KR100986128B1 - 가지고비고사리 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가지고비고사리 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 고사리목 고사리과의 가지고비고사리의 전초(全草) 추출물을 활성성분으로 0.001 - 30.0중량%, 바람직하게는 0.01 - 5중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름방지효과, 아토피 개선효과, 항염효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과가 우수한 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 가지고비고사리 추출물은 활성산소 소거효과뿐만 아니라, 사람 섬유아세포에서 MMP-1 생합성 저해효과와 타입 1 프로콜라겐의 생합성 촉진에 의한 피부 탄력 및 잔주름 개선효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름 방지효과, 아토피 개선효과, 항염효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과를 나타낸다.

가지고비고사리 추출물, 항노화용 화장료, 주름 개선효과, 미백효과, 보습효과, 모발손상방지효과, 탈모방지 및 육모 효과, 피부자극 완화효과, 여드름 방지효과, 아토피 피부 개선효과, 항염효과, 피부 외용제

Description

가지고비고사리 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물{A skin-care agent containing Coniogramme japonica extract}

본 발명은 유효성분으로 가지고비고사리 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological aging)와 광노화(phtoaging) 두 가지로 나눌 수 있다[Gilchrest BA: J. Am . Acad . Dermatol.,21, 610-613(1989)]. 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다[Braverman IM 등: J. Invest . Dermatol., 78, 434-443(1982)]. 광노화는 피부가 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다[Ridder GM등: J. Am . Acad . Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 또한, 피부노화는 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 활성산소종이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응이 일어나고, 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상 받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부가 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 활성산소종 뿐만 아니라 MMP(Matrix metallopretease)라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 노출에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로, 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 지금까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 MMP 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다.

다음으로, 색소 침착에 의한 피부 변화이다. 피부는 태양광의 자외선으로부터 피부를 보호하기 위해 정상적으로 멜라닌을 생성한다. 멜라닌은 피부 세포의 일종인 멜라노싸이트에서 생성되고, 피부 표면에 분포되어 인체에 유해한 자외선을 차단하는 자연적인 스크리닝 기능을 나타낸다. 멜라닌 생성 기전에는 멜라노싸이트에서 합성되는 티로시나제라는 효소가 있다. 티로시나제는 티로신이라는 아미노산을 기질로 하여 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논(Dopaquinone)을 생성시키며, 도파퀴논으로부터 여러 단계의 산화 축합반응으로 흑색 색소인 멜라닌이 생성된다. 이미 아스코르빈산(일본특허공개 평4-9320), 하이드로퀴논(일본특허공개 평6-192062), 코지산(일본특허공개 소56-7710), 알부틴(일본특허공개 평4-9315) 및 일부의 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 나타내어 미백 화장료로 이용되고 있으나, 처방계 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고, 티로시나제의 억제효과는 입증되었으나, 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다.

다음으로, 피부질환이란 사람을 포함한 포유동물의 머리털과 손톱, 발톱을 포함하는 모든 피부에 나타나는 이상 소견을 의미하는 것으로, 아토피 알러지를 가진 사람에게서 나타나는 아토피 피부염(atopic dermatitis)이 대표적인 피부질환이다. 아직까지 아토피 피부염의 원인은 명확히 밝혀지지 않았지만 아토피 피부염 환자의 약 70%에서 아토피 병력이 있었으며, 알레르기성 체질인 사람에서 잘 발병하고, 특히 다른 알러지 질환인 알러지성 비염, 천식 등을 동반하여 유전적 요인이나 면역 질환의 하나로 이해하고 있다. 이 병의 특징으로 초기의 심한 가려움증에 의해 대부분이 피부를 긁고 이에 따른 2차 감염과 특히 환자의 정신적 안정 및 감정의 상태에 따라 더욱 악화될 수도 있다. 아토피 피부염은 상당히 많은 사람이 앓고 있는데, 전 인구의 0.5~1%가, 어린이의 경우는 5~10%가 고통받고 있다. 증상이 나타나는 시기는 대체로 생후 2~6개월 내이며, 특히 1세 미만의 영아에게서 가장 많이 나타나고, 85%가 만 다섯 살 안에 나타난다. 아토피성 피부염은 주로 유아기에 자주 발생하지만, 최근에는 사춘기 이후의 환자가 증가하고 있고, 그 병력도 매우 길어지고 있다. 아토피성 피부염의 치료에는 높은 약리효과를 기대할 수 있는 부신피질 호르몬 등의 약제가 사용되고 있다. 그러나, 이와 같은 부신피질 호르몬제의 부작용이 문제가 되고 있고, 환자는 치료기간 중에 부작용의 위험에 노출되어 있다. 더욱이, 부신피질 호르몬제의 사용 중지에 의하여 리바운드(약물의 사용정지 후에 일어나는 극적인 환부의 병세악화)가 생기는 것도 잘 알려져 있다. 이와 같은 부작용의 대책으로서, 부신피질 호르몬 등의 호르몬을 포함하지 않는 비스테로이드성 항염증제 또는 항히스타민제 등이 사용되고 있으나 완치가 어려운 상태이다. 따라서, 부작용이 없는 아토피 피부염의 경감 또는 치료제 개발이 매우 절실한 실정이다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 항산화, 주름완화, 미백, 가려움 완화 등의 기능을 가진 기능성 화장료(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 예를 들어, 미국 특허공보 US 5,972,341는 코미포라(Commiphora)속 식물, 특히, 코미포라 무쿨(Commiphora mukul) 추출물의 주름개선 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허 공개 평9-672662 는 히알루로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단(Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평3-294384는 히지키아(Hizikia)속으로부터 추출된 항산화 조성물에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평7-10769는 수렴효과(astringent effect)가 있는 페오피시에강(Phaeophyceae) 추출물에 관하여 기술하고 있다. 대한민국 특허 제0431076호는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 특허 제0511494호는 하수오, 시엽, 일라이트를 포함하는 아토피 피부염 치료를 위한 추출물 및 조성물을 개시하고 있으며, 대한민국 특허공개 제2004-65126호는 천연의 영지버섯, 유근피, 감초, 백봉령, 백지마 및 백년초 등으로부터 얻은 한방 식물 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유와 예방에 효과를 갖는 한방 화장료 조성물을 개시하고 있다. 또한, 대한민국 특허공개 제2004-11584호는 감초, 창이자, 홍화, 돈지(돼지비계)와 같은 천연성분의 물질을 정제 혼합하여 구성된 아토피성 피부질환의 치료에 우수한 조성물에 관해 개시하고 있다.

