KR20190102017A - 치료법에 의한 인체의 치료 방법에 사용하기 위한 헤디키움 코로나리움(Hedychium coronarium) 종의 식물 추출물을 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치료법에 의한 인체의 치료 방법에 사용하기 위한, 더욱 구체적으로는 세포 정화 시스템 중 적어도 하나를 보호 및/또는 활성화하는 데 사용하기 위한, 헤디키움 코로나리움(Hedychium coronarium) 종의 식물 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

치료법에 의한 인체의 치료 방법에 사용하기 위한 헤디키움 코로나리움(Hedychium coronarium) 종의 식물 추출물을 포함하는 조성물
본 발명은 유해한 환경의 영향을 받은 피부의 치료를 위한 적용에 있어 헤디키움 코로나리움(Hedychium coronarium) 종의 식물 추출물의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
헤디키움(Hedychium)은 생강과 진지베라세아에(Zingiberaceae)의 현화식물 속이다. 동남아시아(태국, 말레이시아, 인도네시아, 필리핀 등), 중국 남부, 히말라야 산맥 및 마다가스카르가 원산지로, 대략 70 내지 80종의 공지된 종이 있다. 일부 종은 다른 지역(남아프리카, 남아메리카, 중앙아메리카, 서인도 제도 및 태평양, 인도양 및 대서양의 많은 섬)에서 널리 귀화되었다. 속명 헤디키움(Hedychium)은 "감미로운"을 의미하는 헤디스(hedys) 및 "눈"을 의미하는 "키오스(chios)"의 두 가지 고대 그리스 단어에서 유래되었다. 이는 모식종 헤디키움 코로나리움(Hedychium coronarium)의 향기로운 흰색 꽃을 지칭한다. 일반명은 꽃생강(garland flower), 진저 릴리, 및 카힐리 진저(kahili ginger)를 포함한다.
헤디키움 속의 구성원은 뿌리 줄기가 있는 다년생 식물로, 일반적으로 120 cm에서 180 cm 높이까지 자란다. 일부 종은 흰색, 노란색 및 오렌지색으로, 이국적인 나뭇잎과 향기로운 수상 꽃차례를 목적으로 재배된다. 다수의 품종들은 정원용으로 개발되었다. 선택된 종은 예를 들어, 헤디키움 아우란티아쿰(Hedychium aurantiacum), 헤디키움 코키네움(Hedychium coccineum), 헤디키움 코로나리움(Hedychium coronarium), 헤디키움 덴시플로룸(Hedychium densiflorum), 헤디키움 엘립티쿰(Hedychium ellipticum)(셰이빙 브러시 진저), 헤디키움 플라베센스(Hedychium flavescens), 헤디키움 가드네리아눔(Hedychium gardnerianum)(진저 릴리), 헤디키움 사무이엔세(Hedychium samuiense), 및 힌디어로 카푸르 카차리(kapur kachari)라 불리는 헤디키움 스피카툼(Hedychium spicatum)을 포함한다.
개별 종은 각각의 생물학적 분류법에서 서로 상이하며, 그 기원과 관련하여서도 여러 사례가 있다.
("진저 버터플라이"라고도 알려져 있는) 헤디키움 코로나리움 종은 Andrea Johan Retzius의 책 "Observationes Botanicae" t. 3, p. 73~74에서 Johann Gerhard Koenig이 1783년에 처음으로 기술하였다.
("와일드-헤디드 진저"라고도 알려져 있는) 헤디키움 스피카툼 종은 James Edward Smith(1811)가 최초로 기록하였고, 다음으로 Abraham REES의 작업인 "the Cyclopaedia; universal dictionary Arts, Sciences and Literature." t. 17 p.521~522에서 1819년에 Francis Buchanan-Hamilton이 이에 대해 기술하였다.
헤디키움은 문헌["Edible Medicinal and non medicinal Plants", Vol. 8 Flowers, pages 853-860" ] 또는 ["Medicinal plants used by women from Agnalazaha littoral forest (South-eastern Madagascar)", Journal of Ethno biology and Ethno medicine, 2013] 및 [X. Yan, et al. "Traditional Chinese Medicines, Molecular Structures, Natural Sources, and Applications", 1999] 또는 [Sharma et al. "Phytochemistry", 14:578, 1975]에서 기술된 바와 같이 전통의학에서의 사용에 대하여 널리 기술되었다.
WO 2002/056859 A2는 헤디키움 추출물을 포함하는 조성물 및 이의 화장료 용도에 관해 개시하고 있다. 그러나 상기 국제 출원은 구체적으로 헤디키움 스피카툼 종의 용도를 개시하고 있으며, 일 양태에서는 피부의 견실함, 톤, 또는 감촉을 조절하는 데 있어서의 이의 활성에 대해, 다른 양태에서는 UV에 의한 금속단백분해효소-1(MMP-1) 분비 억제, 내인성 세포 항산화 방어 시스템의 일부로서 글루타티온을 보호하기 위한 매연에 기인한 티올 손실 억제, 및 유해한 반응성 산소 종(ROS) 형성의 전구체가 되는 산화질소의 생성 억제를 기저 메커니즘으로 하는 피부의 환경적 손상 치료에 대한 이의 용도를 기술하고 있다.
BR PI0905586-0 A2는 헤디키움 코로나리움 식물의 꽃으로부터 유래한 이의 추출물의 피부 보습, 활력 회복 및 재생을 위한 화장료 용도를 기술하고 있다. 나아가, 이 꽃의 고농도 플라보노이드로 인한 항노화 효과 및 항염증 및 항과산화 활성, 그리고 미세혈관 및 모세관의 강화, 및 부종 및 광 유도성 홍반 형성을 방지하는 특성이 언급되어 있다.
WO 2006/053415 A1은 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, HLE(인간 백혈구 엘라스타제)의 억제 메커니즘을 이용하는 적용을 포함한, 화장료 적용에 있어서 몇몇 식물 추출물의 적합성을 언급하고 있다. 그러나 헤디키움 식물 추출물은 활용 가능한 식물의 방대한 목록 상에서 개괄적으로만 언급되고 있고, 헤디키움 종에 대하여 구체적인 효과는 전혀 기술되어 있지 않거나 나타나 있지 않다.
제1 구현예에 따르면, 본 발명은 치료법에 의한 인체의 치료 방법에 사용하기 위한, 예컨대, 특히 피부의 환경적 손상에 대한 보호 및/또는 치료, 더욱 구체적으로는 치료법에 의한 인체의 치료 방법에서의 세포 정화 시스템 중 적어도 하나의 보호 및/또는 활성화를 위한, 헤디키움 코로나리움(Hedychium coronarium) 종의 식물 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
환경적 손상은 임의의 유해한 환경적 영향, 예컨대, 태양 또는 UV 램프 및 태양 시뮬레이터를 포함한 비천연 공급원으로부터의 유해한 방사, 예컨대, UV 복사, 및 오존뿐만 아니라, 예컨대, 독소 및/또는 배기가스, 산업 공해, 농업 공해 및 담배 연기를 포함한 오염물질로부터의 유해한 영향을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "환경적 손상에 대한 보호"는 유해한 환경적 영향으로부터 유래하는 증상 또는 유해한 효과의 방지 및/또는 감소를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "환경적 손상의 치료"는 유해한 환경적 영향으로부터 유래하는 증상 또는 손상의 감소, 개선, 향상 및/또는 제거를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 세포 정화 시스템은 세포 대사의 세포 시스템(이하, "세포 대사 시스템"으로도 지칭됨) 및 살아 있고 온전한 세포를 제공하는 데 필수적이며 살아 있고 생명 유지에 필수적인 세포의 추가적인 핵심 요소 및 유해한 환경적 영향에 대하여 기능하는 세포 방어 시스템을 구성하는 세포 내 장벽 시스템의 세포 시스템을 포함한다. 그 점에 있어서, 세포 대사 시스템 및 세포 내 장벽 시스템의 세포 시스템은 특히 다음의 시스템을 포함한다:
- 세포의 아데노신 삼인산(ATP)의 공급량 대부분을 생성하는 미토콘드리아는 화학적 에너지의 공급원으로 사용되며, 따라서 소위 세포의 동력 공급을 대표한다. 세포 에너지 공급 이외에도, 미토콘드리아는 다양한 기타 중요한 세포 과정, 예컨대, 신호 전달, 열 발생, 세포 분화, 세포 분열 사이클의 제어 및 세포 성장, 세포 사망(세포자멸사), 산화적 대사, 당질, 지질, 칼슘, 철(헴 합성)의 항상성 및 기타 다수에 관여한다.
- 리소좀은 수명을 초과하였거나 더 이상 유용하지 않은 세포 물질의 재활용을 허용하는 세포질의 세포 소기관이다. 이의 주요 기능은 모든 진핵 세포에서 내인성 또는 외인성 기질의 소화(소위 자식작용 또는 이식작용)이다. 리소좀은 세포 폐기물, 지방, 탄수화물, 단백질 및 기타 거대 분자를 단순한 화합물로 분해하며, 그 후 이들은 새로운 세포 구성 물질로서 다시 세포질로 전달된다. 사실, 이의 지질막은 많은 효소(약 40종의 상이한 유형의 가수분해 효소), 양성자 펌프 및 수송 단백질을 함유한다. 산 pH는 산 가수분해효소의 최적의 활성을 허용하도록 조절된다(따라서 리소좀은 세포 위장과 같다). 자식작용은 세포가 그의 에너지원을 동원하여 손상된 세포 소기관을 방어 및 파괴하고 이를 통해 심각한 영향을 피할 수 있게 하는 중요한 메커니즘이다. 이 과정은 단백질 및 비 기능성 세포 소기관을 제거하고 교체할 수 있게 해, 항상성을 보장한다. 이는 장수 제어 및 암 또는 당뇨병과 같은 병리의 성장에 관여한다.
- 특히, 세포 막관통 시스템을 포함하는 세포 내 장벽 시스템은 세포 막관통 시스템이 미토콘드리아로부터의 대사 에너지 생성물의 수송 및 리소좀으로부터 대사 폐기물의 수송을 제어하고 이를 초래하므로 세포의 세포 정화 시스템에서 중요한 역할을 하며, 따라서 살아 있고 온전한 세포를 제공하는 데 필수적인 효과적이며 기능적인 세포 대사에 있어서 중요한 역할을 한다. 강하고 온전한 막관통 시스템은 소위 "밀착 접합부(tight junction)", 즉, 세포 사이에 확립된 접합부(세포-세포 접합부)를 포함한다. 이 접합부는 몇몇 막관통 단백질 패밀리, 예컨대, 클라우딘, 오클루딘 및 부착 분자(ZO-1, ZO-2, ZO-3,…)로 구성된다. 밀착 접합부는 표피층을 포함한 피부 조직에 존재한다. 클라우딘 1 및 4는 표피의 상층(각질형성세포가 분화하는 곳)에서 발견되는 단백질이다. 면역염색법 연구는 이러한 마커의 존재를 보여주었고, 이들 단백질이 특히 상피의 세포들 사이의 세포 간 공간에서 분자들의 흐름을 제어함으로써, 그리고 소분자의 진입을 차단함으로써, 그리고 표피의 상층의 온전성(각질세포들 사이에서 강화된 응집성)을 유지함으로써, 세포 사이의 피부 장벽에 참여한다는 점을 보여주었다. 나아가, 클라우딘은 각질층의 항상성 및 칼슘 구배의 제어에 중요한 역할을 한다. 이 밀착 접합부의 손상은 증가하는 칼슘 유량 및 교란된 구배로 인한 피부 장벽의 손상을 초래하고, 변경된 분화를 초래하며, 결국에는 피부 장벽 보호의 손상으로 이어진다.
- 세포 대사 시스템의 추가의 중요한 양태는 대식세포 및 기타 세포 유형, 예컨대, 상피세포 및 내피세포에 의해 생성되는 케모카인인 인터퓨킨 8(IL-8)의 생산과 관련이 있다. 내피세포는 저장 소포인 Weibel-Palade 소체에 IL-8을 저장한다. IL-8은 처음에는 99개 아미노산 길이의 전구체 펩티드로 생산되며, 절단되어 여러 활성 IL-8 이소형을 생성한다. IL-8은 분비되며, 선천 면역계 반응에서 면역 반응의 중요한 매개체이다. 호중구 화학쏠림 인자(neutrophil chemotactic factor)라고도 알려져 있는 IL-8은 두 가지 주요 기능을 가지고 있다. IL-8은 표적 세포, 주로 호중구뿐만 아니라, 다른 과립구에서 화학주성을 유도하여, 표적 세포들이 감염 부위로 이동하게 한다. IL-8은 또한, 그들이 도착하면 식균작용을 유도한다. IL-8은 또한, 혈관 신생의 강력한 프로모터로 알려져 있다. 표적 세포에서, IL-8은 이동 및 식균작용, 예컨대, 세포 내 Ca2+의 증가, 엑소시토시스(예컨대, 히스타민 방출) 및 호흡 폭발에 필요한 일련의 생리적 반응을 유도한다. IL-8은 선천 면역 반응에 관여하는 톨 유사 수용체가 있는 임의의 세포에 의해 분비될 수 있다. 일반적으로, 대식세포가 가장 먼저 항원을 발견하므로, 다른 세포를 동원하기 위하여 IL-8을 방출하는 첫 번째 세포이다. IL-8의 단량체 및 동종 이합체 형태 모두가 케모카인 수용체인 CXCR1 및 CXCR2의 강력한 유도인자라고 보고된 바 있다.
- 세포 대사 시스템의 추가의 중요한 양태는 β-엔돌핀의 생산에 관한 것이다. β-엔돌핀은 피부 생리학 및 항상성, 신경 영양성 작용, 통증, 면역 방어, 내분비, 감정 및 스트레스 반응과 같은 다양한 생물학적 현상에 관여하는 프로피오멜라노코르틴(POMC)에서 유래한 신경매개체인 내인성 오피오이드이다. 피부에서는 β-엔돌핀이 각질형성세포에 의해 분비되며, 이의 수용체는 주요 피부 세포(각질형성세포, 섬유모세포 및 멜라닌 세포)에 존재한다. 이와 함께, β-엔돌핀은 각질형성세포 이동 자극, 상처 치유 및 세포 분화 관여, 표피 및 모낭 멜라닌 생성 유도 및 모발 성장 제어를 포함하는 다양한 피부 대사 및 피부 방어 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 또한, 증가된 β-엔돌핀은 모낭 멜라닌 세포의 가지돌기의 개수를 조절한다. 이로부터 기능적인 세포 대사 시스템은 세포의 세포 정화 시스템에서 추가적인 중요한 역할을 하며, 따라서, 살아 있는, 그리고 생명 유지에 중요한 세포 및 유해한 환경적 영향에 대해 기능적인 세포 방어 시스템을 제공하기 위한 추가의 필수적인 양태인, 기능적인 β-엔돌핀 생산 시스템을 추가로 요구한다는 것이 명백하다.
