selecionada no seguinte grupo: γ-Ciclodextrina, 2-hidroxipropil β~ Ciclodextrina, β-Ciclodextrina de Éter Sulfobutílico, β-Ciclodextrina Sulfatada e Maltosil β-Ciclodextrina.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o uso

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2/2 de etanoi.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o etanoi e a ciclodextrina são simultaneamente utilizados.
10. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo uso sucessivo de etanoi seguido pela ciclodextrina.
11. Método de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo uso sucessivo da ciclodextrina seguido por etanoi.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende um processo de reticulação.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o processo de reticulação ocorre após o uso de ciclodextrina.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende um segundo uso de ciclodextrina, que ocorre após o processo de reticulação.
15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o processo de reticulação ocorre antes do uso de ciclodextrina.
16. Produto para o tratamento de tecidos bioprotéticos, em particular tecidos cardiovasculares; dito produto caracterizado pelo fato de que compreende uma ciclodextrina.
17. Produto de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a ciclodextrina é β-ciclodextrina.
18. Produto de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda etanoi.
19. Kit para o tratamento de tecidos bioprotéticos, caracterizado pelo fato de que compreende dois produtos separados, a saber, um primeiro produto contendo uma ciclodextrina e um segundo produto contendo etanoi.