KR20190103055A - 곰취 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커 - Google Patents

곰취 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커 Download PDF

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    • C12Q2600/13—Plant traits

Abstract

본 발명은 곰취 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 관한 것으로, 본 발명의 품종은 곰취 중에서 잎의 크기가 작고 엽색이 진한 특징을 가지고 있어 일반 곰취에 비해 식재료로 용이하게 사용할 수 있으며, 일반 곰취 품종의 경우 저지대에서 재배하면 병해에 약하나 한택곰취는 환경적응성이 뛰어나므로 재배하는데 어려움이 없는 장점이 있다.

Description

곰취 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커{Hanteak, new cultivar of Ligularia fischeri and molecular marker for discriminating the same}
본 발명은 곰취 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 관한 것이다.
곰취(Ligularia fischeri)는 국화과에 속하는 여러해살이풀로, 한국, 일본, 중국, 사할린섬, 동시베리아 등지에 분포되어 있고, 특히 고원이나 깊은 산의 습지에서 자라며 높이는 1~2m이고 뿌리줄기는 굵고 털이 없다. 뿌리에 달린 잎은 길이가 9cm에 이르는 것도 있고 큰 심장 모양으로 톱니가 있으며 잎자루가 길다. 뿌리에 달린 잎 사이에서 줄기가 나오며, 줄기에는 잎이 3장 달리는데 모양은 뿌리에 달린 잎과 비슷하지만 크기가 작고 잎자루의 밑부분이 줄기를 싸고 있다. 7~9월에 줄기 끝에 지름 4~5cm의 노란색 설상화가 총상꽃차례(raceme)로 핀다. 꽃차례 길이는 50cm 이상이고 꽃자루 길이는 1~9cm이며, 포가 1개 있다. 총포(involucre)는 통처럼 생긴 종 모양으로 길이 10~12mm, 너비 8~14mm이다. 열매는 수과로 10월에 익으며 길이 6.5~11mm이다. 곰취 열매에는 갈색 관모가 있어서 바람에 잘 날려 흩어진다. 어린 잎은 나물로 먹으며 독특한 향미가 있다. 한방에서는 가을에 뿌리줄기를 캐서 말린 것을 호로칠(葫蘆七)이라 하여, 해수·백일해·천식·요통·관절통·타박상 등에 처방한다.
한편, 최근 분자 생물학이 발달하면서 특정 DNA 염기 서열의 다형성을 탐색하고 이를 분자마커로 활용하는 기술은 환경의 영향을 받지 않고 연차간 변이가 거의 없기 때문에 유전자 지도 작성, 내병성 유전자의 맵핑(mapping), 품종 식별 등 다양한 분야에 활용 가능하게 되었다. 특히, 유전적 분자마커 기술 개발은 작물 육성에서 이용가치가 증가되고 있다.
한편, 한국등록특허 제1748566호에는 '초위성체 마커를 이용한 국화 품종식별 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1684069호에는 '팽이버섯 품종 특이적 유전자 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 곰취 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 곰취의 자연교잡종을 유도하고 채집한 종자를 파종하여 발아시킨 유묘를 번식시킨 결과, 일반 곰취에 비해 잎의 크기가 작고 엽색이 진한 식물체를 선발할 수 있었으며, 상기 식물체를 계통 육성하여 곰취 신품종 '한택'으로 명명하였다. 또한, 일반 곰취 품종의 경우 병해에 약하고 여름철 고온다습한 환경에서 식물체가 녹아내려 고사하기 때문에 주로 고지대, 반그늘에서 재배되지만, 곰취 신품종 '한택'은 환경적응력이 우수하고 병충해에 강해 저지대 및 양지에서도 재배가 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18661P이며, 엽신의 길이가 10~17cm로 짧고, 엽신의 너비가 10~20cm로 좁으며, 엽병이 갈색이면서 길이가 18~26cm로 짧은 곰취 신품종 '한택'(Ligularia fischeri 'Hanteak') 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 곰취 신품종 '한택' 식물체의 부분체 또는 그로부터 유래된 자손 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18661P인 곰취 신품종 '한택' 식물체의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 기탁번호가 KCTC18661P인 곰취 신품종 '한택' 식물체의 판별방법을 제공한다.
본 발명의 곰취 신품종 '한택'은 일반 곰취에 비해 잎의 크기가 작고 엽색이 진해 쌈 채소나 장아찌 등의 식재료로 유용하게 사용 가능하고, 일반 곰취와 달리 환경적응력이 우수하고 병충해에 강해 해발이 낮은 정원이나 공원 등 조경으로 식재시에도 환경적응력이 뛰어나고 재배가 쉬워 조경 및 정원용 식물소재로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 출원품종과 대조품종(곰취)의 식물체 높이(A), 잎 크기(B), 엽색(C), 화경 길이(D) 및 엽병 색(E)을 비교한 사진이다.
도 2는 본 발명의 출원품종과 대조품종의 엽록체 게놈 염기서열을 분석하여 InDel(A) 및 핵 내 45S rDNA의 염기서열을 분석하여 SNP(B) 다형성이 나타난 부위를 나타낸 모식도이다.
