KR20190091482A - Glp-1/글루카곤 이중 작용제, 링커 및 하이알루론산을 포함하는 콘쥬게이트 - Google Patents

Glp-1/글루카곤 이중 작용제, 링커 및 하이알루론산을 포함하는 콘쥬게이트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제, 링커 및 - L1 -L2 - L - Y - R20 그룹을 갖는 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이고, 여기서, Y는 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제 모이어티를 나타내며; -L은 하기 화학식 Ia에 의한 링커 모이어티이다:
[화학식 Ia]
Figure pct00087

상기 화학식 Ia에서,
점선은 아미드 결합을 형성함에 의해 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제 모이어티의 아미노 그룹들 중 하나에 부착되는 것을 나타낸다.
본 발명은 추가로 상기 콘쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물 뿐만 아니라 GLP-1/글루카곤 수용체 작용제에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위한 의약으로서의 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

GLP-1/글루카곤 이중 작용제, 링커 및 하이알루론산을 포함하는 콘쥬게이트
본 발명은 GLP-1/글루카곤 이중 작용제, 링커 및 하이알루론산을 포함하는 콘쥬게이트, 상기 콘쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물 뿐만 아니라, GLP-1/글루카곤 이중 작용제에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하기 위한 의약으로서의 이들의 용도, 예를 들어, 당뇨병 및 비만을 포함하는 대사 증후군의 장애의 치료에서의 이들의 용도 뿐만 아니라, 과도한 음식 섭취의 감소에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.
GLP-1 작용제
엑센딘-4는 독이 있는 미국독도마뱀(Gila monster)(헬로더마 서스펙툼(Heloderma suspectum))의 타액 분비물로부터 단리된 39개 아미노산 펩티드이다. 이는 글루카곤-유사 펩티드 패밀리의 몇몇 구성원과 약간의 서열 유사성을 가지며, 이때 53%라는 최고 상동성은 글루카곤-유사 펩티드-1 [7-36]-아미드(GLP-1)에 대한 것이다. 엑센딘-4는 GLP-1 수용체 상에서 작용제로 작용하며, 단리된 래트 섬세포(islet)에서 GLP-1-유사 인슐린 분비촉진 작용을 갖는다. 엑센딘-4는 높은 효력의 작용제이고, 절두된 GLP-1 작용제-(9-39)-아미드는 인슐린 분비 베타-세포의 글루카곤-유사 펩티드 1-(7-36)-아미드 수용체에서 길항제이다. 엑센딘-4("엑세나티드(exenatide)")는 메트포르민 및/또는 술포닐우레아를 복용하는 2형 당뇨병에 걸린 환자에서 혈당 조절을 개선하기 위해 미국 및 유럽에서 최근에 승인되었으나, 적당한 혈당 조절을 달성하지는 못했다.
엑센딘-4의 아미노산 서열은 하기 서열 번호 1로 표시된다:
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS-NH2
GLP-1(7-36)-아미드의 아미노산 서열은 하기 서열 번호 2로 표시된다:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2
글루카곤은 순환 포도당이 낮을 때, 혈류 내로 방출되는 29개 아미노산 펩티드이다. 글루카곤의 아미노산 서열은 하기 서열 번호 3으로 표시된다:
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH
리라글루티드(Liraglutide)는 다른 변형 중에서 지방산이 위치 20의 라이신에 연결되어 연장된 작용 지속 기간을 초래하는 시판되는 화학적 변형 GLP-1 유사체이다(문헌[Drucker DJ et al., Nature Drug Disc. Rev. 9, 267-268, 2010]; 문헌[Buse, J.B. et al., Lancet, 374:39-47, 2009]).
리라글루티드의 아미노산 서열은 하기 서열 번호 4로 표시된다:
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK((S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴-)EFIAWLVRGRG-OH
저혈당 동안, 혈당 수준이 정상 아래로 떨어지는 경우, 글루카곤은 간에 신호를 보내 글리코겐을 분해하고, 글루코스를 방출시켜, 혈당 수준을 증가시켜 정상 수준에 도달되게 한다. 저혈당은 당뇨병으로 인해 고혈당(상승된 혈당 수준)을 갖는 인슐린 치료 환자의 흔한 부작용이다. 따라서, 글루코스 조절에서의 글루카곤의 가장 주된 역할은 인슐린 작용을 중화하고 혈당 수준을 유지하는 것이다.
GLP-1 수용체 작용제, 예컨대 GLP-1, 리라글루티드 및 엑센딘-4는 공복 및 식후 글루코스(FPG 및 PPG)를 감소시킴으로써 T2DM 환자에서 혈당 제어를 개선시키는 다음 3가지의 주요 약리 활성을 갖는다: (i) 증가된 글루코스-의존성 인슐린 분비(개선된 제1상 및 제2상), (ii) 고혈당 상태 하에서의 글루카곤 억제 활성, (iii) 식사-유래 글루코스의 흡수를 지연시키는 위 배출 속도의 지연.
GLP-1/글루카곤(Glc) 작용제
문헌[Pocai et al, Obesity.2012;20:1566-1571; Diabetes 2009, 58, 2258]) 및 문헌[Day et al., Nat Chem Biol 2009;5:749]에는 예를 들어, 하나의 분자에서의 GLP-1의 작용과 글루카곤의 작용의 조합에 의한 GLP-1 수용체와 글루카곤 수용체의 이중 활성화가 항당뇨 작용과 확연한 체중 저하 효과가 있는 치료 원리로 이어진다는 것이 기술되어 있다.
글루카곤 및 GLP-1 수용체 둘 다에 결합하여 이들을 활성화시키고(문헌[Hjort et al. Journal of Biological Chemistry, 269, 30121-30124,1994]; 문헌[Day JW et al, Nature Chem Biol, 5: 749-757, 2009]), 체중 증가를 억제하고, 음식 섭취를 감소시키는 펩티드가 국제 공개 제2008/071972호, 국제 공개 제2008/101017호, 국제 공개 제2009/155258호, 국제 공개 제2010/096052호, 국제 공개 제2010/096142호, 국제 공개 제2011/075393호, 국제 공개 제2008/152403호, 국제 공개 제2010/070251호, 국제 공개 제2010/070252호, 국제 공개 제2010/070253호, 국제 공개 제2010/070255호, 국제 공개 제2011/160630호, 국제 공개 제2011/006497호, 국제 공개 제2011/152181호, 국제 공개 제2011/152182호, 국제 공개 제2011/117415호, 국제 공개 제2011/117416호, 및 국제 공개 제2006/134340호에 기술되어 있다.
블룸(Bloom) 등(국제 공개 제2006/134340호)은 글루카곤 및 GLP-1 수용체 둘 다에 결합하고 이들을 활성화시키는 펩티드가 글루카곤 및 엑센딘-4로부터의 하이브리드 분자(여기서, N-말단 부분(예를 들어, 잔기 1 내지 14 또는 1 내지 24)은 글루카곤으로부터 유래되고, C-말단 부분(예를 들어, 잔기 15 내지 39 또는 25 내지 39)은 엑센딘-4로부터 유래됨)로서 구축될 수 있음을 개시하고 있다.
문헌[Otzen et al., Biochemistry, 45, 14503-14512, 2006]에는 N-말단 및 C-말단 소수성 패치가 기본 잔기의 소수성 및/또는 높은 β-시트 성향으로 인해 글루카곤의 피브릴화에 연루된다는 것이 개시되어 있다.
국제 공개 제2014/056872호에는 엑센딘-4로부터 유래되는, GLP-1 수용체 및 글루카곤 둘 다에 결합하고 이들을 활성화시키는 펩티드가 개시되어 있으며, 여기서, 적어도 위치 14의 아미노산은 상기 펩티드가 본 발명에서 활성 성분으로 적절해지게 하는 연장된 반감기를 위한 측쇄를 갖는다.
장시간 작용성 GLP-1/글루카곤 작용제
이상적으로, 펩티드는 인체에 적용한 후 적어도 1주일 동안 인간에서 지속된 혈장중 수준을 제공하여, 매주 1회 또는 그보다 더 긴 주사 빈도를 발생시키는 방식으로 제형화된다.
장시간 작용성 GLP-1 작용제를 이용한 현재의 요법제로는 23 게이지 니들을 이용하여 매주 1회 주사하는 폴리(글리콜-코 락트산)을 기반으로 한 데포(depot) 현탁액 형태의 엑센딘-4인 바이두레온(Bydureon)®이 있다.
국제 공개 제2012/173422호에는 매주 투여를 위한, 면역글로불린의 Fc 영역에 콘쥬게이션된 GLP-1/글루카곤 작용제가 기술되어 있으며, 여기서, 상기 펩티드는 옥신토모듈린(oxyntomodulin)으로부터 유도된다.
담체 연결 프로드러그
생체 내에서의 약물의 물리화학적 또는 약동학적 특성, 예컨대 약물의 반감기를 향상시키기 위해, 상기 약물은 담체와 콘쥬게이션될 수 있다. 약물이 담체 및/또는 링커에 일시적으로 결합되는 경우, 상기 시스템은 일반적으로 담체-연결 프로드러그로 지정된다. IUPAC에 의해 제공된 정의에 따르면, 담체-연결 프로드러그는 제공된 활성 물질과 일시적 담체 그룹(개선된 물리화학적 또는 약동학적 특성을 발생시키고, 일반적으로 가수분해 절단에 의해 생체 내에서 용이하게 제거될 수 있음)의 일시적 결합을 함유하는 프로드러그이다.
상기 담체-연결 프로드러그에 사용되는 링커는 일시적일 수 있으며, 이는 상기 링커가 생리학적 조건(pH 7.4의 수성 완충액, 37℃) 하에서 비-효소적으로 가수분해에 의해 분해가능(절단가능)하며, 예를 들어, 1시간 내지 3개월의 범위의 반감기를 가짐을 의미한다. 적합한 담체는 중합체이고, 링커에 직접 콘쥬게이션될 수 있거나, 비-절단성 스페이서를 통해 콘쥬게이션될 수 있다.
흔적을 남기지 않는(traceless) 프로드러그 링커를 통한 일시적 중합체 콘쥬게이션은 중합체 부착으로 인한 연장된 체류 시간, 링커 최적화를 통한 제어된 약물 방출 및 중합체 콘쥬게이트로부터의 방출 후의 천연(native) 펩티드의 원래의 약리학적 특성의 회복의 장점을 조합한다.
중합체-링커 펩티드 콘쥬게이트를 이용하면, 천연 비변화 펩티드는 환자에의 적용 후에 서서히 방출되고, 이는 링커의 방출 동역학 및 중합체 담체의 약동학에 의해서만 좌우된다. 이상적으로, 방출 동역학은 체액 내의 프로테아제 또는 에스테라아제와 같은 효소의 존재와 독립적이어서 일관되고 균일한 방출 패턴을 보장할 것이다.
약물의 많은 급성 부작용이 약물 최고 수준과 관련될 수 있는데, 이는 주어진 약물 제형의 용량(dosage)을 제한할 수 있다. 주어진 용량에 있어서의 약물 최고 수준(최대 약물 농도, Cmax)의 감소는 급성 부작용의 위험을 상승시키지 않고서 상기 약물이 더 높은 용량으로 투여되게 할 수 있다. 결국 더 높은 용량의 투여는 궁극적으로 투약 빈도를 감소시켜서 매주 1회 또는 심지어 매달 1회의 투약 간격을 초래할 수 있다.
담체 연결 프로드러그의 투여는 약물 농도가 특정한 시간 기간 동안 상대적으로 평탄하게 남아있게 하는 방식으로 약물 방출이 제어되게 할 수 있다. 약물 방출 그 자체는 의도된 투약 간격을 위하여 최적화될 필요가 있는 링커에 의해 주로 제어될 것이다.
적합한 중합체는 링커의 약물 방출 반감기보다 유의하게 더 긴 제거(clearance) 반감기를 가질 필요가 있으며, 그 이유는 그렇지 않으면 약물이 중합체에 여전히 부착되어 있는 동안 중합체의 일부분이 제거될 것이기 때문이다. 따라서 짧은 담체 반감기는 주어진 용량에 있어서 약물의 손실을 초래하고 더 가파른 약물 농도 곡선을 초래한다.
국제 공개 제2008/148839호, 국제 공개 제2009/095479호 및 국제 공개 제2012/035139호에는 약물 링커 콘쥬게이트를 포함하는 프로드러그가 언급되어 있으며, 여기서 링커는 절단가능한 결합을 통하여 생물학적 활성 모이어티, 예컨대 GLP 1- 작용제 엑센딘-4에 공유적으로 부착된다. 생물학적 활성 모이어티는 환형 이미드 형성에 의한 환화-활성화시에 프로드러그로부터 방출된다. 방출 동역학은 pH 값에 의존적이고, 4.5 내지 5의 pH 값에서의 프로드러그의 보관에 있어서 최소이고 대략 7.4 내지 7.5의 생리학적 pH에서 그의 의도된 방출 속도에 도달한다. 링커가 L-알라닌을 기반으로 하고, 중합체 담체가 PEG-라이신 기반 하이드로겔인 GLP-1 작용제-프로드러그가 기술되어 있다. 이중 GLP-1/글루카곤 작용제-프로드러그는 기술되어 있지 않다.
하이알루론산(HA)
문헌[Dhal et al., Journal of Biomedical Nanotechnology, vol 9, 2013, 1-13]에는 약물 콘쥬게이트를 위한 적합한 담체로서 하이알루론산이 보고되어 있다. 문헌[Kong et al., Biomaterials 31 (2010), 4121-4128]에는 마우스에서 3일에 걸쳐 글루코스 저하 효과를 나타낸 엑센딘-4-하이알루론산 콘쥬게이트가 보고되어 있다. 사용된 HA는 약 2.4 내지 12.%의 범위의 약물 부하를 갖는 선형 중합체였다.
문헌[Shendi et al., J. Mater. Chem B, 2016, 4, 2803-2818]에는 디비닐술폰으로 개질된 하이알루론산이 개시되어 있으며, 여기서, 비닐술폰 그룹의 일부는 생물활성 분자의 콘쥬게이션에 사용되고, 나머지 비닐술폰 그룹은 하이알루론산 하이드로겔을 형성하기 위한 가교결합제로 사용된다.
유럽 특허 제1790665 A1호에는 약물을 하이알루론산에 콘쥬게이션시키기 위하여 축합제를 사용하여 수용성 개질 하이알루론산을 생성하는 방법이 개시되어 있다. 이러한 콘쥬게이트는 정맥내 투여에 의해 혈액 중 약물의 체류 시간을 향상시킨다. 이러한 콘쥬게이트를 가교결합시켜 겔을 형성하는 것이 또한 개시되어 있다.
본 발명의 콘쥬게이트에 적합한 GLP-1/글루카곤 이중 작용제 펩티드는 산성 pH 값 및/또는 생리학적 pH 값에서, 예를 들어 pH 4.5 및/또는 pH 7.4에서 25℃에서 높은 용해도를 갖는다. 또한, 4.5 내지 5의 pH 값에서의 화학적 안정성이 장시간 작용성 프로드러그 생성물에 있어서 중요한 기준이다. 프로드러그는 바람직하게는 4℃에서 적어도 6개월의 저장 기간을 획득하기 위해 이러한 pH 범위에서 제형화된다.
본 발명에서, 가교결합된 하이알루론산의 하이드로겔이 적용 부위에서의 가용성 HA보다 더 긴 국소적 데포로서의 체류 시간으로 인해 선택되었다. 담체 중합체로서의 하이알루론산(HA)의 사용에 대한 중요한 기준은 최종 완제 의약품(drug product)에서의 달성가능한 약물 부하이고, 이는 중합체 자체의 약물 부하 및 최종 용액/현탁액의 농도에 의해 결정된다. 피하 약물 데포에 대한 주사 부피가 실제로 1 mL 이하, 바람직하게는 0.6 mL 이하로 제한된다는 사실이 제공된다.
HA의 중합체 용액/현탁액이 더욱 농축될수록, 제형은 더욱 점성이 되고, 이는 콘쥬게이트 제형의 주사가능성에 부정적 영향을 미친다. 점성 용액은 주사기를 가압하는 플런저에 대한 힘을 제한하기 위해 더 큰 직경의 주사 바늘을 필요로 한다. 또한, 주사 시간이 더 길다.
본 발명의 목적은 투여 후 적어도 6일의 기간에 걸쳐 활성 형태의 GLP-1/글루카곤 작용제를 방출하고, 우수한 환자 순응을 위해 26 게이지 니들 또는 심지어 더 작은 내경의 니들을 통해 주사될 수 있는, 피하 데포로서 투여하기 위한 콘쥬게이트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은
단량체형 이당류 단위의 0.001 내지 20 mol%는 가교결합제에 의해 가교결합되고;
단량체형 이당류 단위의 0.2 내지 20 mol%는 -L1-L2 -L-Y-R20 그룹을 갖는, 가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
여기서,
L1은, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O-, NH(R5aa) 및 C(O)N(R5aa)로부터 선택되는 그룹으로 대체되고 OH 및 C(O)N(R5aaR5aaa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 임의로 치환되는 C1-20 알킬 쇄이고, 여기서 R5aa 및 R5aaa는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L1은 상기 하이알루론산의 베타-1,3-D-글루쿠론산의 카복시 그룹과 아미드 결합을 형성하는 말단 아미노 그룹을 통하여 상기 하이드로겔에 부착되고;
L2는 단일 화학 결합이거나, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O- 및 C(O)N(R3aa)로부터 선택되는 그룹으로 대체되고, OH 및 C(O)N(R3aaR3aaa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 임의로 치환되는 C1-20 알킬 쇄이고, 여기서 R3aa 및 R3aaa는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L2는
Figure pct00001
Figure pct00002
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, L2는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착되고;
L은 하기 화학식 Ia의 링커이고:
[화학식 Ia]
Figure pct00003
상기 화학식 Ia에서,
점선은 아미드 결합을 형성함에 의한 Y의 N-말단에의 부착을 나타내고;
X는 C(R4R4a) 또는 N(R4)이고;
R1, R1a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R2, R2a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R4, R4a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
여기서, R2, R2a, R4 또는 R4a 중 하나는 L2에 부착된다;
Y는 하기 화학식 Ib를 갖는 펩티드 모이어티이거나:
[화학식 Ib]
His- D-Ser -Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Glu-Ser-Lys-Ala-Ala-Gln-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
상기 화학식 Ib에서,
X14는 Lys을 나타내고, -NH2 측쇄 그룹은 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴로 관능화된다;
Y는 하기 화학식 Ic를 갖는 펩티드 모이어티이고:
[화학식 Ic]
His- dSer-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Asp-Glu-Gln-Leu-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
상기 화학식 Ic에서,
X14는 Lys을 나타내고, -NH2 측쇄 그룹은 (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴로 관능화된다;
R20은 OH 또는 NH2이다.
본 발명은 투여 후 적어도 6일의 기간에 걸쳐 활성 형태로 피하 데포로부터의 GLP-1/글루카곤 작용제 방출을 제공하는 콘쥬게이트에 관한 것이다.
이는 환자가 GLP-1/글루카곤 작용제의 혈장중 수준 및 결과적으로 혈당의 최적 조절을 유지할 수 있도록 하면서 주사 빈도를 감소시키는 데 도움이 된다.
부가적으로, 본 발명에 따른 콘쥬게이트는 작용제의 매우 평탄한 약동학적 프로파일을 생성하는 방출 프로파일로 이중 GLP-1/글루카곤 작용제를 방출하여서 Cmax-관련된 부작용의 위험을 더 낮아지게 할 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트의 추가 장점으로는 26 게이지 니들 또는 심지어 더 작은 내경의 니들을 통한 우수한 주사가능성이 있다.
도 1a: 고분자량(250만 Da) 하이알루로난(HA)의 생체 내에서의 분해 프로파일 및 이의 분해의 동역학적 특성.
임플란트된 HA를 MRI 기술로 모니터링하였다. 표준(상부) 및 CEST(하부) 영상 기술 둘 다에 의해 획득된 대표적인 MRI 영상.
도 1b: 디비닐 술폰 가교결합 하이알루로난의 생체 내에서의 분해 프로파일 및 이의 분해의 동역학적 특성. 분해의 동역학적 특성은 1 ppm에서의 피크 크기의 도시에 의해 결정되었다.
도 1c: 고분자량(250만 Da) 히알루로난(HA)의 생체 내에서의 분해 프로파일 및 이의 분해의 동역학적 특성.
분해의 동역학적 특성은 1 ppm에서의 피크 크기의 도시에 의해 결정되었다.
도 2: 서열 번호 5의 펩티드의 HA-하이드로겔-Aib-링커 콘쥬게이트의 고상 1H-NMR 스펙트럼.
도 3. 서열 번호 5를 갖는 펩티드의 HA-하이드로겔-Aib-링커 콘쥬게이트로부터 시험관 내에서의 방출 동역학.
도 4: 비가교결합 HA를 포함하는 단회 용량(제1일)의 서열 번호 5의 펩티드로 처리된 수컷 db/db 마우스에서의 식후 혈당 프로파일.
도 5a: 서열 번호 5의 펩티드를 포함하는 4회 용량(제1일, 제8일, 제15일, 제22일)의 HA-하이드로겔-Aib-링커 콘쥬게이트로 처리된 암컷 식이-유도 비만 마우스의 체질량 변화.
도 5b: 서열 번호 5의 펩티드를 포함하는 4회 용량(제1일, 제8일, 제15일, 제22일)의 HA-하이드로겔-Aib-링커 콘쥬게이트로 처리된 암컷 식이-유도 비만 마우스의 사료 소비량.
도 6: 4.5 mg/kg의 HA-Aib-링커-콘쥬게이트를 암컷 C57BL/6 마우스에게 단회 피하 투여한 후 서열 번호 5의 펩티드의 혈장중 농도.
도 7: 16.05%)으로 0.623 mg/kg을 암컷 괴팅겐(Gottingen) 미니피그에 단회 피하 투여한 후 서열 번호 5의 펩티드의 혈장중 농도(HA-Aib-링커-콘쥬게이트로서 현탁액.
도 8. 수컷 db/db 마우스에서의 식후 혈당 프로파일: 50 nmol/kg의 서열 번호 5의 가교결합 HA 콘쥬게이트를 이용한 단회 피하 처리 및 1.7 nmol/kg의 서열 번호 5의 순수 펩티드를 이용한 일일 1회 피하 처리
링커-L2-에 결합된 GLP-1/글루카곤 작용제는 "GLP-1/글루카곤 작용제 모이어티"로 지칭된다.
"보호 그룹"은 후속 화학 반응에서 화학선택성을 얻기 위해 합성 동안 분자의 화학 관능 그룹을 일시적으로 보호하는 모이어티를 지칭한다. 알코올에 대한 보호 그룹은, 예를 들어, 벤질 및 트리틸이고, 아민에 대한 보호 그룹은, 예를 들어, 3급-부틸옥시카보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐 및 벤질이고, 티올에 있어서 보호 그룹의 예로는 2,4,6-트리메톡시벤질, 페닐티오메틸, 아세트아미도메틸, p-메톡시벤질옥시카보닐, 3급-부틸티오, 트리페닐메틸, 3-니트로-2-피리딜티오, 4-메틸트리틸이 있다.
"보호된 관능 그룹"은 보호 그룹에 의해 보호된 화학적 관능 그룹을 의미한다.
"아실화제"는 산 클로라이드, N-하이드록시 숙신이미드, 펜타플루오르페놀 및 파라-니트로페놀과 같은 이탈 그룹에 임의로 연결되는, 아실화 반응에서 아실 그룹을 제공하는 구조 R-(C=O)-의 모이어티를 의미한다.
"알킬"은 직쇄 또는 분지형 탄소 쇄를 의미한다. 알킬 탄소의 각각의 수소는 치환체로 대체될 수 있다.
"알킬렌"은 분자의 두 모이어티가 알킬렌 그룹에 연결되는 직쇄 또는 분지형 탄소 쇄를 의미한다. 알킬렌 탄소의 각각의 수소는 치환체로 대체될 수 있다.
"아릴"은 복소환식 고리를 포함하는 단환식 또는 다환식 또는 융합 방향족 고리로부터 유도되는 임의의 치환체, 예를 들어, 페닐, 티오펜, 인돌릴, 나프틸, 피리딜(임의로 추가로 치환될 수 있음)을 지칭한다.
"아실"은 R이 알킬 또는 아릴인 구조 R-(C=O)-의 화학 관능 그룹을 의미한다.
"C1-4 알킬"은 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 알킬 쇄, 예를 들어, 분자의 말단에 존재할 경우, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 2급-부틸 3급-부틸, 또는 예를 들어 -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2- (분자의 두 모이어티가 알킬 그룹에 의해 연결될 때)를 의미한다. C1 -4 알킬 탄소의 각각의 수소는 치환체로 대체될 수 있다.
"C1-6 알킬렌"은 분자의 두 모이어티가 알킬렌 그룹에 연결되는, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 쇄, 예를 들어 -CH2-, -CH2-CH2-, -CH(CH3)-, -CH2-CH2-CH2-, -CH(C2H5)-, -C(CH3)2-를 의미한다. C1-6 알킬 탄소의 각각의 수소는 치환체로 대체될 수 있다.
따라서, "C1-18 알킬"은 1 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 알킬 쇄를 의미하고, "C8-18 알킬"은 8 내지 18개의 탄소 원자를 갖는 알킬 쇄를 의미한다. 따라서, "C1-50 알킬"은 1 내지 50개의 탄소 원자를 갖는 알킬 쇄를 의미한다.
"할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도를 의미한다. 할로겐이 플루오로 또는 클로로인 것이 일반적으로 바람직하다.
"하이알루론산"은 베타-1,3-D-글루쿠론산 및 베타-1,4-N-아세틸-D-글루코사민 및 이들 각각의 나트륨 염으로 구성된 이당류의 중합체를 의미한다. 이들 중합체는 선형이다.
Figure pct00004
"이당류 단위"는 베타-1,3-D-글루쿠론산 및 베타-1,4-N-아세틸-D-글루코사민 및 이들 각각의 나트륨 염으로 구성된 이당류를 의미하며, 이는 HA에 대한 단량체 빌딩 블록이다.
"가교결합된 하이알루론산"은 HA의 상이한 쇄들이 가교결합제에 의해 공유적으로 연결되어 3차원 중합체 네트워크를 형성하는 "하이알루론산의 중합체"를 의미한다. 가교결합도는 중합체 네트워크에서 이당류 단위 대 가교결합제 단위의 몰비를 지칭한다.
"가교결합제"는 선형 또는 분지형 분자 또는 화학 그룹일 수 있으며, 바람직하게는 각각의 원위 말단에 적어도 화학 관능 그룹을 갖는 선형 분자이다.
"관능화된 하이알루론산"은 HA가 원위 말단에 화학적 작용성 화학 그룹을 갖는 L1 그룹으로 화학적으로 개질된 하이알루론산의 중합체를 의미한다. 관능화의 정도는 중합체에서 이당류 단위 대 L1 단위의 몰비를 지칭한다.
용어 "화학 관능 그룹"은 카복실산 및 활성화된 유도체, 아미노, 말레이미드, 티올 및 유도체, 술폰산 및 유도체, 카보네이트 및 유도체, 카바메이트 및 유도체, 하이드록실, 알데하이드, 케톤, 하이드라진, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 인산 및 유도체, 포스폰산 및 유도체, 할로아세틸, 알킬 할라이드, 아크릴로일 및 다른 알파-베타 불포화 마이클 수용체(michael acceptor), 아릴 플루오라이드와 같은 아릴화제, 하이드록실아민, 피리딜 디술피드와 같은 디술피드, 비닐 술폰, 비닐 케톤, 디아조알칸, 디아조아세틸 화합물, 옥시란, 및 아지리딘을 지칭하지만, 이에 한정되지 않는다.
화학 관능 그룹이 또다른 화학 관능 그룹에 커플링되는 경우, 생성된 화학 구조는 "결합"으로 지칭된다. 예를 들어, 아민 그룹과 카복실 그룹의 반응은 아미드 결합을 발생시킨다.
"반응성 관능 그룹"은 과분지된 모이어티에 연결되는 주쇄 모이어티의 화학 관능 그룹이다.
"관능 그룹"은 "반응성 관능 그룹", "분해가능한 상호연결된 관능 그룹" 또는 "콘쥬게이트 관능 그룹"에 대해 사용되는 집합적 용어이다.
용어 "차단 그룹" 또는 "캡핑 그룹"은 동의어로 사용되고, 반응성 관능 그룹에 비가역적으로 연결되어 이들을, 예를 들어, 화학 관능 그룹과 반응할 수 없도록 만드는 모이어티를 지칭한다.
용어 "보호하는 그룹" 또는 "보호 그룹"은 반응성 관능 그룹에 가역적으로 연결되어 이들을, 예를 들어, 특정 조건 하에서 다른 화학 관능 그룹과 반응할 수 없도록 만드는 모이어티를 지칭한다.
용어 "활성화 그룹"은 당업자에게 공지된 형태들의 상응하는 화학 관능 그룹을 적합하게 활성화시키기 위한 화학 관능 그룹을 지칭한다. 예를 들어, 활성화된 형태의 카복실 그룹은 활성 에스테르, 예컨대 숙신이미딜 에스테르, 벤조트리아질 에스테르, 니트로페닐 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, 아자벤조트리아질 에스테르, 아실 할로겐화물, 혼합형 또는 대칭형 무수물, 아실 이미다졸을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "비-효소적으로 절단가능한 링커"는 효소 활성 없이 생리학적 조건 하에서 가수분해적으로 분해가능한 링커를 지칭한다.
용어 "스페이서", "스페이서 그룹", "스페이서 분자" 및 "스페이서 모이어티"는 상호교환가능하게 사용되고, 본 발명의 하이드로겔 담체에 존재하는 모이어티를 기술하기 위해 사용되는 경우, 2개의 모이어티를 연결하기에 적합한 임의의 모이어티, 예컨대 -NH-, -N(C1-4 알킬)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)NH-, -C(O)N(C1-4 알킬)-, -O-C(O)-, -S(O)-, -S(O)2-로부터 선택되는 하나 이상의 그룹이 단편에서 임의로 개재된 C1 -50 알킬을 지칭한다.
용어 "말단의", "말단" 또는 "원위 말단"은 2개의 모이어티 사이의 결합에 인접하여 위치하거나 그 내부에 위치하거나, 올리고머 또는 중합체 쇄의 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 분자 또는 모이어티 내의 관능 그룹 또는 결합의 위치를 지칭하며, 이에 의해 상기 관능 그룹은 화학 관능 그룹일 수 있고, 결합은 분해가능하거나 영구적인 결합일 수 있다.
어구 "결합 형태" 또는 "모이어티"는 더 큰 분자의 일부인 하위-구조를 지칭한다. 어구 "결합 형태"는 본 기술 분야에 잘 알려진 시약, 시작 물질 또는 가상 시작 물질을 말하거나 나열함으로써 모이어티에 대한 언급을 단순화하는 데 사용되고, 이에 의해 "결합 형태"는, 예를 들어, 시약 또는 시작 물질에 존재하는 하나 이상의 활성화 그룹 또는 보호 그룹 또는 하나 이상의 수소 라디칼(-H)이 모이어티에 존재하지 않음을 의미한다.
중합체성 모이어티를 포함하는 모든 시약 및 모이어티는 분자량, 쇄 길이 또는 중합도, 또는 관능 그룹의 수와 관련하여 변동성을 나타내는 것으로 공지된 거대분자 실체(entity)를 지칭하는 것으로 이해된다. 따라서, 가교결합 시약, 및 가교결합된 모이어티에 대해 제시된 구조는 단지 대표적 예이다.
시약 또는 모이어티는 선형 또는 분지형일 수 있다. 시약 또는 모이어티가 2개의 말단 그룹을 갖는 경우, 이는 선형 시약 또는 모이어티로 지칭된다. 시약 또는 모이어티가 2개 초과의 말단 그룹을 갖는 경우, 이는 분지형 또는 다작용성 시약 또는 모이어티인 것으로 간주된다.
본 발명의 콘쥬게이트에 사용되는 링커는 일시적이고, 이는 링커가 생리학적 조건(pH 7.4의 수성 완충액, 37℃) 하에서 비-효소적으로 가수분해에 의해 분해가능함(절단가능함)(이때 반감기는 예를 들어, 1시간 내지 3개월의 범위임)을 의미한다.
용어 "GLP-1/글루카곤 작용제 하이드로겔 콘쥬게이트"는 GLP-1/글루카곤 작용제의 담체-연결된 콘쥬게이트를 지칭하며, 여기서 담체는 하이드로겔이다. 용어 "하이드로겔 콘쥬게이트" 및 "하이드로겔-연결 콘쥬게이트"는 하이드로겔에 일시적으로 연결된 생물학적 활성제의 콘쥬게이트를 지칭하며, 동의어로 사용된다.
"하이드로겔"은 많은 양의 물을 흡수할 수 있는 3차원의 친수성 또는 친양쪽성(amphiphilic) 중합체 네트워크로 정의될 수 있다. 상기 네트워크는 동종중합체 또는 공중합체로 구성되고, 화학적 또는 물리적(이온성, 소수성 상호작용, 얽힘(entanglement)) 공유 가교결합의 존재로 인해 불용성이다. 가교결합은 네트워크 구조 및 물리적 온전성을 제공한다. 하이드로겔은 물과의 열역학적 양립성을 나타내는데, 이는 하이드로겔이 수성 매질에서 팽창되게 한다. 네트워크의 쇄는 기공이 존재하고 이들 기공의 상당 부분이 1 ㎚ 내지 1000 ㎚의 치수인 방식으로 연결된다.
약물의 "자유 형태"는 중합체 콘쥬게이트로부터 방출된 후와 같은 변형되지 않은 약리학적 활성 형태의 약물, 구체적으로 GLP-1/글루카곤 작용제를 지칭한다.
용어 "약물", "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 모이어티", "생물학적 활성제", "활성제"는 동의어로 사용되고, 결합 형태 또는 자유 형태의 GLP-1/글루카곤 작용제를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, GLP-1/글루카곤 작용제의 "치료학적 유효량"은 주어진 질환 및 이의 합병증의 임상 소견을 치유하거나, 완화하거나, 부분적으로 저지하기에 충분한 양을 의미한다. 이를 달성하기에 적당한 양은 "치료학적 유효량"으로 정의된다. 각각의 목적을 위한 유효량은 질환 또는 손상의 중증도 뿐만 아니라 대상체의 체중 및 전반적인 상태에 좌우될 것이다. 적절한 용량을 결정하는 것은 값들의 매트릭스를 구축하고, 상기 매트릭스에서의 상이한 지점들을 테스트함으로써 일상적인 실험을 이용하여 달성될 수 있으며, 이는 모두 숙련된 의사의 통상적인 기술 내에 있음이 이해될 것이다.
"안정한" 및 "안정성"은 지시된 보관 시간 내에서 하이드로겔 콘쥬게이트가 여전히 콘쥬게이션된 채로 있고, 상당한 정도로 가수분해되는 것이 아니며, GLP-1/글루카곤 작용제와 관련하여 허용가능한 불순물 프로파일을 나타내는 것을 의미한다. 안정적인 것으로 간주되기 위해, 조성물은 자유 형태 약물을 5% 미만으로 함유한다.
용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 바람직하게는 인간에 사용하기 위해 EMEA(유럽) 및/또는 FDA(미국) 및/또는 임의의 다른 국가의 규제 기관과 같은 규제 기관에 의해 승인된 것을 의미한다.
"약제학적 조성물" 또는 "조성물"은 1종 이상의 활성 성분, 및 1종 이상의 불활성 성분 뿐만 아니라 임의의 2종 이상의 성분의 조합, 복합체화 또는 응집, 또는 1종 이상의 성분의 해리, 또는 1종 이상의 성분의 다른 유형의 반응 또는 상호작용으로부터 직접적 또는 간접적으로 생기는 임의의 생성물을 의미한다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 부형제(약제학적으로 허용되는 담체)를 혼합하여 제조된 임의의 조성물을 포함한다.
"건조 조성물"은 GLP-1/글루카곤 작용제 하이드로겔 콘쥬게이트 조성물이 용기 내에 건조 형태로 제공되는 것을 의미한다. 건조에 적합한 방법으로는 예를 들어 분무-건조 및 동결건조(냉동-건조)가 있다. GLP-1/글루카곤 작용제 하이드로겔 콘쥬게이트의 상기 건조 조성물은 최대 10%, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 2% 미만(칼 피셔(Karl Fischer)법에 따라 결정됨)의 잔존 수분 함량을 갖는다. 바람직한 건조 방법은 동결건조이다. "동결건조된 조성물"은 GLP-1/글루카곤 작용제 하이드로겔 콘쥬게이트 조성물을 먼저 냉동시키고, 이후에 감압에 의해 수분을 감소시켰음을 의미한다. 이러한 용어는 조성물을 최종 용기에 충전하기 전에 제조 공정에서 나타나는 추가 건조 단계를 배제하지 않는다.
"동결건조"(냉동-건조)는 조성물을 냉동시키고, 그 후 주위 압력을 감소시키고, 임의로 열을 가하여 조성물 내의 냉동된 물을 고체상에서 가스로 직접 승화시키는 것을 특징으로 하는 탈수 과정이다. 전형적으로, 승화된 물은 탈승화에 의해 수집된다.
"재구성"은 건조 조성물에 액체를 첨가하여 이를 액체 또는 현탁 조성물의 형태로 만드는 것을 의미한다. 용어 "재구성"은 물의 첨가에 한정되지 않고, 예를 들어, 완충제 또는 다른 수성 용액을 포함하는 임의의 액체의 첨가를 지칭하는 것으로 이해된다.
"재구성 용액"은 필요로 하는 환자에게 투여하기 전에 GLP-1/글루카곤 작용제 하이드로겔 콘쥬게이트의 건조 조성물을 재구성하는 데 사용되는 액체를 지칭한다.
"용기"는 GLP-1/글루카곤 작용제 하이드로겔 콘쥬게이트 조성물이 포함되고, 재구성할 때까지 보관될 수 있는 임의의 용기를 의미한다.
"완충액" 또는 "완충제"는 pH를 원하는 범위 내에서 유지시키는 화학적 화합물을 지칭한다. 생리학적으로 허용되는 완충액은, 예를 들어, 나트륨 포스페이트, 숙시네이트, 히스티딘, 바이카보네이트, 시트레이트 및 아세테이트, 피루베이트이다. Mg(OH)2 또는 ZnCO3와 같은 제산제가 또한 사용될 수 있다. 완충 용량은 pH 안정성에 가장 민감한 조건에 맞추기 위해 조정될 수 있다.
"부형제"는 치료제와 함께 투여되는 화합물, 예를 들어, 완충제, 등장성 조절제, 보존제, 안정화제, 흡착방지제, 산화방지제, 또는 다른 보조제를 지칭한다. 그러나, 일부 경우에서, 1종의 부형제는 이중 또는 삼중 기능을 가질 수 있다.
"동결건조보호제"는 관심 단백질과 조합되는 경우 일반적으로 건조시, 특히 동결건조 및 이후의 보관 동안 단백질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 유의하게 방지하거나 감소시키는 분자이다. 예시적 동결건조보호제는 당, 예를 들어, 수크로스 또는 트레할로스; 아미노산, 예를 들어, 아르기닌, 글라이신, 글루타메이트 또는 히스티딘; 메틸아민, 예를 들어, 베타인; 친액성 염, 예를 들어, 황산마그네슘; 폴리올, 예를 들어, 3가 이상의 당 알코올, 예를 들어, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨, 및 만니톨; 에틸렌 글리콜; 프로필렌 글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플루로닉(pluronics); 하이드록시알킬 전분, 예를 들어, 하이드록시에틸 전분(HES), 및 이들의 조합물을 포함한다.