- 대사 시스템의 전술된 양태 외에도, 추가적인 양태는 세포의 멜라닌 생성, 즉 멜라닌 세포에 의한 세포에서의 멜라닌 생성에 관한 것이다. 멜라닌은 피부, 눈 및 모발에서 발견되는 색소, 따라서 피부색을 담당한다. 멜라닌 세포는 표피의 기저층에 위치하고 있다. 멜라닌 세포는 각질형성세포에 연결된 가지 세포로, 멜라닌을 함유하는 특정 세포 소기관인 멜라닌 소체를 전달한다. 멜라닌 생성은 멜라닌 합성 및 각질형성세포로의 전달의 두 단계를 포함한다. 멜라닌은 골지체 및 조면 소포체로부터 생겨나는 세포 소기관인, 멜라닌 세포의 멜라닌 소체에서 합성된다. 멜라닌의 합성은 티로시나제 효소에 의해 촉매되어, 아미노산 티로신으로부터 이루어진다. 티로신은 디하이드록시페닐알라닌(DOPA)에 대해 반응하고, 그 후, 이는 도파퀴논으로 산화된다. 몇몇 추가적인 화학 반응 단계 후, 마침내 멜라닌이 형성된다. 멜라닌 세포 내에서, 멜라닌 색소는 멜라닌 소체인 "백(bag)"에 갇히고, 그 후, 멜라닌 소체는 표면으로 보내진다. 멜라닌 세포는 몇몇 각질형성세포와 접촉할 수 있게 하는 가지돌기 연결부가 있다. 멜라닌 소체는 그들이 생성된 세포체로부터 그들이 축적되는 가지 끝으로 수송되며, 멜라닌이 분산되는 인접한 각질형성세포로 전달된다. 일반적으로, 멜라닌 생성은 오래 지속되는 색소 침착을 초래하는데, 이는 기존 멜라닌의 산화로 인한 색소 침착과는 대조적이다. 멜라닌 생성에는 기저 수준과 활성화된 수준이 있다. 일반적으로, 밝은색 피부의 사람들은 낮은 기저 수준의 멜라닌 생성을 나타낸다. UV-B 복사선에의 노출은 증가된 멜라닌 생성을 초래한다. 멜라닌 생성의 목적은 피부 아래층인 진피를, 그것을 손상시킬 수 있는(DNA 광 손상) UV-B 광선으로부터 보호하는 것이다. 멜라닌의 색은 어두워서, 대부분의 UV-B 광선을 흡수하여 UV-B 광선이 이 피부층을 통과하지 못하도록 차단할 수 있게 한다. 다수의 자극이 멜라닌 생성 또는 배양된 멜라닌 세포에 의한 멜라닌 생산을 바꿀 수 있지만, 그것이 작용하는 방법은 완전히 이해되지는 않는다. 또한, 독성 오염물질 및 UV 조사와 같은 유해한 환경적 영향은 멜라닌 생성 및 결국에는 색소 침착을 유발할 수 있다. 보호 기능과 관련하여, 기능적인 멜라닌 생성은 바람직하게는 일정하고 균일한 피부의 색소 침착을 제공한다. 유해한 환경적 영향으로 인해 중요한 세포의 멜라닌 생성이 악화되어 원하지 않는 얼룩 같은 색소 침착을 유발할 수 있으며, 가장 위험한 유형의 피부암이자 색소를 함유하는 멜라닌 세포로부터 발달하는 흑색종(악성 흑색종이라고도 알려져 있음)의 형성을 초래할 수 있다. 흑색종의 주된 원인은 낮은 수준의 피부 색소를 가진 이들에서의 자외선(UV) 노출이다. 이로부터 기능적인 세포 대사 시스템이 일정하고 균일한 피부의 방어적 색소 형성을 도출하고, 원하지 않는 얼룩 같은 색소 침착, 특히 흑색종 형성을 방지하는, 생명 유지에 중요하고, 기능을 발휘하는 멜라닌 생성 시스템을 추가로 요구한다는 것은 명백하다. 따라서, 기능적인 멜라닌 생성은 세포의 세포 정화 시스템에서 추가적인 중요한 역할을 하며, 따라서 이는 살아 있는, 그리고 생명 유지에 중요한 세포 및 유해한 환경적 영향에 대해 기능적인 세포 방어 시스템을 제공하기 위한 추가의 필수적인 양태이다.
전술한 설명으로부터, 생명 유지에 중요하고 기능적인 세포는 유해한 환경적 영향에 대항하여 생명 유지에 중요하고 기능적인 세포 방어 시스템을 위한 강력한 세포 정화 시스템을 필요로 하며, 이때, 이러한 세포 정화 시스템은 특히, 기능적인 미토콘드리아, 리소좀, IL-8 생산, β-엔돌핀 생산, 멜라닌 생성 및 강력하고 온전한 세포 막관통 시스템의 핵심 요소들의 최적의 상호 작용과 함께, 생명 유지에 중요하고 기능적인 세포 대사 시스템을 기반으로 하며, 본 발명에 따라 이들은 함께 세포의 세포 정화 시스템을 형성한다.
따라서, 본 발명은 본 명세서에서 앞서 정의한 바와 같은 조성물에 관한 것으로, 이때, 상기 정화 시스템은 미토콘드리아 보호 및/또는 활성화, 리소좀 보호 및/또는 활성화, 세포 IL-8 방출 억제, β-엔돌핀의 세포 생성, 불규칙한 멜라닌 방출의 억제, 및 클라우딘 회생에 의한 세포 막관통 시스템의 보호 및/또는 활성화로부터 선택된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "추출물"은 헤디키움 코로나리움 식물 종의 식물의 유사하거나 상이한 부분의 추출에 의해 유래된 작용제를 의미한다. 본 발명에 따른 추출물은 이 식물의 추출된 부분(들)으로부터 분리된 화합물의 혼합물이다.
특정 구현예에 따르면, 상기 헤디키움 코로나리움 종의 식물 추출물은 이 식물의 꽃, 종자, 열매, 잎, 줄기, 뿌리 및/또는 뿌리줄기로부터 유래하며; 더욱 구체적으로는 이 식물의 뿌리 및/또는 뿌리줄기로부터 유래한다.
본 발명의 조성물은 적어도 1종의 용매 및/또는 적어도 1종의 국소적으로 허용 가능한 보조 물질을 더 포함할 수 있다.
적합한 용매의 예는 저급 C1-C8-알코올 C1-C8-알킬 폴리올, C1-C8-알킬 케톤, C1-C8-알킬 에테르, 아세트산, C1-C8-알킬 에스테르, 클로로포름, 및/또는 무기 용매, 예컨대, 물, 무기 산, 예컨대, 염산, 및 무기 염기, 예컨대, 수산화나트륨, 및 이의 혼합물을 포함한다.
바람직한 용매는 에탄올, 1-프로판올, 이소프로필 알코올, 에틸 아세테이트, 부틸 아세테이트, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등 및 이의 혼합물을 포함한다. 에탄올, 물 및 글리세롤 및 이의 혼합물이 가장 바람직하다.
본 명세서에서 이전에 정의한 바와 같이, 헤디키움 코로나리움 종의 식물 추출물은 0.05% 내지 5.0%(중량/부피), 더욱 바람직하게는 0.1% 내지 3.0%(중량/부피), 훨씬 더 바람직하게는 0.2 내지 2.0%(중량/부피)의 범위의 농도를 갖는다.
화장료로 허용 가능한 보조 물질은 다음을 포함한다:
- pH 조절제, 예컨대, 완충 물질;
- 당업자에게 주지된 모든 화장료로 허용 가능한 무기 및 유기 산을 포함하는 무기 및 유기 산 또는 염기;
- 지방 물질, 예컨대, 미네랄 오일, 예를 들어, 파라핀 오일 또는 바셀린 오일, 실리콘 오일, 및 식물 유래 오일, 예컨대, 코코넛 오일, 스위트아몬드 오일, 아프리콧 오일, 옥수수 오일, 호호바 오일, 올리브 오일, 아보카도 오일, 세삼 오일, 팜 오일, 유칼립투스 오일, 로즈마리 오일, 라벤더 오일, 파인 오일, 타임 오일, 민트 오일, 카르다몸 오일, 오렌지꽃 오일, 대두유, 겨기름, 쌀기름, 유채씨유 및 피마자유, 밀배아유 및 이로부터 분리된 비타민 E, 달맞이꽃 오일; 동물성 오일 또는 지방, 예컨대, 수지, 라놀린, 클래리파이드 버터, 중성 오일(미글리콜(Miglycol) 812), 스쿠알렌, 지방산 에스테르, 지방 알코올의 에스테르, 예컨대, 트리글리세라이드, 글리세롤모노스테아레이트, 세틸알코올, 중쇄 트리글리세라이드, 화이트 바셀린, 매크로골-1000-글리세롤모노스테아레이트, 프로필렌글리콜 및 정제수를 포함하는 소위 기초 크림("Basiscreme") DAC(독일 의약품 Codex(Deutscher Arzneimittel Codex)에 따른 중요한 기초 조성물), 및
- 식물 레시틴(예컨대, 대두 레시틴), 식물로부터 분리된 스핑고지질/세라마이드,
- 피부 온도에 상응하는 녹는점을 갖는 왁스 물질, 예컨대, 밀랍, 카르나우바 왁스 및 칸델릴라, 미세결정 왁스, 폴리에틸렌 또는 실리콘 왁스, 및 특히 국소 적용에 적합한 모든 오일 및 왁스, 예컨대, 문헌[CTFA publication Cosmetic Ingredient Handbook, 1st ed., 1988, The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington]에 언급된 것들;
표면 활성제, 예컨대, 분산제, 습윤제, 유화제 등;
- 충전제;
- 안정화제;
- 공용매;
- 염료 및 색소;
- 보존제;
- 보습제;
- 항산화제;
- UV 보호제
- 연화제;
- 윤활제 또는 슬립제;
- 피부 컨디셔닝제.
바람직한 보조 물질은 항산화제, 보습제, 연화제, 피부 컨디셔닝제, 지방 물질, 예컨대, 특히 화장료 지방 및 오일, 및 UV 보호제의 군으로부터 선택된다.
일반적으로, 본 발명의 맥락에서 위에 언급된 물질들의 보조 물질 카테고리로의 분류는 이들 보조 물질들도 특정 활성을 나타낼 수 있고, 특히 보습 및 지질 보충 효과를 갖는 오일 및 기타 보조 물질에 어느 정도 적용되는 활성을 나타낸다는 사실을 배제하지 않는다.
본 발명의 조성물은 적어도 1종의 추가적인 화장 활성제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 화장제 또는 화장 활성 조성물을 이용하여 제조된 작용제는 본질적으로 독일 식품 생활용품 사료법(German Food and Feed Code)[독일어 = LFGB]에서 말하는 작용제, 즉 그것들이 주로 질병, 고통, 신체 손상 또는 병리학적 증상의 경감 또는 제거를 위한 것이 아닌 한, 피부 관리제, 세정, 관리를 위한, 또는 외모 또는 체취에 영향을 미치기 위한, 또는 향기로운 인상을 부여하기 위한, 인간에서 외용을 위한 물질 또는 물질 제형이다. 화장 활성제의 예는 일반적으로 다음을 포함한다: 항여드름제, 항미생물제, 항발한제, 수렴제, 탈취제, 모발제거제, 피부 컨디셔닝제, 피부 연화제, 피부 수분 증가제, 예컨대, 글리세롤 또는 우레아, 선스크린제, 각질용해제, 자유 라디칼 스캐빈저, 항지루제, 항비듬제, 방부 활성 화합물, 피부 노화 조짐 치료를 위한 활성 화합물 및/또는 피부의 분화 및/또는 증식 및/또는 색소 침착을 조절하는 작용제, 비타민, 예컨대, 비타민 C(아스코르브산) 및 이의 유도체, 예컨대, 글리코시드, 예컨대, 아스코르빌 글루코시드, 또는 아스코르브산의 에스테르, 예컨대, 소듐 또는 마그네슘 아스코르빌 포스페이트 또는 아스코르빌 팔미테이트 및 스테아레이트, L-아스코르브산 포스페이트 에스테르, L-아스코르브산 포스페이트 에스테르의 알칼리 금속 염, 예컨대, 소듐 및 포타슘 염; L-아스코르브산 포스페이트 에스테르의 알칼리 토금속 염, 예컨대, 마그네슘 및 칼슘 염; L-아스코르브산 포스페이트 에스테르의 3가 금속 염, 예컨대, 알루미늄 염; L-아스코르브산 설페이트 에스테르의 알칼리 금속 염, 예컨대, L-아스코르브산 설페이트 에스테르의 소듐 및 포타슘 염; L-아스코르브산 설페이트 에스테르의 알칼리 토금속 염, 예컨대, 마그네슘 및 칼슘 염; L-아스코르브산 설페이트 에스테르의 3가 금속 염, 예컨대, 알루미늄 염; L-아스코르브산 에스테르의 알칼리 금속 염, 예컨대, 소듐 및 포타슘 염; L-아스코르브산 에스테르의 알칼리 토금속 염, 예컨대, 마그네슘 및 칼슘 염; 및 L-아스코르브산 에스테르의 3가 금속 염, 예컨대, 알루미늄 염, 레티노이드(레티놀, 레티날, 레트산), 안트랄린(디옥시안트라놀), 안트라노이드, 퍼옥사이드(특히, 벤조일 퍼옥사이드), 미녹시딜, 리튬 염, 항대사산물, 비타민 D 및 이의 유도체; 카테콜, 플라보노이드, 세라마이드, 다가불포화 지방산, 필수 지방산(예컨대, 감마-리놀렌산), 효소, 조효소, 효소 억제제, 수화제, 피부 진정제, 세정제 또는 거품 형성제, 및 무기 또는 합성 매팅 충전제, 또는 장식용 물질, 예컨대, 색소 또는 염료 또는 파운데이션, 메이크업 제형, 및 기타 화장 치장제, 그리고 눈, 입술, 얼굴 등의 유색 모형 제작을 위한 유색 입자 및 연마제. 나아가, (본 발명의 헤디키움 추출물 이외의) 식물 유래 활성 화합물 추출물 또는 이로부터 수득된 추출물 또는 개별 물질이 언급될 수 있다. 일반적으로, 식물 활성 화합물 추출물은 다음으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: 고체 식물 추출물, 액체 식물 추출물, 친수성 식물 추출물, 친유성 식물 추출물, 개별적인 식물 구성성분; 및 이의 혼합물, 예컨대, 플라보노이드 및 이의 아글리칸(aglycon): 루틴, 퀘르세틴, 디오스민, 하이페로사이드, (네오)헤스페리딘, 헤스페리틴, 은행나무(Ginkgo biloba)(예컨대, 징코플라본 글리코시드), 산사나무 추출물(예컨대, 올리고머 프로시아니딘), 메밀(예컨대, 루틴), 회화나무(예컨대, 루틴), 자작나무 잎(예컨대, 퀘르세틴 글리코시드, 하이페로사이드 및 루틴), 딱총나무(elder) 꽃(예컨대, 루틴), 린덴 꽃(예컨대, 퀘르세틴 및 파르네솔 함유 에센셜 오일), 세인트존스워트 오일(예컨대, 올리브 오일 추출물), 카렌듈라, 아르니카(예컨대, 에센셜 오일 함유 꽃의 유성 추출물, 플라보노이드 함유 극성 추출물), 멜리사(예컨대, 플라본, 에센셜 오일); 면역자극제: 에키나세아 푸르푸레아(Echinacea purpurea)(예컨대, 알코올성 추출물, 신선한 수액, 압착즙), 엘레우테로코커스 센티코서스(Eleutherococcus senticosus); 알칼로이드: 라우월피아(예컨대, 프라즈말린), 페리윙클(예컨대, 빈카민); 추가의 식물성 약리물질: 알로에, 마로니에(예컨대, 에스신), 마늘(예컨대, 마늘유), 파인애플(예컨대, 브로멜라인), 인삼(예컨대, 진세노사이드), 성모 마리아 시슬 열매(예컨대, 실리마린에 대해 표준화된 추출물), 꽝꽝나무 뿌리(예컨대, 루스코제닌), 쥐오줌풀(예컨대, 발레리아내(Valerianae)를 지칭하기도 하는 발레포트리에이트), 카바(예컨대, 카바 락톤), 호프 꽃(예컨대, 호프 비터), 파시플로래, 용담(gentian)(예컨대, 에탄올성 추출물), 안트라퀴논 함유 약물 추출물, 예컨대, 알로인 함유 알로에 베라즙, 화분 추출물, 조류 추출물, 감초 추출물, 야자 추출물, 갈피미아(Galphimia)(예컨대, 오리지널 팅크) 겨우살이(mistletoe)(예컨대, 수성 에탄올성 추출물), 피토스테롤(예컨대, 베타-시토스테롤), 베르바스쿰(verbascum)(예컨대, 수성 알코올성 추출물), 드로세라(예컨대, 리큐어 와인 추출물), 바다갈매나무 열매(예컨대, 그로부터 얻어진 즙 또는 바다갈매나무 오일), 마쉬멜로우 뿌리, 프리뮬러 뿌리 추출물, 아욱(mallow)으로부터의 신선한 식물 추출물, 컴프리(comprey), 담쟁이넝쿨, 속새, 서양톱풀, 창질경이(예컨대, 압착즙), 쐐기풀(Stinging Nettle), 애기똥풀, 파슬리; 노롤레나 로비타(Norolaena lobita), 타게테스 루시다(Tagetes lucida), 티오마 시엠스(Teeoma siems), 모모드디카 카란티아(Momordica charantia)로부터의 식물 추출물, 및 알로에 베라 추출물.
