KR20220093016A - 바다대나무 추출물을 또는 이의 분획물을 유효성분으로 기능성 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 자외선에 대한 피부보호, 미백 또는 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 바다대나무(Ecklonia maxima) 에탄올 추출물, 이의 에틸아세테이트 분획물 및 효소 추출물이 항산화, 자외선에 대한 피부 보호, 미백 및 주름 개선 활성을 나타냄을 확인하였다.
따라서 본 발명의 조성물은 항산화, 자외선에 대한 피부 보호, 미백 및 주름 억제용으로 화장료 및 이너뷰티 식품으로 활용 가능하다.
또한, 바다대나무(Ecklonia maxima) 에틸아세테이트 분획물이 LPS로 염증을 유도한 제브라 피쉬에 대해 항염 효과를 나타냈었다. 본 발명에서 바다대나무(Ecklonia maxima) 분획물은 항염증 용도로 약학, 식품 산업에 적용이 가능하다.

Description

바다대나무 추출물을 또는 이의 분획물을 유효성분으로 기능성 조성물{Functional composition comprising extract or fraction of Ecklonia maxima}
본 발명은 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장품 또는 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 바다대나무 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학, 식품 조성물에 관한 것이다.
피부는 인체에서 가장 큰 기관으로서 그 면적이 약 1.6㎡에 이르는 큰 크기이며, 무게로도 체중의 16%나 되는 큰 기관으로서, 피부는 내부 장기를 보호하기 위하여 신체를 덮고 있는 가장 기본적인 외피로서의 역할 이외에도 많은 기능을 수행하고 있는 매우 중요한 기관이다.
그러나, 피부를 구성하는 세포 외부로부터 가해진 과도한 물리적, 화학적 자극 및 스트레스, 영양결핍, 자외선, 환경오염물질, 급격한 기온의 변화 등과 같은 세포를 손상시키는 세포손상자극들에 의하여 세포내의 다양한 생화학적 변화가 유도되면 피부 외관에 기미, 주근깨, 잡티, 탄력손실, 각질화, 주름생성과 같은 피부의 노화를 촉진시키게 된다.
피부노화 현상 중 피부의 착색이나 얼룩 등의 색소 침착의 요인으로는 생체 내에서의 대사 장해 등의 내인적 요소와 자외선 등에 의한 외인적 요소를 들 수 있는데, 일반적으로 후자의 외인적 요소에 의한 것이 주를 이루며, 이와 같이 피부에 자외선이 조사되는 경우 자외선에 의하여 멜라노사이트(melanocyte)가 자극을 받고, 멜라노사이트가 활성화되면 티로시나아제(tyrosinase) 효소가 작용하여 피부가 타서 갈색이 되는데, 이것은 멜라닌이 생성되어 과잉광선을 흡수하여 생체를 보호하기 위한 것으로 추측된다. 그래서 화장품업계에서는 이러한 현상을 방지하기 위해서 멜라노사이트의 활성을 억제하고 티로시나아제 효소 및 멜라닌 색소의 생성을 억제함으로써 피부의 착색이나 얼룩 등의 색소 침착을 방지하는 미백제를 개발하는 것이 종래부터 중요한 이슈가 되고 있다.
또한, 피부노화 현상 중 주름이 형성되는 원인은 자연적 노화에 의한 주름의 생성과 자외선 노출(광노화)에 의한 주름의 생성으로 크게 나눌 수 있으며, 자연적 노화와 광노화에 의한 피부변화와 관련되어 발견되는 공통적인 현상에 관하여 지금까지의 연구결과에 의하면 진피 내 주 단백질인 콜라겐(collagen)과 엘라스틴(elastin)의 감소 및 변형이 주름의 생성 및 피부의 탄력저하에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히, 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 콜라겐의 감소가 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다는 연구 결과가 보고되고 있다. 즉, 콜라겐 감소에 영향을 끼치는 자유 라디칼들은 피부 콜라겐 등의 결합조직 형성파괴, 세포막 기능 저해, DNA 변이 촉진, 단백질 작용 변형, 세포 간 에너지 전이, 신진 대사와 관련된 분자들의 변형을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 피부 노화에 자유 라디칼이 관여한다는 사실은 자유 라디칼을 불활성화시키는 항산화제들을 사용하여 노화 과정을 지연시킬 수 있다는 것을 의미한다. 한편, 정상적인 세포에서도 대사과정 중 어느 정도의 자유 라디칼과 기타 활성 산소 및 과산화물이 생성되며, 이들에 대한 생체방어기구에 이상이 초래되거나 각종 물리적, 화학적 요인들에 의하여 활성산소의 생성이 생체 방어계의 용량을 초과하게 될 경우 산화적 스트레스가 야기된다. 따라서, 활성산소를 억제하는 것은 피부노화를 방지하는 화장물 조성료에 중요한 요소이다.
대한민국 등록특허공보 제10-2086687호
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장품 또는 건강기능성 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 과제는 바다대나무 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학, 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.
상기 기능성은 항산화, 자외선에 대한 피부보호, 미백 및 주름개선으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효과를 나타내는 것일 수 있다.
상기 추출물은 바다대나무(Ecklonia maxima)를 에탄올 용매로 추출한 것일 수 있다.
상기 분획물은 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물의 에틸아세테이트 분획물일 수 있다.
상기 추출물은 셀루클라스트(celluclast) 효소를 이용하여 추출된 것일 수 있다.
또한 본 발명은 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
상기 기능성은 항산화, 자외선에 대한 피부보호, 미백 및 주름개선으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효과를 나타내는 것일 수 있다.
상기 건강기능성 식품은 이너뷰티 식품인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 바다대나무(Ecklonia maxima) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 바다대나무(Ecklonia maxima) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물이 항산화, 자외선에 대한 피부 보호, 미백 및 주름 개선 활성을 나타냄을 확인하였는바, 따라서 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 에틸아세테이트 분획물을 유효선분으로 포함하는 조성물은 항산화, 자외선에 대한 피부 보호, 미백 및 주름 억제용으로 화장료 및 이너뷰티 식품으로 활용 가능하다.
또한, 바다대나무(Ecklonia maxima) 에틸아세테이트 분획물이 LPS로 염증을 유도한 제브라 피쉬에 대해 항염 효과를 나타냈었다. 본 발명에 따른 바다대나무(Ecklonia maxima) 분획물은 항염증 용도로 약학, 식품 산업에 적용이 가능하다.