또한 다음으로, 남성형 탈모증은 남성호르몬 의존적이어서 남성호르몬의 양에 직접적인 관계가 있으며, 이에 따라 최근 남성호르몬 활성억제를 통한 탈모의 예방 및 치료를 위한 많은 연구가 보고되고 있다. 한편, 남성호르몬의 분비상승에 의해 피지선의 기능이 활발해지면 생성된 과잉 피지가 모낭벽의 과각화로 인하여 모낭 내에 정체되면서 생기는 면포가 여드름의 초기단계이다. 남성호르몬에 의한 탈모 및 여드름의 기전을 설명하면, 5-알파-리덕타아제(5-α-Reductase)는 피지선, 모낭, 전립선, 부고환 등의 남성 호르몬 반응성 조직에 존재하는 남성 호르몬들 중 하나로서, 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)으로 대사시키는데 관여하는 효소이며, 그 전환에는 NADPH를 필요로 한다. 또한, 테스토스테론(testosterone)은 남성 성충동, 골격근 증가, 남성외부생식기, 음낭성장, 정자형성 등에 관여하고, 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)은 여드름, 피지 증가, 탈모 및 전립선 비대증 등의 해당 조직에 관여한다. 특히, 사춘기 이후에 남성 호르몬의 과량 분비는 여드름과 탈모를 유발하는데, 5-알파-리덕타아제에 의하여 생성되는 남성 호르몬의 활성형태인 디하이드로테스토스테론의 과량 생성을 막기 위해 5-알파-리덕타아제 억제제를 사용하여 탈모방지 및 여드름 방지제를 개발하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

이러한 피부의 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다.

본 발명은 여러 천연물 중 피부 외용제의 원료로서의 효능을 확인하고, 그 사용 방법을 개발하고, 이 원료를 사용함으로써 우수한 기능성을 갖는 피부 외용제 를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 목적은 피부 외용제 및 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 활성산소 소거효과, MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과, 항염효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부 외용제 및 화장료에 적용시 자외선 조사 등에 의한 미백효과와 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부 외용제 및 화장료에 적용시 보습효과 및 아토피 피부 개선에 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부 외용제 및 화장료에 적용시 우수한 모발손상방지효과, 탈모 방지효과, 육모효과 및 여드름 방지효과를 갖는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물에 대하여 화장품 또는 피부 외용제로의 응용 가능성을 연구한 결과, 가지고비고사리 천연물을 선정하고 이로부터 추출물을 제조하여, 활성산소 소거효과, 주름개선효과, 염증 완화효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과를 측정한 결과, 그 효과가 우수하여 피부 외용제 및 화장료로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

가지고비고사리(Coniogramme japonica)는 여러해살이풀로써, 한국(제주·전남)·일본·타이완·중국 등지에 분포한다. 뿌리줄기는 굵고 길게 옆으로 뻗으며 잎이 드문드문 나오고 갈색의 비늘 조각이 있다. 잎자루는 길이가 50∼60㎝이고 가늘며 연한 녹색이고 뒷면은 검은빛이 도는 갈색이다. 가지고비고사리 및 동속 근연식물의 근경 혹은 전초를 산혈련이라고 한다. 거풍, 청열, 활혈, 해독의 효능이 있다. 근경은 목적, 종통, 미능골통, 안와상부 가장자리의 통증, 풍습(류머티즘으로 인한 관절통), 월경폐지를 치료한다고 알려져 있다.

본 발명에 따른 가지고비고사리 추출물은 활성산소 소거효과와 MMP 저해 효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과, 피부 잔주름 개선 효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사 후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과를 나타내었다.

또한, 가지고비고사리 추출물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과 등의 미백작용을 나타내었다.

또한, 가지고비고사리 추출물은 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화 및 아토피 개선효과를 나타내었다.

또한, 가지고비고사리 추출물은 우수한 모발손상 및 탈모방지 효과와 여드름방지 효과를 갖는 여드름균 항균활성과 5-알파-리덕타아제 억제 효과를 나타내었다.

따라서, 이러한 가지고비고사리 추출물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 활성산소 소거효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백, 보습, 모발손상 방지, 탈모 방지, 여드름방지, 아토피 개선효과, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부 외용제 효과를 가짐을 알 수 있다.

본 발명은 가지고비고사리 천연물을 추출용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는 식물 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 추출물이 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결건조하여 얻은 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 가지고비고사리 천연물의 함량이 피부 외용제 조성물 전체에 대해서 동결건조중량 기준 0.001-30.0중량%인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공한다. 상기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 상기 피부 외용제 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 연고, 에센스, 샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어무스, 립스틱, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 가지고비고사리 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 피부 외용제 조성물이 화장료 조성물 또는 약학 조성물인 것을 특징으로 한다.