바람직한 화장 활성 화합물은 본 발명에 따른 용도에서 활성인 화합물, 예컨대, 특히 피부관리제, 피부 컨디셔닝제, 피부 연화제, 피부 수분 증가제, 예컨대, 글리세롤 또는 우레아, 선스크린제, 각질용해제, 자유 라디칼 스캐빈저, 항지루제, 피부 노화 조짐 치료를 위한 활성 화합물 및/또는 피부의 분화 및/또는 증식 및/또는 색소 침착을 조절하는 작용제에서 활성인 화합물이다.
본 발명에 따른 헤디키움 코로나리움 종 추출물인 식물 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 국소 적용을 위한 것이다. 따라서, 피부에의 국소 적용에 적합하고, 다양한 제품 유형으로 제조될 수 있는 제형으로는 로션, 크림, 겔, 에멀젼, 스틱, 스프레이, 연고, 클렌징 액체 워시 및 고형 바(bar), 샴푸, 페이스트, 무스, 와이프, 패치, 화장 드레싱 또는 마스크 및 접착 밴드, 하이드로겔, 및 필름 또는 리포좀 제형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
헤디키움 코로나리움 종의 식물 추출물은 본 발명에 따른 조성물에 약 0.001중량% 내지 약 20중량%의 양으로, 특히 약 0.01% 내지 약 10%의 양으로, 바람직하게는 약 0.1중량% 내지 약 5.0중량%의 양으로, 더욱 바람직하게는 약 0.15중량% 내지 약 3.0중량%의 양으로, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.2중량% 내지 약 2.0중량%의 양으로 존재하며, 각각의 경우 조성물의 총 중량을 기준으로 한다.
또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 청구항 제5항에 따른 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물의 제조 방법에 관한 것이다:
- 추출될 헤디키움 코로나리움 식물의 뿌리 및/또는 뿌리줄기의 조각을 특정량 제공하는 것에 있는 단계 a);
- 상기 헤디키움 코로나리움 식물의 뿌리 및/또는 뿌리줄기의 조각을 적합한 용매 또는 용매 혼합물로 추출하여 헤디키움 코로나리움 식물 뿌리 및/또는 뿌리줄기 조각 추출 혼합물을 수득하는 단계 b);
- 단계 b)에서 수득된 상기 헤디키움 코로나리움 식물 뿌리 및/또는 뿌리줄기 조각 추출물 혼합물을 여과하여 헤디키움 코로나리움 식물 뿌리 및/또는 뿌리줄기 조각 추출물 혼합물의 여과액을 수득하는 단계 c);
- 단계 c)에서 수득된 상기 헤디키움 코로나리움 식물 뿌리 및/또는 뿌리줄기 조각 추출물 혼합물의 여과액을 침전시켜 상청액으로부터 고형 잔류물을 분리하는 단계 d);
- 단계 d)에서 수득된 상기 상청액을 여과하여 헤디키움 코로나리움 식물 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물을 투명한 용액으로 수득하는 단계 e);
- 단계 e)에서 수득된 상기 투명한 용액을 적합한 용매 또는 용매 혼합물을 이용하여 원하는 농도로 조정하여 원하는 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물을 수득하는 단계 f).
본 명세서에서 이전에 정의된 바와 같은 방법에서, 단계 a)에서 헤디키움 코로나리움 종의 식물 추출물의 조각은 바람직하게는 파쇄되거나, 절단되거나 분쇄된 뿌리 및/또는 뿌리줄기로부터 선택되고; 단계 b)에서 용매 또는 용매 혼합물은 바람직하게는 친수성 또는 수 혼화성 용매, 예컨대, 바람직하게는 위에 기술된 바와 같은 용매들로부터 선택된다. 바람직하게는 에탄올이 단계 b)에서 헤디키움 조각 추출에 사용된다. 바람직하게는 1회 이상의 하이드로알코올성 추출(바람직하게는 알코올을 이용함)이 수행된다. 바람직하게는 추출은 비율 1/10의 식물 조각 및 하이드로알코올성 용매를 이용하여 수행된다(예컨대, 1 kg의 식물 조각, 예컨대, 특히 50% (w/w) 에탄올 10dm3으로 추출된 뿌리/뿌리줄기 조각). 단계 c)에서는 당업자에게 주지된 통상적인 여과 기술이 적용된다; 단계 d)에서는 고형 잔류물과 상청액은 당업자에게 주지된 통상적인 기술을 이용하여 분리된다; 단계 e)에서는 상청액의 추가 정화 및 정제를 위하여 상청액의 분리가 수행되어 헤디키움 추출물이 투명한 용액의 형태로 수득된다; 단계 f)에서는 투명한 용액의 원하는 농도로의 조정이 바람직하게는 위에 기술된 바와 같은 용매들로부터 선택된 적합한 용매 또는 용매 혼합물로, 더욱 바람직하게는 10/90 내지 90/10, 바람직하게는 20/80 내지 80/20의 부피비의 물과 글리세롤의 혼합물로 달성된다.
특정 구현예에 따르면, 본 명세서에서 이전에 정의된 바와 같은 방법의 단계 f)에서, 투명한 용액의 원하는 농도로의 조정은 비율(부피/부피)이 30/70과 동일한 물/글리세롤 혼합물로 달성된다.
본 발명의 대상인 이 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물은 경구, 국소 또는 비경구로 투여될 수 있는 추가의 제형 내로 도입될 수 있다.
국소용 제형은 적어도 1종의 화장료로 허용 가능한 부형제 및 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물 유효량을 포함하는 것을 특징으로 한다.
위에 기술된 바와 같은 제형의 정의에 사용된 표현 "국소용"은 직접 적용의 경우든 또는 예를 들어, 직물 또는 종이 와이프 또는 피부와 접촉하도록 한 위생 제품 형태의 바디 케어 제품과 같은 간접 적용의 경우든, 상기 제형이 피부 적용에 의해 사용됨을 의미한다.
위에 기술된 바와 같은 국소용 제형의 정의에 사용된 표현 "화장료로 허용 가능한"은 1976년 7월 27일자의 유럽 경제 공동체 협회 지침 번호 76/768/CEE(1993년 6월 14일자의 지침 번호 93/35/CEE로 개정됨)에 따라, 이 제형이, 인체의 다양한 부분(표피, 모발 및 털 시스템, 네일, 입술 및 생식기) 또는 치아 및 구강 점막과, 오로지 및 주로, 세정, 방향, 외관 변형 및/또는 체취 보정 및/또는 보호 또는 양호한 조건으로의 유지를 위하여, 접촉되도록 한 임의의 물질 또는 제제를 포함함을 의미한다.
적어도 1종의 화장료로 허용 가능한 부형제 및 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물 유효량을 포함하는 국소용 제형은 일반적으로 묽은 수성 또는 물/알코올 용액 형태, 단일 또는 다중 에멀젼, 예컨대, 유중수(W/O), 수중유(O/W) 또는 수중유중수(W/O/W) 에멀젼 형태(이때, 오일은 식물성 또는 미네랄성 오일임), 또는 분말 형태이다. 또한, 그것들은 직물 또는 부직포 물질 상에, 그것이 와이프든, 종이 타올든 또는 의복이든 상관 없이, 분산 또는 함침될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물은 위에 정의된 바와 같은 국소 제형에 사용되는 여러 가지 종류의 보강제 또는 활성 성분과 결부되는데, 보강제 또는 활성 성분은 지방, 유기 용매, 증점제, 겔화제, 연화제, 거품 생성 계면활성제 및/또는 세제, 과지방제, 증점 및/또는 겔화 계면활성제, 항산화제, 불투명화제, 안정제, 거품형성제, 향수, 유화 계면활성제, 하이드로트로픽제, 가소제, 과지방제, 텍스쳐 작용제, 색소, 격리제, 킬레이트화제, 보존제, 에센셜 오일, 염료, 친수성 또는 친유성 활성제, 보습제, 향수, 미네랄 또는 유기 선(sun) 필터, 미네랄 충전제일 수 있고, 또는 화장료에 보통 사용되는 임의의 기타 성분일 수도 있다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 오일의 예로 미네랄 오일, 예컨대 파라핀 오일, 바셀린 오일, 이소파라핀 또는 미네랄 화이트 오일, 동물 기원의 오일, 예컨대 스쿠알렌 또는 스쿠알란, 식물 오일, 예컨대 스위트 아몬드 오일, 코코넛 오일, 피마자유, 호호바 오일, 올리브 오일, 유채씨유, 땅콩 오일, 해바라기 오일, 맥아 오일, 옥수수 배아 오일, 대두유, 면실유, 알팔파 오일, 양귀비 오일, 호박 오일, 달맞이꽃 오일, 밀레 오일, 보리 오일, 호밀 오일, 홍화 오일, 캔들베리 오일, 시계초 오일, 헤이즐넛 오일, 팜유, 시어 버터, 행인유, 칼로필룸(calophyllum) 오일, 시심브리움(sisymbrium) 오일, 아보카도 오일, 카렌듈라 오일; 에톡실화 식물 오일; 합성 오일, 예를 들어 지방산 에스테르, 예컨대 부틸 미리스테이트, 프로필 미리스테이트, 세틸 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트, 헥사데실 스테아레이트, 이소프로필 스테아레이트, 옥틸 스테아레이트, 이소세틸 스테아레이트, 도데실 올레에이트, 헥실 라우레이트, 프로필렌글리콜 디카프릴레이트, 라놀산의 에스테르 유도체, 예컨대, 이소프로필 라놀레이트, 이소세틸 라놀레이트, 지방산 모노글리세라이드, 디글리세라이드 및 트리글리세라이드, 예를 들어 글리세롤 트리헵타노에이트, 알킬벤조에이트, 폴리알파올레핀, 폴리올레핀, 예컨대 폴리이소부텐, 합성 이소알칸, 예컨대 이소헥사데칸, 이소도데칸, 과불소화 오일 및 실리콘 오일을 포함한다. 후자는 더욱 구체적으로는 디메틸폴리실록산, 메틸페닐폴리실록산, 아민으로 개질된 실리콘, 지방산으로 개질된 실리콘, 알코올로 개질된 실리콘, 알코올 및 지방산으로 개질된 실리콘, 폴리에테르 기로 개질된 실리콘, 개질된 에폭시 실리콘, 플루오르화 기로 개질된 실리콘, 시클릭 실리콘, 그리고 알킬 기로 개질된 실리콘을 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 기타 지방은 지방 알코올 및 지방산을 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 왁스의 예는 밀랍; 카르나우바 왁스; 칸델릴라 왁스; 오우리큐리 왁스; 목랍; 코크 파이버 왁스 또는 사탕수수 왁스; 파라핀 왁스, 리그나이트 왁스; 미세결정 왁스; 라놀린 왁스; 오조케라이트; 폴리에틸렌 왁스; 수소화 오일; 실리콘 왁스; 식물 왁스; 주위 온도에서 고체인 지방 알코올 및 지방산; 주위 온도에서 고체인 글리세라이드를 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 증점 및/또는 유화 중합체의 예는 아크릴산 또는 아크릴산 유도체의 단독중합체 또는 공중합체, 아크릴아미드의 단독중합체 또는 공중합체, 아크릴아미드 유도체의 단독중합체 또는 공중합체, 아크릴아미도 메틸프로판 설폰산의 단독중합체 또는 공중합체, 비닐 단량체, 트리메틸아미노에틸 아크릴레이트 클로라이드, 식물 또는 생합성 기원의 하이드로콜로이드, 예를 들어, 잔탄검, 카라야검, 카라게네이트, 알기네이트; 실리케이트; 셀룰로오스 및 이의 유도체; 전분 및 이의 친수성 유도체; 폴리우레탄을 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 고분자전해질 유형의 중합체는 예를 들어, 아크릴산 및 2-메틸-[(1-옥소-2-프로페닐)아미노] 1-프로판 설폰산(MPSA)의 공중합체, 아크릴아민 및 2-메틸-[(1-옥소-2-프로페닐)아미노] 1-프로판 설폰산의 공중합체, 2-메틸-[(1-옥소-2-프로페닐)아미노] 1-프로판 설폰산 및 (2-하이드록시에틸) 아크릴레이트의 공중합체, 2-메틸-[(1-옥소-2-프로페닐)아미노] 1-프로판 설폰산의 단독중합체, 아크릴산의 단독중합체, 아크릴로일 에틸 트리메틸 암모늄 클로라이드 및 아크릴아미드의 공중합체, MPSA 및 비닐피롤리돈의 공중합체, 아크릴산 및 알킬 아크릴레이트의 공중합체(여기서, 탄소 사슬은 10 내지 30개의 탄소 원자를 포함함), MPSA 및 알킬 아크릴레이트의 공중합체(여기서, 탄소 사슬은 10 내지 30개의 탄소 원자를 포함함)를 포함한다. 이러한 중합체는 본 출원인에 의해 각각 SIMULGELTM EG, SEPIGELTM 305, SIMULGELTM NS, SIMULGELTM INS 100, SIMULGELTM FL, SIMULGELTM 800, SIMULGELTM A라는 상품명으로 판매된다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 유화제의 예는, 프랑스 특허 출원 2 668 080, 2 734 496, 2 756 195, 2 762 317, 2 784 680, 2 784 904, 2 791 565, 2 790 977, 2 807 435 및 2 804 432에 기술된 지방산 염, 에톡실화 지방산, 지방산 및 소르비톨의 에스테르, 에톡실화 지방산의 에스테르, 폴리소르베이트, 폴리글리세롤 에스테르, 에톡실화 지방 알코올, 수크로오스 에스테르, 알킬폴리글리코시드, 황산화 및 인산화 지방 알코올 또는 알킬폴리글리코시드 및 지방 알코올의 혼합물을 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 거품형성 계면활성제 및/또는 세제의 예는 이 활성 분야에서 일반적으로 사용되는 국소적으로 허용 가능한 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비이온성 계면활성제를 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 음이온성 계면활성제는 특히 다음 화합물의 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염, 암모늄 염, 아민 염, 아미노 알코올 염을 포함한다: 알킬에테르 설페이트, 알킬 설페이트, 알킬아미도에테르 설페이트, 알킬아릴폴리에테르 설페이트, 모노글리세라이드 설페이트, 알파-올레핀 설포네이트, 파라핀 설포네이트, 알킬 포스페이트, 알킬에테르 포스페이트, 알킬 설포네이트, 알킬아미드 설포네이트, 알킬아릴 설포네이트, 알킬카복실레이트, 알킬설포석시네이트, 알킬에테르설포석시네이트, 알킬아미드설포석시네이트, 알킬설포아세테이트, 알킬사르코시네이트, 아실화 티오네이트, N-아실타우레이트 및 아실락틸레이트.