도 1 내지 도 18은 바다대나무 에탄올 추출물, 이의 에틸아세테이트 분획물 및 효소 추출물의 항산화 효과를 분석한 결과이다. #:대조군과 비교 (##p<0.01), *: H2O2 그룹 또는 AAPH 그룹과 비교 (*p<0.05, **p<0.01)
도 1은 산화스트레스를 유도한 Vero 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물 처리 농도에 따른 세포내 활성산소종 생성 변화를 분석한 결과이다.
도 2는 산화스트레스를 유도한 Vero 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물 처리 농도에 따른 세포생존율 변화를 분석한 결과이다.
도 3은 Vero 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물의 산화적 스트레스에 의한 세포자멸사(Apoptosis) 보호 효과를 분석한 결과이다. 위는 Hochst 33342 염색 이미지이고, 아래는 Apoptosis body(%)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 제브라 피쉬에서 바다대나무 에탄올 추출물 항산화 효과를 분석하고자, 생존율(%) 변화를 분석한 결과이다.
도 5는 제브라 피쉬에서 바다대나무 에탄올 추출물의 항산화 효과를 분석하고자, 심박수(%) 변화를 분석한 결과이다.
도 6은 제브라 피쉬에서 바다대나무 에탄올 추출물 항산화 효과를 분석하고자, ROS 생성(%) 변화를 분석한 결과이다.
도 7은 제브라 피쉬에서 바다대나무 에탄올 추출물 항산화 효과를 분석하고자, 세포 사멸(cell death %) 변화를 분석한 결과이다.
도 8은 제브라 피쉬에서 바다대나무 에탄올 추출물 항산화 효과를 분석하고자, 지질과산화(%) 수준 변화를 분석한 결과이다.
도 9는 Vero 세포에서 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 처리 농도에 따른 세포내 활성산소종 생성 변화를 분석한 결과이다.
도 10은 Vero 세포에서 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 처리 농도에 따른 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 분석한 결과이다.
도 11은 Vero 세포에서 바다대나무 효소 추출물 처리 농도에 따른 세포내 활성산소종 생성 변화를 분석한 결과이다.
도 12는 Vero 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물 처리 농도에 따른 산화적 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 분석한 결과이다.
도 13은 Vero 세포에서 바다대나무 효소 추출물의 산화적 스트레스에 의한 세포자멸사(Apoptosis) 보호 효과 분석한 결과이다. 위는 Hochst 33342 염색 이미지이고, 아래는 Apoptosis body(%)를 나타낸 그래프이다.
도 14는 제브라 피쉬에서 바다대나무 효소 추출물 항산화 효과를 분석하고자, 생존율(%) 변화를 분석한 결과이다.
도 15는 제브라 피쉬에서 바다대나무 효소 추출물의 항산화 효과를 분석하고자, 심박수(%)를 변화를 분석한 결과이다.
도 16은 제브라 피쉬에서 바다대나무 효소 추출물 항산화 효과를 분석하고자, ROS 생성(%) 변화를 분석한 결과이다.
도 17은 제브라 피쉬에서 바다대나무 효소 추출물 항산화 효과를 분석하고자, 세포 사멸(cell death %) 변화를 분석한 결과이다.
도 18은 제브라 피쉬에서 바다대나무 효소 추출물 항산화 효과를 분석하고자, 지질과산화(%) 수준 변화를 분석한 결과이다.
도 19 내지 도 22는 바다대나무 에탄올 추출물 및 효소 추출물의 자외선에 대한 피부세포 보호 효과를 분석한 결과이다. #:대조군과 비교 (##p<0.01), *: 자외선 처리 그룹과 비교 (*p<0.05, **p<0.01).
도 19는 자외선에 처리한 HaCaT 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물 처리 농도에 따른 세포내 ROS 생성 변화를 분석한 결과이며, 도 20은 자외선에 처리한 HaCaT 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물 처리 농도에 따른 세포생존율 변화를 분석한 결과이다.
도 21은 자외선에 처리한 HaCaT 세포에서 바다대나무 효소 추출물 처리 농도에 따른 세포내 ROS 생성 변화를 분석한 결과이며, 도 22는 자외선에 처리한 HaCaT 세포에서 바다대나무 효소 추출물 처리 농도에 따른 세포생존율 변화를 분석한 결과이다.
도 23 내지 도 27는 바다대나무 에탄올 추출물 및 효소 추출물의 미백 효과를 분석한 결과이다.
도 23은 바다대나무 에탄올 추출물 처리 농도에 따른 B16F10 세포의 생존율을 분석한 결과이고, 도 24는 B16F10 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물 처리 농도에 따른 멜라닌 생성 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 25는 바다대나무 에탄올 추출물의 티로시나아제 저해 활성을 분석한 결과이다.
도 26은 바다대나무 에탄올 효소 추출물 처리 농도에 따른 B16F10 세포의 생존율을 분석한 결과이고, 도 27은 B16F10 세포에서 바다대나무 효소 추출물 처리 농도에 따른 멜라닌 생성 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 28은 바다대나무 에탄올 추출물의 티로시나아제 저해 활성을 분석한 결과이다.
도 29 내지 도 35는 바다대나무 에탄올 추출물 및 효소 추출물의 주름억제 효과를 분석한 결과이다.
도 29는 자외선으로 노화(주름)을 유도한 HDF 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물 처리 농도에 따른 세포내 활성산소종 생성 변화를 분석한 결과이다.
도 30은 자외선으로 노화(주름)을 유도한 HDF 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물 처리 농도에 따른 세포 생존율 변화를 분석한 결과이다.
도 31은 자외선으로 노화(주름)을 유도한 HDF 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물 처리 농도에 따른 콜라겐 함량 변화를 분석한 결과이다.
도 32는 바다대나무 에탄올 추출물 처리 농도에 엘라스타아제 저해활성을 분석한 결과이다.
도 33은 자외선으로 노화(주름)을 유도한 HDF 세포에서 바다대나무 효소 추출물 처리 농도에 따른 세포내 활성산소종 생성 변화를 분석한 결과다
도 34는 자외선으로 노화(주름)을 유도한 HDF 세포에서 바다대나무 효소 추출물 처리 농도에 따른 세포 생존율 변화를 분석한 결과이다.
