JP2020503278A - Glp−1/グルカゴン二重アゴニスト、リンカーおよびヒアルロン酸を含むコンジュゲート - Google Patents
Glp−1/グルカゴン二重アゴニスト、リンカーおよびヒアルロン酸を含むコンジュゲート Download PDFInfo
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Abstract
Description
エキセンディン−4は、毒腺を有するアメリカドクトカゲ(Heloderma suspectum)の唾液分泌物から単離された39アミノ酸ペプチドである。それは、グルカゴン様ペプチドファミリーのいくつかのメンバーとある程度の配列類似性を有し、グルカゴン様ペプチド−1[7−36]−アミド(GLP−1)が53%の最も高い相同性を有する。エキセンディン−4は、GLP−1受容体に対するアゴニストとして作用し、単離ラット膵島におけるGLP−1様のインスリン分泌促進作用を有する。エキセンディン−4は、高い効力のアゴニストであり、切断型GLP−1アゴニスト−(9−39)−アミドは、インスリン分泌ベータ細胞のグルカゴン様ペプチド1−(7−36)−アミド受容体におけるアンタゴニストである。エキセンディン−4(「エキセナチド」)は、メトホルミンおよび/またはスルホニル尿素を服用しているが、十分な血糖コントロールを達成しなかった2型糖尿病を有する患者における血糖コントロールを改善するために米国およびEUにおいて最近承認された。
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS−NH2として示される。
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR−NH2として示される。
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT−OHに示されている。
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAK((S)−4−カルボキシ−4−ヘキサデカノイルアミノ−ブチリル−)EFIAWLVRGRG−OHとして示される。
Pocaiら(非特許文献3;非特許文献4)およびDayら(非特許文献5)は、例えば、1つの分子におけるGLP−1およびグルカゴンの作用を組み合わせることによる、GLP−1およびグルカゴン受容体の二重活性化が抗糖尿病作用および顕著な体重低下効果を伴う治療原理につながることを記載している。
理想的には、ペプチドは、週1回またはより長い注射頻度が得られる人体への適用の後少なくとも1週間にわたるヒトにおける血漿レベルの持続をもたらす方法で製剤化する。
半減期などのin vivoでの薬物の物理化学的または薬物動態特性を向上させるために、そのような薬物を担体にコンジュゲートすることができる。薬物を担体および/またはリンカーに一時的に結合させる場合、そのようなシステムは、一般的に担体結合プロドラッグと指定される。IUPACにより示されている定義によれば、担体結合プロドラッグは、物理化学的または薬物動態特性の改善をもたらし、通常加水分解による切断によってin vivoで容易に除去することができる所定の活性物質と担体グループとの一時的な結合を含むプロドラッグである。
Dhalら(非特許文献9)は、ヒアルロン酸を薬物コンジュゲート用の適切な担体として報告している。Kongら(非特許文献10)は、マウスにおいて3日間にわたりグルコース低下効果を示したエキセンディン−4−ヒアルロン酸コンジュゲートを報告している。使用されたHAは、薬物担持が約2.4〜12%の範囲の線状ポリマーであった。
本発明のコンジュゲートに適するGLP−1/グルカゴン二重アゴニストペプチドは、酸性および/または生理的pH値、例えば25℃でpH4.5および/またはpH7.4で高い溶解度を有する。また4.5〜5のpH値における化学的安定性は、長時間作用性のプロドラッグ製剤に関する重要な基準である。該プロドラッグは、好ましくは4℃で少なくとも6カ月の貯蔵寿命を得るためにこのpH範囲で製剤化する。
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルは、
単量体二糖単位の0.001〜20mol%が架橋剤により架橋され;
単量体二糖単位の0.2〜20mol%が−L1−L2−L−Y−R20基を有し;
L1は、場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−、NH(R5aa)およびC(O)N(R5aa)から選択される基によって置き換えられ、OHおよびC(O)N(R5aaR5aaa)から独立に選択される1つまたはそれ以上の基により場合により置換されたC1−20アルキル鎖であり、R5aaおよびR5aaaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
L1は、ヒアルロン酸のベータ−1,3−D−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており、
L2は、単一化学結合、または場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−およびC(O)N(R3aa)から選択される基によって置き換えられ、OHおよびC(O)N(R3aaR3aaa)から独立に選択される1つまたはそれ以上の基により場合により置換されたC1−20アルキル鎖であり、R3aaおよびR3aaaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
L2は、以下からなる群から選択される末端基を介してL1に結合しており;
Xは、C(R4R4a)またはN(R4)であり;
R1、R1aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R2、R2aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R4、R4aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R2、R2a、R4またはR4aのうち1つはL2に結合している)であり;
Yは、式(Ib)を有するペプチド部分
His−D−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−X14−Glu−Ser−Lys−Ala−Ala−Gln−Asp−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Ala−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser(Ib)
であり、