"계면활성제"는 액체의 표면 장력을 낮추는 습윤제를 지칭한다.
"등장성 조절제"는 주사 데포에서 삼투압 차이로 인한 세포 손상으로부터 발생할 수 있는 동통을 최소화하는 화합물을 지칭한다.
용어 "안정화제"는 본 발명의 콘쥬게이트를 안정화하는 데 사용되는 화합물을 지칭한다. 안정화는 단백질을 안정화하는 힘의 강화, 변성된 상태의 탈안정화 또는 단백질에의 부형제의 직접 결합에 의해 달성된다.
"흡착방지제"는 경쟁적으로 조성물의 용기 내부 표면에 흡착하거나 이를 코팅하는 데 사용되는, 주로 이온성 또는 비-이온성인 계면활성제 또는 다른 단백질 또는 가용성 중합체를 지칭한다. 부형제의 선택된 농도 및 유형은 피해야 할 효과에 좌우되나, 전형적으로 계면활성제의 단층은 CMC 값 바로 위의 계면에서 형성된다.
"산화방지제"는 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산, 엑토인, 글루타티온, 메티오닌, 모노티오글리세롤, 모린, 폴리에틸렌이민(PEI), 프로필 갈레이트, 비타민 E, 킬레이트제, 예를 들어, 시트르산, EDTA, 헥사포스페이트, 티오글리콜산을 지칭한다.
"항미생물제"는 미생물, 예를 들어, 박테리아, 진균류, 효모, 원생동물을 사멸시키거나 이들의 성장을 억제하고/억제하거나, 바이러스를 파괴하는 화학 물질을 지칭한다.
"용기 밀봉"은 용기가 기밀되어 외부와 내부 사이에 가스 교환을 허용하지 않고, 내용물을 살균 상태로 유지하는 방식으로 폐쇄되는 것을 의미한다.
용어 "시약" 또는 "전구체"는 본 발명의 콘쥬게이트를 초래하는 조립 과정에 사용되는 중간체 또는 시작 물질을 지칭한다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
-L1-L2-L-은 하기 화학식 IIa의 링커 모이어티이다:
[화학식 IIa]
Figure pct00005
상기 화학식 IIa에서,
점선은 아미드 결합의 형성에 의한 Y에의 부착을 나타내고;
R1, R1a, R2a는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
-L1-L2-는 상기에 기술된 바와 같이 정의된다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
-L1-L2-L-은
R1이 CH3이고;
R1a가 H이고;
R2a가 H이고;
-L1-L2-가 상기에 기술된 바와 같이 정의되는 화학식 IIa의 링커 모이어티이다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
-L1-L2-L-은
R1이 H이고;
R1a가 CH3이고;
R2a가 H이고;
-L1-L2-가 상기에 기술된 바와 같이 정의되는 화학식 IIa의 링커 모이어티이다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
-L1-L2-L-은
R1이 CH3이고;
R1a가 CH3이고;
R2a가 H이고;
-L1-L2-가 상기에 기술된 바와 같이 정의되는 화학식 IIa의 링커 모이어티이다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
-L1-L2-L-은 하기 화학식 IIb의 링커 모이어티이다:
[화학식 IIb]
Figure pct00006
상기 화학식 IIb에서,
점선은 아미드 결합의 형성에 의한 Y에의 부착을 나타내고;
R1은 H 또는 C1-4 알킬, 바람직하게는 H로부터 선택되고;
R1a는 H 또는 C1-4 알킬, 바람직하게는 H로부터 선택되고;
R2, R2a는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
여기서, -L1-L2-는 상기에 기술된 바와 같이 정의된다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
-L1-L2-L-은 하기 화학식 IIb의 링커 모이어티이다:
[화학식 IIb]
Figure pct00007
상기 화학식 IIb에서,
점선은 아미드 결합의 형성에 의한 Y에의 부착을 나타내고;
R1 및 R1a는 H이고;
R2, R2a는 H 및 CH3로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
여기서, -L1-L2-는 상기에 기술된 바와 같이 정의된다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
-L1-L2-L-은
R1 및 R1a가 H이고;
R2가 H이고, R2a가 CH3이고;
여기서, -L1-L2-는 상기에 기술된 바와 같이 정의되는 화학식 IIb의 링커 모이어티 -L이다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
L2는, 임의로 하나 또는 2개의 탄소 원자가 -O- 및 C(O)N(R3aa)로부터 선택되는 그룹으로 독립적으로 대체된 C1-10 알킬 쇄이고, 여기서 R3aa는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L2는
Figure pct00008
으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, L2는 점선으로 표시된 한 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착된다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
L2는, 임의로 하나의 탄소 원자가 -O- 및 C(O)N(R3aa)로부터 선택되는 그룹으로 독립적으로 대체된 C1-6 알킬 쇄이고, 여기서 R3aa는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L2는
Figure pct00009
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, L2는 점선으로 표시된 한 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착된다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
L2는 -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)NH- 또는 -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-이고, 하기 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고:
Figure pct00010
여기서, L2는 점선으로 표시된 황 원자에 부착되고, L1은 점선으로 표시된 질소 원자에 부착된다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
L2는 -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)NH- 또는 -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-이고,
하기 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고:
Figure pct00011
여기서, L2는 점선으로 표시된 황 원자에 부착되고, L1은 점선으로 표시된 질소 원자에 부착된다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서,
L1은 -O- 및 C(O)N(R5aa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 또는 2개의 그룹이 임의로 개재된, 한 원위 말단 상에 아미노 그룹을 갖는 C1 -10 알킬 쇄이고, 여기서 R5aa는 H 및 C1 -4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다.
추가 실시형태는 가교결합제가 디비닐술폰인 콘쥬게이트에 관한 것이다.
추가 실시형태는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔에서 단량체형 이당류 단위의 0.001 내지 15 mol%가 가교결합제에 의해 가교결합된 콘쥬게이트에 관한 것이다.
추가 실시형태는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔에서 단량체형 이당류 단위의 0.1 내지 5 mol%가 가교결합제에 의해 가교결합된 콘쥬게이트에 관한 것이다.
추가 실시형태는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔의 단량체형 이당류 단위의 0.2 내지 10 mol%가 -L1-L2 -L-Y-R20 그룹은 갖는 콘쥬게이트에 관한 것이다.
추가 실시형태는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔의 단량체형 이당류 단위의 0.5 내지 7 mol%가 -L1-L2 -L-Y-R20 그룹을 갖는 콘쥬게이트에 관한 것이다.
추가 실시형태는
가교결합된 히알루론산 하이드로겔의 단량체형 이당류 단위의 0.5 내지 5 mol%가 -L1-L2 -L-Y-R20 그룹을 갖는 콘쥬게이트에 관한 것이다.
추가 실시형태는
가교결합된 히알루론산 하이드로겔의 단량체형 이당류 단위의 1 내지 3.5 mol%가 -L1-L2 -L-Y-R20 그룹을 갖는 콘쥬게이트에 관한 것이다.
추가 실시형태는
단량체형 이당류 단위의 0.001 내지 20 mol%는 가교결합제에 의해 가교결합되고;
단량체형 이당류 단위의 0.2 내지 20 mol%는 -L1-L2 -L-Y-R20 그룹을 갖고;
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔의 단량체형 이당류 단위의 0.2 내지 30 mol%는 -L1-Z-OH 그룹을 갖는,
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이고,
여기서,
L1은, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O-, NH(R5aa) 및 C(O)N(R5aa)로부터 선택되는 그룹으로 독립적으로 대체되고 OH 및 C(O)N(R5aaR5aaa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 임의로 치환되는 C1-20 알킬 쇄이고, 여기서 R5aa 및 R5aaa는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L1은 상기 하이알루론산의 베타-1,3-D-글루쿠론산의 카복시 그룹과 아미드 결합을 형성하는 말단 아미노 그룹을 통하여 상기 하이드로겔에 부착되고;
L2는 단일 화학 결합이거나, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O- 및 C(O)N(R3aa)로부터 선택되는 그룹으로 독립적으로 대체되고, OH 및 C(O)N(R3aaR3aaa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 임의로 치환되는 C1-20 알킬 쇄이고, 여기서 R3aa 및 R3aaa는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L2는
Figure pct00012
Figure pct00013
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, L2는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착되고;
Z는, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O- 및 C(O)N(R6aa)로부터 선택되는 그룹으로 독립적으로 대체된 C1 -16 알킬 쇄이고, 여기서, R6aa는 수소 또는 C1 -4 알킬이거나;
Z는
Figure pct00014
이고;
Z는
Figure pct00015
Figure pct00016
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, Z는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착되고;
L은 하기 화학식 Ia의 링커이고:
[화학식 Ia]
Figure pct00017
상기 화학식 Ia에서,
점선은 아미드 결합을 형성함에 의한 Y의 N-말단에의 부착을 나타내고;
X는 C(R4R4a) 또는 N(R4)이고;
R1, R1a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R2, R2a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
R4, R4a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
여기서, R2, R2a, R4 또는 R4a 중 하나는 L2에 부착된다;
Y는 하기 화학식 Ib를 갖는 펩티드 모이어티이거나:
[화학식 Ib]
His- D-Ser -Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Glu-Ser-Lys-Ala-Ala-Gln-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
상기 화학식 Ib에서,
X14는 Lys을 나타내고, -NH2 측쇄 그룹은 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴로 관능화된다;
Y는 하기 화학식 Ic를 갖는 펩티드 모이어티이고:
[화학식 Ic]
His- dSer-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Asp-Glu-Gln-Leu-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
상기 화학식 Ic에서,
X14는 Lys을 나타내고, -NH2 측쇄 그룹은 (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴로 관능화된다;
R20은 OH 또는 NH2이다.
추가 실시형태는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔의 단량체형 이당류 단위의 0.2 내지 20 mol%는 -L1-Z-OH 그룹을 갖는
상기에 기술된 바와 같은 가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
추가 실시형태는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔의 단량체형 이당류 단위의 0.2 내지 10 mol%는 -L1-Z-OH 그룹을 갖는
상기에 기술된 바와 같은 가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
추가 실시형태는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔은 -L1-Z-OH 그룹을 갖는,
상기에 기술된 바와 같은 가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이고,
여기서, Z는, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O- 및 C(O)N(R6aa)로부터 선택되는 그룹으로 독립적으로 대체된 C1 -16 알킬 쇄이거나;
Z는
Figure pct00018
이고;
Z는
Figure pct00019
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, Z는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착된다.
추가 실시형태는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔은 -L1-Z-OH 그룹을 갖는
상기에 기술된 바와 같은 가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이고,
여기서,
Z는, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O-로부터 선택되는 것으로 독립적으로 대체된 C1 -8 알킬 쇄이거나;
Z는
Figure pct00020
이고;
Z는
Figure pct00021
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, Z2는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착된다.
추가 실시형태는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔은 -L1-Z-OH 그룹을 갖는
상기에 기술된 바와 같은 가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이고,
여기서,
Z는 -CH2-CH2-이거나;
Z는
Figure pct00022
이고;
Z는
Figure pct00023
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, Z2는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착된다.
추가 실시형태는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔은 -L1-Z-OH 그룹을 갖는
상기에 기술된 바와 같은 가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이고,
여기서,
Z는 -CH2-CH2-이고;
Z는
Figure pct00024
로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, Z는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착된다.
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서, -L1-L2 -L-Y 그룹은 하기 화학식 IIIa로 표시되는 구조를 갖는다:
[화학식 IIIa]
Figure pct00025
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서, -L1-L2 -L-Y 그룹은 하기 화학식 IIIb로 표시되는 구조를 갖는다:
[화학식 IIIb]
Figure pct00026
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서, -L1-L2 -L-Y 그룹은 하기 화학식 IIIc로 표시되는 구조를 갖는다:
[화학식 IIIc]
Figure pct00027
콘쥬게이트의 또다른 실시형태에서, -L1-L2 -L-Y 그룹은 하기 화학식 IIId로 표시되는 구조를 갖는다:
[화학식 IIId]
Figure pct00028
하나의 실시형태에서, Y는 서열 번호 5의 서열로부터 선택되는 GLP-1/글루카곤 작용제를 나타낸다.
하나의 실시형태에서, Y는 서열 번호 6의 서열로부터 선택되는 GLP-1/글루카곤 작용제를 나타낸다.
본 발명의 또다른 실시형태는
단량체형 이당류 단위의 0.001 내지 20 mol%는 디비닐술폰에 의해 가교결합되고;
단량체형 이당류 단위의 0.5 내지 5 mol%는 -L1-L2 -L-Y-R20 그룹을 가지며; -L1-L2 -L-Y 그룹은 하기 화학식 IIIb로 표시되는 구조를 갖는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다:
[화학식 IIIb]
Figure pct00029
상기 화학식 IIIb에서,
L1은 NH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-이고;
L1은 상기 하이알루론산의 베타-1,3-D-글루쿠론산의 카복시 그룹과 아미드 결합을 형성하는 말단 아미노 그룹을 통하여 상기 하이드로겔에 부착되고;
Y는 서열 번호 5의 서열을 갖는 펩티드 모이어티이다.
본 발명의 또다른 실시형태는
단량체형 이당류 단위의 0.001 내지 20 mol%는 디비닐술폰에 의해 가교결합되고;
단량체형 이당류 단위의 0.5 내지 5 mol%는 -L1-L2 -L-Y-R20 그룹을 가지며; -L1-L2 -L-Y 그룹은 하기 화학식 IIIb로 표시되는 구조를 갖고;
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔의 단량체형 이당류 단위의 0.2 내지 30 mol%는 -L1-Z-OH 그룹을 갖는
가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이고,
여기서,
[화학식 IIIb]
Figure pct00030
상기 화학식 IIIb에서,
L1은 NH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-이고;
L1은 상기 하이알루론산의 베타-1,3-D-글루쿠론산의 카복시 그룹과 아미드 결합을 형성하는 말단 아미노 그룹을 통하여 상기 하이드로겔에 부착되고;
Z는 -CH2-CH2-이고;
Z는 말단 그룹
Figure pct00031
를 통하여 L1에 부착되고, 여기서, Z는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착되고;
Y는 서열 번호 5의 서열을 갖는 펩티드 모이어티이다.
[표 1]
Figure pct00032
K(γE-x53)는 Lys을 나타내고, 여기서, -NH2 측쇄 그룹은 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴로 관능화된다.
K(γE-x70)는 Lys을 나타내며, 여기서, -NH2 측쇄 그룹은 (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴로 관능화된다.
본 발명의 콘쥬게이트가 하나 이상의 산성 또는 염기성 그룹을 함유하는 경우, 본 발명은 또한 이들의 상응하는 약제학적으로 또는 독성학적으로 허용가능한 염, 특히 이들의 약제학적으로 이용가능한 염을 포함한다. 따라서, 산성 그룹을 함유하는 본 발명의 콘쥬게이트는, 예를 들어, 알칼리 금속염, 알칼리 토금속 염 또는 암모늄 염으로서 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 상기 염의 더욱 정확한 예는 나트륨 염, 칼륨 염, 칼슘 염, 마그네슘 염 또는 암모니아 또는 유기 아민, 예를 들어, 에틸아민, 에탄올아민, 트리에탄올아민 또는 아미노산과의 염을 포함한다. 하나 이상의 염기성 그룹, 즉, 양성자화될 수 있는 그룹을 함유하는 본 발명의 콘쥬게이트가 존재할 수 있고, 이들의 무기 산 또는 유기 산과의 부가염의 형태로 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 발명의 콘쥬게이트가 분자 내에 산성 및 염기성 그룹을 동시에 함유할 경우, 본 발명은 언급된 염 형태에 더하여, 내부 염 또는 베타인(쯔비터이온)도 포함한다. 본 발명의 콘쥬게이트에 따른 각각의 염은 당업자에게 공지된 통상적인 방법, 예를 들어, 이들을 용매 또는 분산제 중에서 유기 산 또는 무기 산 또는 염기와 접촉시키거나, 다른 염을 이용한 음이온 교환 또는 양이온 교환에 의해 수득될 수 있다. 본 발명은 또한 낮은 생리학적 양립성으로 인해 의약품에서의 사용에 직접적으로 적합한 것은 아니지만 예를 들어 화학 반응 또는 약제학적으로 허용되는 염의 제조를 위한 중간체로 사용될 수 있는 본 발명의 콘쥬게이트의 모든 염을 포함한다.
제조 공정
하이알루론산 하이드로겔의 합성
가교결합된 하이알루론산은 상이한 방법들에 의해 유도될 수 있다. HA와 가교결합제의 반응, 변형된(활성화된) HA와 가교결합제의 반응, 2가지의 상이한 변형된 HA와 가교결합제의 반응. 예가 문헌[Oh et al, Journal of Controlled Release 141 (2010), 2-12]에 기술되어 있다. 실시예 7에는 반응식 1에 도시된 바와 같은 모노 2작용성 가교결합제인 디비닐술폰을 이용한 비변형 Ha의 가교결합이 기술되어 있다. 가교결합제를 이용한 비변형 Ha의 가교결합은 또한 하이드록실 매개된 알킬화(반응식 2), 1-메틸, 2-클로로 피리디늄 요오다이드를 이용한 오토 가교결합(반응식 3), 아미드 형성(반응식 4) 및 디올-에폭시드 화학반응(반응식 5)에 의해 달성될 수 있다.
2가지 상이한 변형 HA로부터 시작하는 가교결합 방법은 티올과 말레이미드의 마이클(Michael) 부가 반응(반응식 6), 및 클릭 화학(Click chemistry)(반응식 7 및 반응식 8에 예시됨)이다.
변형 HA로부터 시작하는 가교결합 방법은 알데하이드(디올 산화)(반응식 9) 및 2 + 2 부가환화 반응(반응식 10 및 반응식 11에 예시됨)이다.
Figure pct00033
반응식 1: 디비닐 술폰을 이용한 가교결합
Figure pct00034
반응식 2: 하이드록실 매개된 알킬화
Figure pct00035
반응식 3: 오토 가교결합
Figure pct00036
반응식 4: 아미드 반응
Figure pct00037
반응식 5: 디올 - 에폭시드 화학반응
Figure pct00038
반응식 6: 마이클 부가 가교결합(티올 - 말레이미드)
Figure pct00039
반응식 7: 클릭 화학
Figure pct00040
반응식 8: 클릭 화학
Figure pct00041
반응식 9: 알데하이드(디올 산화) - 아민 환원적 아미노화
Figure pct00042
반응식 10: 2 +2 부가환화
Figure pct00043
반응식 11: 2 +2 부가환화
링커 L은 실시예에 기술된 바와 같은, 그리고 국제 공개 제2009/095479호, 국제 공개 제2011/012718호 및 국제 공개 제2012/035139호에 개시된 바와 같은 방법에 의해 제조된다.
펩티드-링커 콘쥬게이트의 합성
라이신 내에서와 같은 아미노 그룹의 측쇄 변형 및 비천연 아미노산을 함유하는 펩티드의 바람직한 제조 방식으로는 적합한 수지 상에서의 고상 합성법(SPPS)이 있다.
예가 다음 문헌에 주어져 있다: 문헌[Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., 1984]; 문헌[Atherton and Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, a practical approach, Oxford, IRL Press, New York, 1989]; 문헌[Pennington and Dunn, Methods in Molecular Biology, Volume 35, Peptide Synthesis Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1994]; 문헌[Jones, The Chemical Synthesis of Peptides, Clarendon Press, Oxford, 1991].
펩티드의 고상 합성은 고체 지지체-보유 링커에 대한 N-말단 보호 아미노산 유도체를 이용하여 시작된다. 고체 지지체는 SPPS에서 사용되는 용매와 양립가능한 임의의 중합체로서 수지(예를 들어, 트리틸 수지, 클로로트리틸 수지, 왕(Wang)-수지(펩티드 산을 원할 경우) 또는 링크(Rink)-수지, 지버(Sieber)-수지(펩티드 아미드가 Fmoc-전략의 이용에 의해 수득되어야 할 경우) 상에의 아미노산 유도체(그의 카복시 그룹을 포함함)의 커플링을 허용하는 임의의 중합체일 수 있다. 중합체 지지체의 안정성이 펩티드 합성 동안 α-아미노 그룹의 탈보호에 이용되는 조건 하에서 주어져야 한다.
첫 번째의 N-말단 보호 아미노산이 링커-수지 구축물 상에 커플링된 후, N-말단을 보호하는 그룹은 염기, 예컨대 피페리딘/디메틸포름아미드 혼합물(Fmoc-전략)에 의해 절단된다. 유리된 아미노 그룹은 커플링 시약, 예를 들어 BOP (벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트), HBTU (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸아미늄 헥사플루오로포스페이트), HATU (O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N′,N′-테트라메틸우로늄 헥사플루오르포스페이트)를 3차 염기, 예컨대 DIPEA (디이소프로필에틸 아민) 또는 NMM (N-메틸모르폴린) 또는 대안적으로 DIC (N,N'-디이소프로필카보디이미드) / HOBt 수화물 (1-하이드록시벤조트리아졸)과 함께 이용하여, Fmoc-보호된 아미노산 유도체와 반응시킨다. 이 공정은 원하는 아미노산 서열이 얻어질 때까지 반복된다.
아미노산 유도체의 반응성 측쇄 관능기는 대개 고상 펩티드 합성에 사용되는 조건 하에서 안정한 적합한 보호 그룹으로 차단된다. 상기 보호 그룹은 펩티드가 고상에서 조립된 후 동일 조건 하에서 수지로부터의 원하는 생성물의 절단과 동시에 제거된다. 보호 그룹 및 이의 도입을 위한 절차는 문헌[Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd ed., Wiley & Sons, New York, 1999] 또는 문헌[Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 1994]에서 발견될 수 있다.
SPPS에서 임의로 측쇄 보호 그룹을 이의 변형을 위하여 제거할 가능성도 있다. 그러한 보호 그룹의 제거를 위한 조건은 모든 다른 보호 그룹이 온전하게 남아있도록 하는 것이어야 한다. 라이신은 ivDde- 또는 Dde-그룹으로 보호될 수 있으며(문헌[Chhabra et al., Tetrahedron Lett. 39, 1603, 1998] 참조), 상기 그룹은 DMF 중 하이드라진-용액에 대하여 불안정하다. 일단 N-말단 보호 그룹 뿐만 아니라, 모든 측쇄 보호 그룹이 산에 불안정한 보호 그룹이면, ivDde- 또는 Dde-보호 그룹은 DMF 중 하이드라진에 의해 절단될 수 있다. 라이신 측쇄로부터 유리된 아미노 그룹은 그 후에 예를 들어 다른 Fmoc-아미노산 또는 지방산에 의해 변형될 수 있다.
Lys(14) 측쇄의 변형: 펩티드 Y는 그 서열 내에 4개의 라이신 아미노산을 가지며, 여기서, 위치 14의 라이신은 측쇄에서 변형된다(화학식 I 및 화학식 II 참조). 따라서, 펩티드 합성에 있어서, 2개의 상이한 측쇄 보호 라이신이 사용된다: 위치 14를 위한 빌딩 블록으로서, Mmt-측쇄(모노메톡시트리틸) 보호된 라이신이 사용되고, Boc-측쇄 보호된 라이신이 기타의 것에 사용된다.
이러한 2개의 상이한 보호 그룹의 절단은 서로에 대하여 임의로 선택될 수 있다.
펩티드는 마지막으로, 트리플루오로아세트산 함유 칵테일, 예를 들어 킹 칵테일(King's cocktail)을 사용하여 모든 측쇄 보호 그룹과 동시에 수지로부터 절단될 수 있다(문헌[King et al., Int. J. Peptide Protein Res. 36, 255-266, 1990]). 이러한 칵테일은 예를 들어 트리플루오로아세트산 (TFA), 물, 에탄디티올 (EDT), 티오아니솔, 페놀, 트리에틸실란 (TES) 또는 트리이소프로필실란 (TIPS)을 가변적인 양으로 함유할 수 있다.
특정한 반응 시간 후, 수지를 여과 제거하며, 조 펩티드를 에테르, 예를 들어 디에틸 에테르, 메틸3급.부틸 에테르 또는 디이소프로필 에테르에서 침전시킨다. 침전물은 원심분리에 의해 용액으로부터 분리되거나 여과 제거될 수 있다.
따라서 본 발명의 추가 목적은 다음 단계를 포함하는, 링커-콘쥬게이트 L2*-L-Y의 제조 방법을 제공하는 것이었다:
a) 위치 2에서 D-Ser을 포함하는 수지 상에서의 Y의 펩티드 서열의 조립;
b) 위치 1에서의 Fmoc-His(Trt)-OH로서의 His의 커플링;
c) Fmoc의 탈보호;
d) 하기 화학식 Iaa의 링커 시약인 시약 L2 *-L-의 커플링:
[화학식 Iaa]
Figure pct00044
상기 화학식 Iaa에서,
L2 *는 -O- 및 C(O)N(R3aa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹이 임의로 개재되고, OH 및 C(O)N(R3aaR3aaa)(여기서, R3aa 및 R3aaa는 H 및 C1 -4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택됨)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 임의로 치환되는 C1-20 알킬 쇄이고; L1에의 콘쥬게이션용으로 의도된 화학 관능 그룹을 포함하고;
PA는 OH 또는 활성화 그룹, 예컨대 p-니트로페닐에스테르이다;
e) 위치 14에서의 Mmt의 탈보호;
f) 위치 14에서의 Palm-Glu(γOSu)-OtBu 또는 Stea-Glu(γOSu)-OtBu의 커플링;
g) 수지로부터의 절단 및 모든 보호된 그룹으로부터의 탈보호.
본 방법의 또다른 실시형태에서,
L2*는 -O- 및 C(O)N(R3aa)(여기서, R3aa는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택됨)로부터 선택되는 하나의 그룹이 임의로 개재된 C1 -6 알킬 쇄이고; 티올 또는 말레이미드로부터 선택되는 화학 관능 그룹을 포함한다.
본 방법의 또다른 실시형태에서,
L2*는 -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)NH- 또는 -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-이고,
티올 그룹을 화학 관능 그룹으로 포함한다.
따라서 본 발명의 목적은 다음 단계를 포함하는, 링커-콘쥬게이트 L2*-L-Y의 제조 방법을 제공하는 것이다:
a) 위치 2에서 D-Ser을 포함하는 수지 상에서의 Y의 펩티드 서열의 조립;
b) 위치 1에서의 Fmoc-His(Trt)-OH로서의 His의 커플링;
c) Fmoc의 탈보호;
d) 하기 화학식 Iab의 링커 시약인 시약 L2 *-L-의 커플링:
[화학식 Iab]
Figure pct00045
상기 화학식 Iab에서,
정의는 상기에 기술된 바와 같다;
e) 위치 14에서의 Mmt의 탈보호;
f) 위치 14에서의 Palm-Glu(γOSu)-OtBu 또는 Stea-Glu(γOSu)-OtBu의 커플링;
g) 수지로부터의 절단 및 모든 보호된 그룹으로부터의 탈보호.
링커 콘쥬게이트 L2*-L-Y (여기서, L에서의 X는 NH임)에 있어서, 대안적인 방법은 링커 시약인 시약 L2*-L-을 두 단계로 커플링시키는 것이고, 첫 번째, 아미노산 부분을 커플링시키고, 두 번째, 링커의 있는 부분을 커플링시킨다.
따라서 본 발명의 목적은 다음 단계를 포함하는, 링커-콘쥬게이트 L2*-L-Y (여기서, L에서의 X는 NH임)의 제조 방법을 제공하는 것이다:
a) 위치 2에서 D-Ser을 포함하는 수지 상에서의 Y의 펩티드 서열의 조립;
b) 위치 1에서의 Fmoc-His(Trt)-OH로서의 His의 커플링;
c) Fmoc의 탈보호;
d) 하기 화학식 Icc의 아미노산의 커플링:
[화학식 Icc]
Figure pct00046
상기 화학식 Icc에서, P는 보호 그룹, 바람직하게는 Fmoc이다;
e) Fmoc의 탈보호;
f) 하기 화학식 Icd의 링커 시약인 시약 L2 *-L*-의 커플링:
[화학식 Icd]
Figure pct00047
상기 화학식 Icd에서, 정의는 상기에 정의된 바와 같고; PA는 OH 또는 활성화 그룹, 예컨대 p-니트로페닐에스테르이다;
g) 위치 14에서의 Mmt의 탈보호;
h) 위치 14에서의 Palm-Glu(γOSu)-OtBu 또는 Stea-Glu(γOSu)-OtBu의 커플링;
i) 수지로부터의 절단 및 모든 보호된 그룹으로부터의 탈보호;
(여기서,
R1, R1a, R2a는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
L2*-는 상기에 기술된 바와 같이 정의됨).
본 방법의 하나의 실시형태에서, 화학식 Icc에서 R1은 CH3이고, R1a는 H이다.
본 방법의 또다른 실시형태에서, 화학식 Icc에서 R1은 H이고, R1a는 CH3이다.
본 방법의 또다른 실시형태에서, 화학식 Icc에서 R1은 CH3이고, R1a는 CH3이다.
따라서 본 발명의 또다른 목적은 다음 단계를 포함하는, 화학식 L2*-L-Y의 링커-콘쥬게이트의 제조 방법을 제공하는 것이다:
a) 위치 2에서 D-Ser을 포함하는 수지 상에서의 Y의 펩티드 서열의 조립;
b) 위치 1에서의 Fmoc-His(Trt)-OH로서의 His의 커플링;
c) Fmoc의 탈보호;
d) Fmoc-Aib-OH의 커플링;
e) Fmoc의 탈보호;
f) 하기 화학식 Iac의 링커 시약인 시약 L2 *-L*-의 커플링:
[화학식 Iac]
Figure pct00048
;
g) 위치 14에서의 Mmt의 탈보호;
h) 위치 14에서의 Palm-Glu(γOSu)-OtBu 또는 Stea-Glu(γOSu)-OtBu의 커플링;
i) 수지로부터의 절단 및 모든 보호된 그룹으로부터의 탈보호.
본 발명의 또다른 목적은 다음 단계를 포함하는, 화학식 L2*-L-Y의 링커-콘쥬게이트의 제조 방법을 제공하는 것이다:
a) 위치 2에서 D-Ser을 포함하는 수지 상에서의 Y의 펩티드 서열의 조립;
b) 위치 1에서의 Fmoc-His(Trt)-OH로서의 His의 커플링;
c) Fmoc의 탈보호;
d) Fmoc-Aib-OH의 커플링;
e) Fmoc의 탈보호;
f) 하기 화학식 Iac의 링커 시약인 시약 L2 *-L*-의 커플링:
[화학식 Iac]
Figure pct00049
;
g) 위치 14에서의 Mmt의 탈보호;
h) Fmoc-Glu(tBu)의 커플링;
i) Fmoc의 탈보호;
j) Palm-NHS 또는 Stea-NHS의 커플링;
k) 수지로부터의 절단 및 모든 보호된 그룹으로부터의 탈보호.
본 발명의 또다른 목적은 다음 단계를 포함하는, 화학식 L2*-L-Y의 링커-콘쥬게이트의 제조 방법을 제공하는 것이다:
a) 위치 2에서 D-Ser을 포함하는 수지 상에서의 Y의 펩티드 서열의 조립;
b) 위치 1에서의 Fmoc-His(Trt)-OH로서의 His의 커플링;
c) Fmoc의 탈보호;
d) Fmoc-Aib-OH의 커플링;
e) 위치 14에서의 Mmt의 탈보호;
f) 위치 14에서의 Palm-Glu(γOSu)-OtBu 또는 Stea-Glu(γOSu)-OtBu의 커플링;
g) Fmoc의 탈보호;
h) 하기 화학식 Iad의 링커 시약인 시약 L2 *-L*-의 커플링:
[화학식 Iad]
Figure pct00050
;
i) 수지로부터의 절단 및 모든 보호된 그룹으로부터의 탈보호;
j) S-tBu 보호 그룹의 환원적 절단.
모든 상기에 기술된 공정을 위한 추가의 후속적인 공정 단계로는 크로마토그래피에 의한 정제 및 본 기술 분야에 공지된 방법에 의한 화학식 -L2*-L-Y의 펩티드 링커 콘쥬게이트의 단리가 있다.
본 발명의 콘쥬게이트는 빌딩 블록인 활성화된 하이알루론산 하이드로겔(-L1*을 포함함) 및 활성화된 펩티드 링커 콘쥬게이트 L2*-L-Y를 합성함으로써 제조될 수 있다.