가지고비고사리 추출물은 캡슐제, 액상제, 연고제, 첩부제 또는 약학적으로 허용되는 담체를 이용한 서방화 제제 등의 약학 조성물로 제제화할 수 있으며, 약리학적으로 허용되는 기제, 운반제, 부형제, 결합제(예: 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당밀, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스), 분쇄제(예: 한천, 전분, 벨라틴 가루, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨), 윤활제(예: 스테아린산 마그네슘, 활석, 수첨 식물유) 및 착색제 등을 포함한다. 상기 운반제 및 부형제로는 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등을 사용한다.

상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제 방향제, 방부제 등의 첨가제가 더 첨가될 수 있다.

이와 같이 제조되는 약학 조성물은 증상에 따라 일일 1회 내지 수회 피부에 적용할 수 있으며 증상의 호전 정도에 따라 적용을 조절할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 가지고비고사리 추출물 제조

세절하여 음건한 가지고비고사리를 95%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물은 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜, 감압농축물 및 동결건조물이 0.001~30.0중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 가지고비고사리 추출물을 제조하였다.

실시예 2: NBT 법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 비교샘플로 하고 NBT(Nitro Blue Tetrazolium)법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560㎚에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na₂CO₃ ------------------------------------- 2.4㎖

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1㎖

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1㎖

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1㎖

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1㎖

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1㎖

7. 6mM CuCl₂ 용액----------------------------------- 0.1㎖

① 바이엘병에 상기 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1㎖을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 상기 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간 배양한다.

③ 그 후 상기 7을 가하여 반응을 정지시키고 560㎚에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 상기 6 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과는 아래 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 1에 나타내었다.

활성산소 소거율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560㎚에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560㎚에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560㎚에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560㎚에서의 흡광도

표 1과 같이, 가지고비고사리 추출물은 BHT(Butylated hydroxytoluene)보다 우수한 항산화력을 나타냄을 확인하였다.

시료명	활성산소 소거율(%)
가지고비고사리 추출물 0.25중량%	98%
가지고비고사리 추출물 0.1중량%	95%
가지고비고사리 추출물 0.05중량%	85%
가지고비고사리 추출물 0.025중량%	75%
BHT(Butylated hydroxytoluene) 0.1중량%	87%

실시예 3: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 BHT(Butylated hydroxytoluene)와 같은 항산화제를 비교샘플로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560㎚에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 각각 0.25%, 0.1%, 0.05%, 0.025% 농도의 가지고비고사리 추출물을 준비하였다. 상기 농도의 추출물을 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560㎚에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 2로 산출하였다.

자유라디칼 소거활성(%)= {100-(B/A)}X100

A: 본 발명의 가지고비고사리 추출물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 본 발명의 가지고비고사리 추출물을 처리한 실험군 웰의 흡광도

표 2와 같이, 가지고비고사리 추출물은 항산화제로 많이 이용되고 있는 BHT(Butylated hydroxytoluene)보다 우수한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

시료명	자유라디칼 소거활성(%)
가지고비고사리 추출물 0.25중량%	97%
가지고비고사리 추출물 0.1중량%	95%
가지고비고사리 추출물 0.05중량%	95%
가지고비고사리 추출물 0.025중량%	90%
BHT(Butylated hydroxytoluene) 0.1중량%	81%

실시예 4: 세포내 활성산소 소거효과

실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물의 자외선에 의해 세포 내에서 생성되는 활성산소 생성 억제효과 즉, 활성산소 소거효과를 알아보기 위하여 비교샘플로 EGCG(Epigallocatechin gallate)를 선정하고, 형광물질을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실험에 사용한 세포주는 독일 암연구센터의 퓌세니그 박사(Dr. Fusenig)로부터 분양받은 인간 각질세포 HaCaT 세포주(Human keratinocytes HaCaT cell line)로서 이를 형광측정용 96웰 블랙 플레이트(well black plate)에 웰당 2.0 × 10⁴개로 분주하고 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)이 첨가된 DMEM(Dulbeccos Modification of Eagles Medium, FBS 10%, Gibco, USA)배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 1일간 배양한 후, 각각 0.02, 0.01, 0.005% 농도로 가지고비고사리 추출물을 처리하였다.

시험시료를 넣고 24시간 배양한 후 HCSS(HEPES-buffered control salt solution)로 세척하여 남아있는 배지를 제거하고 HCSS에 20μM로 준비된 DCFH-DA (2',7'- dichlorodihydro-fluorescein diacetate, Molecular Probes, USA)를 100㎕ 가하고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 20분간 배양한 후, HCSS로 세척하였다. 이 후 농도별로 처리된 HCSS를 100㎕ 가한 후 초기에 활성산소로 산화된 DCF(dichlorofluorescein)의 형광도를 형광플레이트 판독기(Ex;485㎚, Em;530㎚)로 측정하였다. 이후 UVB(20mJ/cm²)를 조사하고 가지고비고사리 추출물 처리 후 형광도를 형광플레이트 판독기(Ex;485㎚, Em;530㎚)로 측정하였다.

표 3과 같이, 가지고비고사리 추출물은 활성산소 소거효과에 비교 시료로 많이 이용되고 있는 EGCG(Epigallocatechin gallate)보다 우수한 활성산소 소거 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

시료명	활성산소 소거효과(%)
가지고비고사리 추출물 0.02중량%	55
가지고비고사리 추출물 0.01중량%	45
가지고비고사리 추출물 0.005중량%	27
EGCG(Epigallocatechin gallate) 0.01중량%	43

실시예 5: 인비트로 MMP -1 활성저해 실험

MMP-1 활성 저해 효과를 측정하기 위하여 형광 분석법을 이용하였다. 실험에 사용한 기질은 형광물질이 표지된 DQ^TM-콜라겐, 효소(collagenase)는 Molecular probe사(Eugene, OR, USA)에서 시판중인 제품을 사용하였으며, 반응완충액(0.5M Tris-HCl, 1.5M NaCl, 50mM CaCl₂, 2mM 소듐 아자이드, pH 7.6)은 10배 희석 후 사용하였다. 반응완충액 100㎕에 0.25㎎/㎖로 반응완충액에 용해한 DQ^TM-콜라겐 20㎕와 가지고비고사리 추출물(0.02, 0.01, 0.005중량%) 40㎕을 첨가하고 0.5단위(unit)로 희석한 콜라게나제 40㎕을 첨가한다. 암소, 실온에서 20분 경과 후 형광 분광광도계(Perkin Elmer, UK)를 이용하여 흡수파장 495㎚, 방출파장 515㎚로 형광값을 측정하며, 대조군으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 형광값을 측정하였으며 시료 자체의 형광값도 측정하여 효소활성 계산시 보정하였다.