또한, 국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 음이온성 계면활성제는 아미노산, 펩티드, 단백질의 N-아실화 유도체(여기서, 아실 사슬은 8 내지 16개의 탄소 원자를 포함함); 선택적으로 수소화된 지방산 염, 코코넛 오일의 산 염을 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 양쪽성 계면활성제는 특히 알킬베타인, 알킬아미도베타인, 술타인, 알킬아미도알킬설포베타인, 이미다졸린 유도체, 포스포베타인, 암포폴리아세테이트 및 암포프로피오네이트를 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 양이온성 계면활성제는 특히 제4 암모늄 유도체를 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 비이온성 계면활성제는 특히 알킬폴리글리코시드(여기서, 알킬 사슬은 8 내지 16개의 탄소 원자를 포함함), 피마자유 유도체, 폴리소르베이트, 코프라 아미드, N-알킬아민 및 아민 옥사이드를 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 텍스쳐 작용제의 예는 아미노산의 N-아실화 유도체, 예를 들어 아지노모토(AJINOMOTO)사에 의해 AMINOHOPETM LL이라는 상품명으로 판매되는 라우로일 리신, 내쇼날 스타치(NATIONAL STARCH)사에 의해 DRYFLOTM라는 상품명으로 판매되는 옥테닐 전분 석시네이트, 세픽(SEPPIC)에 의해 MONTANOV 14라는 상품명으로 판매되는 미리스틸 폴리글루코시드, 셀룰로오스 섬유, 목화 섬유, 키토산 섬유, 탈크, 견운모 또는 운모를 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 불투명화제 및/또는 펄링제의 예는 나트륨 팔미테이트, 나트륨 스테아레이트, 나트륨 하이드록시스테아레이트, 마그네슘 팔미테이트, 마그네슘 스테아레이트, 마그네슘 하이드록시스테아레이트, 에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 에틸렌 글리콜 디스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디스테아레이트 및 지방 알코올을 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 증점 및/또는 겔화 계면활성제의 예는 다음을 포함한다:
- 선택적으로 알콕실화된, 알킬폴리글리코시드의 지방 에스테르 및 특히 에톡실화된 메틸폴리글루코시드 에스테르, 예컨대 각각 글루카메이트(GLUCAMATE)TM LT 및 글루메이트(GLUMATE)TM DOE120이라는 상품명으로 판매되는 PEG 120 메틸 글루코오스 트리올리에이트 및 PEG 120 메틸 글루코오스 디올리에이트;
- 알콕실화 지방 에스테르, 예컨대 크로틱스(CROTHIX)TM DS53이라는 상품명으로 판매되는 PEG 150 펜타에리트리틸 테트라스테아레이트, 안틸(ANTIL)TM 141이라는 상품명으로 판매되는 PEG 55 프로필렌 글리콜 올리에이트;
- 지방-사슬 폴리알킬렌 글리콜 카바메이트, 예컨대 엘파코스(ELFACOS)TM T211이라는 상품명으로 판매되는 PPG 14 라우레스 이소포릴 디카바메이트, 엘파코스TM GT2125라는 상품명으로 판매되는 PPG 14 팔메스 60 헥실 디카바메이트.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 선 필터의 예는 개정된 화장품 지침 76/768/EEC의 부록 VII에 나타나는 모든 것들을 포함한다.
국소용 제형에서, 본 발명의 대상인 방법에 따라 수득된 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물과 결부될 수 있는 활성 성분의 예는 미백 또는 탈색 작용을 갖는 화합물, 예를 들어 아르부틴, 코지산, 하이드로퀴논, 엘라그산, 비타민 C, 마그네슘 아스코르빌 포스페이트, 폴리페놀 추출물, 글리코실화 폴리페놀 유도체, 예컨대 로즈마리닐 글루코시드, 포도 추출물, 소나무 추출물, 와인 추출물, 올리브 추출물, 샘(pond) 추출물, N-아실화 단백질, N-아실화 펩티드, N-아실화 아미노산, N-아실화 단백질, 아미노산, 펩티드의 부분 가수분해물, 단백질의 전체 가수분해물, 단백질의 부분 가수분해물, 폴리올(예를 들어, 글리세린 또는 부틸렌 글리콜), 우레아, 피롤리돈 카르복시산 또는 이 산의 유도체, 글리시레틴산, 알파-비스아볼롤, 당 또는 당 유도체, 다당류 또는 이의 유도체, 하이드록시산, 예를 들어 락트산, 비타민, 비타민 유도체, 예컨대 레티놀, 비타민 E 및 이의 유도체, 미네랄, 효소, 조효소, 예컨대 조효소 Q10, 호르몬 또는 호르몬 유사 물질, 대두 추출물, 예를 들어 라퍼민(Raffermine)TM, 밀 추출물, 예를 들어 텐신(Tensine)TM 또는 글리아딘(Gliadine)TM, 식물 추출물, 예컨대 탄닌이 풍부한 추출물, 이소플라본이 풍부한 추출물 또는 테르펜이 풍부한 추출물, 담수성 조류 또는 해조류 추출물, 에센셜 왁스, 세균 추출물, 미네랄, 일반적인 지질, 세라마이드 또는 인지질과 같은 지질, 슬리밍(slimming) 작용을 갖는 활성제, 예컨대 카페인 또는 이의 유도체, 예컨대 아디폴레스(ADIPOLESS)TM라는 상품명으로 판매되는 퀴노아 추출물, 예컨대 세레닉스(SERENIKS)TM 207이라는 상품명으로 판매되는 솔송나무 추출물, 예컨대 아디포슬림(ADIPOSLIM)TM이라는 상품명으로 판매되는 라우로일 프롤린을 포함하는 조성물, 지성 피부에 대하여 항균 활성 또는 정제 작용을 갖는 활성제, 예컨대 리파시드(LIPACIDE)TM PVB, 원기를 주거나 자극하는 성질을 갖는 활성제, 예컨대 세피토닉(SEPITONIC)TM M3 또는 피지오게닐(Physiogenyl)TM, 판테놀 및 이의 유도체, 예컨대 세피캡(SEPICAP)TM MP, 항노화 활성제, 예컨대 세피리프트(SEPILIFT)TM DPHP, 리파시드(LIPICIDE)TM PVB, 세피비놀(SEPIVINOL)TM, 세피바이탈(SEPIVITAL)TM, 수분공급 활성제, 예컨대 세피캄(SEPICALM)TM S, 세피캄TM VG 및 세피리프트(SEPILIFT)TM DPHP, "항-광 노화" 항노화 활성제, 진피-표피 연결부의 온전성을 보호하는 활성제, 세포외 기질 성분의 합성을 증가시키는 활성제, 슬리밍 활성을 갖는 활성제, 예컨대 카페인, 테오필린, AMPc, 녹차, 세이지(sage), 은행나무, 담쟁이덩굴, 마로니에, 대나무, 루스쿠스, 버처즈 브룸(butcher's broom), 센텔라 아시아티카(centella asiatica), 헤더(heather), 울마리아(ulmaria), 푸쿠스(fucus), 로즈마리, 버드나무, 피부에 "열감"을 생성하는 활성제, 예컨대 피부 미세순환 활성화제(예를 들어, 니코티네이트) 또는 피부에 "냉감"을 생성하는 제품(예를 들어, 멘톨 및 이의 유도체)을 포함한다.
본 발명을 본 발명의 특정한 구체적인 구현예에 관한 다음의 실시예에 의해 추가로 설명한다. 달리 지시되지 않는 한, 실시예는 당업자에게 일상에서 주지된 표준적인 기술을 이용하여 수행되었다. 다음의 실시예는 단지 예시적인 목적을 위한 것으로, 본 발명의 조건 또는 범위에 대하여 전적으로 한정적인 것은 아니다. 따라서, 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 어떠한 방식으로도 해석되어서는 안 된다.
- 도 1은 (조사 또는 비 조사 조건 하에) HCR 추출물로 48시간 동안 처리한 섬유모세포에서 ATP 적정을 이용한 실시예 2의 미토콘드리아 보호에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 2는 (조사 또는 비 조사 조건 하에) HCR 추출물로 48시간 동안 처리한 섬유모세포에서 NAD+/NADH 적정을 이용한 실시예 2의 미토콘드리아 보호에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 3은 (조사 또는 비 조사 조건 하에) HCR 추출물로 48시간 동안 처리한 후 LysoTracker 섬유모세포 염색의 정량화를 이용한 실시예 3의 리소좀 보호에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 4는 실시예 4의 HCR 추출물로 24시간 동안 사전 처리하거나 하지 않고, BaP로 오염시키고 24시간 동안 다시 처리한 피부 외식편에 의해 방출된 IL-8에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 5는 실시예 5의 HCR 추출물로 40시간 동안 처리한 후 각질형성세포에 의해 방출된 β-엔돌핀의 적정에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 6은 실시예 5의 HCR 추출물로 40시간 동안 처리한 후 각질형성세포에서의 총 단백질량의 적정에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 7은 실시예 5의 총 단백질에 대해 보고된 HCR 추출물로 40시간 처리한 후 각질형성세포에 의해 방출된 β-엔돌핀의 적정에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 8은 실시예 6의 HCR 추출물(농도 0.001, 0.005 및 0.01% DE)로 72시간 동안 처리한 후 B16 멜라닌 세포에 의해 방출된 멜라닌의 적정에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 9는 실시예 6의 HCR 추출물(농도 0.01, 0.05 및 0.1% DE)로 72시간 동안 처리한 후 B16 멜라닌 세포에 의해 방출된 멜라닌의 적정에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 10은 실시예 6의 HCR 추출물(농도 0.001, 0.005 및 0.01% DE)로 72시간 동안 처리한 후 B16 멜라닌 세포에서의 총 단백질량의 적정에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 11은 실시예 6의 HCR 추출물(농도 0.01%, 0.05% 및 0.1% DE)로 72시간 동안 처리한 후 B16 멜라닌 세포에서의 총 단백질량의 적정에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 12는 실시예 6의 총 단백질에 대해 보고된 HCR 추출물(농도 0.001%, 0.005% 및 0.01% DE)로 72시간 동안 처리한 후 B16 멜라닌 세포에 의해 방출된 멜라닌의 적정에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 13은 실시예 6의 총 단백질에 대해 보고된 HCR 추출물(농도 0.01%, 0.05% 및 0.1% DE)로 72시간 동안 처리한 후 B16 멜라닌 세포에 의해 방출된 멜라닌의 적정에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 14는 실시예 7의 ROS 생성 자극 없이 24시간의 처리 후의 각질형성세포에서의 ROS 유리에 미치는 HCR 추출물의 영향에 관한 결과를 도시한 것이다.
- 도 15는 실시예 7의 ROS 생성 자극과 함께 24시간의 처리 후의 각질형성세포에서의 ROS 유리에 미치는 HCR 추출물의 영향에 관한 결과를 도시한 것이다.
실시예 1: 헤디키움 코로나리움 뿌리 추출물의 제조
헤디키움 코로나리움 뿌리 추출물은 본 발명의 방법에 따라 제조한다.
단계 (a)에서, 최대 10 cm 길이의 크기를 갖는 헤디키움 코로나리움의 파쇄된 뿌리(뿌리줄기)를 적합한 추출 용기에 제공한다.
단계 (b)에서, 물/에탄올 혼합물[50/50(w/w)]을 추출 용매로서 파쇄된 뿌리에 첨가하고, 2회의 추출을 수행한다.
단계 (c)에서, 통상적인 여과 기술을 이용하여 추출 혼합물을 여과한다.
단계 (d)에서, 고체 잔류물을 침전시킨 후, 상청액을 기울여 따라 단계 (c)의 여과액을 농축한다.
단계 (e)에서, 통상적인 여과 기술을 이용하여 단계 (d)의 상청액을 여과한다..
단계 (f)에서, 30/70(v/v)의 비를 갖는 물과 글리세롤의 혼합물 중 20 g/l의 용액으로 단계 (e)의 투명한 용액을 조정한 후, 추가 정제를 위한 최종 여과를 수행하여 2.0%(w/v)의 원하는 농도로 최종 추출물을 수득한다.