활성화된 그룹 L1 * 및 L2 *은 펩티드를 중합체에 콘쥬게이션시키기 위해 사용된다.
반응식 12는 자가-희생 링커를 이용하여 펩티드를 중합체에 콘쥬게이션시키기 위해 사용될 수 있는 상이한 유형들의 연결 화학을 나타낸다. 따라서, 티올-말레이미드 화학 외에도, 다른 이중직교 화학(biorthogonal chemistry)이 사용될 수 있다. 반응식 12에서, 점선은 L1 및 L2가 부착되는 위치를 나타낸다.
관능화된 하이알루론산 하이드로겔에 GLP-1/글루카곤 작용제-링커 콘쥬게이트를 로딩한 후, 모든 잔여 관능 그룹을 적합한 차단 시약으로 임의로 캡핑하여 원하지 않는 부반응을 방지한다.
관능화된 말레이미도 그룹-함유 HA-하이드로겔의 경우에서, 티올 함유 화합물, 예를 들어, 메르캅토에탄올이 적합한 차단제이다.
Figure pct00051
반응식 12
본 발명의 또다른 양태는 L2*- L -Y를 포함하는 관능화된 중간체이고, 여기서, L2*, L 및 Y는 상기에 기술된 바와 같이 정의된다.
L2*-L-Y의 하나의 실시형태는 티올 관능기를 포함하여서 하기 화학식 IV를 생성한다:
[화학식 IV]
HS-L2- L -Y
상기 화학식 IV에서, L2, L 및 Y는 상기에 기술된 바와 같은 의미를 갖는다.
L2*-L-Y의 하나의 실시형태는 하기 화학식 IVa의 것이다:
[화학식 IVa]
Figure pct00052
L2*-L-Y의 하나의 실시형태는 하기 화학식 IVb의 것이다:
[화학식 IVb]
Figure pct00053
L2*-L-Y의 하나의 실시형태는 하기 화학식 IVc의 것이다:
[화학식 IVc]
Figure pct00054
또다른 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트를 위한 하이드로겔은 그 제조 방법으로부터 미세입자의 형태로 수득될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 반응성 하이드로겔은 메시 또는 스텐트에 의해 형상화된다. 가장 바람직하게는, 하이드로겔은 미립자형 비드로 성형되는데, 이는 표준 시린지에 의한 피하 또는 근육내 주사제로서 투여될 수 있다. 이러한 연성 비드는 1 내지 500 마이크로미터의 직경을 가질 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물이다. 약제학적 조성물은 하기 단락에서 추가로 기술된다.
본 발명의 콘쥬게이트의 조성물은 현탁 조성물 또는 건조 조성물로 제공될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 약제학적 조성물은 건조 조성물이다. 건조의 적합한 방법은, 예를 들어, 분무-건조 및 동결건조(냉동-건조)이다. 바람직하게는, 본 발명의 콘쥬게이트의 약제학적 조성물은 동결건조에 의해 건조된다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 약제학적 조성물은 즉시 이용할 수 있는 현탁액이다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 약제학적 조성물은 콘쥬게이트가 물/완충액 중에서 0.5 내지 8%(w/v)의 농도까지 팽창되는 즉시 이용할 수 있는 현탁액이다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 약제학적 조성물은 콘쥬게이트가 물/완충액 중에서 1 내지 4%(w/v)의 농도까지 팽창되는 즉시 이용할 수 있는 현탁액이다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 약제학적 조성물은 콘쥬게이트가 물/완충액 중에서 1.5 내지 3%(w/v)의 농도까지 팽창되는 즉시 이용할 수 있는 현탁액이다.
바람직하게는, 본 발명의 콘쥬게이트는 1회 적용으로 적어도 3일 동안 치료학적 유효량의 GLP-1/글루카곤 작용제를 제공하기에 충분하도록 조성물 형태로 투약된다. 더 바람직하게는, 본 발명의 콘쥬게이트의 1회 적용은 1주일 동안 충분하다.
본 발명에 따른 본 발명의 콘쥬게이트의 약제학적 조성물은 하나 이상의 부형제를 함유한다.
비경구 조성물에 사용되는 부형제는 완충제, 등장성 조절제, 보존제, 안정화제, 흡착방지제, 산화방지제, 증점제/점도 향상제, 또는 다른 보조제로 분류될 수 있다. 일부 경우에서, 이들 성분은 이중 또는 삼중 기능을 가질 수 있다. 본 발명에 따른 본 발명의 콘쥬게이트의 조성물은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 함유한다:
(i) 완충제: pH를 원하는 범위 내에서 유지하기 위한 생리학적으로 허용되는 완충제, 예를 들어, 나트륨 포스페이트, 바이카보네이트, 숙시네이트, 히스티딘, 시트레이트 및 아세테이트, 술페이트, 니트레이트, 클로라이드, 피루베이트. Mg(OH)2 또는 ZnCO3와 같은 제산제가 또한 사용될 수 있다. 완충 용량은 pH 안정성에 가장 민감한 조건에 맞추기 위해 조정될 수 있다.
(ii) 등장성 조절제: 주사 데포에서 삼투압 차이로 인한 세포 손상으로부터 발생할 수 있는 동통의 최소화. 글리세린 및 염화나트륨이 예이다. 유효 농도는 혈청에 있어서 285 내지 315 mOsmol/kg의 추정 오스몰 농도를 이용하여 삼투압 측정에 의해 결정될 수 있다.
(iii) 보존제 및/또는 항미생물제: 다중용량 비경구 제제는 주사시 환자가 감염될 위험을 최소화하기에 충분한 농도의 보존제의 첨가를 필요로 하며, 상응하는 규제 요건이 확립되었다. 전형적인 보존제는 m-크레졸, 페놀, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 클로로부탄올, 벤질 알코올, 페닐수은 니트레이트, 티메로솔, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 벤조산, 클로로크레졸, 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함한다.
(iv) 안정화제: 안정화는 단백질을 안정화하는 힘의 강화, 변성된 스테이터(stater)의 탈안정화 또는 단백질에의 부형제의 직접 결합에 의해 달성된다. 안정화제는 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 글라이신, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 당, 예를 들어, 글루코스, 수크로스, 트레할로스, 폴리올, 예를 들어, 글리세롤, 만니톨, 소르비톨, 염, 예를 들어, 인산칼륨, 황산나트륨, 킬레이트제, 예를 들어, EDTA, 헥사포스페이트, 리간드, 예를 들어, 2가 금속 이온(아연, 칼슘 등), 다른 염 또는 유기 분자, 예를 들어, 페놀성 유도체일 수 있다. 게다가, 올리고머 또는 중합체, 예를 들어, 사이클로덱스트린, 덱스트란, 덴드리머, PEG 또는 PVP 또는 프로타민 또는 HSA가 사용될 수 있다.
(v) 흡착방지제: 주로 이온성 또는 비-이온성 계면활성제 또는 다른 단백질 또는 가용성 중합체가 경쟁적으로 조성물 또는 조성물의 용기의 내부 표면에 흡착하거나 이를 코팅하는 데 사용된다. 예를 들어, 폴록사머(플루로닉(Pluronic) F-68), PEG 도데실 에테르(Brij 35), 폴리소르베이트 20 및 80, 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜, PEG-폴리히스티딘, BSA 및 HSA 및 젤라틴. 부형제의 선택된 농도 및 유형은 피해야 할 효과에 좌우되나, 전형적으로 계면활성제의 단층은 CMC 값 바로 위의 계면에서 형성된다.
(vi) 동결건조보호제 및/또는 동결보존제: 냉동 건조 또는 분무 건조 동안, 부형제는 수소 결합 파괴 및 물 제거에 의해 야기되는 탈안정화 효과를 중화시킬 수 있다. 이러한 목적을 위해, 당 및 폴리올이 사용될 수 있으나, 상응하는 긍정적 효과가 계면활성제, 아미노산, 비-수성 용매, 및 기타 펩티드에 대해서도 관찰되었다. 트레할로스는 수분-유도 응집을 감소시키는 데 특히 효율적이고, 또한 물에 대한 단백질 소수성 그룹의 노출에 의해 잠재적으로 야기되는 열 안정성을 개선시킨다. 만니톨 및 수크로스가 또한 단독의 동결건조보호제/동결보존제로서 또는 서로 조합되어 사용될 수 있으며, 만니톨:수크로스의 더 높은 비가 동결건조된 케이크의 물리적 안정성을 향상시키는 것으로 공지되어 있다. 만니톨은 또한 트레할로스와 조합될 수 있다. 트레할로스는 또한 소르비톨과 조합될 수 있거나 또는 소르비톨이 단독 보호제로 사용될 수 있다. 전분 또는 전분 유도체가 또한 사용될 수 있다.
(vii) 산화방지제: 항산화제, 예를 들어, 아스코르브산, 엑토인, 메티오닌, 글루타티온, 모노티오글리세롤, 모린, 폴리에틸렌이민(PEI), 프로필 갈레이트, 비타민 E, 킬레이트제, 예를 들어, 시트르산, EDTA, 헥사포스페이트, 티오글리콜산.
(viii) 증점제 또는 점도 향상제: 바이알 및 주사기에서 입자의 침강을 지연시키고, 입자의 혼합 및 재현탁을 촉진하고 현탁액의 주사를 더 용이하게(즉, 주사기 플런저에 대한 낮은 힘) 만들기 위해 사용된다. 적합한 증점제 또는 점도 향상제는, 예를 들어, 카보폴 940(Carbopol 940), 카보폴 울트레즈 10(Carbopol Ultrez 10)과 같은 카보머 증점제, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(하이프로멜로스(hypromellose), HPMC) 또는 디에틸아미노에틸 셀룰로오스(DEAE 또는 DEAE-C)와 같은 셀룰로오스 유도체, 콜로이드성 규산마그네슘(비검(Veegum)) 또는 규산나트륨, 하이드록시아파타이트 젤, 트리칼슘 포스페이트 겔, 잔탄, 사티아(Satia) 검 UTC 30과 같은 카라기난, 지방족 폴리(하이드록시산), 예를 들어, 폴리(D,L-락트산 또는 L-락트산)(PLA) 및 폴리(글리콜산)(PGA) 및 이들의 공중합체(PLGA), D,L-락티드, 글리콜리드 및 카프로락톤의 삼원공중합체, 폴록사머, 폴리(옥시에틸렌)-폴리(옥시프로필렌)-폴리(옥시에틸렌)(예를 들어, 플루로닉(Pluronic)®)의 트리블록을 제조하기 위한 친수성 폴리(옥시에틸렌) 블록 및 소수성 폴리(옥시프로필렌) 블록, 폴리에테르에스테르 공중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 테레프탈레이트/폴리부틸렌 테레프탈레이트 공중합체, 수크로스 아세테이트 이소부티레이트(SAIB), 덱스트란 또는 이의 유도체, 덱스트란 및 PEG의 조합물, 폴리디메틸실록산, 콜라겐, 키토산, 폴리비닐 알코올(PVA) 및 유도체, 폴리알킬이미드, 폴리(아크릴아미드-코-디알릴디메틸 암모늄(DADMA)), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 글리코사미노글리칸(GAG), 예를 들어, 더마탄 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 케라탄 술페이트, 헤파린, 헤파란 술페이트, 하이알루로난, 소수성 A-블록, 예를 들어, 폴리락티드(PLA) 또는 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA) 및 친수성 B-블록, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리비닐 피롤리돈으로 구성된 ABA 트리블록 또는 AB 블록 공중합체이다. 상기 블록 공중합체 뿐만 아니라 상기 언급된 폴록사머도 역 열적 겔화 거동(투여를 촉진하기 위한 실온에서의 유체 상태 및 주사 후 체온에서의 졸-겔 전이 온도보다 높은 온도에서의 겔 상태)을 나타낼 수 있다.
(ix) 전착제 또는 확산제: 비제한적으로 결합 조직의 세포간 공간에서 발견되는 다당류인 하이알루론산과 같은 간극 공간 내의 세포외 기질의 성분의 가수분해를 통해 결합 조직의 침투성을 조절한다. 비제한적으로 하이알루로니다제와 같은 전착제는 일시적으로 세포외 기질의 점도를 감소시키고, 주사된 약물의 확산을 촉진한다.
(x) 기타 보조제: 예컨대 습윤제, 점도 조절제, 항생제, 하이알루로니다제. 염산 및 수산화나트륨과 같은 산 및 염기는 제조 동안 pH 조정에 필요한 보조제이다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 조성물은 하나 이상의 증점제 및/또는 점도 조절제를 함유한다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 조성물은 증점제 및/또는 점도 조절제로서 하이알루론산을 함유한다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 조성물은 증점제 및/또는 점도 조절제로서 하이알루론산을 5 내지 30 중량%의 농도로 포함한다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 조성물은 증점제 및/또는 점도 조절제로서 200 kDa 내지 6백만 kDa의 분자량의 하이알루론산을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 조성물은 증점제 및/또는 점도 조절제로서 500 kDa 내지 3백만 kDa의 분자량의 하이알루론산을 포함한다.
또다른 실시형태에서, 조성물은, 26 이상의 니들 게이지를 갖는 튜브를 포함하는 주사 디바이스를 통하여 조성물을 피하 투여하고, 상기 조성물을 매주 1회 투여하는 것을 특징으로 하는, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 비만 또는 고혈당의 치료 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 적어도 하나의 콘쥬게이트를 포함한다.
용어 "부형제"는 바람직하게는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아쥬반트, 또는 비히클을 나타낸다. 상기 의약품 부형제는 살균 액체일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 경구 투여되는 경우에 바람직한 부형제이다. 염수 및 수성 덱스트로스는 약제학적 조성물이 정맥내 투여되는 경우에 바람직한 부형제이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게는 주사가능한 용액을 위한 액체 부형제로 사용된다.
적합한 의약품 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 젤, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탤크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 원하는 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 산제, 지속-방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 이러한 조성물은 환자에의 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 부형제와 함께 바람직하게는 정제된 형태의 치료학적 유효량의 치료제를 함유할 것이다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
일반적 실시형태에서, 건조 형태이든 현탁액이든 또다른 형태이든 간에 본 발명의 약제학적 조성물은 단회 또는 다회 용량(dose) 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 건조 조성물은 단회 용량으로 제공되고, 이는 이것을 공급하는 용기가 하나의 약제학적 용량을 함유하는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명의 또다른 양태에서, 조성물은 단회 용량 조성물로 제공된다.
본 발명의 또다른 양태에서, 조성물은 용기에 포함된다. 하나의 실시형태에서, 용기는 이중-챔버 주사기이다. 특히, 본 발명에 따른 건조 조성물은 이중-챔버 주사기의 제1 챔버에 제공되고, 재구성 용액은 이중-챔버 주사기의 제2 챔버에 제공된다.
본 발명의 콘쥬게이트의 건조 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 적용하기 전에, 건조 조성물은 재구성된다. 재구성은 본 발명의 콘쥬게이트의 건조 조성물이 내부에 제공된 용기, 예를 들어, 바이알, 주사기, 이중-챔버 주사기, 앰풀, 및 카트리지에서 일어날 수 있다. 재구성은 건조 조성물에 소정량의 재구성 용액을 첨가함으로써 행해진다. 재구성 용액은 추가 첨가제, 예를 들어, 보존제 및/또는 항미생물제를 함유할 수 있는 살균 액체, 예를 들어, 물 또는 완충액이다. 조성물이 단회 용량으로 제공되는 경우, 재구성 용액은 하나 이상의 보존제 및/또는 항미생물제를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 재구성 용액은 살균수이다.
본 발명의 추가 양태는 재구성된 조성물의 투여 방법에 관한 것이다. 조성물은 피내, 피하, 근육내, 정맥내, 골내 및 복강내를 포함하는 주사 또는 주입 방법에 의해 투여될 수 있다.
추가 양태는 치료학적 유효량의 본 발명의 콘쥬게이트, 및 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 재구성된 조성물의 제조 방법이고, 여기서, GLP-1/글루카곤 작용제는 하이드로겔에 일시적으로 연결되고, 본 방법은 다음 단계를 포함한다:
· 본 발명의 조성물과 재구성 용액을 접촉시키는 단계.
또다른 양태는 치료학적 유효량의 본 발명의 콘쥬게이트, 및 임의로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 재구성된 조성물이고, 여기서, GLP-1/글루카곤 작용제는 상기 방법에 의해 수득가능한 하이드로겔에 일시적으로 연결된다.
본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 콘쥬게이트의 건조 조성물을 제조하는 방법이다. 하나의 실시형태에서, 이러한 현탁 조성물은 다음 단계에 의해 제조된다:
(i) 본 발명의 콘쥬게이트를 하나 이상의 부형제와 혼합하는 단계,
(ii) 단회 또는 다회 용량과 동등한 양을 적합한 용기 내로 옮기는 단계,
(iii) 상기 용기 내의 조성물을 건조시키는 단계, 및
(iv) 용기를 밀봉하는 단계.
적합한 용기는 바이알, 주사기, 이중-챔버 주사기, 앰풀, 및 카트리지이다.
또다른 양태는 부품 키트(kit of parts)이다. 투여 디바이스가 단순히 피하 주사기라면, 키트는 주사기, 니들 및 주사기와 함께 사용하기 위한 건조 조성물을 포함하는 용기 및 재구성 용액을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 주사 디바이스는 간단한 피하 주사기 이외의 것이고, 따라서 재구성된 본 발명의 콘쥬게이트를 포함하는 별개의 용기가 주사 디바이스와 맞물리도록 맞추어져서, 사용시 용기 내의 액체 조성물이 주사 디바이스의 유출구와 유체 연결되게 한다. 투여 디바이스의 예는 피하 주사기 및 펜 주사기 디바이스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직한 주사 디바이스는 펜 주사기인데, 이 경우 용기는 카트리지, 바람직하게는 일회용 카트리지이다.
바람직한 부품 키트는 니들 및 본 발명에 따른 조성물을 함유하고 임의로 재구성 용액을 추가로 함유하는 용기를 포함하며, 용기는 니들과 함께 사용하기 위한 것으로 맞추어진다. 바람직하게는, 용기는 이중-챔버 주사기이다.
또다른 양태에서, 본 발명은 펜 주사기 디바이스와 함께 사용하기 위한 것으로 이상에서 기술된 바와 같은 본 발명의 콘쥬게이트의 조성물을 함유하는 카트리지를 제공한다. 카트리지는 단회 용량 또는 다회 용량의 GLP-1/글루카곤 작용제를 함유할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 본 발명의 콘쥬게이트의 현탁 조성물은 본 발명의 콘쥬게이트 및 하나 이상의 부형제 뿐만 아니라 자유 형태이거나 콘쥬게이트로서의 다른 생물학적 활성제도 포함한다. 바람직하게는, 상기 추가의 하나 이상의 생물학적 활성제는 콘쥬게이트, 더욱 바람직하게는 하이드로겔 콘쥬게이트이다. 상기 생물학적 활성제는 병용 요법 하에 기술된 화합물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
주사가능성
바람직하게는, 제형은 0.26 ㎜보다 작은 내경의 니들(26 게이지), 더욱 더 바람직하게는 0.18 ㎜보다 작은 내경의 니들(28 게이지), 가장 바람직하게는 0.16 ㎜보다 작은 내경의 니들(30 게이지)을 통한 주사에 의해 투여될 수 있다.
용어 "주사에 의해 투여될 수 있는", "주사가능한" 또는 "주사가능성"은 특정 농도(w/v) 및 특정 온도에서 액체 중에서 팽창된 본 발명에 따른 생물분해성 HA 하이드로겔을 함유하는 주사기의 플런저에 적용되는 특정 힘, 상기 주사기의 유출구에 연결된 주어진 내경의 니들, 및 니들을 통해 주사기로부터 본 발명에 따른 생물분해성 하이드로겔의 특정 부피를 배출하는 데 필요한 시간과 같은 요인의 조합을 나타내는 것이 이해된다.
주사가능성을 제공하기 위해, 물/완충액에서 팽창되고, 주사기(4.7 ㎜ 직경의 플런저를 가짐)에 함유된 본 발명에 따른 콘쥬게이트의 1 mL의 부피는 26 게이지의 니들을 통해 20 뉴턴 이하의 힘을 적용하여 10초 이내에 실온에서 배출될 수 있다.
바람직한 주사가능성은 30 게이지의 니들을 통해 20 뉴턴 이하의 힘을 적용하여 10초 이내에 실온에서 배출될 수 있는, 물/완충액에서 팽창되고, 주사기(4.7 ㎜ 직경의 플런저를 가짐)에 함유된 본 발명에 따른 콘쥬게이트의 1 mL의 부피이다.
주사가능성을 제공하기 위해, 적어도 1.5%(w/v)의 농도까지 물/완충액에서 팽창되고, 4.7 ㎜ 직경의 플런저를 갖는 주사기에 함유된 본 발명에 따른 콘쥬게이트의 1 mL의 부피는 30 게이지의 니들을 통해 30 뉴턴 미만의 힘을 적용하여 10초 이내에 실온에서 배출될 수 있다.
더욱 바람직하게는, 주사가능성은 30 게이지의 니들을 통해 30 뉴턴 미만의 힘을 적용시킴으로써 적어도 2%(w/v)의 농도까지 물/완충액에서 팽창된 본 발명에 따른 콘쥬게이트에 대해 달성된다.
가장 바람직하게는, 주사가능성은 30 게이지의 니들을 통해 20 뉴턴 미만의 힘을 적용시킴으로써 적어도 2%(w/v)의 농도까지 물/완충액에서 팽창된 본 발명에 따른 콘쥬게이트에 대해 달성된다.
콘쥬게이트의 중요한 특징은 이의 적용 부위에 남아 있는 안정한 데포의 형성이다. 중합체의 분해는 약물의 방출 후에 시작되어야 한다.
또다른 실시형태는 28 이상의 게이지를 갖는 튜브를 포함하고, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 비만 또는 고혈당의 치료 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 콘쥬게이트를 추가로 포함하는 주사 디바이스이다.
투여 유닛, 패키지, 펜 디바이스 및 투여
본 발명의 화합물(들)은 적합한 약제학적 조성물에서의 사용용으로 제조될 수 있다. 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 투여 유닛의 형태로 존재할 수 있다.
본 조성물은, 본 발명의 화합물(들) 및 담체(이는 하나 이상의 추가 성분으로 이루어질 수 있음)를 접촉시키는 단계를 포함하는 임의의 적합한 약제학적 방법에 의해 제조될 수 있다.
투여 유닛은 예를 들어 캡슐, 정제, 당의정, 과립 사세, 드롭, 용액, 현탁액, 동결건조물 및 산제일 수 있으며, 이들 각각은 정해진 양의 본 발명의 화합물(들)을 함유한다.
각각의 전술한 본 발명의 화합물(들)의 투여 유닛 또는 본 발명의 약제학적 조성물(투여 유닛)은 용이한 수송 및 보관을 위하여 패키지로 제공될 수 있다. 투여 유닛은 표준 단회 또는 다회 용량 패키징에 패키징되고, 이들의 형태, 재료 및 형상은 제조되는 유닛의 유형에 따라 달라진다.
예를 들어, 정제 및 기타 형태의 고형 투여 유닛은 단일 유닛으로 패키징될 수 있으며, 단일 패키징 유닛은 다중팩 용기에 패키징될 수 있다.
액상 제형은 단일 유닛, 예를 들어 바이알, 카트리지, 주사기/사전충전 주사기, 주입 백, 접을 수 있는 플라스틱 백, 주입 병, 취입-충전 시일 병 또는 주입 튜브류 내에 또는 단회 또는 다회 용량 주사가능 형태로, 예를 들어 펜 디바이스, 펌프 또는 주사기의 형태로 패키징될 수 있으며, 단일 패키징 유닛은 다중팩 용기 내에 패키징될 수 있다. 단일 패키지는 단지 하나의 또는 복수의 투여 유닛을 포함할 수 있다. 패키지는 예를 들어 종이, 보드지, 판지, 플라스틱, 금속, 하나 이상의 종이, 플라스틱 및 금속의 조합물 또는 라미네이트, 또는 유리로 만들어질 수 있다. 예시적인 실시형태로는 예를 들어 정제 또는 캡슐을 함유하는 블리스터 패키지(이는 다시 보드지 박스 내에 제공될 수 있음), 예를 들어 산제를 함유하는 알루미늄 장벽 라미네이트 사세, 예를 들어 정제 또는 용액을 함유하는 유리 또는 플라스틱 병, 또는 용액 또는 현탁액을 함유하는 바이알, 카트리지, 주사기, 주입 백, 주입 병, 주입 튜브류 또는 앰풀이 있다.
특정 실시형태에서, 투여 유닛은 적용을 위한 디바이스, 예를 들어, 주사기, 주사 펜 또는 자기주사기와 함께 제공될 수 있다. 상기 디바이스는 약제학적 조성물과 별개로 제공될 수 있거나, 약제학적 조성물로 사전충전될 수 있다.
흔히 간단히 "주사 펜"으로 지칭되는 "펜형 주사 디바이스"는 전형적으로 집필용 만년필과 비슷한 장방형을 갖는 주사 디바이스이다. 이러한 펜은 대개 관상 단면을 갖지만, 상기 펜은 삼각형, 직사각형 또는 정사각형 또는 이러한 지오메트리(geometry)를 바탕으로 한 임의의 변동과 같은 다른 단면을 용이하게 가질 수 있다. 일반적으로, 펜형 주사 디바이스는 다음의 세 주요 요소를 포함한다: 흔히 하우징 또는 홀더에 내장되는 카트리지를 포함한 카트리지부; 카트리지부의 일 단부에 연결된 니들 어셈블리; 및 카트리지부의 다른 단부에 연결된 투약부. 전형적으로, 카트리지(흔히 "앰풀"로도 지칭됨)는 약으로 충전되는 보관용기, 카트리지의 보관용기의 일 단부에 위치하는 가동 고무 타입 마개(bung) 또는 스토퍼, 및 다른 (흔히, 넥다운(necked-down)) 단부에 위치하는 관통가능 고무 시일을 가진 정상부(top)를 포함한다. 고무 시일을 적소에 고정시키기 위해, 권축가공된 환형 금속 밴드가 전형적으로 사용된다. 카트리지 하우징은 전형적으로 플라스틱으로 만들어질 수 있지만, 카트리지의 저장용기는 역사상 유리로 만들어져 왔다.
병용 요법
본 발명의 콘쥬게이트, GLP-1 및 글루카곤 수용체에 대한 이중 작용제는 다른 약리학적 활성 화합물, 예를 들어, 독일의약품집(Rote Liste) 2016에서 언급된 모든 약물, 예를 들어, 독일의약품집 2015, 1장에서 언급된 모든 체중 감량제 또는 식욕 억제제, 독일의약품집 2016, 58장에서 언급된 모든 지질 강하제, 독일의약품집 2016에서 언급된 모든 항고혈압제 및 신장보호제(nephroprotective), 또는 독일의약품집 2016, 36장에 언급된 모든 이뇨제와 광범위하게 조합될 수 있다.
활성 성분 병용물은 특히 작용의 상승적 개선을 위해 사용될 수 있다. 이것은 환자에 활성 성분들을 별개로 투여함으로써, 또는 복수의 활성 성분이 하나의 제약 제제에 존재하는 병용 제품의 형태로 적용될 수 있다. 활성 성분들의 별개 투여에 의해 활성 성분들이 투여될 때, 이것은 동시에 또는 연속적으로 수행될 수 있다.
상기 병용물에 적합한 다른 활성 물질은 특히, 예를 들어, 언급된 징후 중 하나와 관련하여 하나 이상의 활성 물질의 치료 효과를 강화하고/강화하거나 하나 이상의 활성 물질의 용량이 감소되게 하는 것을 포함한다.
병용물에 적합한 치료제는 예를 들어 다음을 포함한다: 항당뇨병제, 예컨대
인슐린 및 인슐린 유도체, 예를 들어, 글라진(Glargine)/란투스(Lantus®), 270 내지 330 U/mL의 인슐린 글라진(유럽 특허 제2387989 A호), 300 U/mL의 인슐린 글라진(유럽 특허 제2387989 A호), 글루리신(Glulisin)/애피드라(Apidra®), 데테미르(Detemir)/레베미르(Levemir®), 리스프로(Lispro)/휴마로그(Humalog®)/리프롤로그(Liprolog®), 데글루덱(Degludec)/데글루덱플러스(DegludecPlus), 아스파르트(Aspart), 기저 인슐린 및 유사체(예컨대, LY-2605541, LY2963016, NN1436), 페길화 인슐린 리스프로(Lispro), 휴물린(Humulin®), 린제타(Linjeta), 술리젠(SuliXen®), NN1045, 인슐린 플러스 심린(Insulin plus Symlin), PE0139, 속성 작용 및 단기 작용 인슐린(예컨대, 린제타(Linjeta), PH20, NN1218, 힌스벳(HinsBet)), (APC-002)하이드로겔, 경구, 흡입성, 경피 및 설하 인슐린(예컨대, 익쥬베라(Exubera®), 나슐린(Nasulin®), 아프레자(Afrezza), 트레고필(Tregopil), TPM 02, 캡슐린(Capsulin), 오랄린(Oral-lyn®), 코발아민(Cobalamin®) 경구 인슐린, ORMD-0801, NN1953, NN1954, NN1956, 비아탭(VIAtab), 오샤디(Oshadi) 경구 인슐린). 2작용성 링커에 의해 알부민 또는 또다른 단백질에 결합된 인슐린 유도체도 추가로 포함된다.
GLP-1, GLP-1 유사체 및 GLP-1 수용체 작용제, 예를 들어 릭시세나티드(Lixisenatide)/AVE0010/ZP10/릭수미아(Lyxumia), 엑세나티드(Exenatide)/엑센딘-4/비에타(Byetta)/비두레온(Bydureon)/ITCA 650/AC-2993, 리라글루티드(Liraglutide)/빅토자(Victoza), 세마글루티드(Semaglutide), 타스포글루티드(Taspoglutide), 신크리아(Syncria)/알비글루티드(Albiglutide), 둘라글루티드(Dulaglutide), r엑센딘-4, CJC-1134-PC, PB-1023, TTP-054, 란글레나티드(Langlenatide)/HM-11260C, CM-3, GLP-1 엘리젠(Eligen), ORMD-0901, NN-9924, NN-9926, NN-9927, 노덱센(Nodexen), 비아도르(Viador)-GLP-1, CVX-096, ZYOG-1, ZYD-1, GSK-2374697, DA-3091, MAR-701, MAR709, ZP-2929, ZP-3022, TT-401, BHM-034. MOD-6030, CAM-2036, DA-15864, ARI-2651, ARI-2255, 엑세나티드(Exenatide)-XTEN 및 글루카곤-Xten.
DPP-4 억제제, 예를 들어 알로글립틴(Alogliptin)/네시나(Nesina), 트라젠타(Trajenta)/리나글립틴(Linagliptin)/BI-1356/온데로(Ondero)/트라젠타(Trajenta)/트라드젠타(Tradjenta)/트라옌타(Trayenta)/트라드젠타(Tradzenta), 삭사글립틴(Saxagliptin)/온글리자(Onglyza), 시타글립틴(Sitagliptin)/자누비아(Januvia)/젤레비아(Xelevia)/테사베(Tesave)/자누멧(Janumet)/벨메티아(Velmetia), 갈부스(Galvus)/빌다글립틴(Vildagliptin), 아나글립틴(Anagliptin), 제미글립틴(Gemigliptin), 테넬리글립틴(Teneligliptin), 멜로글립틴(Melogliptin), 트렐라글립틴(Trelagliptin), DA-1229, 오마리글립틴(Omarigliptin)/MK-3102, KM-223, 에보글립틴(Evogliptin), ARI-2243, PBL-1427, 피녹사신(Pinoxacin).
SGLT2 억제제, 예를 들어 인보카나(Invokana)/카나글리포진(Canaglifozin), 포르지가(Forxiga)/다파글리플로진(Dapagliflozin), 레모글리포진(Remoglifozin), 세르글리플로진(Sergliflozin), 엠파글리플로진(Empagliflozin), 이프라글리플로진(Ipragliflozin), 토포글리플로진(Tofogliflozin), 루세오글리플로진(Luseogliflozin), LX-4211, 에르투글리포진(Ertuglifozin)/PF-04971729, RO-4998452, EGT-0001442, KGA-3235/DSP-3235, LIK066, SBM-TFC-039,
비구아니드(Biguanide)(예를 들어, 메트포르민(Metformin), 부포르민(Buformin), 펜포르민(Phenformin)), 티아졸리딘디온(예를 들어, 피오글리타존(Pioglitazone), 리보글리타존(Rivoglitazone), 로시글리타존(Rosiglitazone), 트로글리타존(Troglitazone)), 이중 PPAR 작용제(예를 들어, 알레글리타자르(Aleglitazar), 무라글리타자르(Muraglitazar), 테사글리타자르(Tesaglitazar)), 술포닐우레아(Sulfonylurea)(예를 들어, 톨부타미드(Tolbutamide), 글리벤클라미드(Glibenclamide), 글리메피리드(Glimepiride)/아마릴(Amaryl), 글리피지드(Glipizide)), 메글리티니드(Meglitinides)(예를 들어, 나테글리니드(Nateglinide), 레파글리니드(Repaglinide), 미티글리니드(Mitiglinide)), 알파-글루코시다제 억제제(예를 들어, 아카보스(Acarbose), 미글리톨(Miglitol), 보글리보스(Voglibose)), 아밀린(Amylin) 및 아밀린 유사체(예를 들어, 프람린티드(Pramlintide), 심린(Symlin)).
GPR119 작용제(예를 들어, GSK-263A, PSN-821, MBX-2982, APD-597, ZYG-19, DS-8500), GPR40 작용제(예를 들어, 파시글리팜(Fasiglifam)/TAK-875, TUG-424, P-1736, JTT-851, GW9508).
기타 적합한 병용 파트너로는 다음이 있다: 사이클로셋(Cycloset), 11-베타-HSD의 억제제(예를 들어, LY2523199, BMS770767, RG-4929, BMS816336, AZD-8329, HSD-016, BI-135585), 글루코키나제의 활성제(예를 들어, TTP-399, AMG-151, TAK-329, GKM-001), DGAT의 억제제(예를 들어, LCQ-908), 단백질 티로신포스파타제 1의 억제제(예를 들어, 트로두스퀘민(Trodusquemine)), 글루코스-6-포스파타제의 억제제, 프룩토스-1,6-비스포스파타제의 억제제, 글리코겐 포스포릴라제의 억제제, 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제의 억제제, 글리코겐 신타제(synthase) 키나제의 억제제, 피루베이트 데하이드로키나제의 억제제, 알파2-길항제, CCR-2 길항제, SGLT-1 억제제(예를 들어, LX-2761).
예를 들어 다음과 같은 하나 이상의 지질 강하제가 또한 병용 파트너로서 적합하다: HMG-CoA-리덕타제 억제제(예를 들어, 심바스타틴(Simvastatin), 아토르바스타틴(Atorvastatin)), 피브레이트(예를 들어, 베자피브레이트(Bezafibrate), 페노피브레이트(Fenofibrate)), 니코틴산 및 이의 유도체(예를 들어, 니아신(Niacin)),
PPAR-(알파, 감마 또는 알파/감마)작용제 또는 조절제(예를 들어, 알레글리타자르(Aleglitazar)),
PPAR-델타 작용제, ACAT 억제제(예를 들어 아바시마이브(Avasimibe)), 콜레스테롤 흡수 억제제(예를 들어, 에제티마이브(Ezetimibe)), 담즙산-결합 물질(예를 들어 콜레스티라민, 콜레세벨람(colesevelam)), 회장 담즙산 수송 억제제, MTP 억제제, 또는 PCSK9의 조절제.
HDL-상승 화합물, 예를 들어 CETP 억제제(예를 들어, 토르세트라피브(Torcetrapib), 아나세트라피드(Anacetrapid), 달세트라피드(Dalcetrapid), 에바세트라피드(Evacetrapid), JTT-302, DRL-17822, TA-8995) 또는 ABC1 조절자.
다른 적합한 병용 파트너로는, 예를 들어, 다음과 같은 비만의 치료를 위한 하나 이상의 활성 물질이 있다: 시부트라민(Sibutramine), 테소펜신(Tesofensine), 오를리스타트(Orlistat), 카나비노이드-1 수용체의 길항제, MCH-1 수용체 길항제, MC4 수용체 작용제, NPY5 또는 NPY2 길항제(예를 들어, 벨네페리트(Velneperit)), 베타-3-작용제, 렙틴(leptin) 또는 렙틴 모방체, 5HT2c 수용체의 작용제(예를 들어, 로르카세린(Lorcaserin)) 또는 부프로피온(bupropione)/날트렉손(naltrexone), 부프로피온(bupropione)/조니사미드(zonisamide), 부프로피온(bupropione)/펜터민(phentermine) 또는 프람린티드(pramlintide)/메트렐렙틴(metreleptin)의 병용물.
기타 적합한 병용 파트너로는 다음이 있다:
추가 위장 펩티드, 예를 들어, 펩티드 YY 3-36(PYY3-36) 또는 이의 유사체, 췌장 폴리펩티드(PP) 또는 이의 유사체.
글루카곤 수용체 작용제 또는 길항제, GIP 수용체 작용제 또는 길항제, 그렐린(ghrelin) 길항제 또는 역작용제, 제닌(Xenin) 및 이의 유사체.
게다가, 고혈압, 만성 심부전 또는 아테롬성 동맥 경화증에 영향을 주기 위한 약물, 예를 들어 안지오텐신 II 수용체 길항제(예를 들어, 텔미사르탄(telmisartan), 칸데사르탄(candesartan), 발사르탄(valsartan), 로사르탄(losartan), 에프로사르탄(eprosartan), 이르베사르탄(irbesartan), 올메사르탄(olmesartan), 타소사르탄(tasosartan), 아질사르탄(azilsartan)), ACE 억제제, ECE 억제제, 이뇨제, 베타-차단제, 칼슘 길항제, 중추 작용성 고혈압 유발제(centrally acting hypertensive), 알파-2-아드레날린 수용체의 길항제, 중성 엔도펩티다제의 억제제, 혈소판 응집 억제제 및 기타 약물 또는 이들의 병용물과의 조합물이 적합하다.
용도