도 35는 자외선으로 노화(주름)을 유도한 HDF 세포에서 바다대나무 효소 추출물 처리 농도에 따른 콜라겐 함량 변화를 분석한 결과이다.
도 36 내지 도 44는 바다대나무 에탄올 추출물, 이의 에틸아세테이트 분획물 및 효소 추출물의 항염증 효과를 분석한 결과이다.
도 36은 LPS로 염증을 유도한 제브라 피쉬에서 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 처리에 따른 생존율(%) 변화를 분석한 결과이다.
도 37은 LPS로 염증을 유도한 제브라 피쉬에서 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 처리에 따른 심박수(%)를 변화를 분석한 결과이다.
도 38은 LPS로 염증을 유도한 제브라 피쉬에서 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 처리에 따른 ROS 생성(%) 변화를 분석한 결과이다.
도 39는 LPS로 염증을 유도한 제브라 피쉬에서 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 처리에 따른 세포 사멸(cell death %) 변화를 분석한 결과이다.
도 40은 LPS로 염증을 유도한 제브라 피쉬에서 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 처리에 따른 지질과산화(%) 수준 변화를 분석한 결과이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화장료 조성물은 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 바다대나무(Ecklonia maxima)는 바다대나무(sea bamboo)로 불리는 갈조류로 학명은 에클로니아 막시마(Ecklonia maxima)이다.
본 발명의 용어 “추출물”이란 천연물로부터 그 안의 성분을 뽑아낸 물질로, 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물은 생 바다대나무 또는 건조된 바다대나무를 이용하여 추출할 수 있으며, 구체적은 건조된 바다대나무 에 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있다. 더욱 구체적으로 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올 또는 이들의 혼합용매를 용출 용매로써 사용하고, 추출 온도는 10 내지 100℃로 사용하여 추출할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 바다대나무(Ecklonia maxima) 시료를 수돗물로 세척하여 부착된 염분, 착생식물 및 잔해물을 제거하고, 동결 건조 후 미세 분말로 분쇄하여 -20℃에서 저장하였다. 동결건조한 바다대나무 분말(250g)에 70% 에탄올을 사용하여 4회 추출하고 진공 여과하였다. 여액은 회전 증발기로 농축하여 바다대나무 에탄올 추출물(Ecklonia maxima ethanol extract, EME)을 수득하였다.
따라서 본 발명의 바다대나무 추출물은 구체적으로 바다대나무에 60 내지 80% 에탄올을 첨가하여 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 셀루클라스트(Celluclast) 효소를 사용하여 바다대나무 효소 추출물을 제조하였다. 구체적으로 동결건조한 바다대나무 분말 2g을 탈이온수 100 ㎖에 현탁하고 1M HCl 또는 NaOH를 사용하여 효소의 최적 pH 값(pH 4.5)으로 조정하였다. 바다대나무 현탁액에 효소(Celluclast)를 0.5%의 농도로 주입하고 효소의 최적온도인 50℃ 에서 24시간 동안 교반하여 가수분해물을 제조하였다. 가수 분해 반응 후, 10분간 열탕(90℃ 이상 100℃ 이하)에서 가열하여 효소를 불활성화시키고, 마지막으로, 상기 가수 분해물을 여과하고, pH를 7.0으로 재조정하고 동결건조하여 바다대나무 효소 추출물(Ecklonia maxima celluclast extract, EMC)로 사용하였다.
따라서 상기 추출물은 구체적으로 추출과정에서 효소를 이용하는 효소 추출물일 수 있다.
본 발명에서 상기 효소는 셀루클라스트(Celluclast)일 수 있다.
본 발명의 용어 “분획물”은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명의 바다대나무 분획물은 바다대나무 추출물을 증류수(물)에 현탁한 후, 탄소수 1(C1) 내지 4(C4)의 알코올, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 분획함으로써 수득할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 바다대나무 에탄올 추출물(Ecklonia maxima ethanol extract, EME)을 탈이온수에 현탁하여, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 용매에서 분획하여 각 용매별 분획물을 제조하였다. 바다대나무 에탄올 추출물(Ecklonia maxima ethanol extract, EME)의 에틸아세테이트 분획물의 항산화 및 항염효과를 확인하였다.
따라서 상기 분획물은 구체적으로 바다대나무 에탄올 추출물을 에틸아세테이트 용매로 분획한 것일 수 있다.
상기 기능성은 항산화, 자외선에 대한 피부보호, 미백 및 주름개선으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 바다대나무 에탄올 추출물, 이의 에틸아세테이트 분획물 및 효소 추출물이 Vero 세포에서 산화 스트레스에 의한 세포내 활성산소종(intracellular ROS) 생성을 억제하고, 세포 생존율의 감소를 억제함을 확인하였다. 또한, 제브라피쉬 모델에 산화적 스트레스에 의한 생존율의 감소를 회복시키고, 심박수 증가를 감소시키며 ROS 생성, 세포사멸(%) 및 지질과산화(%)를 감소시키는 것을 확인하였다.
즉, 바다대나무 에탄올 추출물, 및 효소 추출물 산화적 스트레스에 의해 유도되는 손상을 억제하며, 세포를 보호하여 항산화 효과를 가짐을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서 바다대나무 에탄올 추출물, 효소 추출물이 자외선에 의한 세포내 활성산소종 생성을 억제하고 피부 세포를 보호하여 자외선에 대한 피부보호 효과를 가짐을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서 바다대나무 에탄올 추출물, 및 효소 추출물이 B16F10 세포에서 멜라닌 생성을 억제하며, 티로시나아제 활성을 저해하여 미백효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서 바다대나무 에탄올 추출물이 자외선에 의한 세포내 활성 산소종 생성 및 세포 사멸을 억제하여 노화(주름)을 억제함을 확인하였으며, 콜라겐 생성 감소를 회복시키며, 엘라스타나제의 활성을 저해시켜 주름 형성을 억제 또는 주름을 개선시킬 수 있음을 확인하였다.
또한, 바다대나무 효소 추출물이 자외선에 의한 노화(주름)을 억제하며, 콜라겐 생성 감소를 회복시켜 주름 형성을 억제 또는 주름을 개선시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션,왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜,1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르,폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제,미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시테이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 오일, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 바다대나무, 추출물, 분획물에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
전술한 본 발명의 일 실시예에서 바다대나무(Ecklonia maxima)의 에탄올 추출물, 효소 추출물이 항산화, 자외선에 대한 피부보호, 미백 및 주름개선 효과를 나타냄을 확인하였으며, 바다대나무(Ecklonia maxima) 에탄올 추출물의 에틸아세테이드 분획물이 항산화 효과를 나타냄을 확인하였는바, 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 식품 조성물은 항산화, 자외선에 대한 피부보호, 미백 또는 주름개선 효과가 우수한 것을 특징으로 한다.