결과는 표 4에 나타내었으며, 가지고비고사리 추출물을 0.02% 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성을 89% 억제하였으며, 이는 녹차추출물의 저해 효과보다 우수하게 나타났다.

시료명	인비트로 MMP-1 저해율(%)
가지고비고사리 추출물 0.02중량%	89
가지고비고사리 추출물 0.01중량%	65
가지고비고사리 추출물 0.005중량%	49
녹차추출물 0.2중량%	66

실시예 6: 자외선 조사 후 가지고비고사리 추출물에 의한 MMP -1 발현억제 평가

본 실험예는 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간을 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 알칼라인 포스파타제 결합된 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질용액(다이에탄올아민 완충용액 내에 1㎎/㎖ ρ-나이트로페닐인산 함유)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 가지고비고사리 추출물은 0.02중량%에서 72% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율에 비해 상당히 우수한 결과를 나타내었다.

시험군	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-
가지고비고사리 추출물 0.02중량%	72
가지고비고사리 추출물 0.01중량%	39
가지고비고사리 추출물 0.005중량%	26
레티놀	38

실시예 7: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

본 실실예는 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물 첨가 후 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 하기와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1)배지에 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum)을 첨가하여 1× 10⁴cell/cm²농도로 배양하였다. 70-80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다.

프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 가지고비고사리 추출물을 0.02%, 0.01%, 0.005% 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

결과는 표 6과 같이, 가지고비고사리 추출물을 0.02% 처리시 프로콜라겐의 생합성이 34% 촉진되었으며, 이는 세포신호전달 물질인 TGF(Tissue Growth Factor)-β와 유사한 효과를 나타내었다.

시료명	프로콜라겐 생합성촉진효과(%)
가지고비고사리 추출물 0.02중량%	34%
가지고비고사리 추출물 0.01중량%	18%
가지고비고사리 추출물 0.005중량%	15%
TGF(Tissue Growth Factor)-β 0.001중량%	37%

실시예 8: 가지고비고사리 추출물의 엘라스틴 생성 촉진 효과

가지고비고사리 추출물의 엘라스틴 생성 촉진 효과를 알아보기 위하여, 사람으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 사람의 섬유 아세포에 상기 실시예 1의 가지고비고사리 추출물을 처리하여 엘라스타제(elastase) 활성 억제효과를 확인하였다.

먼저, 사람의 섬유 아세포를 배양용 플라스크에 넣고 약 70∼80 % 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이후 가지고비고사리 추출물을 1일간 처리한 후 세포배양액을 채취하여 상업적으로 이용가능한 엘라스틴 측정기구를 이용하여 엘라스틴 생성 정도를 측정하였다[Bieth J: Biochem med ., 11, 350-357(1974), Schwartz DE: J.Invest Dermatol., 86, 63-68(1986)]. 즉, 엘라스타제의 기질인 Suc-(Ala)3 NA(N-succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide)를 이용하여, NA가 분해되면서 생기는 색의 변화를 흡광도를 이용하여, 엘라스타제의 활성도를 측정하였다. 이때 가지고비고사리 추출물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였다.

하기 표 7과 같이, 가지고비고사리 추출물은 대조군에 비하여 엘라스타제의 활성을 뛰어나게 억제함을 알 수 있으며, 활성 억제율은 가지고비고사리 추출물의 농도가 증가할수록 높아짐을 확인하였다. 이를 통하여 가지고비고사리 추출물이 우수한 노화 방지 및 탄력 증진 효과를 나타냄을 알 수 있다.

시료명	엘라스타제 활성 억제율 (%)
가지고비고사리 추출물 0.02중량%	34%
가지고비고사리 추출물 0.01중량%	18%
가지고비고사리 추출물 0.005중량%	11%
대조군	0%

실시예 9: 티로시나제 활성 억제 실험

티로시나제는 버섯에서 분리 및 정제된 것으로 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 기질인 L-티로신(Sigma)은 0.05M 인산나트룸 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1㎎/㎖ 용액으로 만들어 사용하였다. 가지고비고사리 추출물은 0.05M 인산나트륨 완충용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 후 사용하였다. L-티로신 용액 0.5㎖를 시험관에 넣고 여기에 가지고비고사리 추출물 시료액 0.5㎖을 가하고 37℃ 항온기에서 10분간 방치하였다. 그 후 각 시료액에 200unit/㎖ 티로시나제 0.5㎖를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이 반응액이 든 시험관을 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시킨 후 분광광도계를 파장 475㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 상기 시료 대신 완충용액 0.5㎖를 넣은 것을 사용하였다.

상기 각 시료의 티로시나아제 활성 저해율은 수학식 3에 따라 계산하였다.

티로시나제 활성저해율(%) = 100-[(비교군 흡광도/대조군 흡광도)]X100

결과는 표 8에 나타냈으며, 가지고비고사리 추출물을 0.02% 처리시 티로시나아제 저해율은 알부틴과 유사한 효과를 나타내었다.