도 3은 분자마커를 이용한 곰취, 한택(출원품종), 다도해곰취, 한대리곰취 및 1400m 곰취의 PCR 결과로, A는 InDel(Insert/Deletion) 분자마커, B는 dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) 분자마커를 의미한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC18661P이며, 엽신의 길이가 10~17cm로 짧고, 엽신의 너비가 10~20cm로 좁으며, 엽병이 갈색이면서 길이가 18~26cm로 짧은 곰취 신품종 '한택'(Ligularia fischeri 'Hanteak') 식물체를 제공한다.
본 발명의 곰취 신품종 '한택'은 표 1, 표 2 및 도 1에 기재된 것과 같은 형태학적 특징을 가지며, 일반 곰취 식물체와 비교하여 잎의 크기가 작고 엽색이 진한 식물체이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 곰취 신품종 '한택'은 제주에서 수집한 곰취와 강원지역에서 수집한 곤달비(Ligularia stenocephala (Maxim.) Matsum. & Koidz.)를 식물원 내의 포지에서 자연교잡을 유도한 후 환경적응성과 내병성이 높아 저지대와 양지에서 고사하지 않고 건강하게 자라는 개체를 선발하여 상기 개체를 계통 육성하였다. 본 발명자는 일반 곰취에 비해 엽신의 길이가 10~17cm로 짧고, 엽신의 너비가 10~20cm로 좁으며, 엽병이 갈색이면서 길이가 18~26cm로 짧은 특성을 가지는 곰취 품종을 '한택'으로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2018년 1월 25일자에 기탁하였다(기탁번호 : KCTC18661P).
본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCTC18661P인 곰취 신품종 '한택' 식물체의 부분체 또는 그로부터 유래된 자손 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 식물체의 '부분체'는 이에 한정하지 않으나, 곰취 신품종 '한택'의 화분, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 자손 식물체는 곰취 신품종 '한택'의 무성생식을 통해 유래된 자손 식물체 또는 곰취 신품종 '한택'을 모본으로 사용하여 다른 품종과 교배를 통해 유래된 자손 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18661P인 곰취 신품종 '한택' 식물체의 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이서 세트에 있어서, 상기 서열번호 1 및 2; 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 InDel(Insert/Deletion) 변이지역을 증폭할 수 있는 프라이머 세트이고, 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트는 SNP(single nucleotide polymorphism)에 기반한 dCAPS 마커용 프라이머 세트이다(표 3).
본 명세서에서, 용어 'dCAPS(Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences)' 마커는 SNP 중 제한효소 자리에 위치한 SNP를 일컫는다. 본 발명의 dCAPS 마커는 핵 내 45S rDNA 염기서열에 존재하는 '곰취'와 '한택 곰취-다도해 곰취-한대리 곰취-1400m 곰취' 식물체의 간의 특이적인 SNP 중 제한효소(PstI, NotI)자리에 위치한 SNP를 선정하여 후보 dCAPS 마커로 개발할 수 있다.
상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 7 및 8 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 7 및 8의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에서, 서열번호 1, 3, 5 및 7로 나타낸 염기서열은 정방향 프라이머를 나타내며, 서열번호 2, 4, 6 및 8로 나타낸 염기서열은 역방향 프라이머를 나타낸다.
본 발명에 따른 곰취 신품종 '한택' 식물체의 판별용 프라이머 세트는 상기 4개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면, 곰취 신품종 '한택' 식물체의 판별이 보다 정확하게 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한,
곰취 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 기탁번호가 KCTC18661P인 곰취 신품종 '한택' 식물체의 판별방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 곰취 신품종 한택의 판별 방법은 구체적으로는, 곰취 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 곰취 신품종 한택의 또 다른 판별 방법은 구체적으로는, 곰취 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 또는 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 상기 증폭 단계의 산물을 제한효소로 절단하는 단계; 및 상기 절단 산물을 겔 전기영동하여 절단 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 판별 방법에 있어서, 상기 제한효소는 PstI, NotI 제한효소일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 산물에는 PstI 제한효소, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 증폭 산물에는 NotI 제한효소를 처리하여 증폭 산물을 절단할 수 있다.
본 발명의 방법은 곰취 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 곰취 신품종 한택의 육성과정 및 수집