또다른 양태에서, 본 발명은 GLP-1 및 글루카곤에 대한 수용체에 결합하고, 이들의 활성을 조절함으로써 발생될 수 있는 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에 적합한 약제를 제조하기 위한, 병용 파트너로서 상기 기술된 활성 물질 중 적어도 하나와 병용된 본 발명에 따른 콘쥬게이트 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다.
상기 조성물은 GLP-1/글루카곤 작용제 및 GLP-1/글루카곤 작용제의 작용제에 대해 공지된 질환 또는 장애의 치료 또는 예방, 예를 들어, 고혈당증의 치료 및 예방 및 임의의 유형의 진성 당뇨병, 예를 들어, 인슐린-의존성 진성 당뇨병, 인슐린 비-의존성 진성 당뇨병, 당뇨병전증 또는 임신성 진성 당뇨병의 치료 및 예방, 대사 증후군 및/또는 비만 및/또는 섭식 장애, 인슐린 내성 증후군의 예방 및 치료, 혈장 지질 수준 저하, 심장 위험 감소, 식욕 감소, 체중 감소 등의 방법에서 사용하기 위한 것이다.
상기 콘쥬게이트 또는 조성물은 지방간증, 바람직하게는 비-알콜성 간 질환(NAFLD) 및 비-알콜성 지방간염(NASH)의 치료 또는 예방에서 유용하다.
1종 이상의 활성 물질과 병용된 본 발명에 따른 콘쥬게이트 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염의 사용은 동시에, 별개로 또는 순차적으로 일어날 수 있다.
또다른 활성 물질과 병용된 본 발명에 따른 콘쥬게이트 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염의 사용은 동시에 또는 시차를 두지만, 특히 단기간 내에 일어날 수 있다. 상기 두 활성 물질은, 동시에 투여되는 경우, 함께 환자에게 제공되고; 상기 두 활성 물질은, 시차를 두고 사용되는 경우, 12시간 이하, 그러나 특히 6시간 이하의 기간 내에 환자에게 제공된다. 12시간, 그러나, 특히 6시간 이하.
그 결과, 또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 콘쥬게이트 또는 이러한 화합물의 생리학적으로 허용가능한 염 및 병용 파트너로서 상기 기술된 활성 물질 중 적어도 하나와 함께 임의로 하나 이상의 불활성 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 콘쥬게이트 또는 이의 생리학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물 및 이와 조합되는 추가 활성 물질은 이들 둘 다가 하나의 제형, 예를 들어, 현탁액에 함께 존재할 수 있거나, 예를 들어, 소위 부품 키트로서 2개의 동일하거나 상이한 제형에 개별적으로 존재할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 치료학적 유효량의 본 발명의 콘쥬게이트 또는 본 발명의 약제학적 조성물 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 하나 이상의 병태의 치료를 필요로 하는 포유동물 환자, 바람직하게는 인간에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 환자에서의 치료, 제어, 지연 또는 예방 방법이다.
방법
이용되는 약어는 하기와 같다:
AA 아미노산
AcOH 아세트산
AcOEt 에틸 아세테이트
Aib 알파-아미노-이소부티르산
cAMP 환형 아데노신 모노포스페이트
Bn 벤질
Boc 3급-부틸옥시카보닐
BOP (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트
BSA 소 혈청 알부민
tBu 3차 부틸
dAla D-알라닌
DBU 1,3-디아자바이사이클로[5.4.0]운데센
DCC N,N -디사이클로헥실카보디이미드
DCM 디클로로메탄
Dde 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)-에틸
ivDde 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소사이클로헥실리덴)3-메틸-부틸
DIC N,N'-디이소프로필카보디이미드
DIPEA N,N-디이소프로필에틸아민
DMAP 디메틸아미노-피리딘
DMEM 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)
DMF 디메틸 포름아미드
DMS 디메틸술피드
DMSO 디메틸술폭시드
DTT DL 디티오트레이톨
DVS 디-비닐술폰
EDC 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드
EDT 에탄디티올
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
eq 화학량론적 당량
EtOH 에탄올
FA 포름산
FBS 소 태아 혈청
Fmoc 플루오레닐메틸옥시카보닐
gGlu 감마-글루타메이트 (γE)
HATU O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N′,N′-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HBSS 행크스 평형 염 용액(Balanced Salt Solution)
HBTU 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸-우로늄 헥사플루오로포스페이트
HEPES 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산
HOBt 1-하이드록시벤조트리아졸
HOSu N-하이드록시숙신이미드
HPLC 고성능 액체 크로마토그래피
HTRF 균일 시간 해상 형광(Homogenous Time Resolved Fluorescence)
IBMX 3-이소부틸-1-메틸잔틴
LC/MS 액체 크로마토그래피/질량 분광법
Mal 3-말레이미도 프로필
Mal-PEG6-NHS N-(3-말레이미도프로필)-21-아미노-4,7,10,13,16,19-헥사옥사-헨에이코산산 NHS 에스테르
Me 메틸
MeOH 메탄올
Mmt 4-메톡시트리틸
MS 질량 스펙트럼 / 질량 분광법
MTBE 메틸 3급-부틸 에테르
MW 분자 질량
NHS N-하이드록시 숙신이미드
Palm 팔미토일
iPrOH 2-프로판올
PBS 인산염 완충 염수
PEG 폴리에틸렌 글리콜
PK 약동학적 특성
PyBOP 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트
Phth 프탈이미도
RP-HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피
rpm 분당 회전수
RT 실온
SEC 크기 배제 크로마토그래피
Stea 스테아릴
TCEP 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드
TES 트리에틸실란
TFA 트리플루오로아세트 산
THF 테트라하이드로푸란
TMEDA N,N,N´N´-테트라메틸에틸렌 디아민
Tris 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄
Trt 트리틸
UPLC 초고성능 액체 크로마토그래피
UV 자외선
V 부피
펩티드 화합물의 일반적 합성
재료:
다양한 링크(Rink)-아미드 수지(4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르류실아미노메틸 수지, 머크 바이오사이언시즈(Merck Biosciences); 4-[(2,4-디메톡시페닐)(Fmoc-아미노)메틸]페녹시 아세트아미도 메틸 수지, 애질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies))를 0.2 내지 0.4 mmol/g의 범위 내의 로딩으로 펩티드 아미드의 합성에 사용하였다.
Fmoc 보호된 천연 아미노산을 프로테인 테크놀로지즈 인크.(Protein Technologies Inc.), 센느 케미칼즈(Senn Chemicals), 머크 바이오사이언시즈, 노바바이오켐(Novabiochem), 아이리스 바이오테크(Iris Biotech), 나가세(Nagase) 또는 바켐(Bachem)으로부터 구매하였다. 하기 표준 아미노산을 합성 전반에 걸쳐 사용하였다: Fmoc-L-Ala-OH, , Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH, , Fmoc-L-Gln(Trt)-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L-His(Trt)-OH, Fmoc-L-Ile-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH, Fmoc-L-Phe-OH, Fmoc-L-Pro-OH, Fmoc-L-Ser(tBu)-OH, Fmoc-D-Ser(Boc)-OH, Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH.
게다가, 하기 특수 아미노산을 상기와 동일한 공급처로부터 구매하였다: Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-Aib-OH, Fmoc-D-Ser(tBu)-OH, Fmoc-D-Ala-OH, Boc-L-His(Boc)-OH (톨루엔 용매화물로서 입수가능) 및 Boc-L-His(Trt)-OH.
고상 펩티드 합성을, 예를 들어, 표준 Fmoc 화학 및 HBTU/DIPEA 활성화를 이용하여 프리루드 펩티드 합성기(Prelude Peptide Synthesizer)(프로테인 테크놀로지즈 인크(Protein Technologies Inc)) 또는 유사한 자동화 합성기에서 수행하였다. DMF를 용매로 사용하였다. 탈보호: 2 x 2.5분 동안 20% 피페리딘/DMF. 세척: 7 x DMF. 커플링: 2 x 20분 동안 DMF 중 2:5:10의 200 mM AA/500 mM HBTU/2 M DIPEA. 세척: 5 x DMF.
Lys-측쇄가 변형된 경우, Fmoc-L-Lys(ivDde)-OH 또는 Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH를 상응하는 위치에서 사용하였다. 합성의 완료 후, ivDde 그룹을 변형된 문헌의 절차(문헌[S.R. Chhabra et al., Tetrahedron Lett. 39, (1998), 1603])에 따라 DMF 중 4% 하이드라진 수화물을 이용하여 제거하였다. Mmt 그룹을 디클로로메탄 중 1% TFA를 이용한 반복 처리에 의해 제거하였다. 수지를 요망되는 산의 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르로 처리하거나, HBTU/DIPEA 또는 HOBt/DIC와 같은 커플링 시약을 이용함으로써 하기 아실화를 실시하였다.
합성된 모든 펩티드를 82.5% TFA, 5% 페놀, 5% 물, 5% 티오아니솔, 2.5% EDT로 이루어진 킹 절단 칵테일을 이용하여 수지로부터 절단하였다. 그 후, 조 펩티드를 디에틸 또는 디이소프로필 에테르에서 침전시키고, 원심분리하고, 동결건조하였다. 펩티드를 분석용 HPLC에 의해 분석하고, ESI 질량 분광법에 의해 확인하였다. 조 펩티드를 통상적인 분취용 HPLC 정제 절차에 의해 정제하였다.
분석용 HPLC/UPLC
0.5 mL/분의 유량에서 구배 용출로 40℃에서 워터스(Waters) 엑스브리지(XBridge) BEH130 3.5 μm C18 컬럼(2.1 x 150 mm)를 이용하여 애질런트 1100 시리즈 HPLC 시스템에서 분석용 HPLC를 수행하고, 215 및 280 nm에서 모니터링하였다. 구배는 15분에 걸쳐 10% B에서 90% B까지, 그 후, 1분 동안 90% B로 설정하거나, 12.5분에 걸쳐 15% B에서 50% B까지, 그 후, 3분에 걸쳐 50% B에서 90% B까지로 설정하였다. 완충액 A = 물 중 0.1% 포름산, B = 아세토나이트릴 중 0.1% 포름산.
일반적인 분취용 HPLC 정제 절차:
조 펩티드를 악타 퓨리파이어 시스템 (Aekta Purifier System) 또는 자스코 세미프렙 (Jasco semiprep) HPLC 시스템에서 정제하였다. 상이한 크기 및 상이한 유량의 분취용 RP-C18-HPLC 컬럼을 정제할 조 펩티드의 양에 따라 사용하였다. 아세토니트릴 + 0.1% TFA (B) 및 물 + 0.1% TFA (A)를 용출제로 이용하였다. 생성물을 함유하는 분획을 수집하고, 동결건조시켜 정제된 생성물을 수득하였다.
LCMS법 A: 215 nm에서 검출
컬럼: Aeris Widepore, 3.6 μm, 100 x 2.1 mm, 40℃
용매: H2O+0.1% TFA : ACN+0.1% TFA (유량: 0.5 ml/분)
구배: 90:10 (0분) → 10:90 (10분) → 10:90 (10.67분) → 90:10 (11분) → 90:10 (12분)
엑센딘-4 유도체의 안정성 테스트
펩티드 배치(batch)의 용해도 및 안정성의 테스트 전, 이의 함량을 결정하였다. 따라서, 이의 순도(HPLC-UV) 및 배치의 염 부하의 양(이온 크로마토그래피)의 2개의 파라미터를 조사하였다.
안정성 테스트를 위해, 용해도에 대해 획득된 상청액의 분취물을 25℃ 또는 40℃에서 7일 동안 보관하였다. 상기 시간 과정 후에, 샘플을 4000 rpm에서 20분 동안 원심분리하고, 상청액을 HPLC-UV를 이용하여 분석하였다.
잔여 펩티드의 양의 결정을 위해, t0 및 t7에서의 표적 화합물의 피크 면적을 비교하여, 하기 식에 따라 "잔여 펩티드 %"를 생성하였다:
잔여 펩티드 % = [(t7에서의 펩티드 피크 면적) x 100]/t0에서의 펩티드 피크 면적.
t0에서 관찰된 피크 면적의 합계에 의해 감소된, 모든 관찰된 불순물로부터의 피크 면적의 합계를 비교하여 가용성 분해 생성물의 양을 계산하였다(즉, 새로이 형성된 펩티드-관련 종의 양을 결정하기 위하여). 이러한 값을 하기 식에 따라 t0에서의 펩티드의 초기 양에 대한 퍼센트로 제공하였다:
가용성 분해 생성물 % = {[(t7에서 불순물의 피크 면적의 합계) - (t0에서의 불순물의 피크 면적의 합계)] x 100}/t0에서의 펩티드 피크 면적.
"잔여 펩티드 %" 및 "가용성 분해 생성물 %"의 합계로부터 100%까지의 잠재적 차이는 하기 식에 따라 스트레스 조건에서 가용성인 채로 남아있는 것이 아닌 펩티드의 양을 반영한다:
침전물 % = 100-([잔여 펩티드 %] + [가용성 분해 생성물 %])
이러한 침전물은 원심분리에 의한 분석으로부터 제거된 비-가용성 분해 생성물, 중합체 및/또는 피브릴을 포함한다.
화학적 안정성은 "잔여 펩티드 %"로 표시된다.
음이온 크로마토그래피
기기: 디오넥스(Dionex) ICS-2000, 프리/컬럼(pre/column): Ion Pac AG-18 2 x 50 ㎜ (디오넥스)/AS18 2 x 250 ㎜ (디오넥스), 용출제: 수성 수산화나트륨, 유량: 0.38 mL/분, 구배: 0 내지 6분: 22 mM KOH, 6 내지 12분: 22 내지 28 mM KOH, 12 내지 15분: 28 내지 50 mM KOH, 15 내지 20분: 22 mM KOH, 서프레서(suppressor): ASRS 300 2 mm, 검출: 전도도.
GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체 효능에 대한 시험관 내 세포 분석법
서열 번호 5 및 6의 펩티드 화합물을 국제 공개 제2014056호에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 인간 글루카곤 수용체(h글루카곤 R) 또는 인간 GLP-1 수용체(hGLP-1 R)를 발현하는 세포를 증가하는 농도의 열거된 화합물에 노출시키고 형성된 cAMP를 측정함으로써 GLP-1 및 글루카곤 수용체에서의 펩티드 화합물의 효력을 결정하였다. 상기 수용체들에 대한 펩티드의 아고니즘을 인간 GIP, GLP-1 또는 글루카곤 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK-293 세포주의 cAMP 반응을 측정하는 기능 분석에 의해 결정하였다.
세포의 cAMP 함량을 HTRF(균일 시간 해상 형광)를 기반으로 한 시스바이오 코포레이션(Cisbio Corp.)으로부터의 키트(카탈로그 번호 62AM4PEC)를 이용하여 결정하였다. 준비를 위해, 세포를 T175 배양 플라스크 내로 분주하고, 배지 (DMEM / 10% FBS)에서 거의 컨플루언시(confluency)까지 하룻밤 성장시켰다. 그 후, 배지를 제거하고, 세포를 칼슘 및 마그네슘이 결여된 PBS로 세척하고, 이어서 아큐타제 (accutase)(시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich) 카탈로그 번호 A6964)를 이용하여 프로테이나제 처리를 하였다. 떼어낸 세포를 세척하고, 분석 완충제 (1 x HBSS; 20 mM HEPES, 0.1% BSA, 2 mM IBMX)에 재현탁시키고, 세포 밀도를 결정하였다. 그 후, 이것을 400000개의 세포/ml까지 희석시키고, 25 ㎕-분취물을 96웰 플레이트의 웰 내로 분배하였다. 측정을 위하여, 분석 완충제 중 테스트 화합물 25 ㎕를 웰에 첨가하고, 이어서 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 용해 완충액에 희석시킨 HTRF 시약 (키트 구성 요소)을 첨가한 후, 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션하고, 665 / 620 nm에서 형광 비를 측정하였다. 작용제의 시험관 내 효력을 최대 반응의 50% 활성화를 야기한 농도 (EC50)의 결정에 의해 정량화하였다.
하이드로겔 분석 방법
하이알루론산 하이드로겔 중 말레이미드 함량의 추정.
HA 하이드로겔에 혼입된 말레이미드 그룹의 추정을 비색 분석법으로 수행하였다. pH 7.5의 PBS 완충액 중 트리스-(2-카복시에틸) 포스핀 하이드로클로라이드(TCEP)를 이용한 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)의 환원에 의해 5-티오 2-니트로벤조산을 제조하였다. 20 mol% 과량의 5,5'-디티오비스-(2-니트로벤조산)을 TCEP와의 부반응을 방지하기 위해 사용하였다. 소정량의 말레이미드 관능화 하이드로겔을 pH 3.5의 20 mM 숙시네이트 완충 염수(SBS)에 현탁시켰다. 상기 5-티오 2-니트로벤조산 용액을 하이드로겔 현탁액에 첨가하고, 반응 혼합물을 볼텍스 혼합(2 x 10초)한 후, 45분 동안 25℃에서 온화하게 교반하였다. 이후, 현탁액을 10분 동안 25℃에서 원심분리하고, 상청액의 분취물을 취했다. 상청액의 흡광도를 412 ㎚에서 측정하였다. 용액 중 5-티오 2-니트로벤조산의 농도를 보정 곡선을 이용하여 추정하였다. 하이드로겔 중의 말레이미드 농도는 반응한 티올의 몰과 동등하며, 이는 첨가된 5-티오 2-니트로벤조산의 양과 상청액에 존재하는 5-티오 2-니트로벤조산의 양 사이의 차이로부터 계산된다.
하이드로겔-펩티드 콘쥬게이트에서의 펩티드 로딩의 추정을 위한 절차.
소정량의 HA 하이드로겔-펩티드 콘쥬게이트를 CHES 완충액(pH 9.5)에 현탁시키고, 현탁액을 70℃에서 온화하게 교반하였다. 현탁액을 원심분리하고, 분취물을 HPLC법에 의해 펩티드 함량에 대해 분석하였다. HPLC법은 애질런트 1100 LC를 이용하여 q C-18 키네틱스(Kinetics) 컬럼(내경 = 4.6 ㎜ 및 길이 = 100 ㎜, 입자 크기 2.6 ㎛, 페노메넥스(Phenomenex))을 이용하는 것으로 이루어진다. 이동상 A의 조성은 90% 물 / 10% 아세토니트릴 / 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)이고, 이동상 B는 10% 아세토니트릴 / 90% 물 / 0.09 % TFA이다. 구배는 8분 내에 이동상 25% B로부터 55% B까지이다. 유량은 1 mL/분으로 유지하였다. 하이드로겔로부터 방출된 펩티드를 정량화하기 위한 표준으로서 순수한 펩티드를 사용하였다.
1H-NMR(핵 자기 공명)을 이용한 정량적 분석
고체 상태 또는 (겔 상태) MAS(magic angle spinning) 양성자 NMR을 Ha-하이드로겔 콘쥬게이트의 특성화에 사용하였다. 소정 버전에서, 생성된 NMR 스펙트럼의 선모양을 증강시키기 위한 수단을 이용하여 샘플을 D2O에서 팽창시키고, ZrO2(이산화지르코늄) 회전자에 로딩하였다. 매직각(54.7°) 조건 하에 높은 회전(4 내지 13 Khz) 속도에서 샘플을 회전시킬 수 있는, 400 MHz 자석 내에 설치된 MAS 탐침자 내에 회전자를 넣었다. 상당한 선모양의 좁아짐이 생기고, 이는 다음의 추정에 유용한 NMR 스펙트럼의 획득을 초래한다:
- 가교결합도 (p.e. DVS)
- 하이드로겔 관능화의 정도 (p.e. 말레이미드)
- HA 하이드로겔의 펩티드 로딩
- 중합체 주쇄에 결합되지 않은 자유 펩티드의 양
- 잔존 자유 소분자, 예를 들어 용매 또는 시약의 결정
- 콘쥬게이트 순도의 결정
소정 버전의 실험에서, 광역 동종핵 분리(broadband homonuclear decoupled) T2 스핀-스핀 완화 필터를 사용하여 하이알루론산 주쇄 공명의 넓은 신호를 억제하였다.
소정 버전의 실험에서, 확산 정렬 NMR 실험을 이용하여 중합체 비결합된 작은 분자 또는 펩티드 성분을 억제하였다. 최대 MAS 속도에서 800 ms까지의 DOSY 혼합 시간을 사용하였다. DOSY 필터는 중합체 주쇄에 대한 치환체의 화학적 치환에 대한 직접적인 입증을 가능하게 하였다. 모든 실험을 팽창된 상태에서 직접적으로 HA 바이오 콘쥬게이트의 천연 상태에서, 이의 화학적 분해 없이, 수행하였다.
소정 버전의 분석에서, 확산 및 T2 스핀-스핀 완화 필터를 하이브리드 실험에서 조합하여 1) 중합체의 주쇄에의 치환체의 연결성을 확립하고, 2) 복합 스핀 시스템을 그의 T2 완화 속도에 의해 수정하였다.
NMR을 위한 HA 콘쥬게이트의 샘플의 제조
스톡 용액:
정확한 양의 5 내지 10 mg의 말레산을 칭량하여 5 mL 플라스크 내에 넣고, 1,5 mL의 2,2,2-트리플루오르에탄올-d3을 첨가하였다. 그 후, 상기 플라스크를 D2O를 이용하여 5 mL까지 충전시켰다. 이 혼합물을 동결건조된 HA 물질의 후속적인 팽창을 위한 스톡 용액으로 사용하였다.
HA 콘쥬게이트 겔의 제조:
정확한 양의 3 내지 5 mg의 HA 콘쥬게이트를 칭량하여 에펜도르프-캡(Eppendorf-Cap) 내에 넣고, 150 μL의 스톡 용액을 첨가하였다. 에펜도르프-캡을 볼텍서(vortexer)로 진탕시킨 후 겔 형성이 시작되었다. 상기 겔을 실온에서 하룻밤 유지하였다. 그 후, 상기 겔을 HR-MAS-회전자 내에 넣었다. 회전자를 9.39 T에서 고상 NMR 분광계에서 측정하였는데, 이는 400.13 MHz의 양성자 공명에 상응한다. 쌍극자 쌍극자 상호작용을 감소시키기 위하여, 회전자를 대략 54,7°의 매직각까지 조정하고, 10 KHz에서 스피닝하였다. 양성자 스펙트럼을 25초의 재생 지연 및 2048 스캔을 이용하여 기록하였다.
평가:
데이터의 기록 후, FID(자유 유도 감쇠))에 윈도우 증대(window multiplication) 및 푸리에 변환(Fourier transformation)을 가하였다. 스펙트럼을 상 보정하고, 기준선 보정 루틴을 스펙트럼에 적용한 후 신호 적분을 하였다. 7.5 ppm으로부터 대략 7 ppm까지의 방향족 관능기의 양성자 신호를 적분하고, 펩티드의 방향족 양성자의 상응하는 수로 계산하였다. 이를 내부 표준물의 말레산 신호에 대하여 행하였다. 상기 둘 다의 값을 펩티드 로딩의 추정을 위하여 비로 세팅하였다. 콘쥬게이트의 다른 구조적 특징을 위하여, 표 2에 나타낸 양성자 신호를 사용하였다.
[표 2]
Figure pct00055
도 2는 서열 번호 5의 펩티드의 HA-하이드로겔-Aib-링커 콘쥬게이트의 전형적인 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
실시예
실시예 1
서열 번호 5의 서열을 포함하는 Aib-링커-펩티드 콘쥬게이트의 합성
고상 합성을 노바바이오켐 링크-아미드 수지 (4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르류실아미노메틸 수지) (100 내지 200 메시, 0.34 mmol/g의 로딩)에서 실시하였다. Fmoc-합성 전략을 HBTU/DIPEA-활성화와 함께 적용하였다. 위치 14에서 Fmoc-Lys(Mmt)-OH 및 위치 1에서 Fmoc-His(Trt)-OH를 고상 합성 프로토콜에서 사용하였다. 그 후 Fmoc-Aib-OH를 커플링시켰다.
그 후 디클로로메탄 중 1% TFA를 이용한 반복 (8회) 처리에 의해 수지 상의 펩티드로부터 Mmt-그룹을 절단하였다. 그 후 수지를 디클로로메탄 중 3% DIPEA로 3회 처리하고, 그 후 디클로로메탄으로 3회, 이어서 DMF로 3회 세척하였다. 이후, N-하이드록시 숙신이미드 에스테르 Palm-Glu(γOSu)-OtBu (DMF 중 3 당량)를 유리된 아미노-그룹에 커플링시키고, 이어서 Fmoc-절단하였다.
Fmoc 절단 후, 링커 시약 5c를 커플링시켰다 (DMF 중 2 당량).
펩티드를 킹 칵테일을 이용하여 수지로부터 절단하였다 (문헌[D. S. King, C. G. Fields, G. B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 36, 1990, 255-266]). 조 생성물을 아세토니트릴/물 구배 (이들 둘 다는 0.1% TFA를 포함하는 완충제)를 사용하여 워터스 컬럼 (선파이어(Sunfire), 프렙(Prep) C18)에서의 분취용 HPLC를 통해 정제하였다.
마지막으로, 정제된 펩티드의 분자 질량을 LC-MS에 의해 확인하였다.
실시예 2
서열 번호 5의 서열을 포함하는 Asn-링커-펩티드 콘쥬게이트의 합성
방법에서 설명한 바와 같은 고상 합성을 링크-아미드 수지 (4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-노르류실아미노메틸 수지)에서 실시하였다. Fmoc-합성 전략을 HBTU/DIPEA-활성화와 함께 적용하였다. 위치 14에서 Fmoc-Lys(ivDde)-OH 및 위치 1에서 Fmoc-His(Trt)-OH를 고상 합성 프로토콜에서 사용하였다.
링커 부착: 표준 프로토콜을 이용하여 N-말단 Fmoc 그룹을 절단한 후, 2.5 당량의 7e, 3 당량의 PyBOP, 및 3 당량의 DIPEA (DMF 중) (펩티드 1 mmol당 50 ml)를 혼합하였다. 15분 후, 수지-결합된 펩티드를 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 16시간 동안 온화한 진탕 하에 반응시켰다. 그 후 용매를 여과에 의해 제거하고, 후속적으로 여액을 DMF, DCM, 이소-프로판올 및 디에틸 에테르로 세척하였다.
라이신의 아실화 및 절단: ivDde-그룹을 문헌[S.R. Chhabra et al., Tetrahedron Lett. 39, (1998), 1603]에 따라 수지 상의 펩티드로부터 절단하였다. 이후 Palm-gGlu-OSu를 염기로서 DIPEA를 이용하여 유리된 아미노-그룹에 커플링하였다. 펩티드를 킹 칵테일을 이용하여 수지로부터 절단하였다 (문헌[D. S. King, C. G. Fields, G. B. Fields, Int. J. Peptide Protein Res. 36, 1990, 255-266]). 조 생성물을 아세토니트릴/물 구배(둘 모두 0,1% TFA를 포함하는 완충액)를 이용하여 워터스 컬럼(엑스브리지, BEH130, 프렙 C18 5 μM)에서 분취용 HPLC를 통해 정제하였다. 정제된 펩티드-링커 콘쥬게이트를 LCMS (방법 A)에 의해 분석하였다: 분자 이온 피크, m/z 1189, z=4).
실시예 3
링커 시약 5c의 합성
링커 시약 5c를 하기 반응식에 따라 합성하였다:
Figure pct00056
링커 시약 중간체 5a의 합성:
m-메톡시트리틸 클로라이드(3 g, 9.71 mmol)를 DCM(20 mL)에 용해시키고, DCM(20 mL) 중 에틸렌디아민(6.5 mL, 97.1 mmol)의 용액에 적가하였다. 2시간 후, 용액을 디에틸 에테르(300 mL)에 붓고, 30/1(v/v)의 염수/0.1 M NaOH 용액으로 3회(각각 50 mL) 및 염수로 1회(50 mL) 세척하였다. 유기상을 Na2SO4에서 건조시키고, 휘발성 물질을 감압 하에서 제거하였다. Mmt-보호된 중간체(3.18 g, 9.56 mmol)를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
Mmt-보호된 중간체(3.18 g, 9.56 mmol)를 무수 DCM(30 mL)에 용해시켰다. 6-(S-트리틸메르캅토)헥산산(4.48 g, 11.47 mmol), PyBOP(5.67 g, 11.47 mmol) 및 DIPEA(5.0 mL, 28.68 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반시켰다. 용액을 디에틸 에테르(250 mL)로 희석시키고, 30/1(v/v)의 염수/0.1M NaOH 용액으로 3회(각각 50 mL) 및 염수로 1회(50 mL) 세척하였다. 유기상을 Na2SO4에서 건조시키고, 휘발성 물질을 감압 하에서 제거하였다. 5a를 플래시 크로마토그래피로 정제하였다.
수율: 5.69 g (8.09 mmol).
MS: m/z 705.4 = [M+H]+ (MW의 이론치 = 705.0).
링커 시약 중간체 5b의 합성:
무수 THF(50 mL) 중 5a(3.19 g, 4.53 mmol)의 용액에 BH3·THF(1 M 용액, 8.5 mL, 8.5 mmol)를 첨가하고, 용액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 추가의 BH3·THF(1 M 용액, 14 mL, 14 mmol)를 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 메탄올(8.5 mL)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. N,N-디메틸-에틸렌디아민 (3　mL, 27.2 mmol)을 첨가하고, 용액을 가열 환류시키고, 3시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 그 후 에틸 아세테이트 (300 mL)로 희석시키고, 포화 Na2CO3 수용액 (2 x 100 mL) 및 포화 NaHCO3 수용액 (2 x 100 mL)으로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4에서 건조시키고, 휘발성 물질을 감압 하에서 제거하여, 조 아민 중간체(3.22 g)를 수득하였다.
아민 중간체(3.22 g)를 DCM(5 mL)에 용해시켰다. DCM(5 mL) 및 DIPEA(3.95 mL, 22.65 mmol)에 용해된 Boc2O(2.97 g, 13.69 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 플래시 크로마토그래피로 정제하여, 조 Boc- 및 Mmt-보호 중간체(3.00 g)를 수득하였다.
MS: m/z 791.4 = [M+H]+, 519.3 = [M-Mmt+H]+ (MW의 이론치 = 791.1).
0.4 M 수성 HCl(48 mL)을 아세토니트릴(45 mL) 중 Boc- 및 Mmt-보호 중간체의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 아세토니트릴(10 mL)로 희석시키고, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물의 pH 값을 5 M NaOH 용액의 첨가에 의해 5.5까지 조정하였다. 아세토니트릴을 감압 하에서 제거하고, 수성 용액을 DCM(4 x 100 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기상을 Na2SO4에서 건조시키고, 휘발성 물질을 감압 하에서 제거하였다. 조 5b를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
수율: 2.52 g (3.19 mmol).
MS: m/z 519.3 = [M+H]+ (MW의 이론치 = 519.8　g/mol).
링커 시약 5c의 합성:
중간체 5b(985 ㎎, 1.9 mmol) 및 p-니트로페닐 클로로포르메이트(330 ㎎, 2.5 mmol)를 무수 THF(10 mL)에 용해시켰다. DIPEA(0.653 mL, 3.7 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 용액을 아세트산(1 mL)의 첨가에 의해 산성화시켰다. 5c를 RP-HPLC로 정제하였다.
수율: 776 ㎎, (1.13 mmol).
MS m/z 706.3 = [M+Na]+ (MW의 이론치 = 706.3).
실시예 4
링커 시약 7f (Asn 링커)의 합성
링커 시약 7f를 하기 반응식에 따라 합성하였다:
Figure pct00057
MeOH(10 mL) 및 아세트산(0.5 mL) 중 N-메틸-N-boc-에틸렌디아민(0.5 mL, 2.79 mmol) 및 NaCNBH3(140 ㎎, 2.23 mmol)의 냉각된(0℃) 용액에 EtOH(10 mL) 중 2,4,6-트리메톡시벤즈알데하이드(0.547 ㎎, 2.79 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하고, 2 M HCl(1 mL)로 산성화시키고, 포화 수성 Na2CO3(50 mL)로 중화시켰다. 모든 휘발성 물질의 증발, 생성된 수성 슬러리의 DCM 추출 및 유기 분획의 농축은 조 오일로서 N-메틸-N-boc-N'-tmob-에틸렌디아민(7a)을 생성시켰고, 이를 RP-HPLC로 정제하였다.
수율: 593 ㎎ (1.52 mmol)
MS: m/z 377.35 = [M+Na]+, (이론치 = 377.14).
N-Fmoc-N-Me-Asp(OtBu)-OH(225 ㎎, 0.529 mmol)를 DMF(3 mL)에 용해시키고, 7a(300 ㎎, 0.847 mmol), HATU(201 ㎎, 0.529 mmol) 및 콜리딘(0.48 mL, 3.70 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반하여 7b를 생성시켰다. fmoc 탈보호를 위해, 피페리딘(0.22 mL, 2.16 mmol)을 첨가하고, 교반을 1시간 동안 지속하였다. 아세트산(1 mL)을 첨가하고, 7c를 RP-HPLC로 정제하였다.
수율: 285 ㎎ (TFA 염으로서 0.436 mmol)
MS: m/z 562.54 = [M+Na]+, (이론치 = 562.67).
6-트리틸메르캅토헥산산(0.847 g, 2.17 mmol)을 무수 DMF(7 mL)에 용해시켰다. HATU(0.825 g, 2.17 mmol), 및 콜리딘(0.8 mL, 6.1 mmol) 및 7c(0.78 g, 1.44 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 60분 동안 교반하고, AcOH(1 mL)로 산성화시키고, RP-HPLC로 정제하였다. 생성물 분획을 포화 수성 NaHCO3로 중화시키고, 농축시켰다. 잔여 수성상을 DCM으로 추출하고, 용매의 증발시 7d를 단리시켰다.
수율: 1.4 g (94%)
MS: m/z 934.7 = [M+Na]+, (이론치 = 934.5).
MeOH(12 mL) 및 H2O(2 mL) 중 7d(1.40 ㎎, 1.53 mmol)의 용액에 LiOH(250 ㎎, 10.4 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 70℃에서 14시간 동안 교반하였다. 혼합물을 AcOH(0.8 mL)로 산성화시키고, 7e를 RP-HPLC로 정제하였다. 생성물 분획을 포화 수성 NaHCO3로 중화시키고, 농축시켰다. 수성상을 DCM으로 추출하고, 용매의 증발시 7e를 단리시켰다.
수율: 780　mg (60 %)
MS: m/z 878.8 = [M+Na]+, (이론치 = 878.40).
무수 DCM(4 mL) 중 7e(170 ㎎, 0.198 mmol)의 용액에 DCC(123 ㎎, 0.59 mmol) 및 N-하이드록시-숙신이미드(114 ㎎, 0.99 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 0.5 mL의 AcOH로 산성화시키고, 7f를 RP-HPLC로 정제하였다. 생성물 분획을 포화 수성 NaHCO3로 중화시키고, 농축시켰다. 잔여 수성상을 DCM으로 추출하고, 용매의 증발시 7f를 단리시켰다.
수율: 154 ㎎ (0.161 mmol)
MS: m/z 953.4 = [M+H]+, (이론치 = 953.43).
실시예 5
링커 시약 8e의 합성
링커 시약 8e를 하기 반응식에 따라 합성하였다:
Figure pct00058
링커 시약 중간체 8b의 합성을 질소 분위기 하에서 수행하였다. 30 mL의 THF(건조, 분자 체) 중 아민 8a(1.69 g, 4.5 mmol, 제조를 위해 국제 공개 제WO-A 2009/133137호 참조)의 용액을 0℃까지 냉각시켰다. DIPEA(980 ㎕, 5.63 mmol) 및 3 mL의 THF(건조, 분자 체) 중 부틸 클로로포르메이트(630 ㎕, 4.95 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반하고, 냉각을 제거하고, 혼합물을 실온에서 추가 20분 동안 교반하였다. THF 중 1 M LiAlH4(9 mL, 9 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 1.5시간 동안 환류시켰다. 메탄올(11 mL) 및 100 mL 포화 Na/K 타르트레이트 용액을 천천히 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기층을 Na2SO4에서 건조시키고, 용매를 감압 하에서 증발시켰다. 조 생성물 8b(1.97 g)를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
MS: m/z 390.2 = [M+H]+ (MW의 이론치 = 389.6).
120 mL의 아세토니트릴 중 조 생성물 8b(1.97 g), N-(브로모에틸)-프탈이미드(1.43 g, 5.63 mmol) 및 K2CO3(1.24 g, 9.0 mmol)의 용액을 6시간 동안 환류시켰다. 60 mL의 포화 NaHCO3 용액을 첨가하고, 혼합물을 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 조합된 유기물을 건조시키고(Na2SO4), 용매를 감압 하에서 제거하였다. 프탈이미드 8c를 용출제로서 헵탄(0.02% NEt3를 함유함) 및 증가하는 양의 에틸 아세테이트(0.02% NEt3를 함유함)를 이용하여 실리카 상에서 정제하였다.