시료명	티로시나제 저해율(%)
대조군	-
가지고비고사리 추출물 0.02중량%	55%
가지고비고사리 추출물 0.01중량%	45%
가지고비고사리 추출물 0.005중량%	41%
알부틴 0.2중량%	58%

실시예 10: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 합성억제 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호: 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신(trypsin)-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄[Lotan : Cancer Res., 40, 3345-3350(1980)]의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척한 후 균질화 완충액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF(phenylmethanesulphonylfluoride)) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포여액에 1N NaOH{10% DMSO(Dimethyl sulfoxide) 포함}를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 4에 의하여 계산하였다.

저해율 (%) = [(A-B)/A]x 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 합성 억제효과를 시험한 결과, 가지고비고사리 추출물은 0.02%에서 33%의 멜라닌 생성 억제효과를 나타내어 알부틴과 유사한 생성 억제 효과를 나타내었다(표 9).

시료명	멜라닌 합성 저해효과(%)
대조군	-
가지고비고사리 추출물 0.02중량%	33%
가지고비고사리 추출물 0.01중량%	23%
가지고비고사리 추출물 0.005중량%	11%
알부틴 0.2중량%	36%

실시예 11: 염증유발관련 효소( hyaluronidase ) 활성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위해 염증유발관련 효소인 히아루로니다제의 효소 활성을 측정하여 판단한 것이다.

히아루로니다제(hyaluronidase)는 히아루론산을 가수분해하는 효소로 염증을 유발한다. 본 실시예에서는 이 효소의 활성을 억제하여 항염증효과를 측정하는 방법[Kakegawa Y: Japanese J. of Inflammantion, 4, 437-438(1984)]을 응용해 항염증 효과를 판정하였다.

컴프리, 시소, 유용성 감초 추출물, 가지고비고사리 추출물을 시료로 사용하여 히아루로니다제 활성 억제 효과를 조사하였다.

각 시료들의 히아루로니다제에 대한 저해활성은 다음과 같이 행하였다.

시료 100㎕와 히아루로니다제 용액(type Ⅳ-S, Sigma사, 400U/ml) 50㎕를 넣고 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 효소활성화 용액(compound 48/80 CaCl_{2 ·}2H₂O, Sigma사, 0.1㎎/㎖) 100㎕를 첨가하고 다시 37℃에서 20분간 반응시킨다. 히아루론산(hyaluronic acid) 용액(0.4㎎/㎖)을 250㎕ 넣고 37℃에서 40분간 반응시키고, 0.4N NaOH 100㎕를 넣어 반응을 종결시킨다. 포타슘보레이트 용액을 100㎕ 첨가하여 95℃에서 3분간 반응시키고 냉각시킨 다음 ρ-디메틸아미노벤즈알데히드 용액을 3㎖ 넣고 다시 20분간 37℃에서 반응시켜 발색시킨다. 585㎚에서 흡광도를 측정하여 히아루로니다제에 대한 저해율을 측정하였다. 히아루로니다제에 대한 저해율(%)은 수학식 5에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 히아루로니디아제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(A-B)/A] x 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 효소활성

B : 시료를 첨가한 웰의 효소 활성

히아루로니다제 효소 활성 억제 효과를 시험한 결과 가지고비고사리 추출물의 IC₅₀값은 0.25%로 나타나 히아루로니다제 저해효과가 뛰어나다고 알려진 기존의 항염증제인 유용성 감초 추출물, 컴프리 추출물, 시소 추출물 등에 비해 우수하거나 유사한 효과를 나타내었다(표 10).

시료	히아루로니다제 활성 억제효과(IC50)
컴프리 추출물	0.24%
시소 추출물	0.55%
유용성 감초 추출물	0.21%
가지고비고사리 추출물	0.25%

실시예 12: 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS(Phosphate buffered saline)로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS(Phosphate buffered saline)를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS(Phosphate buffered saline)를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 가지고비고사리 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565㎚ 흡광도를 측정하였다. 수학식 6에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 7에 의하여 계산하였다.

세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

St : 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

실험 결과, 가지고비고사리 추출물은 0.02% 농도에서 자외선에 의한 세포독성을 42.5% 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 상기 실험을 통해 가지고비고사리 추출물이 자외선에 의한 세포손상을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다(표 11).

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
가지고비고사리 추출물	0.02	42.5
	0.01	34
	0.005	21

실시예 13: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 가지고비고사리 추출물을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로써 가지고비고사리 추출물의 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성률은 수학식 8에 의해 계산하였다.

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

실험 결과, 가지고비고사리 추출물은 0.02% 농도에서 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 37% 억제하여 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다(표 12).

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
가지고비고사리 추출물 (실시예 1)	0.02	37
	0.01	21.6
	0.005	11

실시예 14: 자외선 조사에 의한 프로스타글란딘 생합성 억제 효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물의 프로스타글란딘 생합성 억제 효과를 평가하기 위하여 사람의 표피 조직에서 분리한 각질형성세포(Keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. FBS가 포함되지 않은 배지로 교체하고, 18시간 동안 배양한 다음, 상기 각질형성세포에 최종농도가 50uM이 되도록 아스피린(aspirin)을 처리하여 각질형성세포에 존재하는 프로스타글란딘 생합성 효소(prostaglandin E₂ synthetase, 또는 cyclooxygenase, 이하 COX)의 활성을 제거하였다. 아스피린 처리 2시간 후에 각질형성세포가 들어있는 각 웰을 PBS로 2회 세척하고 각 웰에 100㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질형성세포에 UVB 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 30mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 각 웰에 각질형성세포 배양액(keratinocyte growth media, Clonetics, Biowhittacker사, MD, USA) 250㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 가지고비고사리 추출물을 처리한 후 16시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 적당량 취하여 16시간 동안 생합성된 PGE₂(prostaglandin E₂)를 정량함으로써 가지고비고사리 추출물의 프로스타글란딘 억제효과를 판단하였다. PGE₂의 양은 효소면역분석법(enzyme immunoassay)를 이용하여 정량화하였다. 실험 결과, 가지고비고사리 추출물은 자외선에 의한 프로스타글란딘의 생성을 효과적으로 억제함을 알 수 있었다. 특히 생성되는 PGE₂는 주로 COX-2 효소에 의해 만들어지는 것으로 알려져 있으므로 상기 실험을 통해 가지고비고사리 추출물이 COX-2 효소의 유도작용 또는 활성을 억제함을 알 수 있다(표 13).