실시예 2: UVA를 조사한 섬유모세포에서 미토콘드리아 네트워크에 미치는 헤디키움 코로나리움 뿌리 추출물(HCR 추출물)의 영향 평가(MitoTracker 염색, ATP 및 NAD+/NADH 적정)
1) - 배경 정보
a) - 본 연구의 목적은 UVA 조사된 섬유모세포의 미토콘드리아 분포 및 세포 에너지 대사에 미치는 HCR 추출물의 영향을 평가하는 것이었다.
b) - 41세의 공여자(백인 여성)의 유방 피부 진피로부터 성형수술 후 추출한 정상 인간 섬유모세포(NHF)를 1차 단일층으로 배양하였다;
c) - 그런 다음, 시험 추출물을 24시간 동안 적용하였다,
d) - 세포를 (처리 없이) 조사하고, 시험 화합물을 다시 24시간 더 적용하였다;
e) - 미토콘드리아를 염색하거나 세포를 수집하여 ATP(아데노신 트리포스페이트) 및 NAD+/NADH(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드) 적정을 수행하였다.
2) - 용량 결정(XTT 분석에 의한 세포독성/생존율 확인) 및 평가된 시험 화합물
a) - XTT 분석으로 세포 생존율/독성을 확인하여 작용 용량을 평가한 후, 시험 농도 2% HCR 건조 추출물(배양 배지 중 1/20 HCR 희석액에 해당하며 최종적으로 0.1% HCR을 수득함)을 선택하였다.
b) - 처리 24시간 전에, 항생제(Gibco™ 15140) 및 10%의 소태아혈청(FBS, Gibco™ 10270)를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM)(Gibco™ 41966)에 세포를 96-웰 마이크로플레이트에 (추후에 적정을 위하여 사용된 밀도인 웰당 5,000개 세포의 세포 밀도, 즉, 15,000 NHF/cm²로) 시딩하였다(37℃; 5% CO2에서 인큐베이션). 처리는 FBS 불포함 배지에서 수행하였다(48시간; 37℃; 5% CO2).
c) - 48시간의 처리 후, 웰을 비우고, PBS(인산 완충 식염수)로 살살 헹구었다. 그런 다음, XTT 용액(0.3 mg/ml)을 세포에 적용하고, 플레이트를 암소에서 인큐베이션 시켰다(3시간, 37℃; 5% CO2). 3시간의 인큐베이션 후, 650 nm 기준으로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 결과에서 편견이 될 수 있는 XTT 분자와 추출물 사이의 상호 작용이 존재하지 않음을 확인하기 위하여, 세포 불포함(그러나 산출물은 포함 또는 불포함) 웰에서 XTT 용액을 사용하여 블랭크를 달성하였다. 키트 "세포 증식 키트 II(XTT)"(Roche Diagnostics™ 11465015001)를 이용하여 XTT 시험을 수행하였다. 비색법인 XTT 시스템은 미토콘드리아 활성을 정량화하는 분석법으로, 생존율 시험법으로 사용하였다. 이 시험은 세포의 미토콘드리아 호흡 사슬에 존재하는 "석시네이트-테트라졸륨 환원효소" 시스템에 의한, 노란색의 테트라졸륨 염 XTT의 오렌지색 포르마잔으로의 절단을 기반으로 한다. 따라서, 이 전환은 대사 활성 세포, 즉, 살아있는 세포에서만 일어난다. 유도체 포르마잔은 650 nm 기준으로 450 nm에서의 분광분석법에 의해 측정된다.
d) - 광학 밀도 데이터 평균(OD, 또는 흡광도)을 각 경우에서 계산하였다. 처리된 세포의 생존율을 비처리 대조군의 백분율로 표현하였다:
Figure pct00001
비처리 대조군과 비교하여 미토콘드리아 활성의 80% 한계 미만으로 세포 생존율을 감소시키는 처리를 세포에 대해 유독한 것으로 간주하였다. 반대로, 데이터의 증가는 미토콘드리아 활성을 의미한다.
3) - 미토콘드리아 네트워크 보호의 평가
a) - 처리 하루 전에, 이전에 기술된 바와 동일한 배지(완전 배지, 즉, FBS 함유)에 (60 mm 지름의 페트리 접시당 150,000개 세포의 세포 밀도, 즉, 7,700 NHF/cm²로) 섬유모세포를 접시에 시딩하였다(37℃; 5% CO2에서 인큐베이션). 그런 다음, (각각 하나의 접시에) 각각의 시험 화합물 농도/용량을 24시간 동안 적용하였다(혈청 불포함 배지 중; 37℃/5% CO2에서 인큐베이션). 그런 다음, 세포를 식염수 완충액 중에서 UVA 조사하거나 조사하지 않고(Vilber Lourmat RMX 3W™ 기계에서 8 J/cm²), 마지막으로 24시간 더 (배양 배지 중의) 시험 화합물로 다시 처리하였다.
b) - 미토콘드리아 염색을 평가하기 위하여, 세포를 형광 프로브(Invitrogen MitoTracker™)와 함께 인큐베이션 시켰다. 적절한 형광 필터를 장착하거나 장착하지 않고, x40 대물렌즈(Olympus CK40™ 현미경 및 Archimed Microvision 소프트웨어)로 세포를 관찰하고, 사진을 찍었다. 사진은 각각 미토콘드리아 네트워크 또는 전체 세포의 시각화를 허용하였다.
4) - 대사 활성에 미치는 영향 평가(ATP 및 NAD +/ NADH 적정)
a) - 세포 대사에 미치는 UV 및 시험 산출물의 영향을 확인하기 위하여, ATP 및 NAD+/NADH 적정을 수행하였다.
(i) - 처리 하루 전, 이전에 기술된 바와 동일한 배지에서, 96-웰 플레이트에 (웰당 5,000개 세포의 세포 밀도, 즉, 15,000 NHF/cm²로) 세포를 시딩하였다. 그런 다음, 동일한 처리 및 조사 시간으로 진행했다: (혈청 불포함 배지 중에서) 24시간 동안 1차 적용, 이후 UVA 조사 또는 비조사(동일 용량) 및 마지막으로 24시간 더 2차 처리. 이전처럼, 실험의 시작부터 종료 시까지, 세포를 37℃/5% CO2에서 인큐베이션 하였다. 여기서 각각의 용량을 5반복(ATP의 경우) 또는 6반복(NAD+/NADH의 경우)으로 시험하였다.
(ii) - 적정 단계로 진행하기 위하여, 세포 용해물 또는 펠릿을 처리 종료 시에 수집하였다. 세포 ATP 총 수준의 적정을 위하여, 세포 및 상청액(산출물을 함유하는 배지)를 함유하는 웰에 세제를 첨가하여 세포를 용해시키고 세포 용해물을 수득하였다. 세포 내 NAD+ 및 NADH 적정을 위하여, 상청액을 제거하고, 세포를 투과성으로 만들어 투과성 세포 펠릿을 수득하였다.
(iii) - 그 후, 상업용 키트: 발광성 ATP 검출 분석 키트(Abcam™ ab113849) 및 NAD+/NADH 세포 기반 분석 키트(Cayman Chemical™ 600480)로 적정을 수행하였다.
(iv) - NAD 분석 키트는 두 가지 기존 형태(산화된 NAD+ 및 환원된 NADH)를 투여한다. 먼저, 에탄올 및 알코올 탈수소효소 첨가는 샘플에서 발견되는 NAD+를 NADH로 환원시킬 수 있고, 동시에 에탄올을 산화시킬 수 있다. 그런 다음, 테트라졸륨 염 기질(WST-1)의 유색의 포르마잔으로의 환원과 동시에 총 NADH가 산화된다. 이 결과물의 측정된 양(흡광도)은 각 샘플의 총 NAD(NAD+ 및 NADH)에 비례한다.
(v) - ATP 분석 키트는 반딧불이(포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)) 루시페라제를 기반으로 한 ATP 모니터링 시스템이다. 첨가된 루시페라제 및 D-루시페린이 샘플의 ATP와 반응하여 빛을 생성하고, 이 측정치(발광)는 ATP 농도에 비례한다.
b) - 각각의 표준물질에 대해 수득된 ATP 및 NAD+/NADH 적정의 미가공 데이터, 즉, 발광 단위(RLU) 또는 OD 측정치를 그래프법으로 도표화하여 표준 곡선을 결정하였다. 그 후, 샘플에서 측정된 ATP 또는 NAD+/NADH의 농도를 결정하였다. 각 조건의 정량적 값의 평균을 냈다. 데이터를 농도(ATP 또는 NAD+/NADH의 경우 nM)로서 그래프로 표시하였다. 또한, 조사를 수반하거나 수반하지 않은 (100%로 설정된) 비처리 대조군에 대해, 또는 조사를 수반하지 않은 각각의 동일한 조건(UVA 영향의 평가)에 대해 각 조건에 대해 얻은 결과를 표시할 수 있다:
Figure pct00002
XTT 분석법에 대해 기술한 바와 동일한 기준을 이용하여 결과의 통계적으로 유의미한 영향을 스튜던트 t-검정에 의해 결정하였다(비 조사 또는 조사 대조군, 또는 조사를 수반하지 않은 각각의 동일한 조건과의 비교).
5) - 결과
a) - 용량 결정(XTT 분석법에 의한 세포독성/생존율 확인)
0.0005% 내지 0.01% HCR(건조 추출물(DE)) 시험 농도의 경우, 섬유모세포에 대하여 세포독성이 전혀 관찰되지 않았다:
Figure pct00003
b) - 미토콘드리아 네트워크 보호의 평가
영상 관찰로 세포 모양 및 세포의 미토콘드리아 분포에 미치는 UV 조사의 영향을 관찰할 수 있었다. 실제로, 일부 UV 조사된 섬유모세포는 더 이상 방추형이 아니었고, 미토콘드리아 네트워크는 UV 조사가 없었던 경우보다 덜 체계적으로 보였다. 양성 대조군(비타민 C, 500 μM)의 적용 시, UVA의 영향은 덜 뚜렷하였다. 섬유모세포의 0.01%(의 DE)의 HCR 처리는 UV 조사에 의해 손상된 미토콘드리아 네트워크를 보호하였다. UV에 대한 이 효과는 0.005% 및 0.001%에 해당하는 더 낮은 용량으로는 관찰되지 않았다.
c) - 대사 활성에 미치는 영향 평가(ATP 및 NAD + /NADH 적정)
적정 결과를 도 1에 나타내었다. 비 조사 또는 조사된 대조군에 대해, 또는 비 조사된 각각의 조건에 대해 보고된 농도(nM)로서 데이터를 표시하였다. 비 조사된 대조군 또는 조사된 대조군과 비교하여 통계 p 값을 계산하였다. 조사하지 않은 경우, 어떠한 처리도 ATP 생성의 유의미한 억제 또는 자극을 유도하지 않았다. UV 조사는 섬유모세포에 의한 ATP 생성의 강력하고도 매우 유의미한 억제를 유도하였다(-84%***, 기저 수준, 즉, 조사하지 않은 경우와 비교하여 조사된 대조군). 양성 기준(비타민 C, 500 μM)은 이 에너지 합성에 대한 UVA 영향을 유의미하게 상쇄시켰다(조사된 대조군과 비교하여 +61%*). HCR 처리로, ATP 합성의 유의미하거나 매우 유의미한 증가가 관찰되었다: 0.01%, 0.005% 및 0.001%의 경우, 각각 +136%**, +86%* 및 +146%**.
d) - NAD + /NADH 적정
(i) - 조사가 없을 경우, 모든 처리는 기본 NAD+/NADH 섬유모세포 생성을 억제하는 경향을 나타내었다. 결과를 도 2로 나타내었다.
(ii) - UVA 조사 시, NHF에 의한 이 조효소 합성은 유의미하게 억제되었다(기본 수준과 비교하여 -21%*). 여기서, 비타민 C는 UV 조사된 세포에 의한 NAD+/NADH 방출에 대해 예상했던 긍정적인 효과를 보여주지 않았다. 가장 높은 시험 용량(0.01%)으로의 HCR 적용은 UVA에 의해 감소된 NAD+/NADH 섬유모세포 생성을 복원시켰다(조사된 대조군과 비교하여 +19%*). 두 가지의 나머지 시험 용량에서 이 효과는 유의미하지 않았다(+9%).
e) - 따라서, 본 평가는 UVA가 미토콘드리아 네트워크의 부분적인 해체/붕괴 및 ATP 및 NAD+/NADH 생성의 억제를 유도함을 보여준다. HCR 추출물은 배양되고 UV 조사된 섬유모세포에 대하여 효과를 보여, 유의미하게 ATP 생성을 증가시키고 NAD+/NADH 합성을 자극하였다. HCR 추출물은 UV 조사에 대항하여 미토콘드리아 네트워크를 보호할 수 있다. 따라서, HCR 추출물은 미토콘드리아 및 에너지 대사에 대한 UV 손상에 대하여 피부를 보호하는 데 유효하다.
실시예 3: UVA 조사 섬유모세포에서 리소좀 네트워크에 미치는 HCR 추출물의 영향 평가(LysoTracker 염색)
1) - 배경 정보
a) - 본 연구의 목적은 UVA 조사된 섬유모세포의 리소좀 분포에 미치는 HCR 추출물의 영향을 평가하는 것이었다.
b) - 41세의 공여자(백인 여성)의 유방 피부 진피로부터 성형수술 후 추출한 정상 인간 섬유모세포(NHF)를 1차 단일층으로 배양하였다;
c) - 그런 다음, 시험 추출물을 24시간 동안 적용하였다,
d) - 세포를 (처리 없이) 조사하고, 시험 화합물을 다시 24시간 더 적용하였다;
e) - 그런 다음, 리소좀을 소정의 시험 화합물로 염색하였다.
2) - 용량 결정(XTT 분석에 의한 세포독성/생존율 확인) 및 평가된 시험 화합물
실시예 2에 기술된 바와 같이 XTT 분석법을 이용한 용량 결정을 수행하였다.
3) - 리소좀 네트워크 보호의 평가
a) - 실시예 2에 기술된 바와 같이 섬유모세포 시딩을 수행하였다.
b) - 그런 다음, 세포를 형광 프로브(Invitrogen LysoTracker™)와 인큐베이션 하였다. 적절한 형광 필터를 장착하거나 장착하지 않고, 40배 대물렌즈(Olympus CK40 현미경 및 Archimed Microvision 소프트웨어)로 세포를 관찰하고, 사진을 찍었다. 사진은 각각 리소좀 네트워크 또는 전체 세포의 시각화를 허용하였다.
c) - HCS Pharma(프랑스 렌 소재)의 Colombus 소프트웨어로 형광을 평균 강도로 정량화하였다(각 조건에 대해 3개의 이미지). 그것은 LysoTracker로 염색된 세포 영역에 함유된 염색의 각 픽셀에 대한 강도의 평균값이다(최종 값은 이미지의 모든 세포 값의 평균이므로, 각 이미지의 세포 수가 고려된다).