수율: 0.82 g (1.46 mmol)
MS: m/z 563.3 = [M+H]+ (MW의 이론치 = 562.8).
프탈이미드 8c(819 ㎎ 1.46 mmol)를 35 mL의 에탄올에 용해시키고, 하이드라진 수화물(176 ㎕, 3,64 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 환류시켰다. 침전물을 여과 제거하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔여물을 15 mL 디클로로메탄으로 처리하였다. 침전물을 여과 제거하고, 디클로로메탄을 감압 하에서 제거하였다. 잔여물을 RP HPLC로 정제하였다. 풀링된 HPLC 분획을 NaHCO3를 첨가하여 pH 7까지 조정하고, 디클로로메탄으로 수 회 추출하였다. 조합된 유기물을 건조시키고고(Na2SO4), 용매를 감압 하에서 제거하여, 아민 8d를 생성시켰다.
수율: 579 ㎎ (1.34 mmol)
MS: m/z 433.3 = [M+H]+ (MW의 이론치 = 432.7).
파라-니트로페닐 클로로포르메이트(483 ㎎, 2.40 mmol)를 10 mL의 디클로로메탄(건조, 분자 체)에 용해시켰다. 5 mL의 디클로로메탄(건조, 분자 체) 및 1.8 mL의 sym-콜리딘 중 아민 8d(1.00 g, 2.31 mmol)의 용액을 첨가하고, 혼합물을 40분 동안 실온에서 교반하였다. 디클로로메탄을 감압 하에서 제거하고, 잔여물을 아세트산으로 산성화시키고, RP-HPLC로 정제하여, 파라-니트로페닐 카바메이트 8e를 생성시켰다.
수율: 339 ㎎ (0.57 mmol)
MS: m/z 598.3 = [M+H]+ (MW의 이론치 = 597.8).
실시예 6
GLP-1 수용체 및 글루카곤 수용체 효능에 대한 시험관 내 세포 분석법
서열 번호 5 및 6의 펩티드 화합물을 국제 공개 제2014056호에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 인간 글루카곤 수용체(h글루카곤 R) 또는 인간 GLP-1 수용체(hGLP-1 R)를 발현하는 세포를 노출시키는 상기에 설명된 방법에 의해 GLP-1 및 글루카곤 수용체에서의 펩티드 화합물의 효력을 결정하였다.
그 결과를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
GLP-1 및 글루카곤 수용체에서의 엑센딘-4 유도체의 EC50 값 (pM으로 표시됨)
Figure pct00059
하이알루론산 하이드로겔의 합성
실시예 7
디비닐 술폰 가교결합 하이알루론산
실시예 7a
0.2 M 수산화나트륨(168.9 g)에 용해될 때까지 교반하면서 염화나트륨(23.4 g)을 첨가하였다. 빠른 기계적 교반 하에 상기 용액에 나트륨 하이알루로네이트(25.4 g, 400 내지 500 KDa)를 첨가하였고, 이는 2시간 동안 지속되었다. 생성된 중합체 용액은 대략 12%(w/w)의 농도를 갖는다. 이소프로판올(1.6 mL) 중 디비닐술폰(0.41 mL, 0.48 g)의 용액을 제조하고, 약 30초에 걸쳐 첨가(5 x 0.4 mL)하였다. 혼합물을 추가 2분 동안 교반하고, 23x28x6.5 ㎝ 유리 트레이에 붓고, 플라스틱 커버로 밀봉하였다. 4시간 동안 실온에서 정치 후, 겔을 0.9% 염수(3 ㎏) 중 1 M 염산(100.1 g)의 용액에 단일 조각으로 옮겼다. 이를 실온에서 온화하게 교반하였다. 24시간 후, 용액의 pH는 2.28이었다. 용액을 폐기하여 겔(416.2 g)을 남겼다. 이후, 겔에 0.9% 염수(3 ㎏)를 첨가하고, 이를 18시간 동안 실온에서 온화하게 교반하였다. 상기 혼합물에 0, 2, 4, 6 및 8시간째에 1 M 수산화나트륨(9.7 mL)을 첨가하였다. 겔을 실온에서 추가 24시간 동안 온화하게 교반하였고, 이때 겔의 pH는 6.65였다. 겔을 120시간 동안 2 내지 8℃에서 보관한 후, 10 mM 인산나트륨 용액 pH 7.4(2 L)을 첨가하였다. 겔을 추가 21시간 동안 교반하고, 세척액을 폐기하여, 2.4%의 최종 중합체 농도를 갖는 겔(1036.2 g)을 남겼다.
실시예 7b
디비닐술폰 가교결합 하이알루론산의 대안적인 합성
35 g의 나트륨 하이알루로네이트에 946 mL의 살균수를 첨가하였다. 반응 혼합물을 7일 동안 2 내지 8℃에서 유지시켰고, 그 동안 투명한 용액이 형성되었다. 이러한 용액에 1 M 111 mL의 1.0 M 수산화나트륨 용액을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 5분 동안 격렬하게 교반하였다. 반응 혼합물을 90분 동안 2 내지 8℃에서 유지시켰다. 이후, 10 mL의 살균수 중 6.7 mL의 디비닐술폰의 현탁액을 중합체 용액에 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 5분 동안 격렬하게 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 2 내지 8℃에서 150분 동안 보관한 후, 25℃에서 90분 동안 보관하였다. 이에 따라 형성된 중합체 겔을 4일 동안 0.9% 살균 염수로 세척하였다. 현탁액의 pH를 1.)M NaOH 또는 1.0 M HCl을 이용하여 7.0까지 조정하였다. 겔 현탁액의 최종 농도는 0.58%였다.
실시예 8
1-(3급-부톡시카보닐) 아미노 3-(3-말레이미도프로필) 아미노프로판의 합성.
Figure pct00060
250 ml 둥근 바닥 플라스크에 3.0 g의 1-(3급-부톡시카보닐) 아미노 3-아미노프로판) 및 100 mL의 무수 클로로포름을 취하였다. 반응 혼합물을 투명한 용액이 형성될 때까지 25℃에서 교반하였다. 이러한 용액에 용해될 때까지 교반하면서 N-숙신이미딜 3-말레이미도프로피오네이트(5.05 g)를 첨가한 후, 3.42 mL의 디이소프로필에틸아민을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 18시간 동안 25℃에서 교반하였다. 용액을 1 M 염산(50 mL), 10% 염수(50 mL), 포화 중탄산나트륨(50 mL), 반-포화 염수(50 mL)로 세척하였다. 유기상을 단리하고, 무수 황산나트륨에서 건조시켰다. 여과에 의해 황산나트륨을 제거한 후, 용액을 감압 하에서 농축시키고, 잔여물을 이동상으로서 에틸 아세테이트:헥산 구배를 이용한 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 감압 하에서의 용매의 제거 후 진공 건조하여 황백색(off white) 고체로서 원하는 생성물(4.03 g)을 제공하였다.
실시예 9
1-아미노 3-(3-말레이미도프로필) 아미노프로판 메틸 술포네이트의 합성.
Figure pct00061
0.25 mol (80g)의 1-(3급-부톡시카보닐) 아미노 3-아미노프로판)을 400 mL 아세톤에 용해시켰다. 35℃에서 가스 형성이 끝날 때까지 (1.5시간) 35 mL (2.19 당량)의 메탄술폰산을 적가하였다.
실온까지 냉각시킨 후, 생성물을 아세톤 (3 x 50 mL)으로 세척하고, 40℃ 및 20 mbar에서 건조시켰다.
조 생성물을 56℃에서 1시간 동안 200 mL 아세톤으로 처리함으로써 정제하였다. 40℃에서의 여과 후, 생성물을 아세톤 (3 x 50 mL)으로 세척하고, 40℃ 및 20 mbar에서 건조시켰다 (수율: 76.2 g의 불그스름한 고체, 96%)
실시예 10
3-(3-말레이미도-프로필) 아미노프로판 관능화 HA 하이드로겔의 합성을 위한 일반 방법
적절한 양의 디비닐술폰 가교결합 HA 현탁액 (실시예 7b)에 살균 염수를 첨가하여 약 1%(w/v)의 겔 농도를 수득하였다. 생성된 현탁액을 15 내지 30분 동안 25℃에서 교반하였다. 수 혼화성 유기 용매(바람직하게는, 에탄올)를 현탁액에 첨가하고, 생성된 현탁액을 추가 30 내지 60분 동안 교반하였다. 이러한 현탁액에 적절한 양의 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸-모르폴리늄 클로라이드(DMT-MM)의 에탄올성 용액을 첨가하였다. DMT-MM 용액을 함유하는 용기를 에탄올로 2회 헹구고, 세척액을 상기 현탁액에 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 90분 동안 25℃에서 교반하였다. 적절한 양의 1-(3급-부톡시카보닐) 아미노 3-(3-말레이미도프로필) 아미노프로판을 디클로로메탄에 용해시켰다. 이러한 용액에 트리플루오로아세트산을 첨가하여 1:1(v/v) 용액을 생성시켰다. 60 내지 90분 동안 실온에서 교반한 후, 반응 혼합물을 감압 하에서 증발 건조시켰다. 잔여물을 에탄올에 용해시키고, 상기 현탁액에 첨가하였다. 말레이미드 유도체를 함유하는 용기를 에탄올로 2회 헹구고, 세척액을 현탁액에 첨가하였다. 현탁액의 pH를 유기 또는 무기 염기(예를 들어, 에탄올 중 10% N-메틸모르폴린)를 이용하여 pH 6.4 내지 6.6까지 조정하였다. 25℃에서 16 내지 20시간 동안 교반한 후, 상기 현탁액을 60 내지 65%(v/v)의 부피까지 에탄올로 처리하였다. 120G에서의 원심분리 후 상청액을 경사시키거나, 시스템에 약간 과압의 N2 가스를 적용하고, 유리 프릿 또는 필터 막을 통해 여과함으로써 반응 혼합물로부터 용매를 제거하였다. 잔여물을 이후 약 15 내지 20분 동안 pH 3.8에서 살균 20 mM 숙시네이트 염수(0.9%)로 처리하고, 에탄올을 60 내지 65%(v/v)의 부피까지 첨가함으로써 침전시켰다. 용매를 상기 절차에 따라 반응 혼합물로부터 제거하였다. 상기 절차를 1회 더 반복하였다.
실시예 11
말레이미드 관능화 HA 하이드로겔에 대한 링커 티올 펩티드의 콘쥬게이션
말레이미드 관능화 HA 하이드로겔에 대한 티올 말단화 추적-링커 함유 펩티드에 대한 일반 절차.
중간 다공도 프릿 또는 필터를 갖춘 살균되고 발열원 제거된 반응기에 적절한 양의 말레이미드 변형된 HA 하이드로겔(실시예 10)을 취하였다. 이후, 적절한 양의 살균 여과된 20 mMol SB 완충액(15%(v/v) 프로필렌 글리콜 및 0.01%(w/v) 트윈(Tween) 20 함유, pH 3.8)을, 생성되는 현탁액의 농도가 약 1%(w/w)가 되도록 반응물에 첨가하였다. 현탁액을 온화한 진탕을 이용하여 30 내지 90분 동안 혼합하였다. 상기 시간 종료시, 적절한 양의 살균 여과된 20 mMol SB 완충액(15%(v/v) 프로필렌 글리콜 및 0.01%(w/v) 트윈 20 함유, pH 3.8)에 용해된 티올 말단화 추적-링커 함유 펩티드를 반응기에 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 1.5 내지 24시간 동안 주위 온도에서 온화하게 진탕하였다. 반응 종료시, 상청액을 약간 과압의 질소를 이용한 여과 또는 현탁액의 원심분리에 의해 제거하였다. 잔여물을 살균 여과된 20 mM SBS 완충액(15%(v/v) 프로필렌 글리콜 및 0.01%(w/v) 트윈 20 함유, pH 3.0)으로 처리하여 현탁액 0.7%(w/v)를 제조하고, 3분 동안 진탕하고, 원심분리하고, 상청액을 경사에 의해 제거하였다. 이러한 과정을 5회 반복하였다. 잔여물을 살균 여과된 20 mM SBS 완충액(15%(v/v) 프로필렌 글리콜 및 0.01%(w/v) 트윈 20 함유, pH 3.0)에 용해된 1-하이드록시-2-메르캅토에탄의 10 mM 용액으로 처리하여, 약 1 중량% 현탁액을 제조하고, 온화한 진탕/혼합을 이용하여 30분 동안 온화하게 교반하였다. 용매를 원심분리, 이어서 경사(상기에 언급된 바와 같음)에 의해 제거하였다. 1-하이드록시-2-메르캅토에탄 처리의 상기 과정을 4회 반복하였다. 잔여물을 살균 여과된 20 mM SBS 완충액(15%(v/v) 프로필렌 글리콜 및 0.01%(w/v) 트윈 20 함유, pH 3.0)에 현탁시켜, 약 0.5 중량% 농도의 현탁액을 제조하고, 3분 동안 혼합한 후, 원심분리 및 경사에 의해 제거하였다. 생성된 잔여물을 20 mM SBS 완충액(15%(v/v) 프로필렌 글리콜 및 0.01%(w/v) 트윈 20 함유, pH 6.5)에 현탁시켜, 0.7 중량% 현탁액을 제조하고, 20분 동안 교반하고, 여과하였다. 상기 과정을 1회 더 반복한 후, 잔여물을 20 mM SBS 완충액(15%(v/v) 프로필렌 글리콜 및 0.01%(w/v) 트윈 20 함유, pH 4.5)에 취하여, 0.5 중량% 현탁액을 제조하고, 15분 동안 교반하고, 여과하였다. 이러한 과정을 1회 반복하였다. 잔여물을 살균수(pH 4.5)에 현탁시키고, 5분 동안 교반하고, 여과하였다. 상기 과정을 5회 반복하였다. 잔여물을 살균 막 필터를 이용하여 무균 여과하고, 동결건조하여 건조하였다.
실시예 12.
HA-Aib-링커-서열 번호 5의 펩티드의 콘쥬게이트의 대안적인 합성
40 g의 디비닐 술폰 가교결합 Ha 하이드로겔 현탁액 (0.92 g의 건조 질량 (0.00229 mol))에 물 중 0.9% NaCl의 용액 100 ml를 첨가하고, 생성된 현탁액을 25℃에서 10분 동안 교반시키고, 20 ml의 0.9 % NaCl과 함께 반응기 내로 옮겼다. 이 중 70 mL를 여과 제거하였다.
50 ml의 에탄올을 현탁액에 첨가한 후, 이를 추가 30분 동안 교반하였다. 이후, 15 ml의 에탄올 중 0.63 g (0.00229 mol, 1 당량)의 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸-모르폴리늄 (DMT-MM) 클로라이드의 용액을 첨가하고, 1시간 30분 동안 교반시켰다.
이후 5 mL 0.9% NaCl 중 0.15 g (0.00046 mol, 0.2 당량)의 1-아미노 3-(3-말레이미도프로필) 아미노프로판-메틸 술포네이트의 용액을 첨가하였다. 10 mL의 에탄올을 첨가하고, 에탄올 중 10% N-메틸모르폴린을 이용하여 pH를 6 내지 6.5까지 조정하고, 하룻밤 교반시켰다.
상기 현탁액을 여과 제거하고, 완충액(pH 3.8) 중 70% 에탄올 50 mL를 이용하여 2회 세척하였다. 그 후, 완충액(pH 3.8) 중 50% 에탄올 50 mL, 그 후 완충액(pH 3.8) 중 20% 에탄올 50 mL, 그 후 완충액(pH 3.8)(20 mM 락트산, 0.9% NaCl, 0.01% 트윈 20, NaOH로 pH를 조정함) 50 mL로 세척하였다. 그 후 50 mL의 완충액(pH 3.8)을 첨가하였다.
15 mL의 완충액(pH 3.8)(20 mM 락트산, 0.9% NaCl, 0.01% 트윈 20, NaOH로 pH를 조정함) 중 108 mg (0.01 당량, 0.02 mmol)의 Aib-링커-펩티드 콘쥬게이트(서열 번호 5를 가짐)(실시예 1)의 용액을 반응기에 첨가하였다. 상기 콘쥬게이트 용액을 포함하는 플라스크를 5 mL의 완충액(pH 3.8)으로 2회 헹구고, 반응기에 첨가하였다. 상기 현탁액을 하룻밤 교반하였다.
반응기 내의 상기 현탁액을 여과 제거하고, 50 mL의 완충액(pH 3.8)으로 5회 세척하였다.
잔여물을 살균 여과된 20 mM SBS 완충액(15%(v/v) 프로필렌 글리콜 및 0.01%(w/v) 트윈 20 함유, pH 3.8)에 용해된 1-하이드록시-2-메르캅토에탄의 10 mM 용액 50 mL로 처리하고, 1 동안 교반시켰다. 그 후, 살균 여과된 20 mM SBS 완충액(15%(v/v) 프로필렌 글리콜 및 0.01%(w/v) 트윈 20을 함유함, pH 3.8) 중 0.2 M 락트산 50 mL를 첨가하고, 25분 동안 교반시켰다. 여과 후, 잔여물을 50 mL의 0.9% NaCl (pH 4.5) (0.1 N HCl)로 5회 세척하였다.
잔여물을 70 mL의 완충액(pH 4.5)(0.1 N HCl)을 이용하여 반응기로부터 꺼내고, 반응기를 20 mL 완충액(pH 4.5)(0.1 N HCl)으로 헹구고, 2개의 분획을 합하고, 냉동 건조시켰다.
펩티드 함량을 1H-NMR로 결정하고, 2개의 배치에 대하여 표 4에 나타냈다.
[표 4]
Figure pct00062
Figure pct00063
실시예 13
가용성 말레이미드 관능화 HA의 합성
100 mL 플라스크에 200 ㎎의 하이알루론산, 나트륨 염(분자량 = 500 kDa) 및 24 ml의 탈이온수를 취하였다. 이를 투명한 용액이 획득될 때까지 교반하였다. 급속 교반 HA 용액에 16 mL의 에탄올, 이어서 (55 mg (0.2mmol)의 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드 (물/에탄올 중) 및 N-메틸모르폴린 (20 μl, 0.2 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물의 반응물을 1시간 동안 교반시켰다. 후속적으로, 1-(2-(2-아미노에톡시)에틸)-1H-피롤-2,5-디온ㆍ트리플루오로아세테이트 염 (60 mg, 0.2 mmol)의 수성 용액을 첨가하고, 생성된 반응 혼합물을 14시간 동안 교반시켰다. 반응물의 pH를 약간 산성이 되도록 조정하였다. 반응 혼합물을 15 ml의 사전 세척 앰버라이트(Amberlite)® CG-120 수지(Na+ 형태)로 처리하고, 생성된 반응 혼합물을 20분 동안 교반시켰다. 수지를 여과 제거하고, 탈이온수로 세척하였다. 조합한 여액을 다시 사전-15 ml의 사전 세척 앰버라이트® CG-120 수지(Na+ 형태)로 다시 처리하였으며, 상기 절차를 따랐다. 앰버라이트® 수지 처리를 1회 더 반복하였다. 여액을 물로 희석시켜, 20% 미만의 에탄올을 함유하는 수성 용액을 형성시켰다. 상기 용액을 4개의 PALL 마크로셉(Macrosep)® 원심분리 디바이스(30 kDa의 분자량 컷오프)를 이용하여 5000 rpm의 속도에서 15분 동안 스핀-여과하였다. 막은 그 위에 주걱으로 온화하게 문지르고(stroking), 밀봉된 디바이스를 격렬하게 흔들어서 매번 깨끗하게 하였다. 체류물(retentate)을 탈이온수(>200 ml)로 수 회 세척하였다. 생성된 농축물들을 조합하고, 동결건조시켜 황백색 고체를 생성하였으며, 이때 수율은 50 내지 75%의 범위였다. 말레이미드의 혼입 정도를 1NMR 분광법으로 추정하였더니 대략 20 몰%인 것으로 밝혀졌다.
실시예 14
HA 하이드로겔의 생체 내 체류 시간의 결정
피하 공간에서의 생체 내에서의 하이드로겔의 체류 시간을 CEST(Chemical Exchange Saturation Transfer) 기술과 조합된 자기 공명 영상(MRI)으로 조사하였다(문헌[Zihl et al Magn. Reson Med 2011, 65(4) 927-948]). 하이드로겔 내부의 물 양성자 콘트라스트의 강도를 사용하여 생체 내 하이드로겔 체류 시간을 평가하였다. 이 목적을 위하여, C57B 마우스를 4마리 동물의 2개의 그룹에서 사용하였다. 서열 번호 5의 HA 콘쥬게이션된 펩티드(Aib-링커를 포함함)의 용액(가용성) 또는 현탁액(디비닐 술폰 가교결합 하이드로겔) 중 어느 하나를 동물에게 주사하였다. 투여된 샘플은 1 내지 3 중량%의 원료 의약품 HA 유도체를 함유한다. 하이드로겔을 하기 모든 승인된 동물 관리 프로토콜에 의해 31 G 니들을 이용하여 주사하였다.
마우스는, 하이드로겔 임플란트 후 77일에 걸쳐 72-mm 부피의 코일을 이용하여 7T-브루커(BRUKER) 스캐너에서 적어도 7 내지 9회 연속 영상화하였다. 각각의 시점에서, 지방-억제된 T2W의 영상의 축방향 스택(axial stack)을 스핀-에코 펄스 시퀀스(RARE: TR/TE=3300/33 ms, NEX=2)를 사용하여, 0.17×0.17×1 mm3의 해상도 및 10 내지 15개의 슬라이스를 이용하여 획득하여 전체 하이드로겔 스캐폴드를 포착하였다. 용량 분석을 체셔(Cheshire)(V4.4.5, 파렉셀(PAREXEL), 미국 매사추세츠주 월섬 소재) 및 아미라(AMIRA) V6.0.1(FEI, 미국 오리건주 힐스보로 소재)을 이용하여 수행하여 하이드로겔 부피를 계산하였다. CEST 시퀀스를 하기 파라미터를 이용하여 각각의 그룹으로부터의 동물의 하위-셀렉션(sub-selection)에서 수행하였다: 1-mm의 슬라이스 두께, FOV=4.5×4.5 cm, 매트릭스=128×96, RARE 팩터(factor)=16, TR/TE=3000/33 ms, MT 모듈 B1=10μT/0.3 s (-6 내지 +6 ppm, 0.17 ppm의 스텝(step)). CEST 전에, 국소화 분광 스캔을 B0 시밍(shimming) 및 워터라인(water-line) 폭의 평가를 위하여 하이드로겔 영역 주위에서 실행하였다. z-스펙트럼에서의 비대칭의 정도를 비대칭 플롯(asymmetry plot)(CEST_asym)을 이용하여 평가하였다. 데이터 처리를 ImageJ (NIH, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재) 및 MS Excel을 이용하여 수행하였다. 조직병리학을 연구 종료시에(제90일) 각각의 그룹으로부터의 대표적인 샘플에서 수행하였다.
주사 부위의 MRI 영상화를 1주일 동안 매일 실시하고, 후속적으로, 12주 동안 매주 1회 측정하였다. 한 그룹에서, 디비닐 가교결합 HA 하이드로겔을 주사하였고, 다른 한 그룹에서, 하이드로겔 및 2,500,000 Da 가용성 HA의 1:1(w/w) 혼합물을 함유하는 현탁액을 사용하였다. 가교결합 HA 순수 하이드로겔로 처리된 동물의 경우, 겔은 연구 마지막까지(3개월)보다 더 오랫동안 점진적이지만 느린 강도의 손실이 시간의 함수로서 있음이 명백하였다(도 1b). 다른 한편으로, 가용성 HA를 함유하는 고분자량의 혼합물에 있어서, 이로 처리된 동물의 경우, 제1일에 강했던 MR 신호가 제4일에 유의하게 감소되었다(도 1c). 이러한 관찰은, 장시간 지속성 치료 효과를 제공하도록 중합체 담체의 체류 시간을 향상시키기 위하여, HA 중합체는 그의 가교결합 형태로 제공되어 초고분자량을 달성할 필요가 있음을 시사한다.
도 1a: 고분자량(250만 Da) 히알루로난(HA)의 생체 내에서의 분해 프로파일 및 이의 분해의 동역학적 특성.
임플란트된 HA를 MRI 기술로 모니터링하였다. 표준(상부) 및 CEST(하부) 영상 기술 둘 다에 의해 획득된 대표적인 MRI 영상.
도 1b: 디비닐 술폰 가교결합 히알루로난의 생체 내에서의 분해 프로파일 및 이의 분해의 동역학적 특성. 분해의 동역학적 특성은 1 ppm에서의 피크 크기의 도시에 의해 결정되었다.
도 1c: 고분자량(250만 Da) 히알루로난(HA)의 생체 내에서의 분해 프로파일 및 이의 분해의 동역학적 특성.
분해의 동역학적 특성은 1 ppm에서의 피크 크기의 도시에 의해 결정되었다.
실시예 15
시험관 내에서의 방출 동역학
GLP-1/글루카곤 작용제 Aib-링커 하이드로겔(서열 번호 5의 펩티드를 포함함)(0.5 ㎎의 GLP-1/글루카곤 작용제)의 분취물을 필터 프릿이 장착된 주사기 내로 옮기고, pH 7.4의 인산염 완충액(60 mM, 3 mM EDTA, 0.01% 트윈-20)으로 5회 세척하였다. 하이드로겔을 상기 완충액에 현탁시키고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 규정된 시점(각각 1 내지 7일의 인큐베이션 시간 후)에 상청액을 교환하고, 유리된 GLP-1/글루카곤 작용제를 215 ㎚에서 RP-HPLC에 의해 정량화하였다. 유리된 GLP-1/글루카곤 작용제와 상관 관계가 있는 UV-신호를 적분하고, 인큐베이션 시간에 대해 도시하였다.
방출의 해당 반감기를 추정하기 위해 곡선-피팅 소프트웨어를 적용하였다.
도 3은 서열 번호 5를 갖는 펩티드(Aib-링커를 포함함)의 HA 하이드로겔로부터의 시험관 내 방출 동역학을 나타낸다.
실시예 16
식후, 수컷 당뇨병 db/db 마우스에서의 혈당에 대한 피하 처리 후의 서열 번호 5의 펩티드의 효과
수컷 당뇨병, 비만 BKS.CG-m+/+ Lepr(db)/J 마우스를 찰스 리버(Charles River)에 주문하고, 도착시에 우드 칩 베딩(wood chip bedding)을 이용하여 그룹으로 수용하였다. 연구 시작시에 마우스는 대략 13 내지 14주령이었다.
마우스를 12시간의 명/암 사이클(명기: 06:00 AM 내지 6:00 PM), 23 내지 26℃의 실온 및 30 내지 70%의 상대 습도를 포함하는 동물 사육장의 조건 하에 수용하였다. 모든 동물은 물 및 설치류 유지용 식사(Ssniff R/M-H)에 자유롭게 접근하였다.
투약하기 7일 전 신체 질량 및 HbA1c의 측정을 수행하였다. 그 후 동물을 처리군(n = 8) 및 새로운 케이지에 할당하여 db/db 그룹들 사이에서 평균 HbA1c 및 신체 질량을 매칭하였다. 투약기의 제1일에, 동물을 25 nmol/kg의 서열 번호 5(비-가교결합 HA를 포함함)의 피하 주사(27G 니들)로 1회 처리하였다. 투약을 08:30 AM과 09:30 AM 사이에 착수하여 완료하였다. 적용한 부피는 5 ml/kg이었으며, 용량을 각각의 개체에 대해 기록된 가장 최근의 신체 질량에 대하여 조정하였다.
동물은 실험 동안 물 및 먹이에 무제한 접근하였다. 투약기의 제1일에, 처리 전 및 처리한지 4시간 후에 혈당 농도를 측정하였다. 그 후 혈당 농도를 8:30 AM과 9:30 AM 사이에 매일 평가하였다. 이 목적을 위하여, 대략 2 μL의 혈액을 꼬리로부터 수집하고, 혈당 농도를 핸드헬드(handheld) 디바이스(아큐 첵(Accu Chek))를 사용하여 측정하였다.
데이터는 도 4에서 평균±SEM으로 도시되어 있다. 비-가교결합 HA를 포함하는 25 nmol/kg의 서열 번호 5를 이용한 단회 피하 처리에 의해 혈당 농도가 일시적으로 감소하였으며, 동물은 투약 후 대략 제7일에 기준선 농도에 도달하였다.
실시예 17
암컷 식이-유도 비만(DIO) C57BL/6 마우스에서의 혈당, 신체 질량, 전신 지방 함량, 및 먹이 소비량에 대한 피하 처리 후의 효과
암컷 C57BL/6NHsd 마우스를 엔비고 알엠에스 인크.(Envigo RMS Inc.)에서 집단 거주 형태로 주문하였으며, 이는 집단 거주 형태로 선적되었고, 투약전 시기의 제38일까지 우드 칩 베딩이 있는 일회용 슈박스 케이징 내의 선적된 케이지 메이트와 함께 집단 거주 형태로 남아있었다. 연구 시작시에 마우스는 25 내지 26주령이었다.
마우스를 12시간의 명/암 사이클(명기: 오전 4:00 내지 오후 4:00), 21 내지 25℃의 실온 및 30 내지 70%의 상대 습도를 포함하는 동물 사육장의 조건 하에 수용하였다. 모든 동물은 약리학적 개입(투약기) 전 16주 동안 물 및 식사에 자유롭게 접근하였다(DIO: 75-TD97366, 일반: 10-Harlan2014). 먹이를 투약전 시기의 제38일에 마지막 시점까지 및 마지막으로 매주 신선한 먹이로 대체하였다. 후속 투약기 동안, 남아있는 먹이의 일부를 제거하고, 신선한 먹이로 대체하고, 펠렛을 주 1회 고르게 혼합하였다.
투약전 제38일에, 비만 DIO 마우스를 처리군 (n = 8)에 할당하여 모든 DIO 그룹들 사이의 평균 신체 질량을 매칭하였다. 설치류 유지용 식사에 임의로 접근하는 연령-매칭된 그룹을 일반(lean) 대조군으로서 연구에 포함시켰다.
마우스를 제1일에 아침에, 그리고, 제8일, 제15일 및 제22일에 오후 1:00와 오후 3:00 사이에 처리하였으며, 이때 30G 니들을 이용하여 가교결합 하이알루론산 또는 주당 0.88 mg/kg의 서열 번호 5를 피하 주사하였다. 적용된 부피는 동물당 300 μl였으며, 다른 주사 부위를 매주 사용하였다(제1 주사: 좌측 견갑골, 제2 주사: 우측 견갑골, 제3 주사: 좌측 옆구리, 제4 주사: 우측 옆구리).
신체 질량 및 먹이 소비량(하나의 케이지에 수용된 4마리 마우스의 그룹에 대하여 추정함)을 28일의 투약기 내내 매일 01:00 내지 03:00 PM에 측정하였다.
통계적 분석을 위하여, ANOVA(One-Way Analysis of Variance)를 시그마플롯(Sigmaplot) 12.5를 이용하여 수행하였다. 수행 검증력은 알파 = 0.050:0.999였고, DIO-비히클 그룹에 대한 비교를 더넷법(Dunnett's Method)을 이용하여 수행하였다. 일반-비히클 그룹에 대한 데이터를 비-비만 상태에 대한 기준 데이터 세트로서 사용하였다.
서열 번호 5의 제1 용량은 뚜렷하고 지속되는 신체 질량-감소 효과를 야기하였는데, 상기 효과는 제2 용량을 투여할 때 제8일까지 지속되었다. 서열 번호 5의 하기 세 용량은 낮은 신체 질량을 유지한다(도 5a, 좌측 패널). 제28일까지, 그리고 4회의 투약 후, 서열 번호 5-처리된 마우스의 평균 신체 질량은 대략 13.6 g으로서, DIO-비히클 그룹의 평균 신체 질량보다 통계적으로 유의하게 더 낮았다(도 5a, 우측 패널). 제1 용량의 투여 후 신체 질량의 첫 번째의 급격한 감소는 확연한 먹이 소비 억제와 연관된 것이었다. 8일 내에, 서열 번호 5-처리된 마우스는 먹이 소비를 정상화하였으며, 그때부터 계속 DIO-비히클 그룹과 비견되는 값을 나타냈다(도 5b).
실시예 18
암컷 C57BL/6 마우스에서의 약동학적 특성
30마리의 암컷 C57BL/6 마우스를 이 연구에서 사용하였다. 동물은 전체 연구 기간 내내 음식 및 물에 임의로 접근하였다. 동물에게 4.5 mg/kg의 HA-Aib-링커-서열 번호 5의 현탁액을 투약하였다. 혈장 샘플을 2, 8, 24, 48, 72, 144, 192, 240, 312 및 336 h에 취하였다. 샘플을 상기 펩티드에 대하여 분석하였다. 모든 정량적 결과를 LC-MS/MS로 결정하였다. 평균 농도의 계산을 위하여, 정량화의 하한치(lower limit of quantification)(LLOQ = 1 ng/mL(혈장 중)) 미만의 값을 0으로 세팅하였다. 약동학적 파라미터를 비-구획 모델 및 선형 사다리꼴 보간 계산법을 이용하여 WinNonlin 6.4라는 프로그램으로 계산하였다.
도 6: 암컷 C57BL/6 마우스에게 4.5 mg/kg의 HA-Aib-링커-콘쥬게이트를 단회 피하 투여한 후 서열 번호 5의 펩티드의 혈장중 농도 및 약동학적 파라미터.
피하 투여 후, 혈장 중 반감기는 약 7일로 매우 길었다.
실시예 19
암컷 괴팅겐(Goettingen) 미니피그에서의 약동학적 특성
평균 35000 g의 암컷 당뇨병 괴팅겐 미니피그 4 마리를 이 연구에서 이용하였다. 동물은 전체 연구 기간 내내 음식 및 물에 임의로 접근하였다. 동물에게 HA-Aib-링커-서열 번호 5의 16.05% 현탁액 0.623 mg/kg을 투약하였다. 혈장 샘플을 0, 1, 4, 8, 24, 48 h에 취하고 이와 동시에 제3일 내지 제21일에 하루 한 번 취하였다. 샘플을 펩티드에 대하여 분석하였다. 모든 정량적 결과를 LC-MS/MS로 결정하였다. 평균 농도의 계산을 위하여, 정량화의 하한치(LLOQ = 1 ng/mL(혈장 중)) 미만의 값을 0으로 세팅하였다. 약동학적 파라미터를 비-구획 모델 및 선형 사다리꼴 보간 계산법을 이용하여 WinNonlin 6.4라는 프로그램으로 계산하였다. 도 7은 한 번 투여 후 혈장중 농도 값 대 시간을 보여준다.
혈장의 평균 약동학적 파라미터는 다음과 같다:
[표 5]
Figure pct00064
피하 투여 후, 혈장에서의 반감기는 약 139 h로 매우 길었는데, 이것은 5.8일이다.
도 7: 암컷 괴팅겐 미니피그에게 HA-Aib-링커-콘쥬게이트로서 현탁액(16.05%) 내의 0.623 mg/kg의 단회 피하 투여 후 서열 번호 5의 펩티드의 혈장중 농도 및 약동학적 파라미터.
실시예 20
주사가능성 연구
pH 4.5의 20 mM 아세테이트 완충액에서 펩티드 콘쥬게이트의 적절한 양을 분산시킴으로써 20 mg/mL HA-펩티드 콘쥬게이트의 현탁액(1)을 주사기에서 준비하였다. 또다른 주사기에서, 본래의 HA의 20 ㎎/mL 용액(2)은 pH 4.5의 20 mM 아세테이트 완충액에 동결건조된 HA를 용해시킴으로써 제조하였다. 4:1의 비로 커넥터를 통해 (1)을 (2)와 혼합하였으며 생성된 현탁액(3)을 2 내지 8℃에서 하룻밤 보관하였다. (3)을 실온까지 조정하고 그 후 주사가능성 실험을 위해 이용하였다. 1 mL BD 플라스틱 루어-락(Luer-Lock) 주사기에 있어서 27Gx1/2" 또는 29Gx1/2" 니들을 주사기에 연결시켰다. PFS 실험의 경우에는 (3)을 수동으로 주사기 내로 진공-충전시켰다. (3)을 함유한 주사기를 LF 플러스 장비의 주사기 홀더 내로 로딩하였다. 주사 속도는 상이한 주사기에 대하여 1 mL/10초까지 조정하였다. 두 가지 상이한 화합물(HA 콘쥬게이션된 서열 번호 5, Aib 링커)에 대한 결과를 표 6에 나타낸다.
[표 6]
Figure pct00065
실시예 21
식후, 수컷 당뇨병 db/db 마우스에서의 혈당에 대한 피하 처리 후의 서열 번호 5의 펩티드의 효과 - 서열 번호 5의 순수 펩티드와 서열 번호 5의 가교결합된 HA 콘쥬게이트 (배치 C)의 비교
수컷 당뇨병, 비만 BKS.CG-m+/+ Lepr(db)/J 마우스를 찰스 리버(Charles River)에 주문하고, 도착시에 우드 칩 베딩을 이용하여 그룹으로 수용하였다. 연구 시작시에 마우스는 대략 13 내지 14주령이었다.
마우스를 12시간의 명/암 사이클(명기: 06:00 AM 내지 6:00 PM), 23 내지 26℃의 실온 및 30 내지 70%의 상대 습도를 포함하는 동물 사육장의 조건 하에 수용하였다. 모든 동물은 물 및 설치류 유지용 식사(Ssniff R/M-H)에 자유롭게 접근하였다.
투약하기 7일 전 신체 질량 및 HbA1c의 측정을 수행하였다. 그 후 동물을 처리군(n = 8) 및 새로운 케이지에 할당하여 db/db 그룹들 사이에서 평균 HbA1c 및 신체 질량을 매칭하였다.
투약 간격은 다음과 같았다:
서열 번호 5의 펩티드: 투약기의 제0일에, 동물을 1.7 nmol/kg의 피하 주사(27G 니들)로 처리하였다. 투약을 08:30 AM과 09:30 AM 사이에 착수하여 완료하고, 제13일까지 매일 반복하였다.
서열 번호 5의 가교결합된 HA 콘쥬게이트: 투약기의 제0일에, 동물을 50 nmol/kg의 피하 주사(27G 니들)로 1회 처리하였다.
동물은 실험 동안 물 및 먹이에 무제한 접근하였다. 투약기의 제1일에, 처리 전 및 처리한지 4시간 후에 혈당 농도를 측정하였다. 그 후 혈당 농도를 8:30 AM과 9:30 AM 사이에 매일 평가하였다. 이 목적을 위하여, 대략 2 μL의 혈액을 꼬리로부터 수집하고, 혈당 농도를 핸드헬드 디바이스(아큐 첵)를 사용하여 측정하였다.
데이터는 도 8에서 평균±SEM으로 도시되어 있다.
50 nmol/kg의 서열 번호 5의 가교결합된 HA 콘쥬게이트를 이용한 단회 피하 처리는 8일보다 오랫동안 혈당 농도를 강하게 감소시켰으며 그 후에는 상기 농도가 상승한다.
1.7 nmol/kg의 서열 번호 5의 순수 펩티드를 이용한 일일 1회 피하 처리는 동물에게 투약하는 한 제13일까지 혈당 농도를 강하게 감소시켰다.
상기 둘 다의 처리에 있어서의 혈당 강하 수준들은 8일보다 더 오랫동안 비견될 만하다.
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> CONJUGATES COMPRISING AN GLP-1/GLUCAGON DUAL AGONIST, A LINKER AND HYALURONIC ACID <130> DE2016-075 WOPCT <150> EP 16306613.7 <151> 2016-12-02 <160> 223 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Heloderma suspectum <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser is modified with an NH2 group <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Arg is modified with an NH2 group <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Thr is modified with an OH group <400> 3 His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser 1 5 10 15 Arg Arg Ala Gln Asp Val Gln Trp Leu Met Asn Thr 20 25 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> liraglutide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys derivatized at N6 with (S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyryl <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4-analogue <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is a D-Ser <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-carboxy-4-hexadecanoylamino-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser is modified with an NH2 group <400> 5 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Glu Ser 1 5 10 15 Lys Ala Ala Gln Asp Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 6 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exendin-4-analogue <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Xaa is a D-Ser <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Lys is functionalized at the amino side chain group as Lys((S)-4-carboxy-4-octadecanoylamino-butyryl) <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser is modified with an NH2 group <400> 6 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Lys Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35