시료명	PGE2 억제율(%)
(-) UV B	음성 대조군
(+) UV B	양성 대조군
(+) UV B + 가지고비고사리 추출물 0.02중량%	55%
(+) UV B + 가지고비고사리 추출물 0.01중량%	31%
(+) UV B + 가지고비고사리 추출물 0.005중량%	11%

실시예 15: 여드름균에 대한 항균력 시험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)에 관한 것이다. 먼저, 여드름 발생원인의 피부 상재균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화하기 위하여 BHI(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%) 액체 배지에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균배양액을 BHI 고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%; 한천 1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후 건조시켰다. 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물을 95% 에탄올 수용액에 12%(W/v)로 희석하여 직경 8㎜의 페이퍼 디스크에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려놓고 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 페이퍼 디스크 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다. 그 결과, 가지고비고사리 추출물의 균 성장 저지환의 크기는 22㎜인 것으로 나타났다.

실시예 16: 가지고비고사리 추출물의 5-알파- 리덕타아제 활성 억제력 평가실험

5-알파-리덕타아제 활성억제 실험에 사용된 5-알파-리덕타아제는 포피 유래의 섬유아세포가 생성하는 효소를 사용하였다.

섬유아세포를 마이크로플레이트 홀마다 1x10⁴개의 세포가 들어가도록 접종한 후 배양한다. 각 홀마다 ³H(트리튬)으로 방사선표지(radio labelling)된 테스토스테론을 0.1.mμ.Ci 첨가한 후에 배양하여 섬유아세포가 이를 이용하는지 측정한다. 가지고비고사리 추출물이 들어가지 않은 것을 대조군으로 삼는다. 24시간 배양 후 상등액을 얻고 에틸아세테이트(ethyl acetate)-사이크로헥산(cyclohexane) (1:1) 추출용매 1㎖로 스테로이드(steroids)를 얻는다. 이렇게 얻어진 스테로이드를 박막크로마토그래피판에 올려놓고 클로로포름/메탄올 혼합액(98/2 (v/v))로 전개시킨다. 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론에 해당하는 점의 방사활성을 덴시토미터를 이용하여 측정하여 전환율을 계산하고, 그 결과를 대조군(추출물을 첨가하지 않았을 때의 전환율)과 비교하여 하기 수학식 9에 의해 5-알파-리덕타아제 저해능을 평가하였다.

저해능(%)=[A-B]/[A] × 100

A=테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 미첨가시)

B=테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 첨가시)

실험 결과, 가지고비고사리 추출물은 5-알파-리덕타아제 저해효과가 있음을 알 수 있다(표 14).

가지고비고사리 추출물 농도(%)	0.02	0.01	0.005
저해율(%)	82.0	76.0	53.4

실시예 17: 컴파운드 48/80에 의한 아토피 피부염 유발 후 가지고비고사리 추출물의 항염증 실험

BALB/c 마우스(5주, 수컷)의 등쪽 목부위 피부의 진피 내로 마리당 30㎕의 컴파운드 48/80(Sigma, Co.; 1㎎/㎖ in saline)을 주사한 후 우리에 집어넣고 60분 동안 마우스가 목을 긁는 행동을 관찰하였다. 가지고비고사리 추출물의 항염 치료 효능을 검정하기 위하여 컴파운드 48/80을 주사하기 5일 전부터 가지고비고사리 추출물을 250㎕/㎖의 농도로 마리당 100㎕씩 마우스의 등쪽 목 부위에 도포하였다. 도포 방법은 5일 동안 하루에 두 번씩 총 10회에 걸쳐 마우스의 등쪽 목 부위에 도포하여 전처리 한 다음 컴파운드 48/80을 주사한 후 총 1시간 동안 5분 간격으로 마우스가 뒷발로 목을 긁는 시간을 측정하여 소양증 정도를 측정하였다.

표 15에서 알 수 있듯이, 가지고비고사리 추출물을 사용하는 경우 컴파운드 48/80에 의한 아토피 피부염 (피부 소양증) 유발을 억제하는 효과를 나타내었다.

	긁는 횟수(Number of scratching in 5min)
	5분	10분	15분	20분	25분	30분	35분	40분	45분	50분	55분	60분
가지고비 고사리 추출물	21	25	29	33	35	37	41	43	46	25	20	17
대조군	40	45	50	62	82	92	97	70	57	52	42	37

실시예 18: 수분 흡습성 실험

가지고비고사리 추출물의 수분 흡습성을 실험하기 위하여, 인간으로부터 직접 채취하거나 또는 상업적으로 구입한 사람의 건조 표피세포에 상기 실시예 1의 가지고비고사리 추출물과 증류수를 각각 포화 흡수시키고 흡수된 물의 양을 측정한 후, 48시간 건조 후의 질량변화를 측정하였다. 각각의 측정된 질량의 변화로부터 피부세포 단위 질량당 흡수된 물의 양을 비교하였다. 이러한 실험은 표피세포에 흡습되는 물의 양을 비교하기 위한 방법으로 실제 사람의 피부에 있어서도 그 보습 효과를 예상할 수 있는 한가지 방법으로 사용되고 있다.