4) - 결과
a) - 용량 결정(XTT 분석법에 의한 세포독성/생존율 확인)
0.0005% 내지 0.01% HCR(DE) 시험 농도의 경우, 섬유모세포에 대하여 세포독성이 전혀 관찰되지 않았다:
Figure pct00004
b) - 리소좀 네트워크 보호의 평가
(i) - UV 조사된 대조군 영상 관찰로 세포 모양 및 세포의 리소좀 구성에 미치는 조서의 영향을 관찰할 수 있었다. 일부 UV 조사된 섬유모세포는 실제로 더 이상 방추형이 아니었고, 리소좀 네트워크는 비처리 및 비조사 대조군과 비교하여 덜 체계적으로 보였다.
(ii) - 형광 강도 측정치가 유의미하게 감소되어(-29%(유의미 *)), 이러한 효과를 증명하였다. 양성 대조군(비타민 C, 500 μM)의 적용은 UVA의 이 효과를 감소시켰다. 결과를 도 3로 나타내었다. 형광 평균 강도가 더 높았으므로(매우 유의미한 효과 **), 정량화 데이터는 이러한 관찰을 뒷받침하였다.
(iii) - 섬유모세포의 0.01% HCR 추출물 처리는 UV 조사에 의한 리소좀 네트워크 손상을 보호하였다. UV에 대한 이 효과는 추출물 0.005% 및 0.001%로는 덜 뚜렷하였다. 0.01% HCR로 +36%의 증가가 있었으므로(조사된 대조군에 비해 유의미한 *), 이는 형광 정량화 결과에 의해 확인된다. 더 낮은 시험 용량(0.005% 및 0.001%)으로는, 효과가 덜 뚜렷하였고, 유의미하지 않았다(각각 +19% 및 +21%).
c) - 따라서, 본 평가는 UVA 조사가 세포 리소좀 네트워크의 부분적인 손상을 초래함을 보여준다. 시험한 HCR 추출물은 UV 조사된 섬유모세포에 대한 영향을 보여주며, UV 조사에 대항하여, 특히 가장 높은 시험 용량(0.01%)에서 리소좀 네트워크를 보호할 수 있다. 따라서, 이 평가로 HCR 추출물이 UV 손상에 대해 진피 세포의 리소좀을 보호하는 데 효과적이라는 결론을 내릴 수 있다.
실시예 4: 인간 피부 외식편 오염 모델에서 HCR 추출물의 영향 평가
1) - 배경 정보
a) - 본 연구의 목적은 인간 피부 외식편의 오염 모델에서 HCR 추출물의 잠재적인 보호 효과를 평가하는 것이었다.
b) - 유방 성형수술(백인 혈통 44세 여성)로부터 유래된, Biopredic™ International(Rennes)이 제공한 인간 피부 외식편(지름 8 mm)에 산출물을 24시간 동안 전체적으로 적용하였다;
c) - 그런 다음, 산출물을 다시 오염기간 중에, 24시간을 더 적용하였다. 환경 오염물질인 벤조피렌(benzo(a)pyrene)(3,4-벤조피렌/BaP)을 전체 처리, 즉, 배양 배지 중에 적용하여 이 모델에서 상기 오염을 유도하였다. 이 오염물질은 IL-8 방출을 유도한다(SEPhRA 결과).
d) - 외식편에 의한 염증성 사이토카인 IL-8(인터류킨 8)의 방출을 상청액(배양 배지)의 적정에 의해 분석하였다.
e) - 또한, 피부 외식편을 클라우딘 1 및 4 발현(CLDN1 및 CLDN4)의 면역염색에 의한 분석을 위해 보존하였다.
2) - 오염의 인간 피부 외식편 모델
a) - 2%(DE) HCR 추출물을 배양 배지에 희석하여 0.1% (DE) HCR 추출물을 수득하고, 이를 시험 화합물로 사용한다.
b) - 24시간의 사전 처리로서 상기 HCR 추출물을 피부 외식편에 전체적으로 적용하였다.
c) - 그런 다음, 추가 24시간 동안, 이 피부 외식편을 BaP(Sigma CRM40071, 40 μM 전체적)로 오염시키거나 오염시키지 않고, 오염되지 않은 피부 외식편과 오염된 피부 외식편에 다시 HCR 추출물을 전체적으로 적용하였다. 각각의 비오염 조건을 3반복하여 시험하였고(3개의 외식편: 면역염색용 2개 및 조직학용 1개), 각각의 오염된 조건을 4반복하여 시험하였다(4개의 외식편: 면역염색용 3개 및 조직학용 1개).
d) - (각 조건, 3개의 비오염 외식편 및 4개의 오염된 외식편에 대해 제거된)상청액에서의 적정을 2반복으로 수행하였다.
e) - IL-8 적정을 검증하기 위하여, 추가 조건, 즉, 1 μg/ml의 기준 전염증성 분자 PMA(포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트, Sigma P8139)로의 자극을 평가하였다. 추출물 비처리 및 비오염된 하나의 외식편에 마지막 24시간 동안 이 제품을 전체적으로 적용하였다.
3) - 피부 외식편의 처리
a) - 그런 다음, 5% 태아 송아지/소 혈청(FBS, Invitrogen™ 10270) 및 300 μL/웰 항생제(페니실린 100 U/ml 및 스트렙토마이신 100 μg/ml, Invitrogen™ 15140)가 첨가된 DMEM 배지(Invitrogen™ 31053)를 채운 24-웰 플레이트에 피부 외식편을 넣었다. 37℃/5% CO2에서 4시간 동안 외식편을 안정화시켰다.
b) - 안정화 후, 24시간 동안 37℃/5% CO2에서 인큐베이션된 외식편 배지 중에 추출물을 전체적으로 적용하거나 적용하지 않았다. 그 때, 사용된 배지는 FBS가 첨가되지 않은 DMEM이었다. 그런 다음, HCR 추출물로 다시 처리(또는 비처리)하면서(37℃/5% CO2 인큐베이션), 24시간 동안 BaP(40 μM)의 전체적인 적용으로 외식편을 오염시키거나 오염시키지 않았다.
c) - IL-8을 투여하기 위하여 이 기간 종료 시 상청액(처리 배지)을 저장하였다. 각 조건(오염 또는 비오염)의 하나의 외식편을 4% 포름알데히드에 보존하여 조직학적 분석(H/E/S 염색)을 수행하였다. 다른 외식편들은 추후 면역염색 실험을 위하여 액체 질소에 동결 보존하였다.
d) - 그런 다음, ELISA 방법인 Bio-Techne/R&Dsystems(D8000C)의 상업적인 키트로 염증성 사이토카인 IL-8을 측정하였다. 각각의 경우에, 측정은 2회씩 이루어졌다. 570 nm를 기준으로, 450 nm 파장에서 흡광도 또는 광학 밀도(OD)를 측정하여 적정 미가공 데이터를 획득하였다.
e) - IL-8 표준물질의 농도 범위를 이용하여 샘플에서 측정된 IL-8의 농도를 결정하였다. IL-8 표준물질(pg/ml)에 대해 얻은 OD 데이터를 가로축에 농도 및 세로축에 OD를 나타낸 표준곡선으로 도표화하였고, 보정 직선을 이용하여 각 데이터에 대하여 블랭크 평균을 감산하여 OD 데이터로부터 IL-8의 양(pg/ml 또는 ng/ml)을 결정하였다.
OD "샘플" = OD "미가공 데이터" - OD 평균 "블랭크"
각 조건의 정량적 값의 평균을 내고, IL-8 농도(ng/ml)를 도 4에 나타내었다.
4) - CLDN 1 및 4 면역염색
a) - 이들 단백질의 발현을 형광 면역염색법으로 관찰하였는데, 형광 면역염색법은 두 개의 항체로 표적 단백질을 검출하는 것을 수반하는 검출 방법이다. 첫 번째 항체인 1차 항체는 단백질에 특이적이어서, 단백질을 검출한다. 그런 다음, 1차 항체에 특이적인 2차 항체는 단백질-1차 항체 복합체를 검출할 수 있고, 형광을 방출한다. 이러한 방식으로 표적 조직, 여기서는 표피 피부의 표적 단백질의 발현 프로파일을 관찰할 수 있다.
b) - 면역염색 전, 동결 보존된 외식편을 크라이오스탯으로 절단하였다. 동결된 절단편을 슬라이드에 올리고, 동결 보존하였다.
c) - 면역염색을 시작하기 위하여, 슬라이드를 해동시키고, 아세톤으로 고정시켰다. 그런 다음, 1차 항체의 비특이적인 고정 부위를 2차 항체와 동일한 종의 혈청(Santa Cruz)으로 차단하였다("차단"). 클라우딘 1 또는 4를 표적으로 하는 1차 항체(각각 Santa Cruz sc-81796 또는 sc-17664)와 실온에서 인큐베이션 한 후, 절단편을 형광 색소(알렉사(Alexa) 종류, Invitrogen™, 488 또는 546 nm, 녹색 또는 적색) 및 DNA에 특이적인 청색 형광 마커인 DAPI(Roche™)에 커플링된 2차 항체와 인큐베이션 하여 핵을 염색하였다.
d) - 마지막으로, 형광 보호를 제공하고 슬라이드 상에 커버 슬립을 접착시키는 마운팅 배지(Dako)로 슬라이드를 "마운트"시켰다. 형광 색소(FITC 녹색, 또는 TRITC 적색) 또는 DAPI(청색)에 대한 적당한 필터를 장착한 형광 광학 현미경(Olympus CK40) 하에 x40 대물렌즈로 슬라이드를 관찰하였다. Archimed logiciel(Microvision)로 영상을 획득하였다.
e) - 이들 두 가지 염색 각각에 대해, 1차 항체의 특이성 제어인 이소형 제어를 수행하였다. 하나의 보조 절단편 슬라이드 상에, 1차 항체 대신, 1차 항체의 동일한 종으로부터 비특이적 면역 글로불린의 혈청(IgG, Santa Cruz)을 사용하였다.
f) - 조직학 대조군을 제조하여 오염 또는 비오염, 처리 또는 비처리 피부 외식편의 조직 온전성을 확인하였다(제공받은 조직 품질 및 처리에 의한 조직 구조 열화 부존재 확인). 처리 종료 시 4% 포름알데히드에 외식편을 고정 및 보존시켰다(각 조건에 대해 1개). 그런 다음, 외식편을 파라핀에 포함시키고, 절단편을 슬라이드 위에 마운트시키고, 헤마톡실린/에오신/사프란(또는 HES)으로 염색하였다.
5) - 결과
a) - 조직학적 분석
(i) - BaP 오염물질 전체 적용의 경우, 클라우딘 1의 분해(발현 억제 및 메싱 실패)가 관찰되었다.
(ii) - HCR 추출물은 오염물질로 인해 초래된 열화를 회복시켰다.
(iii) - BaP 오염물질의 적용은 또한, 클라우딘 4의 발현을 저하시켰다(구조 손상, 형광 강도의 감소; 더 얇고 덜 두꺼운 영역).
(iv) - HCR 추출물 전체 적용은 오염물질로 인한 메싱 실패를 회복시켰다.
b) - 피부 외식편으로부터 방출된 IL-8의 적정
(i) - 오염 후 또는 비오염 후 IL-8 적정 결과를 도 4에 나타내었다. 여기서, 데이터를 IL-8 농도로 표시하였다. 비오염 대조군과 비교하여(검은색 별표) 또는 오염된 대조군과 비교하여(빨간색 별표) 유의도를 표시하였다.
(ii) - 오염 후, 사이토카인 방출이 자극되었다: +59% 유의미함(*)(비처리/비오염 대조군과 비교하여 오염된 대조군). 오염 없이, PMA 자극(전염증성 기준 분자)으로, 사이토카인 방출이 자극되었다: +224% 매우 유의미함(***)(비처리/비오염 대조군과 비교).
(iii) - HCR 추출물 전체 적용으로, IL-8 방출은 오염 또는 비오염 조건에서 억제되었다. 비오염의 경우, 이 효과는 -69%였고, 매우 유의미하였다(***, 비처리/비오염 대조군과 비교). 오염의 경우, 오염물질에 의해 유도된 IL-8 생성은 HCR 추출물 적용에 의해 억제되었다: -69%, 매우 유의미함(***, 오염된 대조군과 비교).
c) - 이 결과는 오염에 의해 유도되는 염증성 스트레스 매개인자에 대항하여 싸우는 HCR 추출물의 유효성을 증명한다. 따라서, HCR 추출물은 오염물질에 의해 유도된 염증성 스트레스 및 조직 온전성, 항상성 및 표피 장벽 기능 유지에 참여하는 단백질에 의해 겪는 분해로부터 피부를 보호하는 데 유효하다고 결론지을 수 있다.
실시예 5: 정상 인간 각질형성세포에 의한 β-엔돌핀 생성에 미치는 HCR 추출물의 효과 평가
1) - 배경 정보
본 연구의 목적은 30세 공여자(백인 여성)의 복부 피부 표피로부터 추출된 정상 인간 각질형성세포(NHK)에 의한 β-엔돌핀(또는 β-EP)에 미치는 4종의 HCR 추출물의 시험관 내 효과를 평가하는 것이었다. β-엔돌핀은 40시간의 처리 후 ELISA 기술에 의해 배양 상청액에서 측정된 신경펩티드이다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, 시험할 농도를 결정하기 위하여, XTT 분석을 미리 수행하여 세포 생존율을 확인하였다.
2) - 용량 결정(XTT 분석에 의한 세포독성/생존율 확인) 및 평가된 시험 화합물
a) - 실시예 2에 기술된 바와 같이, 그러나 [실시예 §c)에서의 48시간 대신] 24시간 처리 후에, XTT 분석법을 이용한 용량 결정을 수행하였다.
b) - 세포 시딩 및 처리
처리 24시간 전에, 완전 KSFM(각질형성세포 무혈청 배지, 항생제 및 성장 보충제 포함)에서, 96-웰 마이크로플레이트에 12,500개 각질형성세포/웰(본 연구에서 나중에 사용된 세포 밀도인 37,500개 세포/cm²와 동일)로 세포를 시딩하였다(37℃/5% CO2에서 인큐베이션). 기저의, 즉, 보충하지 않은 배지(성장 보충제 불포함 KSFM)에서 시험 화합물 각 농도를 3반복하여 시험하였다. 인큐베이션 시간은 24시간이었다(37℃/5% CO2).