따라서, 상기 기능성은 항산화, 자외선에 대한 피부보호, 미백 및 주름개선으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용되는 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 추출물 또는 이의 분획물은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능성 식품은 이너뷰티 식품인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 바다대나무(Ecklonia maxima) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 바다대나무, 추출물, 분획물에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 일실시예에서 바다대나무 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 (EME-EA)이 LPS에 유도 염증에 의한 ROS 생성을 억제하고, 산화적 스트레스에 의해 유도되는 손상을 억제하며, 세포를 보호하여 항염증 효과를 가짐을 확인하였다.
따라서 바다대나무(Ecklonia maxima) 에탄올 추출물의 분획물은 항염증 용도로 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 식품 조성물로 활용 가능하다.
본 발명에서 화장료 조성물에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 바다대나무(Ecklonia maxima) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외의 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 조성물에 포함되는 바다대나무(Ecklonia maxima) 분획물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99 중량%로, 바람직하게는 0.01 중량% 내지 50 중량%를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 항염증을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 바다대나무(Ecklonia maxima) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 바다대나무, 추출물, 분획물에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 식품 조성물에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실험방법 1] 바다대나무 추출물 및 이의 분획물 제조
1-1. 바다대나무 추출물 제조
바다대나무(Ecklonia maxima) 시료를 수돗물로 세척하여 부착된 염분, 착생식물 및 잔해물을 제거하고, 동결 건조 후 미세 분말로 분쇄하여 -20℃에서 저장하였다. 동결건조한 바다대나무 분말(250g)에 70% 에탄올을 사용하여 4회 추출하고 진공 여과하였다. 여액은 회전 증발기로 농축하여 바다대나무 에탄올 추출물(Ecklonia maxima ethanol extract, EME)을 수득하였다.
1-2. 바다대나무 분획물 제조
상기 1-1에서 제조한 바다대나무 에탄올 추출물(Ecklonia maxima ethanol extract, EME)을 탈이온수에 현탁하여, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 용매에서 분획하여 각 용매별 분획물을 제조하였다.
1-3. 바다대나무 효소 추출물의 제조
셀루클라스트(Celluclast) 효소를 사용하여 바다대나무 효소 추출물을 제조하였다. 동결건조한 바다대나무 분말 2g을 탈이온수 100 ㎖에 현탁하고 1M HCl 또는 NaOH를 사용하여 효소의 최적 pH 값(pH 4.5)으로 조정하였다. 바다대나무 현탁액에 효소(Celluclast)를 0.5%의 농도로 주입하고 효소의 최적온도인 50℃ 에서 24시간 동안 교반하여 가수분해물을 제조하였다. 가수 분해 반응 후, 10분간 열탕(90℃ 이상 100℃ 이하)에서 가열하여 효소를 불활성화시키고, 마지막으로, 상기 가수 분해물을 여과하고, pH를 7.0으로 재조정하고 동결건조하여 바다대나무 효소 추출물(Ecklonia maxima celluclast extract, EMC)로 사용하였다.
제조한 추출물 및 분획물을 기능성 조성물로 활용하고자, 표 1과 같이 각 추출물 또는 분획물의 활성을 분석하였다.
시 료 활성 분석
바다대나무 에탄올 추출물(EME) 항산화(실시예1),
자외선에 대한 피부세포 보호(실시예4),
미백(실시예6),
주름억제(실시예8),
항염증(실시예11)
바다대나무 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(EME-EA) 항산화(실시예2)
항염(실시예10)
바다대나무 효소 추출물(EMC) 항산화(실시예3),
자외선에 대한 피부세포 보호(실시예5),
미백(실시예7)
주름억제(실시예9),
항염(실시예12)
[실험방법 2] 항산화 효과 분석
2-1. Vero 세포에서 항산화 효과 분석
바다대나무 에탄올 추출물, 이의 분획물 또는 효소 추출물의 항산화 활성을 분석하고자, 바다대나무 에탄올 추출물, 이의 분획물 및 효소 추출물을 처리한 Vero 세포에서 H2O2(1mM) 또는 AAPH(2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride, 10mM) 스트레스에 의해 유도되는 세포내 활성산소종(intracellular ROS) 생성 변화와 세포 생존율을 변화를 분석하였다.
2-1-1. 세포 생존력 분석
세포의 생존력은 MTT 비색 분석으로 평가하였다. 세포에 샘플을 처리하고 24 시간 배양한 후, MTT를 웰에 첨가하고 3시간 동안 배양하였다. 포르마잔 결정을 DMSO에 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2-1-2. 세포내 ROS 생성 억제 효과 분석
디클로로-디하이드로-플루오레신 다이아세테이트(DCFH-DA) 분석을 이용하여 세포 내 ROS 소거능을 측정하였다. 세포 내 ROS를 측정하기 위해, 각 시료를 세포에 처리 후 2 시간 배양한 후, 웰에 DCFH-DA를 첨가하였다. 배양 10분 후, 485㎚의 여기 파장(excitation wavelength) 및 530㎚의 방출 파장에서 형광을 측정하였다.
2-1-3. 세포내 ROS 생성 억제 효과 분석
AAPH로 산화 스트레스를 유도한 Vero 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물, 이의 분획물 및 효소 추출물 처리에 의한 세포 자멸체(apoptotic body) 형성 억제 효과를 분석하고자, Hochst 33342 염색을 수행하였다. 형광 이미지는 CoolSNAPPro 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경을 사용하여 촬영하였다.
2-2. 제브라 피쉬에서 항산화 효과 분석
다음으로 제브라피쉬에서 바다대나무 에탄올 추출물, 이의 분획물 또는 효소 추출물의 항산화 효과를 분석하였다.
구체적으로 산화스트레스(과산화수소 1mM 또는 AAPH 15mM 처리) 유도한 제브라피쉬 배아에서 생존율(%), 심박수(%), ROS 생성(%), 세포 사멸(%) 및 지질과산화(%) 수준을 분석하였다.