Claims (37)

  1. 단량체형 이당류 단위(monomeric disaccharide units)의 0.001 내지 20 mol%가 가교결합제에 의해 가교결합되고;
    단량체형 이당류 단위의 0.2 내지 20 mol%가 -L1-L2 -L-Y-R20 그룹을 갖는, 가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트(conjugate), 또는 이의 염 또는 용매화물:
    여기서,
    L1은, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O-, NH(R5aa) 및 C(O)N(R5aa)로부터 선택되는 그룹으로 대체되고 OH 및 C(O)N(R5aaR5aaa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 임의로 치환되는 C1 -20 알킬 쇄이고, 여기서 R5aa 및 R5aaa는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    L1은 상기 하이알루론산의 베타-1,3-D-글루쿠론산의 카복시 그룹과 아미드 결합을 형성하는 말단 아미노 그룹을 통하여 상기 하이드로겔에 부착되고;
    L2는 단일 화학 결합이거나, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O- 및 C(O)N(R3aa)로부터 선택되는 그룹으로 대체되고, OH 및 C(O)N(R3aaR3aaa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 임의로 치환되는 C1-20 알킬 쇄이고, 여기서 R3aa 및 R3aaa는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    L2는
    Figure pct00066

    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, L2는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착되고;
    L은 하기 화학식 Ia의 링커(linker)이고:
    [화학식 Ia]
    Figure pct00067