구체적으로, 사람의 표피세포를 건조시켜 단위질량당 함유된 수분의 양을 일정하게 만든 후, 각각의 표피세포 시료의 무게와 함유된 물의 양을 카이저 방법(Kaiser method)을 사용하여 측정하였다. 물의 함량이 측정된 표피세포를 가지고비고사리 추출물(A), 정제수(B)에 각각 24시간 담지하여 포화 흡수시켜준 뒤, 세포 내에 물이 포화흡수된 표피세포를 꺼내서 무게를 달고, 일부를 채취하여 카이저 수분측정기로 함유되어 있는 단위질량당 수분의 양을 측정하였다. 이후 다시 48시간 감압건조시키고 무게를 측정한 후, 일부를 채취하여 카이저 방법에 의해 수분량을 측정하여 함유되어 있는 단위질량당 수분의 양을 측정하였다.

표 16과 같이, 가지고비고사리 추출물로 포화 흡습시킨 표피세포가 정제수에 의하여 포화흡습된 표피세포의 재건조 과정에 있어 정제수보다 훨씬 많은 물을 함유하고 있음을 확인할 수 있었으며, 이로부터 가지고비고사리 추출물의 우수한 피부 흡습성을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 가지고비고사리 추출물이 우수한 보습 효과를 나타냄을 알 수 있다.

	수분함량
	초기 건조상태	포화상태	건조 후
미세결합수	400	800	500
정제수	400	790	400

*단위: 수분 mg/표피세포 질량 g

실시예 19: 가지고비고사리 추출물과 사람 모발 단백질의 결합 효과

사람 모발 케라틴 단백질 50㎍에 실시예 1의 가지고비고사리 추출물을 각각 0.02, 0.01, 0.005중량%의 시험 농도로 첨가하고 상온에서 30분 동안 반응시킨 후, 6% 과산화수소와 0.5% 암모니아 1:1 혼합 용액으로 처리하여 30분 동안 반응시켰다. 반응액을 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 램리(Laemmli)의 방법에 따라 전기영동하고, 젤에 있는 케라틴 단백질을 0.1% 쿠마시 블루(Coomassie brilliant blue R 250), 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 1시간 동안 염색한 후 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합용액에서 탈색시키고 케라틴 단백질 띠를 확인하였다. ImageMaster(Amersham Pharmacia Biotech.) 소프트웨어를 사용하여 50㎍의 사람 모발 케라틴 단백질만 전기영동했을 때 나타나는 케라틴 단백질 띠를 100%로 하고, 가지고비고사리 추출물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 비교하여 케라틴 결합 효과를 %로 표시하였다.

표 17과 같이, 가지고비고사리 추출물 함량이 증가함에 따라 모발 단백질 케라틴과의 결합 능력도 증가하는 것을 알 수 있다.

가지고비고사리 추출물	대조군	0.02%	0.01%	0.005%
모발단백질 결합효과	0	75%	60%	50%

실시예 20: 알칼리와 과산화수소 처리에 의한 케라틴 용출에 대한 가지고비고사리 추출물의 보호 효과

3g의 모발을 10㎖의 과산화수소(6%)와 암모니아(1.68%)의 1:1 혼합용액에 넣고 가지고비고사리 추출물을 각각 0.02, 0.01, 0.005중량%의 시험 농도로 첨가한 후에 상온에서 30분 동안 처리하였다. 반응액 0.5㎖를 Rapid-Con protein concentration kit(Elpis Biotech.)를 사용하여 농축시키고 농축액을 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 램리(Laemmli)의 방법에 따라 전기영동한 후 젤에 있는 케라틴 단백질을 0.1% 쿠마시 블루(Coomassie brilliant blue R 250), 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 1시간 동안 염색하고 10% 빙초산 및 40% 에탄올의 혼합 용액에서 탈색시켜 케라틴 단백질 띠를 확인하였다. ImageMaster software(Amersham Pharmacia Biotech.)를 사용하여 50㎍의 사람 모발 케라틴 단백질만 전기영동했을 때 나타나는 케라틴 밴드를 100%로 하고, 가지고비고사리 추출물을 처리하지 않은 군을 대조군으로 비교하여 케라틴 단백질의 결합 효과를 %로 표시하였다.

표 18에서 보듯이, 가지고비고사리 추출물의 함량이 증가함에 따라 모발로부터 용출되는 케라틴 단백질 함량이 감소하는 것을 알 수 있었다.

가지고비고사리 추출물	대조군	0.02%	0.01%	0.005%
모발 용출 케라틴 단백질	100%	30%	55%	74%

실시예 21: 알칼리와 과산화수소 처리에 의한 모발 인장 강도와 신도에 대한 가지고비고사리 추출물의 효과

3g의 모발을 10㎖의 과산화수소(6%)와 암모니아(1.68%)의 1:1 혼합 용액에 넣고 가지고비고사리 추출물을 각각 0.02, 0.01, 0.005중량%의 시험 농도로 첨가하여 상온에서 30분 동안 처리한 후, 물로 씻고 바람에 건조시켜 Autograph 시험기에서 인장 강도(gf)및 신도(%)를 측정하였다. 다음 표 19는 이와 같이 처리한 모발의 인장 강도 및 신도를 나타낸 것이다.

표 19에서 보듯이, 탈색제(상기 과산화수소와 암모니아 혼합 용액)를 30분간 처리한 경우 가지고비고사리 추출물의 첨가량이 증가함에 따라서 모발의 강도 저하가 억제된 것을 볼 수 있다. 이에 따라, 탈색제를 처리한 경우 가지고비고사리 추출물에 의한 모발 보호 효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.