2-2-1. 제브라피쉬 배아의 생존율 및 심박수 측정
바다대나무 에탄올 추출물, 이의 분획물 또는 효소 추출물의 산화스트레스에 의한 제브라피쉬 배아의 생존을 변화를 분석하였다. 24 웰 플레이트(well plate)에 웰(well) 당 15-20개의 수정 후 7-9 hpf (hour post fertilization)가 지난 제브라피쉬 embryo를 넣고, embryo media 0.9 ㎖을 채웠다. 시료를 1시간 처리한 후 H2O2 1mM을 처리하고, 2 dpf(day post fertilization) 때에 심박수를 측정하고, 생존율은 7일까지 확인하였다.
제브라피쉬에서의 심박수 (Heart Beating rate) 측정은 2 dpf의 제브라피쉬를 슬라이드 글라스 위에 올려놓고 현미경을 통하여 1분 동안 심장이 뛰는 횟수를 측정하였다
2-2-2. 제브라피쉬에서 활성산소(ROS) 생성 측정
제브라피쉬에서 활성산소(ROS)를 측정하기 위하여, 24 웰 플레이트에서 시료와 자극물질(AAPH, 15mM)이 처리된 제브라피쉬를 한 마리씩 96 well plate에 옮기고, DCFH-DA 용액(20 ㎍/㎖)을 1시간 동안 28.5℃의 암실에서 반응시켜, ROS 생성량을 측정하였다. 반응시간이 끝난 후 새로운 배아 배지(embryo media)로 2차례 세척 후에 MS-222(0.003%)로 1분 동안 마취 시킨 후 현광현미경을 이용하여 형태학적으로 관찰하며 image J 프로그램을 이용하여 수치화시켰다
2-2-3. 제브라피쉬 세포 사멸율 측정
제브라피쉬에서 세포사멸을 측정하기 위해 24 웰 플레이트에서 시료와 자극물질이 처리된 제브라피쉬를 한 마리씩 96 웰 플레이트에 옮기고, 아크리딘 오렌지(Acridine orange 용액, 7 ㎍/㎖)을 30분 동안 28.5℃의 암실에서 반응시켜 세포 사멸을 측정하였다. 반응시간이 끝난 후 새로운 embryo media로 2차례 세척 후에 MS-222(0.003%)로 1분 동안 마취 시킨 후 현광 현미경을 이용하여 관찰하며 이미지 J 프로그램을 이용하여 수치화시켰다.
2-2-4. 지질과산화(Lipid peroxidation)의 수준 측정
지질과산화(Lipid peroxidation)의 수준을 측정하기 위해 24 웰 플레이트에서 시료(sample)와 자극물질(AAPH, 15mM)이 처리된 제브라피쉬를 한 마리씩 96 well plate에 옮기고, DPPP(25 ㎍/㎖)을 2시간동안 28.5℃의 암실에서 반응시켜 지질과산화(lipid peroxidation) 수준을 측정하였다. 반응시간이 끝난 후 새로운 embryo media로 2차례 세척 후에 MS222(0.003%)로 1분 동안 마취 시킨 후 형광현미경을 이용하여 형태학적으로 관찰하며 이미지J 프로그램을 이용하여 수치화시켰다.
[실험방법 3] 자외선에 대한 피부 보호효과 분석
자외선 B에 대한 바다대나무 추출물(에탄올 또는 효소)의 피부 보호 효과를 확인하고자, HaCaT 세포에서 시료 및 자외선을 처리하고 세포내 활성산소종 수준 및 세포 생존율 변화를 분석하였다.
인간 각질형성 세포주인 HaCaT세포는 DMEM에 100U/㎖ 페니실린(penicillin) 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)을 혼합한 배지를 사용하여, 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건의 배양기(incubator)에서 배양하였다. 세포배양 배지는 2일마다 새로운 배지로 갈아준 후, 실험을 위하여 4×104개/300㎕의 세포를 48 웰 및 2×106개/2㎖의 세포를 6 웰 플레이트에 접종하여 24시간 뒤 세포가 안정적으로 부착된 후에 실험에 사용하였다.
HaCaT 세포를 80% 밀도가 되도록 배양한 뒤 배지를 걷어내고 인산완충용액으로 1회 세척한 다음 자외선 조사장치를 사용하여 30mJ/㎠ 또는 50mJ/㎠ 의 자외선 B를 조사하였다. 자외선 조사 후 다양한 농도의 시료를 처리하여 24시간 배양하였다.
세포 내 활성 산소종 및 생존율 변화분석 방법은 실험방법 2와 동일한 방법을 사용하였다.
[실험방법 4] 미백효과 분석
바다대나무 에탄올 추출물, 또는 효소 추출물의 미백 활성을 분석하고자, 먼저 각 추출물 처리한 B16F10 세포에서 세포생존율(세포독성), 멜라닌 생성 억제 효과를 분석하였다. 또한, 멜라닌 합성의 관여하는 효소인 티로시나아제의 저해 활성을 분석하였다.
4.1. B16F10 세포에서 세포독성 분석
바다대나무 에탄올 추출물, 또는 효소 추출물을 25, 50, 100㎍/㎖의 농도로 흑색종 세포주(B16F10)에 처리 후, MTT 분석을 수행하여 바다대나무 에탄올 추출물 또는 효소 추출물 처리 농도에 따른 세포 생존율 변화를 분석하였다.
4.2. B16F10 세포에서 멜라닌 생성 억제 효과 분석
멜라닌 생성의 억제 효과를 분석하고자, 흑색종 세포주(B16F10)에서 알파-멜라노사이트 자극 호르몬(α-melanocyte stimulation hormone, α-MSH)으로 멜라닌 생성을 유도하고, 시료를 각 농도하여 멜라닌 생성 억제 효과를 분석하였다.
흑색종 세포주(B16F10)가 완전히 차게(confluency) 자란 후 웰(well) 당 40,000 세포로 분주하고, 세포가 자랄 수 있도록 5% 이산화탄소(CO2)를 포함한 습한 환경의 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션(incubation) 하였다. 다음날 α-MSH 를 1nM 농도로 처리하여 멜라닌 생성을 유도하고, 각 시료를 농도별로 처리한 후 총 4일간 배양하였다. 색깔의 발색은 매 아침마다 육안으로 관찰하며, 색깔의 발색 후에, 200㎕의 세포 상층액을 각 웰(well)로부터 제거하고 흡광도를 450㎚에서 측정하였다. 양성 대조군은 알부틴 100μM을 처리하였다.