    상기 화학식 Ia에서,
    점선은 아미드 결합을 형성함에 의한 Y의 N-말단에의 부착을 나타내고;
    X는 C(R4R4a) 또는 N(R4)이고;
    R1, R1a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    R2, R2a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    R4, R4a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    여기서, R2, R2a, R4 또는 R4a 중 하나는 L2에 부착된다;
    Y는 하기 화학식 Ib를 갖는 펩티드 모이어티이거나:
    [화학식 Ib]
    His- D-Ser -Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Glu-Ser-Lys-Ala-Ala-Gln-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
    상기 화학식 Ib에서,
    X14는 Lys을 나타내고, -NH2 측쇄 그룹은 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴로 관능화(functionalize)된다;
    Y는 하기 화학식 Ic를 갖는 펩티드 모이어티이고:
    [화학식 Ic]
    His- dSer-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Asp-Glu-Gln-Leu-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
    상기 화학식 Ic에서,
    X14는 Lys을 나타내고, -NH2 측쇄 그룹은 (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴로 관능화된다;
    R20은 OH 또는 NH2이다.
  2. 제1항에 있어서,
    단량체형 이당류 단위의 0.001 내지 20 mol%가 가교결합제에 의해 가교결합되고;
    단량체형 이당류 단위의 0.2 내지 20 mol%가 -L1-L2 -L-Y-R20 그룹을 갖고;
    가교결합된 하이알루론산 하이드로겔의 단량체형 이당류 단위의 0.2 내지 30 mol%가 -L1-Z-OH 그룹을 갖는, 가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트, 또는 이의 염 또는 용매화물:
    여기서,
    L1은, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O-, NH(R5aa) 및 C(O)N(R5aa)로부터 선택되는 그룹으로 대체되고 OH 및 C(O)N(R5aaR5aaa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 임의로 치환되는 C1 -20 알킬 쇄이고, 여기서 R5aa 및 R5aaa는 H 및 C1 -4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    L1은 상기 하이알루론산의 베타-1,3-D-글루쿠론산의 카복시 그룹과 아미드 결합을 형성하는 말단 아미노 그룹을 통하여 상기 하이드로겔에 부착되고;
    L2는 단일 화학 결합이거나, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O- 및 C(O)N(R3aa)로부터 선택되는 그룹으로 대체되고, OH 및 C(O)N(R3aaR3aaa)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 그룹으로 임의로 치환되는 C1-20 알킬 쇄이고, 여기서 R3aa 및 R3aaa는 H 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    L2는
    Figure pct00068