3) - 각질형성세포에 의한 β-엔돌핀 생성
a) - NHK를 24웰 플레이트에 시딩하고, 40시간 동안 상이한 농도의 시험 화합물을 처리하였다. USCN Life Science(CEA806Hu)의 ELISA 분석법으로 배양 상청액에서 β-EP를 측정하였다. 또한, 총 단백질량에 대해 β-EP 적정을 보고하기 위하여, 세포 펠릿에서 총 단백질을 측정하였다. 2 mM의 dbAMPc(N-6, 2'-O-디부티릴아데노신 3',3'-사이클릭 모노포스페이트, Sigma D0627)를 양성 대조군으로 사용하였다.
b) - 세포 처리 및 β-EP 분석
처리 48시간 전, 완전 KSFM 중 24웰 플레이트에 75 000개 세포/웰(37,500개 세포/cm²)로 세포를 시딩하였다(37℃/5% CO2에서 인큐베이션). 각 농도의 시험 화합물을 분자의 항-프로테아제 칵테일(류펩틴, 아프로티닌 및 페닐메탄설포닐 플루오라이드 또는 PMSF, 각각 Sigma L8511, A1153 및 P7626)이 첨가된 기본 KSFM에서 3반복하여 시험하였다. 이 칵테일은 적정 시까지 β-EP 단백질을 보호할 수 있게 하였다. 인큐베이션 시간은 40시간이었다(37℃/5% CO2). 시험 전에 배양 상청액 및 세포 펠릿을 수집하고 -20℃에 저장하였다.
c) - 흡광도 데이터(또는 광학 밀도, OD)를 450 nm에서 측정하였다. 각 샘플을 2반복하여 분석하였고, 따라서 각 샘플에 대해 6개의 값이 존재했다(비처리 대조군 및 기준 분자 제외, 이들의 경우 각각 8개와 2개 값이 있었다).
d) - 단백질 적정(Bca 분석)
세포 펠릿 중 총 단백질 적정은 바이신코닌산(bicinchoninic acid)을 기반으로 한 비색법으로 동시에 수행하였다. 바이신코닌산(BCA) 분석의 원리는 Lowry 절차와 유사하며, 둘 다 알칼리 조건 하에 단백질-Cu2+ 복합체의 형성에 이은 Cu2+의 Cu+로의 환원에 의존한다. BCA는 Cu+ 이온에 대해 매우 특이적이며 알칼리 환경에서 Cu+와 자주색-청색 복합체를 형성하여, 단백질에 의한 알칼리성 Cu2+의 환원을 모니터링하는 기반을 제공한다. 환원량 및 BCA-Cu+ 복합체의 양은 존재하는 단백질에 비례하며, 분광광도 측정(570 nm 장파)에 의해 정량화된다. 사용된 단백질 적정 키트(Sigma BCA1)는 바이신코닌산 용액(Sigma B9643) 및 황산구리 5수화물 용액(CuSO4 - Sigma C2284)으로 구성되어 있다. 표준물질 범위는 BSA(소 혈청 알부민 - Sigma A9418)로 준비된다.
e) - 세포 펠릿을 -20℃에서 건조 보존하여, 세포 용해 및 적정을 기다렸다. 세포를 용해시키고 반응 환경을 알칼리화하기 위하여, 세포 펠릿을 실온에서 평형화한 다음, 30분 동안 알칼리 용액에서 용해시켰다. 용해물(용해된 세포 펠릿) 분액에 시약 혼합물(바이신코닌산 + CuSO4)을 첨가하여 적정을 실현하였다. 플레이트를 37℃에서 인큐베이션 한 다음, 몇 분 동안 플레이트를 4℃에 두어 반응을 정지시킨 후, 570 nm 장파에서 측정을 수행하였다.
f) - 결과 표시
β-EP 및 단백질 적정을 위하여, 각각의 표준물질에 대하여 획득한 OD 데이터를 그래프에 도표화하여 표준 곡선을 결정하였다. 그런 다음, 샘플에서 측정된 단백질 또는 β-EP의 양/농도를 결정할 수 있다. 각 조건의 정량적 값의 평균을 냈다. 결과를 양/농도(β-EP의 경우 pg/ml 및 총 단백질의 경우 μg/웰)와 함께 도 5, 6 및 7로 나타내었다.
4) - 결과
a) - 용량 결정(XTT 분석법에 의한 세포독성/생존율 확인)
0.0005% 내지 0.01% HCR(DE) 시험 농도의 경우, 섬유모세포에 대하여 세포독성이 전혀 관찰되지 않았다:
Figure pct00005
b) - β-엔돌핀 적정
두 가지의 시험 농도에서 유도가 발생하므로, HCR 추출물 처리는 각질형성세포에 의한 β-EP 방출에 유익한 효과를 발생시킨다: 0.001%에서 +102%*** 및 0.005%에서 +259% **. 결과를 도 5로 나타내었다.
c) - 총 단백질 적정
두 가지의 시험 농도에서 자극이 강조되었으므로, 총 단백질량에 대해 보고된, HCR 추출물 처리 후 관찰된 각질형성세포에 의한 β-EP 방출에 미치는 유익한 효과가 증명된다: 0.001%에서 +120% *** 및 0.005%에서 +402% **.
정상 인간 각질형성세포, β-엔돌핀(β-EP)이 생성되고, 적정이 이루어지는 배양 상청액에 방출된다. 정상 인간 각질형성세포의 HCR 추출물(0.001 및 0.005%) 처리는 β-EP 방출 자극을 유도하였다.
실시예 6: B16 세포에서 멜라닌 생성에 미치는 HCR 추출물의 영향 평가(멜라닌 적정)
1) - 배경 정보
본 연구의 목적은 뮤린 B16 멜라닌 세포의 시험관 내 모델에서 멜라닌 생성에 미치는 HCR 추출물의 영향을 평가하는 것이다. 본 연구에 사용된 세포는 뮤린 피부로부터 추출된 뮤린 멜라닌 세포(B16-F0 계통, LGC 표준, ATCC-CRL-6322)였다. 이 세포주는 많은 양의 멜라닌을 합성하며, 이 멜라닌은 배양 배지(소위 상청액)에 방출되므로, 분광분석법에 의한 적정이 용이하다. 이러한 멜라닌 세포를 단일 층으로 배양하였다. 72시간 동안 시험 화합물을 적용한 다음, 합성된 멜라닌을 방출시켜, 상청액에서 측정하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, 시험할 농도를 결정하기 위하여, XTT 분석을 미리 수행하여 세포 생존율을 확인하였다.
2) - 용량 결정(XTT 분석에 의한 세포독성/생존율 확인) 및 평가된 시험 화합물
a) - 실시예 2에 기술된 바와 같이, 그러나 [실시예 §c)에서 48시간 대신] 72시간 처리 후에, XTT 분석법을 이용한 용량 결정을 수행하였다.
b) - 세포 시딩 및 처리
처리 24시간 전에, 96-웰 마이크로플레이트에 (웰당 10,500개 세포, 즉, 본 연구에서 나중에 사용된 밀도인 31,250 B16/cm²의 밀도로) 세포를 시딩하였다(37℃/5% CO2에서 인큐베이션). 각 농도의 시험 화합물을 6반복하여 시험하였다. 인큐베이션/처리 시간은 72시간이었다(37℃/5% CO2). 항생제(Gibco 15140), L-글루타민(Gibco 25030)을 함유하고, 10% 소태아혈청 또는 FBS(Gibco 10270)가 첨가된, 페놀 레드 불포함 둘베코 변형 이글 배지 또는 DMEM(Gibco 11880)에 세포를 시딩하고 처리하였다.
3) - 멜라닌 생성에 미치는 영향 평가
a) - 분석 원리
B16 멜라닌 세포를 24-웰 플레이트에 시딩하였다. 그런 다음, 세포를 72시간 동안 시험 화합물(세 가지 농도)로 처리하였다. 마지막으로, 멜라닌 및 총 단백질 적정을 수행하였다. 매 24시간의 세포 배양 사진으로 (72시간 동안) 모든 추출물 적용에 따른 멜라닌 방출을 관찰할 수 있었다. 양성 대조군을 본 연구에 사용하였다:
- 멜라닌 생성을 억제하는 기준 분자(티로시나아제 억제제)인 코지산(Sigma K3125) 1 mM, 및 반대로,
- 색소 침착을 자극하는 기준 분자(cAMP 자극인자)인 αMSH 유사체, 소위 멜라노탄(Sigma M8764, [Nle4, D-Phe7]-α-멜라닌 세포 자극 호르몬 트리플루오로아세테이트 염) 100 nM.
이들 기준의 효과는 둘 모두의 경우 처리 48시간째에 처음으로 및 코지산의 경우 72시간째에 처음으로 확인할 수 있었다. 세 가지 농도의 추출물을 시험하였다(건조 추출물 또는 DE의 중량/부피%). XTT 분석으로부터 획득한 결과에 따른 이러한 비세포독성 용량을 시험하였다.
b) - 세포 처리 및 멜라닌 적정
처리 하루 전, 이전에 기술된 바와 동일한 배지에서, 24-웰 플레이트에 (웰당 60,000개 세포의 세포 밀도, 즉, 31,250 B16/cm²로) 세포를 시딩하였다(37℃/5% CO2에서 인큐베이션). 그런 다음, 각 농도/용량의 시험 화합물을 72시간 동안 3반복하여 시험하였다(37℃/5% CO2에서 인큐베이션). 24시간마다 배양 배지의 착색을 관찰하고, 블랭크(처리 배지는 함유하나 세포는 함유하지 않은 웰)와 비교하였다. 처리 48시간 또는 72시간 후, 상청액을 균질화하고, 492 nm 파장에서의 분광광도법 판독을 위하여 분액을 96-웰 플레이트로 옮겼다(2반복하여 판독). 이 적정은 합성 멜라닌(M0418)의 표준물질 범위에 대해 상대적으로, B16 세포에 의하여 유리된 멜라닌을 정량화할 수 있게 하였다.
c) - 총 단백질 적정(Bca 분석)
실시예 5에 기술된 바와 같이, 세포 펠릿 중 총 단백질 적정을 바이신코닌산(bicinchoninic acid)을 기반으로 한 비색법으로 동시에 수행하였다.
d) - 결과 표시
멜라닌 및 단백질 적정을 위하여, 각각의 표준물질에 대하여 획득한 OD 측정치를 그래프에 도표화하여 표준 곡선을 결정하였다. 그런 다음, 샘플에서 측정된 단백질 또는 멜라닌의 양/농도를 결정할 수 있다. 각 조건의 정량적 값의 평균을 냈다. 상이한 농도의 HCR 추출물을 이용한 결과를 도 8 내지 도 13에 나타내었다.
4) - 결과
a) - 용량 결정(XTT 분석법에 의한 세포독성/생존율 확인)
0.0005% 내지 0.01% HCR(DE) 시험 농도의 경우, 섬유모세포에 대하여 세포독성이 전혀 관찰되지 않았다:
Figure pct00006
b) - 멜라닌 적정
이러한 실험에서, 탈색소침착의 양성 기준인 코지산(1 mM)은 배양 배지에서 매우 강하고 매우 유의미한(***) 멜라닌 방출 억제를 유도한다(90% 초과). 48시간의 처리 후, 전색소침착(pro-pigmentation)의 양성 기준인 멜라노탄(100 nM)은 배양 배지에서 강하고 매우 유의미한(**) 멜라닌 방출 자극을 유도한다(2배 초과)(결과를 상세하게 나타내지 않았음). 72시간에서의 멜라닌 방출은 48시간보다 훨씬 뚜렷하며(OD가 20배 넘게 증가함), 이는 정상적이며 48시간에서 잠재적인 전색소침착 효과를 관찰할 수 있게 한다. 시험한 HCR 추출물은 이 모델에서 처리 72시간 후에 두 가지의 가장 높은 시험 농도에서 뚜렷한 탈색소침착 효과를 보여주었다. 이 모델에서 72시간의 적용 후, HCR 추출물은 다음의 용량 효과로 멜라닌 방출을 억제하였다: 각각 0.1% 및 0.05%의 DE(건조 추출물, 이는 1 mg/ml 및 0.5 mg/ml과 동일함)의 경우 통계적으로 매우 유의미한(***) -86% 및 -45%. 72시간 동안의 B16 멜라닌 세포 처리에 의한 멜라닌 생성의 좋은 모델을 대표하는 본 평가에서, HCR 추출물은 멜라닌 합성을 억제하게 할 수 있었다. 따라서, HCR 추출물은 멜라닌 유리를 감소시키고, 그 결과 태양으로 인한 색소 침착성 반점, 즉, 불규칙하고 불균일한 색소 침착을 방지하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: 정상 인간 각질형성세포에서 HCR 추출물의 항산화 잠재력 평가(H 2 DCFDA 프로브를 이용한 ROS 검출)
1) - 배경 정보
본 평가의 목적은 H2DCFDA 프로브를 이용하여 복부 성형수술(62세 여성, 백인 공여자)에서 추출된 정상 인간 배양 각질형성세포에서 산화 스트레스에 대한 추출물 HCR의 항산화 및 항오염 효과를 평가하는 것이었다. 디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트 프로브(H2DCFDA/디클로로플루오레세인 디아세테이트)는 세포에서 반응성 산소 종(ROS)에 대한 지표로 사용되는 플루오레세인의 화학적으로 환원된 형태이다. 이는 세포 투과성이고 안정적이다. 이것이 세포를 투과할 때, 세포 내 에스테라아제에 의해 아세테이트 기가 절단된다. 그에 따른 생성물은 비형광성의 디클로로디하이드로플루오레세인(또는 H2DCF)이다. ROS(O2-, OH, NO, ONOO, …)의 존재 시, 즉, 산화 시, 이것은 매우 형광성 물질인 디클로로플루오레세인(또는 DCF)로 전환된다. 프로브 산화는 한 종류의 ROS에 대해 특이적이지 않다. 490 nm(여기) 및 525 nm(방출)의 파장에서 형광을 검출한다. 산화적 스트레스는 환경 오염물질인 벤조피렌(benzo(a)pyrene)(3,4-벤조피렌/BaP)에 의해, 또는 반응성 산소 종(ROS)의 기준 생성인자인 과산화수소(과산화수소수/H2O2)에 의해 유도된다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, 시험할 농도를 결정하기 위하여, XTT 분석을 미리 수행하여 세포 생존율을 확인하였다.
2) - 항산화 효과 평가(H 2 DCFDA 프로브)
a) - 분석 원리
정상 인간 각질형성세포를 96-웰 마이크로플레이트에 시딩한 다음, 24시간 동안 시험 대상이 되는 시험 화합물을 처리한 후, ROS 검출을 위한 형광 프로브를 첨가하고, 오염물질 또는 과산화수소로 자극하거나 자극하지 않았다. 이 시험은 ROS와 접촉 시 분해되어 형광을 내는 검출 시스템인 프로브의 사용을 기반으로 한다. 이 프로브 H2DCF-DA는 세포 에스테라아제에 의해 두 개의 CH3-COOH 기로 절단된 후, 세포에 존재하는 ROS와 만나 두 개의 수소 원자를 잃고 형광색의 DCF가 된다.
b) - 세포 처리 및 멜라닌 적정
세포를 완전 KSFM 배지에 10,000개 각질형성세포/웰(30,000개 세포/cm²)로 96-웰 마이크로플레이트에 시딩하고, 24시간 동안 37℃/5% CO2에서 부착되게 하였다. 세포를 시험하려는 세 가지의 비세포독성 농도의 추출물로 (비보충 배지 중에서 6반복하여) 24시간 동안 처리하고, 대조군 조건(비처리 대조군 또는 항산화성 양성 기준)과 동시에 37℃/5% CO2에서 인큐베이션 하였다. 내부 항산화성 양성 기준을 본 연구에 10 μM로 사용하였다.