4.3. 티로시나아제 저해 활성 분석
티로시나아제 저해 검정법은 존스 등에 의해 보고된 방법을 사용하였고 (Jones et al. (2002) Pigment. Cell Res. 15:335), 티로시나아제의 기질인 L-Dopa의 도파크롬(dopachrome)으로의 전환은 450㎚에서 흡수 모니터링에 의해 수행하였다.
티로시나아제는 200U/㎖의 pH 6.8(검정 완충액), 50mM 포타슘 포스페이트 완충액으로 제조하였다. 기질인 L-DOPA의 2mM 모액(working solution)은 각 검정법을 위한 검정 완충액으로 제조, 시료들은 10%의 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO) 0.5㎖에 용해하고 5㎖의 검정 완충액으로 희석하였다. 반응 혼합물은 0.050㎖의 2mM L-DOPA, 0.050 ㎖ 200U/㎖ 머쉬룸 티로시나아제 및 0.050㎖ 시료로 이루어진다. 반응 부피는 200㎕L의 검정 완충액으로 조정하였고, 검정은 96 웰 플레이트(well plate)에서 수행하였다. 테스트 시료에 의한 티로시나아제 저해율(%)는 수학식1과 같이 계산하였다.
Figure pat00001
[실험방법 5] 주름 개선 효과
바다대나무 에탄올 추출 또는 효소 추출물의 주름 개선 또는 억제 효과 분석하였다. 구체적으로 HDF 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물 또는 효소 추출물 처리에 따른 자외선에 의한 세포내 활성산소종 수준, 세포생존율 및 콜라겐 함량 변화를 분석하였으며, 바다대나무 에탄올 추출물의 엘라스틴 저해 활성을 분석하였다.
5.1. HDF 세포에서 주름 개선 효과 분석
바다대나무 에탄올 추출물 또는 바다대나무 효소 추출물 주름 개선 효과를 분석하고자, 세포 인간 섬유아세포주인 HDF 세포에서 자외선으로 노화(주름)를 유도한 후, 세포내 ROS 생성 억제효과, 세포의 생존율 변화 및 콜라겐 감소 억제 효과를 확인하였다.
HDF 세포는 DMEM에 100U/㎖ 페니실린(penicillin) 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)을 혼합한 배지를 사용하여, 37℃, 5% 이산화탄소(CO2) 조건의 배양기(incubator)에서 배양하였다. 세포배양 배지는 2일마다 새로운 배지로 갈아준 후, 실험을 위해 플레이트에 접종하여 24시간 뒤 세포가 안정적으로 부착된 후에 실험에 사용하였다.
HDF 세포를 80% 밀도가 되도록 배양한 뒤 배지를 걷어내고 인산완충용액으로 1회 세척한 다음 자외선 조사장치를 사용하여 50mJ/㎠ 의 자외선 B를 조사하였다. 자외선 조사 후 다양한 농도의 시료를 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후, 세포내 활성산소종 수준, 생존율 및 콜라겐 함량 변화를 분석하였다.
세포 내 활성 산소종 및 생존율 변화분석 방법은 실험방법 2와 동일한 방법을 사용하였다.
콜라겐 함량은 분석은 다음과 같이 수행하였다. 48 웰 플레이트에 HDF 세포를 5×104개로 접종한 후 5% CO2 37℃에서 24시간 배양하였다. 이후 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함되지 않은 DMEM 배지로 교체하고, 시료를 첨가하여 24시간 동안 배양 후, 배양액을 모아서 프로콜라겐 타입 원 단백질 합성 키트(procollagen type Ⅰ protein synthesis kit)를 이용하여 콜라겐 전구체의 C-말단의 양을 측정하였다.
5.2. 엘라스타아제(elastase) 저해 활성 분석
피부 주름 개선효과를 확인하기 위하여 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide를 사용하여 37℃에서 30분간 p-nitroanilide의 생성량을 측정함으로서 돼지의 췌장 엘라스타아제(elastase) 저해 활성을 조사하였다. 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.1㎖ 씩 시험관에 취하고 50mM Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 엘라스타아제(elastase) 용액(Type I： From Porcine Pancreas 유래, 0.6 units/㎖) 0.05㎖를 가한 후 기질로 50mM Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide (1mg/㎖)을 0.1㎖를 첨가하여 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 410㎚에서 흡광도를 측정하였다. 엘라스타아제(elastase) 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타냈다.
[실험방법 6] 항염증 효과
제브라피쉬에서 바다대나무 에틸아세테이트 분획물의 추출물의 항염증 효과를 분석하였다.
구체적으로 LPS (10㎍/㎖)로 염증을 유도한 제브라피쉬 배아에서 생존율(%), 심박수(%), ROS 생성(%), 세포 사멸(%) 및 지질과산화(%) 수준을 분석하였다. 제브라피쉬 배아에서 생존율(%), 심박수(%), ROS 생성(%), 세포 사멸(%) 및 지질과산화(%) 수준 분석방법은 실험방법 2-2의 방법과 동일한 방법으로 수행되었다.
[실시예1] 바다대나무 에탄올 추출물의 항산화 효과
Vero 세포에서 H2O2 1mM에 세포내 활성산소종 생성이 유도되었으며, 바다대나무 에탄올 추출물의 처리 농도가 증가함에 따라 세포내 활성산소종(intracellular ROS) 생성이 억제되는 것을 확인하였다 (도 1).
세포 생존율 분석결과, 이와 유사하게 H2O2 스트레스 처리한 Vero 세포에서 생존율을 현저히 감소하였으며, 바다대나무 에탄올 추출물(EME)의 처리 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 증가하였다 (도 2).
또한, Vero 세포에서 AAPH에 의해 유도된 세포자멸체(apoptotic body) 형성이 바다대나무 에탄올 추출물(EME)이 처리 농도 의존적으로 감소하였다 (도 3).
다음으로 제브라피쉬 배아에서 바다대나무 에탄올 추출물(EME)의 항산화 효과를 분석한 결과, H2O2 1mM 처리한 제브라피쉬 배아의 생존율에서 배아의 생존율이 현저하게 감소하였으며, 바다대나무 에탄올 추출물의 처리 농도의존적으로 생존율이 회복되었다(도 4). 또한 제브라피쉬 배아에서 H2O2 1mM 가 심박수(%)를 증가시키며, 바다대나무 에탄올 추출물이 증가된 심박수(%)를 감소시킴을 확인하였다(도 5).