본 품종은 한택식물원(용인) 내에서 1985년 곰취의 신품종 개발을 위하여 제주에서 수집한 곰취와 강원지역에서 수집한 곤달비(Ligularia stenocephala (Maxim.) Matsum. & Koidz.)를 자연교잡이 이루어지도록 식물원내 포지에 식재하였으며 1986년 상기 식재 장소의 곰취에서 채종한 종자를 파종하여 재배하던 중 환경적응성과 내병성이 높아 여름에도 고사하지 않고 건강하게 자라는 개체를 선발하였다.
기존의 곰취 품종은 저지대에서 재배하면 병충해에 잘 걸리고 여름철 고온다습한 환경에서는 식물체가 녹아내려 고사하기 때문에, 해발고도가 800m 이상인 비교적 높은 강원도 등지에서 주로 재배되었었다. 반면, 본 발명의 신품종은 환경적응력이 뛰어나고 병충해에 강해 해발고도가 낮은 지역에서도 재배가 가능하며 번식도 잘되는 품종이다. 또한, 일반 곰취는 반그늘에서 주로 재배가 이루어지지만 본 발명의 신품종은 비교적 양지에서도 재배가 가능하기 때문에 재배할 수 있는 곳이 광범위하다는 장점이 있다.
따라서, 본 품종은 해발이 낮은 정원이나 공원 등 조경으로 식재시에도 환경적응력이 뛰어나고 재배가 쉬워 조경 및 정원용 식물소재로 이용하기 좋으며, 기존의 곰취 품종에 비해 잎의 크기가 작고 엽색이 진한 특징을 가지고 있어 쌈 채소나 장아찌 등의 식재료로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 곰취 신품종을 '한택'으로 명명하고, 캘러스를 유기하여 2018년 1월 25일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC18661P로 기탁하였다.
실시예 2. 곰취 신품종 한택의 형태적 변이 분석
상기 실시예 1에서 선별된 신품종 한택과 대조품종인 곰취의 형태적인 특성을 실험 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 1 및 2, 그리고 도 1에 나타내었다.
Figure pat00001
Figure pat00002
실시예 3. 곰취 신품종 한택의 판별을 위한 분자마커 개발
3-1. DNA 추출
신품종 한택, 곰취, 다도해곰취, 한대리곰취 및 한라산 1400m 곰취의 잎은 한택식물원 내 식물체로부터 각각 채취하였으며, 사용전까지 -70℃에서 보관하였다.
건조한 시료 0.2g을 막사 사발에 넣고 액체 질소를 사용하여 미세분말 상태가 되도록 분쇄하고 2㎖ 뷰트에 옮겨 담았다. 1.2㎖의 추출버퍼(1.4M NaCl, 100mM Tris(pH 8.0), 20mM EDTA(pH 8.0), 2% CTAB(hexadecyltrimethyl ammonium bromide), 0.2% β-mercaptoethanol)를 튜브에 첨가하고 5초간 볼텍싱하였다. 65℃ 항온기에서 30~60분 반응시키고(10분에 한번씩 섞어줌), 13,500xg로 10분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액에 800㎕의 Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol(25:24:1)을 넣고 상온에서 20분간 인버팅(inverting) 한 후 13,500xg로 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액에 -20℃에 보관했던 아이소프로판올(isopropanol) 800㎕를 넣고 5분간 인버팅하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 튜브를 13,500xg로 10분간 원심분리하고 상층액을 제거하여 펠렛만 남긴다. 200~250㎕의 TE 버퍼를 넣어 펠렛을 녹이고, 2.5㎕ RNase(10mg/㎖)를 넣어 30~60분간 37℃에서 반응시켰다. 반응이 끝나면 3M NaOAc 25㎕를 넣고 잘 섞어준 다음, 600㎕의 차가운(-20℃) 100% 에탄올을 튜브에 넣고 잘 섞은 후 -20℃에서 20분간 반응시킨다. 13,500xg로 10분간 원심 분리하고 상층액을 제거한 후 차가운(-20℃) 70% 에탄올 500㎕를 넣는다. 탭핑 또는 1~2초의 볼텍싱으로 펠렛을 튜브 벽에서 분리시키고, 13,500xg로 10분간 원심 분리하고 상층액을 제거한 다음, DNA 펠렛을 적어도 1시간 이상 건조시켰다. 건조된 DNA를 20~30㎕의 TE 버퍼에 완전히 녹인다.
3-2. 염기서열 분석 및 엽록체 게놈 및 핵 내 45S rDNA 서열 조립
추출된 약 2㎍의 게놈 DNA는 랩지노믹스(www.labgenomics.co.kr)에서 제조 업체가 제공하는 paired-end 표준 프로토콜에 따라 500bp 삽입 크기(insert size)의 게놈 라이브러리로 제작되었다. 시퀀싱은 일루미나사의 MiSeq 플래폼을 이용하여 진행하였다.
차세대유전체분석기술(Next-generation sequencing, NGS)로 생산된 대량의 염기서열은 식물체 유전체 크기의 0.5~1X의 low coverage(엽록체 게놈 크기의 300~400X)에 해당하며, 엽록체 게놈과 45S rDNA 서열은 이 소량의 데이터를 이용하여 dnaLCW(de novo assembly of low-coverage whole genome shotgun sequencing) 방법(한국등록특허 제1447593호)을 통해 완성하였다. 본 분석의 경우 1.01~3.67Gbp에 해당하는 원시데이터를 이용하여 엽록체 게놈 및 45S rDNA를 완성하였다. 완성한 엽록체 유전체의 크기는 신품종 한택이 151,133bp, 곰취가 151,134bp, 다도해곰취가 151,151bp, 한대리곰취가 151,153bp, 한라산 1400m 곰취가 151,157bp였다. 핵 내 45S rDNA의 크기는 한택곰취, 다도해곰취, 한대리곰취 및 한라산 1400m 곰취가 5,878bp, 곰취가 5,877bp였다.
완전한 엽록체 게놈을 조립한 후 DOGMA(http://dogma.ccbb.utexas.edu/) 프로그램과 BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 검색을 통하여 엽록체 유전체의 유전자 부위를 결정하였다.
3-3. 염기서열 비교 분석을 통한 종내 InDel 및 SNP 변이지역 발굴