Figure pct00007
c) - 프로브 도입
세포를 세척한 후, 프로브(비보충 KSFM 중에 50 μM로 희석한 Invitrogen D399)를 적용하고, 플레이트를 37℃/5% CO2에서 45분 동안 인큐베이션 하였다. 블랭크 웰은 세포 없이(그러나 프로브 및 시험 산출물을 함유하여) 수행하였다.
d) - ROS 자극
세포를 세척한 후, BaP(Sigma CRM40071) 또는 과산화수소 용액(Sigma H1009)을 예상한 웰에 적용하였다(비보충 KSFM 중에 각각 최종적으로 36 μM 및 1 mM로 자극한 조건). 다른 웰(비자극 조건)의 경우, 배지만을 적용하였다. 플레이트를 37℃/5% CO2에서 20분 동안 인큐베이션 하였다.
e) - 결과 표시
인큐베이션 후, 490 nm(여기) 및 525 nm(방출) 파장에서 형광을 판독하였다(Tecan Safire II 판독기). 데이터를 RFU(실측 형광 단위)로 표시하였다. 데이터를 수집하고, 평균을 낸 블랭크 데이터를 감산한다.
RFU "샘플" = RFU 미가공 데이터 - RFU 평균 "블랭크"
3) - 결과
(과산화수소 또는 BaP에 의한) ROS 자극이 있거나 없는 항산화 잠재력 분석 결과를 도 14 및 도 15에 제시하였다. 여기서, 데이터는 형광 단위(RFU)로 표시하였다. 비자극 대조군과 비교하여(비처리 아세톤 용매 대조군: 검은색 별표) 또는 H2O2 또는 BaP 자극 대조군과 비교하여(빨간색 별표) 유의도(T-검정)를 나타내었다. (세포는 없지만 시험 화합물은 함유하는) 블랭크 대조군은 시험 추출물 또는 양성 기준 및 H2DCF-DA 프로브 사이의 상호 작용의 부존재를 확인할 수 있게 하였다. ROS 자극이 없을 경우, 상이한 시험 중 어느 것에서도 효과가 관찰되지 않았다. 과산화수소 처리 시, (비자극 대조군과 비교하여) +808%의 ROS 생성의 자극이 있으므로, 세포는 유리 라디칼을 생성한다. BaP 적용 시, (비자극 아세톤 용매 대조군과 비교하여) +141%의 자극도 관찰된다. 사용된 기준 분자와 관련하여, ROS 자극 시, 항산화 효과가 관찰되며, ROS 생성이 -21%(*, H2O2의 경우) 및 -33%(*, BaP의 경우)만큼 감소하므로, 유의미하다. 시험한 HCR 추출물은 0.01%의 농도에서 유효함을 보여주었는데, 이 가장 높은 시험 농도는 BaP 오염물질에 의해 자극된 ROS 생성을 다음과 같이 억제하였다(검출된 ROS의 감소): -23%, 거의 유의미함(p=0.122). 따라서, 본 평가는 가장 높은 시험 농도(0.01%)의 시험 HCR 추출물이 항산화 및 항오염 잠재력을 나타냄을 보여준다.
실시예 8: 청색광을 조사한 섬유모세포에서 자가포식 활성에 미치는 헤디키움 코로나리움 뿌리 추출물(HCR 추출물)의 영향 평가(MDC 분석)
1) - 배경 정보
본 연구의 목적은 453 나노미터 청색광을 조사한 섬유모세포에서 자가포식 활성에 미치는 하나의 HCR 추출물의 영향을 평가하는 것이다. 세포(정상 인간 섬유모세포(또는 NHF))를 1차 단일층으로 배양한다. 시험 대상 산출물을 24시간 동안 적용한 후 조사하고, 그런 다음 시험 대상 산출물을 24시간 동안 적용한 다음, 자가포식 활성을 측정한다(MDC).
리소좀은 수명을 초과하였거나 더 이상 유용하지 않은 세포 물질의 재활용을 허용하는 세포질 세포 소기관이다. 이들의 주요 기능은 진핵 세포에서 내인성 또는 외인성 기질을 소화하는 것이다(소위 자식작용). 리소좀은 세포 폐기물, 지방, 탄수화물, 단백질 및 기타 거대 분자를 작은 화합물로 분해하며, 작은 화합물들은 새로운 세포 구성 물질로서 다시 세포질로 전달된다. 사실, 이의 지질막은 여러 효소, 양성자 펌프 및 수송 단백질을 함유한다. 산 pH는 산 가수분해효소의 최적의 활성을 허용하도록 조절된다[1]-[2]. 형광 LysoTracker 프로브는 살아 있는 세포에서 용이하게 삽입되도록 구성된다(중성 pH에서 부분적으로만 양성자화되는 약한 염기에 형광단이 연결된다). 이러한 특징은 이 라벨링/염색이 산성 세포 소기관, 즉, 리소좀에 대해 매우 선택적일 수 있게 한다[3-5]. 그런 다음, 예를 들어, 청색광과 같은 방사선의 영향을 리소좀 수준에서 평가할 수 있다. 실제로, 이들 방사선은 자유 라디칼 형성을 초래하고, 정상적인 리소좀 네트워크, 세포 공간에서의 이의 분포에 영향을 미친다. 이는 특이적인 형광 프로브인 LysoTracker로 시각화할 수 있다. 자식작용(autophagy)은 리소좀과 융합되는 액포에서 세포질 물질 소화를 가능하게 하는 진핵 세포 절차이다. 사실, 리소좀은 직접 세포질 단편을 통합할 수 있거나(미세자식작용), 자가포식소체라는 자가포식성 액포를 통해 세포질 단편을 통합할 수 있다(거대자식작용, 리소좀의 융합, 그리고 자가포식소체는 소위 자가리소좀이다). 자식작용은 세포가 그의 에너지원을 동원하여 손상된 세포 소기관을 방어 및 파괴하고 이를 통해 심각한 영향을 피할 수 있게 하는 중요한 메커니즘이다. 이 과정은 단백질 및 비 기능성 세포 소기관을 제거하고 교체할 수 있게 해, 항상성을 보장한다. 그것은 영양 결핍(기아)과 같은 상이한 종류의 스트레스 또는 손상에 대한 적응성 세포 반응을 가능하게 하는 필수적인 세포 방어 메커니즘이다. 따라서, 자식작용은 세포 생존뿐만 아니라 발달, 면역, (표피에서 각질형성세포의 각질세포로의 분화를 포함한) 세포 분화와 같은 다른 기초적인 생리적 현상에도 필요하다. 이는 장수 제어, 노화, 암 또는 당뇨병, 전염성 질환, 대사성 질환 또는 신경 퇴행성 질환과 같은 병리의 발달에 관여한다[6-7]. MDC 프로브는 자가포식성 액포에 특이적이고, 자가포식 활성을 용이하게 그리고 특이적으로 정량화할 수 있게 한다[8].
2) - 분석 원리
a) - 자가포식 활성에 미치는 추출물 HCR의 영향을 평가하기 위하여, 섬유모세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고, 산출물을 처리하고, 조사하고, 다시 처리한 다음, MDC 프로브가 자가포식 활성을 측정할 수 있게 한다. 본 연구에서 2종의 양성 기준, 즉, UV 조사에 의한 산화적 스트레스로부터 보호한다고 알려져 있는 항산화제인 비타민 C(L-아스코르브산, Sigma A4544) 500 μM (88 μg/mL) 및 비타민 E(α-토코페롤 아세테이트, Sigma A1157) 200 μM (95 μg/mL)을 사용한다. 세 가지 농도의 추출물 HCR을 시험하며(HCR 추출물은 액체 추출물이므로, 건조 추출물 또는 DE의 중량/부피%), 각 용량은 5반복(5개 웰)으로 평가한다. 453 nm 청색광의 조사 용량은 40 J/cm²(29분 동안 23 mW/cm²)이다.
b) - 처리 24시간 전에, 96-웰 마이크로플레이트에 (웰당 10,000개 세포, 즉, 30,000개 NHF/cm²의 밀도로) 세포를 시딩하였다(37℃/5% CO2에서 인큐베이션).
그런 다음, 세포를 24시간 동안 추출물로 처리한 후(예방적 효과), 조사하거나 조사하지 않는다(453 nm BL, 40 J/cm², 29분 동안 23 mW/cm²). 그런 다음, 섬유모세포를 산출물로 다시 한 번 24시간 동안 처리한다(치료 효과)(따라서, 총 적용은 48시간임). 세포를 완전 배지: 항생제(Gibco 15140) 및 10%의 소태아혈청 또는 FBS(Gibco 10270)를 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 또는 DMEM(Gibco 41966)에 시딩한다. 처리는 FBS 불포함 배지에서 이루어진다. 조사는 PBS(인산 완충 식염수)에서 이루어진다. 모든 인큐베이션/처리 시간은 37℃/5% CO2에서 이루어진다(실온에서 이루어지는 조사는 제외).
c) - 자가포식 활성 평가(MDC 분석)
처리 종료 시, 웰을 세심하게 헹구고(PBS), 0.05 mM MDC 프로브를 세포(Sigma 30432)[17](37℃/5% CO2)에 적용한다. 30분 동안의 인큐베이션 및 세척 후, 380 nm(여기) 및 525 nm(방출) 파장에서 형광을 측정한다(Tecan Safire II 기계). 획득된 데이터를 RFU(실제 형광 단위)로 표시하였다. 블랭크(프로브를 함유하나 세포는 함유하지 않는 웰)가 완료된다.
3) - 결과 표시
모든 데이터에 대해 블랭크 평균을 감산한 다음, 각 조건에 대해 RFU 평균을 계산한다. 스튜던트 t 검정(t-검정법)에 의해, 적합한 대조군(비조사 또는 조사)에 대해 획득된 데이터와 데이터를 비교하여 유의도를 계산한다.
4) - 결과
결과를 아래 표 1에 나타내었다:
청색광(435 나노미터)에 의한 섬유모세포 조사 세포의 자가포식 활성의 HCR 추출물 처리의 영향.
결과물 처리량 RFU (평균)
비처리 및 비조사 NHF 세포 - 96 RFU
HCR 추출물 처리 및 비조사 NHF 세포 0.001%(w/w) 94(*) RFU
HRC 추출물 처리 및 비조사 NHF 세포 0.005%(w/w) 93(*) RFU
HCR 추출물 처리 및 비조사 NHF 세포 0.01%(w/w) 96(*) RFU
비타민 C 처리 및 비조사 NHF 세포 500 μmol 60 (***) RFU
비타민 E 처리 및 비조사 NHF 세포 200 μmol 76 (**) RFU
비처리 및 조사(453 나노미터) NHF 세포 - 110 RFU
HCR 추출물 처리 및 조사(453 나노미터) NHF 세포 0,001% 96(*) RFU
HCR 추출물 처리 및 조사(453 나노미터) NHF 세포 0,005% 94(*) RFU
HCR 추출물 처리 및 조사(453 나노미터) NHF 세포 0.01% 71(***) RFU
비타민 C 처리 및 조사(453 나노미터) NHF 세포 500 μmol 95 RFU
비타민 E 처리 및 조사(453 나노미터) NHF 세포 200 μmol 86(*) RFU
스튜던트 검정법: (*)　: 0.01<p≤0,05 (**)　: 0.001<p≤0,01 (***)　: p≤0.001
5) 분석 및 견해
결과는, 섬유모세포를 청색광(453 나노미터의 파장)으로 조사할 때, 자가포식 활성이 증가함을 보여준다. 비타민 C 또는 비타민 E를 처리하고, 453 나노미터에서 조사할 때, 섬유모세포의 자가포식 활성은 비타민 C의 경우 14%, 비타민 E의 경우 22% 감소한다. 0.001%, 0.005% 및 0.01%의 상이한 중량 농도를 가진 HCR 추출물로 처리 시, 상기 섬유모세포의 자가포식 활성은 각각 약 13%, 15% 및 35% 감소한다.
참고문헌
Figure pct00008
Figure pct00009

Claims (8)

  1. 치료법에 의한 인체의 치료 방법에 사용하기 위한 헤디키움 코로나리움(Hedychium coronarium) 종의 식물 추출물을 포함하는 조성물.
  2. 치료법에 의한 인체의 치료 방법에서 세포 정화 시스템 중 적어도 하나를 보호 및/또는 활성화하는 데 사용하기 위한, 헤디키움 식물 추출물을 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 정화 시스템은 미토콘드리아 보호 및/또는 활성화, 리소좀 보호 및/또는 활성화, 세포 IL-8 방출 억제, β-엔돌핀의 세포 생성, 불규칙한 멜라닌 방출의 억제, 및 클라우딘 회생에 의한 세포 막관통 시스템의 보호 및/또는 활성화로부터 선택되는 것인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤디키움 코로나리움 종의 식물 추출물은 이 식물의 꽃, 종자, 열매, 잎, 줄기, 뿌리 및/또는 뿌리줄기로부터 유래하는 것인, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 헤디키움 코로나리움 종의 식물 추출물은 이 식물의 뿌리 및/또는 뿌리줄기로부터 유래하는 것인, 조성물.
  6. 제5항에 따른 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물의 제조 방법으로서, 다음 단계:
    - 추출될 헤디키움 코로나리움 식물의 뿌리 및/또는 뿌리줄기의 조각을 특정량 제공하는 것에 있는 단계 a);
    - 상기 헤디키움 코로나리움 식물의 뿌리 및/또는 뿌리줄기의 조각을 적합한 용매 또는 용매 혼합물로 추출하여 헤디키움 코로나리움 식물 뿌리 및/또는 뿌리줄기 조각 추출 혼합물을 수득하는 단계 b);
    - 단계 b)에서 수득된 상기 헤디키움 코로나리움 식물 뿌리 및/또는 뿌리줄기 조각 추출물 혼합물을 여과하여 헤디키움 코로나리움 식물 뿌리 및/또는 뿌리줄기 조각 추출물 혼합물의 여과액을 수득하는 단계 c);
    - 단계 c)에서 수득된 상기 헤디키움 코로나리움 식물 뿌리 및/또는 뿌리줄기 조각 추출물 혼합물의 여과액을 침전시켜 상청액으로부터 고형 잔류물을 분리하는 단계 d);
    - 단계 d)에서 수득된 상기 상청액을 여과하여 헤디키움 코로나리움 식물 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물을 투명한 용액으로 수득하는 단계 e);
    - 단계 e)에서 수득된 상기 투명한 용액을 적합한 용매를 이용하여 원하는 농도로 조정하여 원하는 헤디키움 코로나리움 뿌리 및/또는 뿌리줄기 추출물을 수득하는 단계 f)
    를 포함하는 제조 방법.
  7. 제6항에 있어서, 단계 f)에 사용된 상기 적합한 용매는 물과 글리세롤의 혼합물인 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 물/글리세롤(부피/부피) 비는 30/70인, 방법.
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