추가적으로 AAPH(15mM)에 의해 산화 스트레스를 유도한 제브라피쉬 배아에서 ROS 생성, 세포사멸(%) 및 지질과산화(%)가 현저히 증가함을 확인하였으며, 바다대나무 에탄올 추출물의 처리 농도의존적으로 ROS 생성, 세포사멸(%) 및 지질과산화(%)가 감소함을 확인하였다 (도 6 내지 도 8).
즉, 바다대나무 에탄올 추출물이 산화적 스트레스에 의한 ROS 생성을 억제하고, 산화적 스트레스에 의해 유도되는 손상을 억제하며, 세포를 보호하여 항산화 효과를 가짐을 확인하였다.
[실시예 2] 바다대나무 에틸아세테이트 분획물의 항산화 효과
Vero 세포에서 AAPH 10mM에 세포내 활성산소종 생성이 유도되었으며, 바다대나무 에탄올 추출물의 에틸 아세테이트 분획물(EME-EA)의 처리 농도가 증가함에 따라 ROS 생성이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 9).
이와 유사하게 세포 생존율 분석결과 H2O2 스트레스가 Vero 세포의 생존율을 현저히 감소시켰으며, AAPH 스트레스만 처리한 세포와 비교하여 바다대나무 에틸 아세테이트 분획물(EME-EA)의 처리 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 증가하였다 (도 10).
즉, 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 산화적 스트레스에 의한ROS 생성을 억제하고, 세포를 보호하여 항산화 효과를 가짐을 확인하였다.
[실시예 3] 바다대나무 효소 추출물의 항산화 효과
Vero 세포에서 AAPH 10mM에 세포내 활성산소종 생성이 유도되었으며, 바다대나무 효소 추출물의 스트레스가 Vero 세포의 생존율을 현저히 감소시켰으며, AAPH 스트레스만 처리한 세포와 비교하여 바다대나무 에틸 아세테이트 분획물(EME-EA)의 처리 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 증가하였다 (도 10).
즉, 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 산화적 스트레스에 의한ROS 생성을 억제하고, 세포를 보호하여 항산화 효과를 가짐을 확인하였다.
[실시예 3] 바다대나무 효소 추출물의 항산화 효과
Vero 세포에서 AAPH 10mM에 세포내 활성산소종 생성이 유도되었으며, 바다대나무 효소 추출물의 처리 농도가 증가함에 따라 세포내 활성산소종(intracellular ROS) 생성이 억제되는 것을 확인하였다 (도 11).
세포 생존율 분석결과, 이와 유사하게 AAPH 스트레스 처리한 Vero 세포에서 생존율을 현저히 감소하였으며, 바다대나무 효소 추출물(EMC)의 처리 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 증가하였다 (도 12).
또한, Vero 세포에서 AAPH에 의해 유도된 세포자멸체(apoptotic body) 형성이 바다대나무 효소 추출물(EMC)이 처리 농도 의존적으로 감소하였다 (도 13).
다음으로 제브라피쉬 배아에서 바다대나무 효소 추출물(EMC)의 항산화 효과를 분석한 결과, AAPH 10mM 처리한 제브라피쉬 배아의 생존율에서 배아의 생존율이 현저하게 감소하였으며, 바다대나무 효소 추출물의 처리 농도의존적으로 생존율이 회복되었다(도 14). 또한 제브라피쉬 배아에서 AAPH 10mM 가 심박수(%)를 증가시키며, 바다대나무 에탄올 추출물이 증가된 심박수(%)를 감소되었다 (도 15).
추가적으로 AAPH(15mM)에 의해 산화 스트레스를 유도한 제브라피쉬 배아에서 ROS 생성, 세포사멸(%) 및 지질과산화(%)가 현저히 증가함을 확인하였으며, 바다대나무 효소 추출물의 처리 농도의존적으로 ROS 생성, 세포사멸(%) 및 지질과산화(%)가 감소하였다 (도 16 내지 도 18).
즉, 바다대나무 효소 추출물이 산화적 스트레스에 의한 ROS 생성을 억제하고, 산화적 스트레스에 의해 유도되는 손상을 억제하며, 세포를 보호하여 항산화 효과를 가짐을 확인하였다.
[실시예 4] 바다대나무 에탄올 추출물의 자외선에 대한 피부 보호효과
HaCaT 세포에서 자외선 조사에 의해 세포내 활성산소종이 현저하게 증가되었으며, 바다대나무 에탄올 추출물(EME)의 처리 농도가 증가함에 따라 ROS 생성이 억제되었다 (도 19).
또한, 세포 생존율 역시 자외선에 처리에 의해 현저하기 감소하였으며, 바다대나무 에탄올 추출물(EME)의 처리 농도가 증가함에 따라 세포 생존율일 증가하였다 (도 20).
즉, 바다대나무 에탄올 추출물이 자외선에 의한 세포내 활성산소종 생성을 억제하고 피부 세포를 보호함을 확인하였다.
[실시예 5] 바다대나무 효소 추출물의 자외선에 대한 피부 보호효과
HaCaT 세포에서 자외선 조사에 의해 세포내 활성산소종이 현저하게 증가되었으며, 바다대나무 효소 추출물(EMC)의 처리 농도가 증가함에 따라 ROS 생성이 억제되었다 (도 21).
또한, 세포 생존율 역시 자외선에 처리에 의해 현저하기 감소하였으며, 바다대나무 효소 추출물(EMC)의 처리 농도가 증가함에 따라 세포 생존율일 증가하였다 (도 22).
즉, 바다대나무 효소 추출물(EMC)이 자외선에 의한 세포내 활성산소종 생성을 억제하고 피부 세포를 보호함을 확인하였다.
[실시예 6] 바다대나무 에탄올 추출물의 미백효과
B16F10 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물(EME)에 따른 세포독성 분석결과 100 ㎍/㎖ 처리까지 세포 생존율이 90% 이상으로 확인되었다 (도 23). 따라서 100 ㎍/㎖의 농도에서 세포 독성이 없음을 확인하였다.