완성된 5종(신품종 한택, 곰취, 다도해곰취, 한대리곰취, 한라산 1400m 곰취)의 엽록체 게놈 염기서열을 MAFFT (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/) 프로그램으로 비교 분석하였다. 엽록체 게놈 서열의 종간 변이지역은 1~44개의 삽입-결실(InDel)이 확인되었으며, 이 중 2개의 InDel 변이지역(도 3A; LF_i_01, LF_i_04)을 대상으로 식별 마커를 개발하였다.
핵 내 45S rDNA 서열의 경우 5종 모두 두 가지 타입(major/minor)의 서열을 가지고 있었으며 이를 모두 고려했을 때의 변이지역은 1개의 InDel이 확인되었다. 타입을 고려하지 않았을 때의 종간 변이지역은 44개의 SNP, 2개의 InDel이 확인되었으며, 이 중 2개의 SNP 변이지역(도 3B; LF_d_02, LF_d_03)을 대상으로 식별 마커를 개발하였다. 엽록체 게놈과 핵 내 45S rDNA의 염기서열 비교분석을 통하여 개발된 종 구분마커들을 확인하기 위한 프라이머 세트는 Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 프로그램을 이용하여 디자인하였다(표 3). SNP 변이지역을 기반으로 한 2개의 마커는 dCAPS(derived cleaved amplified polymorphic sequence) 마커로 개발하였으며, 각각 PstI, NotI 제한효소로 PCR 산물을 절단하였다(도 2). 하기 표 3의 dCAPS 프라이머 서열에는 PstI, NotI 제한효소의 서열이 일부 나타나있지 않으나 각 마커의 PCR 산물에는 제한효소가 포함되어 있다.
신품종 한택 곰취와 근연종 판별용 분자마커 및 프라이머 정보
마커명 종류 위치 프라이머 서열(5'→3') (서열번호) 산물크기(bp)*
LF_i_01 InDel trnR(UCU)
~trnT(GGU)		 F: TAGCTTGGAAGGCTAGGGGT (1)
R: TCGCCTTCTTCTAGAGGGATCA (2)		 259/259/259
/259/239
LF_i_04 InDel psaA - ycf3 F: GATCTGGAAGTCGATCCGGG (3)
R: TCTGCTCGCGTGATTTGGAA (4)		 206/206/216
/216/216
LF_d_02 dCAPS 45S rDNA F: TGAGACCGATAGCAAACAAGTA (5)
R: CGACACGACGGCATCTCTGC (6)		 (236,219)/236/236/(236,219)/236
LF_d_03 dCAPS 45S rDNA F: GTTGTTGATATGCCCGTGGAGATGCGGCCG (7)
R: GCATGCTCACACTCGAACCC (8)		 (274,249)/249/249/(274,249)/249
(* 산물크기 순서; 곰취/신품종 한택/다도해곰취/한대리곰취/한라산 1400m 곰취).
3-4. 중합효소연쇄반응( PCR )
PCR 반응은 총 볼륨을 25㎕로 하였고, 20ng의 주형 DNA 2㎕, 각 10mM의 dNTPs 0.5㎕, 각 10pmole의 프라이머 1㎕, 1U의 Taq 중합효소(Inclone, 한국) 0.25㎕, 10X Taq 반응완충용액 2.5㎕, 멸균수를 사용하였다. PCR은 94℃에서 5분간 초기 DNA 변성을 수행하였고, DNA 증폭을 위해 94℃에서 20초, 58℃에서 20초, 72℃에서 20초를 총 35회 수행하였다. 마지막 신장 과정은 72℃에서 7분간 수행하였다. PCR 증폭산물은 3% 아가로스 겔 전기영동에서 확인하였다.
개발한 상기 프라이머 세트를 한택곰취 및 근연종에 적용한 결과, 엽록체 게놈의 InDel 변이지역을 대상으로 개발된 LF_i_01 및 LF_i_04 마커 중, LF_i_01 마커로는 한라산 1400m 곰취, 곰취-한택곰취-다도해곰취-한대리곰취를 구분할 수 있었고, LF_i_04 마커로는 곰취-한택곰취, 다도해곰취-한대리곰취-한라산 1400m 곰취를 구분할 수 있었다. 또한, 핵 내 45S rDNA의 SNP 변이지역을 대상으로 개발된 LF_d_02 및 LF_d_03 마커를 적용하여 곰취-한대리곰취, 한택곰취-다도해곰취-한라산 1400m 곰취를 구분할 수 있었다(도 3).
따라서, 본 발명의 LF_i_01, LF_i_04, LF_d_02 및 LF_d_03 마커를 모두 이용하면 곰취, 다도해곰취, 한대리곰취, 1400m 곰취로부터 곰취 신품종 '한택'을 판별할 수 있음을 확인하였다(표 4).
Figure pat00003
한국생명공학연구원 KCTC18661P 20180125
<110> HANTAEK BOTANICAL GARDEN FOUNDATION <120> Hanteak, new cultivar of Ligularia fischeri and molecular marker for discriminating the same <130> PN19057 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tagcttggaa ggctaggggt 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcgccttctt ctagagggat ca 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gatctggaag tcgatccggg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tctgctcgcg tgatttggaa 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgagaccgat agcaaacaag ta 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgacacgacg gcatctctgc 20 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gttgttgata tgcccgtgga gatgcggccg 30 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcatgctcac actcgaaccc 20