    Figure pct00069

    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, L2는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착되고;
    Z는, 임의로 하나 이상의 탄소 원자가 -O- 및 C(O)N(R6aa)로부터 선택되는 그룹으로 대체된 C1-16 알킬 쇄이고, 여기서, R6aa는 수소 또는 C1-4 알킬이거나;
    Z는
    Figure pct00070
    이고;
    Z는
    Figure pct00071

    Figure pct00072

    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, Z는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착되고;
    L은 하기 화학식 Ia의 링커이고:
    [화학식 Ia]
    Figure pct00073

    상기 화학식 Ia에서,
    점선은 아미드 결합을 형성함에 의한 Y의 N-말단에의 부착을 나타내고;
    X는 C(R4R4a) 또는 N(R4)이고;
    R1, R1a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    R2, R2a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    R4, R4a는 H; 및 C1-4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    여기서, R2, R2a, R4 또는 R4a 중 하나는 L2에 부착된다;
    Y는 하기 화학식 Ib를 갖는 펩티드 모이어티이거나:
    [화학식 Ib]
    His- D-Ser -Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Glu-Ser-Lys-Ala-Ala-Gln-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
    상기 화학식 Ib에서,
    X14는 Lys을 나타내고, -NH2 측쇄 그룹은 (S)-4-카복시-4-헥사데카노일아미노-부티릴로 관능화된다;
    Y는 하기 화학식 Ic를 갖는 펩티드 모이어티이고:
    [화학식 Ic]
    His- dSer-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-X14-Asp-Glu-Gln-Leu-Ala-Lys-Asp-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser
    상기 화학식 Ic에서,
    X14는 Lys을 나타내고, -NH2 측쇄 그룹은 (S)-4-카복시-4-옥타데카노일아미노-부티릴로 관능화된다;
    R20은 OH 또는 NH2이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    -L1-L2-L-이 하기 화학식 IIa의 링커 모이어티인 콘쥬게이트, 또는 이의 염 또는 용매화물:
    [화학식 IIa]
    Figure pct00074

    상기 화학식 IIa에서,
    점선은 아미드 결합의 형성에 의한 Y에의 부착을 나타내고;
    R1은 CH3이고;
    R1a는 CH3이고;
    R2a는 H이고; 여기서, -L1-L2는 제1항 또는 제2항에서와 같이 정의된다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    L2가, 임의로 하나의 탄소 원자가 -O- 및 C(O)N(R3aa)로부터 선택되는 그룹으로 대체된 C1 -6 알킬 쇄이고, 여기서 R3aa는 H 및 C1 -4 알킬로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;
    L2가
    Figure pct00075

    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, L2는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착되는, 콘쥬게이트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 가교결합제가 디비닐술폰인, 콘쥬게이트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    Z가 -CH2-CH2-이거나;
    Z가
    Figure pct00076
    이고;
    Z가
    Figure pct00077

    로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 말단 그룹을 통하여 L1에 부착되고, 여기서, Z는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착되는, 콘쥬게이트.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    Z가 -CH2-CH2-이고;
    Z가 말단 그룹
    Figure pct00078

    를 통하여 L1에 부착되고, 여기서, Z는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착되는, 콘쥬게이트.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    -L1-L2-L-Y가 하기 화학식 IIIb의 모이어티인, 콘쥬게이트:
    [화학식 IIIb]
    Figure pct00079
    .
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    -L1-L2-L-Y가 하기 화학식 IIIa의 모이어티인, 콘쥬게이트:
    [화학식 IIIa]
    Figure pct00080
    .
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    -L1-L2-L-Y가 하기 화학식 IIIc의 모이어티인, 콘쥬게이트:
    [화학식 IIIc]
    Figure pct00081
    .
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    Y가 서열 번호 5의 서열로부터 선택되는 GLP-1/글루카곤 작용제인, 콘쥬게이트.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    Y가 서열 번호 6의 서열로부터 선택되는 GLP-1/글루카곤 작용제인, 콘쥬게이트.
  13. 제1항에 있어서,
    단량체형 이당류 단위의 0.001 내지 20 mol%가 디비닐술폰에 의해 가교결합되고;
    단량체형 이당류 단위의 0.5 내지 5 mol%가 -L1-L2 -L-Y-R20 그룹을 갖고, 상기 -L1-L2 -L-Y 그룹이 하기 화학식 IIIb로 표시되는 구조를 갖고:
    [화학식 IIIb]
    Figure pct00082

    가교결합된 하이알루론산 하이드로겔의 단량체형 이당류 단위의 0.2 내지 30 mol%가 -L1-Z-OH 그룹을 갖는, 가교결합된 하이알루론산 하이드로겔을 포함하는 콘쥬게이트:
    여기서,
    L1은 NH-CH2-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2- 또는 -CH2-CH2-CH2-NH-CO-CH2-CH2-이고;
    L1은 상기 하이알루론산의 베타-1,3-D-글루쿠론산의 카복시 그룹과 아미드 결합을 형성하는 말단 아미노 그룹을 통하여 상기 하이드로겔에 부착되고;
    Z는 -CH2-CH2-이고;
    Z는 말단 그룹
    Figure pct00083

    를 통하여 L1에 부착되고, 여기서, Z는 점선으로 표시된 하나의 위치에 부착되고, L1은 다른 점선으로 표시된 위치에 부착되고;
    Y는 서열 번호 5의 서열을 갖는 펩티드 모이어티이다.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 콘쥬게이트 또는 이의 약제학적 염을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 제14항의 약제학적 조성물 및 점도 조절제의 약제학적 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 점도 조절제가 하이알루론산인, 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 점도 조절제가 5 내지 30%(w/v)의 농도의 하이알루론산인, 약제학적 조성물.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 주사가능한 제형의 형태인 약제학적 조성물.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 0.26 mm 미만의 내경(26 게이지)의 니들을 통한 주사에 의해 투여될 수 있는, 주사가능한 제형의 형태인 약제학적 조성물.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 26 게이지의 니들을 통하여 20 뉴턴 이하의 힘을 적용함으로써 1 mL의 부피가 실온에서 10초 내에 배출될 수 있는, 주사가능한 제형의 형태인 약제학적 조성물.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 현탁액의 형태인 약제학적 조성물.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 콘쥬게이트가 0.5 내지 8%(w/v)의 농도를 갖는, 현탁액의 형태인 약제학적 조성물.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 콘쥬게이트가 1.5 내지 3%(w/v)의 농도를 갖는, 현탁액의 형태인 약제학적 조성물.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콘쥬게이트가 1회 적용으로 6일 이상 동안 치료학적 유효량의 GLP1/글루카곤 작용제를 제공하기에 충분하도록 조성물로 투약(dose)되는, 조성물.
  25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단회 용량(single dose) 조성물인 조성물.
  26. 의약으로서 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 콘쥬게이트 또는 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  27. GLP-1/글루카곤 작용제에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 콘쥬게이트 또는 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  28. 당뇨병을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 콘쥬게이트 또는 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  29. 이상지질혈증(dyslipemia)을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 콘쥬게이트 또는 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  30. 대사 증후군을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 콘쥬게이트 또는 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  31. 비만을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 콘쥬게이트 또는 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  32. 지방간을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 콘쥬게이트 또는 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물.
  33. 하기 화학식 IVa의 중간체 L2*-L-Y:
    [화학식 IVa]
    Figure pct00084

    상기 화학식 IVa에서,
    Y는 서열 번호 5 또는 6의 펩티드이다.
  34. 하기 화학식 IVb의 중간체 L2 *-L-Y:
    [화학식 IVb]
    Figure pct00085

    상기 화학식 IVb에서,
    Y는 서열 번호 5 또는 6의 펩티드이다.
  35. 하기 화학식 IVc의 GLP-1/글루카곤 작용제-링커 콘쥬게이트 중간체 L2 *-L-Y:
    [화학식 IVc]
    Figure pct00086

    상기 화학식 IVc에서,
    Y는 서열 번호 5 또는 6의 펩티드이다.
  36. 26 이상의 니들 게이지를 갖는 튜브를 포함하는 주사 디바이스(injection device)를 통하여 조성물이 피하 투여되고, 상기 조성물이 매주 1회 투여되는 것을 특징으로 하는, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 비만 또는 고혈당의 치료 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 하나 이상의 콘쥬게이트를 포함하는 조성물.
  37. 28 이상의 게이지를 갖는 튜브를 포함하고, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 비만 또는 고혈당의 치료 방법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 콘쥬게이트를 추가로 포함하는 주사 디바이스.
KR1020197018576A 2016-12-02 2017-12-01 Glp-1/글루카곤 이중 작용제, 링커 및 하이알루론산을 포함하는 콘쥬게이트 KR20190091482A (ko)

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