다음으로 B16F10 세포에서 멜라닌 함량 변화를 분석한 결과, α-MSH 처리에 의해 멜라닌 함량이 현저하게 증가됨을 확인하였으며, 바다대나무 에탄올 추출물(EME) 처리 농도가 증가함에 따라 멜라닌 함량이 감소되었고, 50㎍/㎖ 이상에서는 양성 대조군과 유사한 수준으로 멜라님 함량이 감소되었다 (도 24).
또한, 티로시나아제 저해활성 분석결과, 바다대나무 에탄올 추출물(EME)의 처리 농도가 증가함에 따라 티로시나아제 저해활성이 증가됨을 확인하였다 (도 25).
즉, 바다대나무 에탄올 추출물이 B16F10 세포에서 멜라닌 생성을 억제하며, 티로시나아제 활성을 저해하여 미백효과를 나타냄을 확인하였다.
[실시예 7] 바다대나무 효소 추출물의 미백효과
B16F10 세포에서 바다대나무 효소 추출물(EMC)에 따른 세포독성 분석결과 25 ㎍/㎖ 처리 세포 생존율이 84.3%, 50 ㎍/㎖ 처리시 77.5%, 100 ㎍/㎖ 처리시 72.7%로 확인되었다 (도 26).
다음으로 B16F10 세포에서 멜라닌 함량 변화를 분석한 결과, α-MSH 처리에 의해 멜라닌 함량이 현저하게 증가됨을 확인하였으며, 바다대나무 효소 추출물(EMC) 처리 농도가 증가함에 따라 멜라닌 함량이 감소되었고, 25㎍/㎖ 이상에서는 양성 대조군과 유사한 수준으로 멜라닌 함량이 감소되었다 (도 27).
또한, 티로시나아제 저해활성 분석결과, 바다대나무 효소 추출물(EMC)의 처리 농도가 증가함에 따라 티로시나아제 저해활성이 증가됨을 확인하였다 (도 28).
즉, 바다대나무 효소 추출물이 B16F10 세포에서 멜라닌 생성을 억제하며, 티로시나아제 활성을 저해하여 미백효과를 나타냄을 확인하였다.
[실시예 8] 바다대나무 에탄올 추출물의 주름 개선주름 개선 효과
HDF 세포에서 바다대나무 에탄올 추출물(EME)의 자외선에 의해 유도되는 노화(주름) 억제효과를 분석한 결과, 바다대나무 에탄올 추출물(EME)이 자외선에 의한 세포내 활성 산소종 생성 및 세포 사멸을 억제함을 확인하였다 (도 29 및 도 30).
또한, HDF 세포에서 자외선에 의해 감소된 콜라겐 함량이 바다대나무 에탄올 추출물(EME) 처리 농도 의존적으로 회복됨을 확인하였다 (도 31)
또한, 피부 탄력을 유지해주는 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소(엘라스타아제)를 농도 의존적으로 저해함을 확인하였다 (도 32).
즉, 바다대나무 에탄올 추출물이 자외선에 의한 노화(주름)을 억제하고, 콜라겐 생성 감소를 회복시키며, 엘라스타나제의 활성을 저해시켜 주름 형성을 억제 또는 주름을 개선시킬 수 있음을 확인하였다.
[실시예 9] 바다대나무 효소 추출물의 주름 효과
HDF 세포에서 바다대나무 효소 추출물(EMC)의 자외선에 의해 유도되는 노화(주름) 억제효과를 분석한 결과, 바다대나무 효소 추출물(EMC)이 자외선에 의한 세포내 활성 산소종 생성 및 세포 사멸을 억제함을 확인하였다 (도 33 및 도 34).
또한, HDF 세포에서 자외선에 의해 감소된 콜라겐 함량이 바다대나무 효소 추출물(EMC) 처리 농도 의존적으로 회복됨을 확인하였다 (도 35).
즉, 바다대나무 효소 추출물이 자외선에 의한 노화(주름)을 억제하며, 콜라겐 생성 감소를 회복시켜 주름 형성을 억제 또는 주름을 개선시킬 수 있음을 확인하였다.
[실시예 10] 바다대나무 에틸아세테이트 분획물의 항염증 효과
제브라피쉬 배아에서 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 (EME-EA)의 항염증 효과를 분석한 결과, LPS로 염증을 유도한 제브라피쉬 배아의 생존율에서 배아의 생존율이 현저하게 감소하였으며, 바다대나무 효소 추출물의 처리 농도의존적으로 생존율이 회복되었다(도 36). 또한 LPS에 의해 증가된 심박수(%)가 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 (EME-EA) 처리 농도 의존적으로 감소되었다 (도 37).
또한, LPS에 의해 염증을 유도한 제브라피쉬 배아에서 ROS 생성, 세포사멸(%) 및 지질과산화(%)가 현저히 증가함을 확인하였으며, 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 (EME-EA)의 처리 농도의존적으로 ROS 생성, 세포사멸(%) 및 지질과산화(%)가 감소하였다 (도 38 내지 도 40).
즉, 바다대나무 에틸아세테이트 분획물 (EME-EA)이 LPS에 유도 염증에 의한 ROS 생성을 억제하고, 산화적 스트레스에 의해 유도되는 손상을 억제하며, 세포를 보호하여 항염증 효과를 가짐을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 기능성은 항산화, 자외선에 대한 피부보호, 미백 및 주름개선으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효과를 나타내는 것인, 화장료 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 추출물은 바다대나무(Ecklonia maxima)를 에탄올 용매로 추출한 것인 화장료 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 분획물은 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것인, 화장료 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 추출물은 셀루클라스트(celluclast) 효소를 이용하여 추출된 것인, 화장료 조성물.
  6. 바다대나무(Ecklonia maxima) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는, 건강기능성 식품 조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 기능성은 항산화, 자외선에 대한 피부보호, 미백 및 주름개선으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효과를 나타내는 것인, 식품 조성물.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 건강기능성 식품은 이너뷰티 식품인 것인, 조성물.
  9. 바다대나무(Ecklonia maxima) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물.
  10. 바다대나무(Ecklonia maxima) 에탄올 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 식품 조성물.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100879558B1 (ko) * 2007-07-31 2009-01-22 라이브켐 주식회사 디벤조­파라­디옥신 유도체를 유효성분으로 함유한 피부보호 및 개선제
KR102086687B1 (ko) 2018-08-09 2020-05-22 김형길 식물 복합추출물의 유효성분을 포함하는 피부 주름개선용 노란색 화장료 조성물

Patent Citations (2)

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Title
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