가지고비고사리 추출물	정제수	0.02%	0.01%	0.005%
인장 강도(gf)	113	125	121	117
신도(%)	45	48.5	47	45.5

실시예 22: 모발성장효과 시험

실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물 2%를 함유하는 30% 함수 에탄올(ethanol) 용액을 제조하여 모발성장효과 시험에 사용하였다. 모발성장효과 시험은 마우스(ICR), 생후 47~53일 것을 사용하여 등 부위 털을 제거하고, 등 부위가 깨끗한 것을 골라 물질군마다 10마리를 사용하여 다음날부터 매일 시험물질을 개체당 100㎖씩 도포하였다. 모발성장 정도를 비교하기 위하여, 대조군으로는 30% 알코올 용액을 각 개체에 도포하여 성장 상태를 관찰하였다. 시간 경과에 따른 모발의 길이 및 모발 성장 정도를 모 제거 후 복원 정도에 따라 점수를 0에서 2까지 부가하여 각각 비교하였다. 즉, 단위 기준은 다음과 같다. 0: 전혀 자라지 않음, 1: 약간 자람, 2: 많이 자람.

실험 결과, 가지고비고사리 추출물이 우수한 모발성장 촉진 효과가 있음을 알 수 있다(표 20).

경과일수/시료	5	10	15
가지고비고사리 추출물	0.13	0.71	1.79±0.19
대조군	0.07	0.17	0.89±0.24

실시예 23 및 비교예 1

실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 21에 나타낸 바와 같다. 우선 표 21에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 23, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 23에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 22에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다. 표 22에서 나타난 바와 같이 가지고비고사리 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

원료		실시예 23	비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부 가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	가지고비고사리 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	잔량	잔량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(△R7)	비고
실시예 23	0.25
비교예 1	0.11

실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 23에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 23에서 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터(parameter) 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다. 따라서 표 23에서 나타나듯 가지고비고사리 추출물을 함유한 실시예 23의 피부 주름 개선 효과가 크게 증진되었음을 확인할 수 있었다.

실험제품	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 23	-0.23	-0.17	-0.11	-0.08	-0.06
비교예 1	-0.11	-0.07	-0.06	-0.04	-0.02
R1: 주름 등고선의최고치와 최저치의 차이값 R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균 R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치 R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값 R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

실시예 24 및 비교예 2

실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 2과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 24에 나타낸 바와 같다. 우선 표 24에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 24, 비교예 2)을 제조한다. 실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 24에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 25에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

·미백효능 평가 기준 :

-3: 매우 악화-2: 악화-1: 약간 악화0: 변화 없음

1: 약간 개선 2: 개선 3: 매우 개선

표 25에서 나타낸 바와 같이 가지고비고사리 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

원료		실시예 24	비교예 2
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부 가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	가지고비고사리 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	잔량	잔량

주)단위: 중량%

	피부색의 밝기 변화(ΔL)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 24	비교예 2	실시예 24	비교예 2	실시예 24	비교예 2
평균값	4.59	1.86	3.3	2.2	2.5	1.4

실시예 25 및 비교예 3

실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 아토피성 피부염 개선효과를 비교예 3과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 26에 나타낸 바와 같다. 우선 표 26에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 25, 비교예 3)을 제조한다. 아토피 피부 개선효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 임상실험을 실시하였다. 5-30세의 아토피 환자로서, 2년 이상 아토피성 피부염을 앓고 있는 환자 30명에 대하여 아토피성 피부염 개선효과를 조사하였다. 동일인에게 왼쪽 손에는 실시예 25의 크림을, 오른쪽 손에는 비교예 3의 크림을 매일 저녁 세정 후, 피부에 1일 1회 60일간 도포하고 아토피성 피부염 상태 개선 정도를 측정하였다. 측정은 설문조사에 의한 관능평가로 실시하였다. 그 결과는 하기 표 27에 나타내었다.

표 27에 나타난 바와 같이 가지고비고사리 추출물을 첨가하여 제조한 실시예 25의 크림이 상기 추출물이 첨가되지 않은 비교제형예의 화장료보다 우수한 아토피성 피부개선 효과가 있다는 것을 알 수 있다.

원료		실시예 25	비교예 3
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부 가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	가지고비고사리 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	잔량	잔량

주)단위: 중량%

	매우 좋다	좋다	그저 그렇다
실시예 25	70% (21명)	30% (9명)	0%
비교예 3	10% (3명)	20% (6명)	70% (21명)

실시예 26: SLS 에 의한 피부자극 완화 효과

실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물을 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 실험으로 평가하였다.

일반적 화장품 처방(크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(sodium lauryl sulfate) 1%와 실시예 23에서 제조된 제품을 혼용하여 24시간, 48시간, 72시간 동안 첩포하여 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

20-50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박 부위에 FINN CHAMBER(FINLAND)를 이용하여 각각의 제품을 0.3㎎씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

시험 결과 SLS를 단독으로 첩포한 부분은 24시간 후부터 피부에 붉게 자극이 나타났으나, 가지고비고사리 추출물을 함유하는 제품을 첩포하고 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발작을 일으키지 않았다.

이 평가의 결과는 가지고비고사리 추출물이 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있는 유의한 효과가 있음을 나타내었다.

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 27내지 29에서 제조하였다. 이들 가지고비고사리 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백효과, 보습효과, 피부자극 완화효과, 여드름 방지효과, 아토피 개선효과 및 항염효과, 모발손상 방지효과, 탈모방지 및 육모 효과등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 27: 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 28: 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 29: 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 가지고비고사리 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

Claims (7)

1. 가지고비고사리 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 노화 방지 효과를 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 미백효과를 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 자극완화 기능을 지니는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 아토피 피부 개선 효과를 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 여드름 개선, 모발손상 방지, 탈모 방지 및 육모 효과를 특징으로 하는 화장료 조성물.