Claims (4)

  1. 기탁번호가 KCTC18661P이며, 엽신의 길이가 10~17cm로 짧고, 엽신의 너비가 10~20cm로 좁으며, 엽병이 갈색이면서 길이가 18~26cm로 짧은 곰취 신품종 '한택'(Ligularia fischeri 'Hanteak') 식물체.
  2. 제1항의 곰취 신품종 '한택' 식물체의 부분체 또는 그로부터 유래된 자손 식물체.
  3. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 제1항의 곰취 신품종 '한택' 식물체의 판별용 프라이머 세트.
  4. 곰취 식물체 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 제1항의 곰취 신품종 '한택' 식물체의 판별방법.
KR1020190022823A 2018-02-27 2019-02-27 곰취 신품종 '한택' 및 이를 판별하기 위한 분자마커 KR102066596B1 (ko)

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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110003754A (ko) * 2009-07-06 2011-01-13 강원대학교산학협력단 곰취 또는 고춧잎 또는 취나물를 이용한 산채 블록 제조방법
KR20110067957A (ko) * 2009-12-15 2011-06-22 숨골권역영농조합법인 연간 계속적으로 생산이 가능한 곰취의 재배방법
KR20170014939A (ko) * 2015-07-31 2017-02-08 경상대학교산학협력단 곰취의 기능성 물질함량 증진법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110003754A (ko) * 2009-07-06 2011-01-13 강원대학교산학협력단 곰취 또는 고춧잎 또는 취나물를 이용한 산채 블록 제조방법
KR20110067957A (ko) * 2009-12-15 2011-06-22 숨골권역영농조합법인 연간 계속적으로 생산이 가능한 곰취의 재배방법
KR20170014939A (ko) * 2015-07-31 2017-02-08 경상대학교산학협력단 곰취의 기능성 물질함량 증진법

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