X14は、−NH2側鎖基が(S)−4−カルボキシ−4−ヘキサデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたLysを表し;
またはYは、式(Ic)を有するペプチド部分
His−dSer−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−X14−Asp−Glu−Gln−Leu−Ala−Lys−Asp−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Ala−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser(Ic)
であり、
X14は、−NH2側鎖基が(S)−4−カルボキシ−4−オクタデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたLysを表し;
R20は、OHまたはNH2である、
前記コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩である。
−L1−L2−L−は、式(IIa)のリンカー部分であり、
R1、R1a、R2aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
−L1−L2−は、上述のように定義される。
−L1−L2−L−は、式(IIa)のリンカー部分であり、式中、
R1は、CH3であり;
R1aは、Hであり;
R2aは、Hであり;
−L1−L2−は、上述のように定義される。
−L1−L2−L−は、式(IIa)のリンカー部分であり、式中、
R1は、Hであり;
R1aは、CH3であり;
R2aは、Hであり;
−L1−L2−は、上述のように定義される。
−L1−L2−L−は、式(IIa)のリンカー部分であり、式中、
R1は、CH3であり;
R1aは、CH3であり;
R2aは、Hであり;
−L1−L2−は、上述のように定義される。
−L1−L2−L−は、式(IIb)のリンカー部分であり、
R1は、HまたはC1−4アルキルから選択され、好ましくはHであり;
R1aは、HまたはC1−4アルキルから選択され、好ましくはHであり;
R2、R2aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
−L1−L2−は、上述のように定義される。
−L1−L2−L−は、式(IIb)のリンカー部分であり、
R1およびR1aは、Hであり;
R2、R2aは、HおよびCH3からなる群から独立に選択され;
−L1−L2−は、上述のように定義される。
−L1−L2−L−は、式(IIb)のリンカー部分−Lであり、式中、
R1およびR1aは、Hであり;
R2は、Hであり、R2aは、CH3であり;
−L1−L2−は、上述のように定義される。
L2は、場合により1つまたは2つの炭素原子が、−O−およびC(O)N(R3aa)から選択される基によって独立に置き換えられたC1−10アルキル鎖であり、R3aaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
L2は、以下からなる群から選択される末端基を介してL1に結合しており;
L2は、場合により1つの炭素原子が、−O−およびC(O)N(R3aa)から選択される基によって独立に置き換えられたC1−6アルキル鎖であり、R3aaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
L2は、以下からなる群から選択される末端基を介してL1に結合しており;
L2は、−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−C(O)NH−または−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−であり、
以下の末端基を介してL1に結合しており;
L2は、−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−C(O)NH−または−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−であり、
以下の末端基を介してL1に結合しており;
L1は、1つの遠位末端にアミノ基を有し、−O−およびC(O)N(R5aa)から独立に選択される1つまたは2つの基によって場合により中断されているC1−10アルキル鎖であり、R5aaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択される。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルにおいて、単量体二糖単位の0.001〜15mol%が架橋剤により架橋されている、コンジュゲートに関する。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルにおいて、単量体二糖単位の0.1〜5mol%が架橋剤により架橋されている、コンジュゲートに関する。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の0.2〜10mol%が−L1−L2−L−Y−R20基を有する、コンジュゲートに関する。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の0.5〜7mol%が−L1−L2−L−Y−R20基を有する、コンジュゲートに関する。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の0.5〜5mol%が−L1−L2−L−Y−R20基を有する、コンジュゲートに関する。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の1〜3.5mol%が−L1−L2−L−Y−R20基を有する、コンジュゲートに関する。
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルは、
単量体二糖単位の0.001〜20mol%が架橋剤により架橋され;
単量体二糖単位の0.2〜20mol%が−L1−L2−L−Y−R20基を有し;
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の0.2〜30mol%が−L1−Z−OH基を有し;
L1は、場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−、NH(R5aa)およびC(O)N(R5aa)から選択される基によって独立に置き換えられ、OHおよびC(O)N(R5aaR5aaa)から独立に選択される1つまたはそれ以上の基により場合により置換されたC1−20アルキル鎖であり、R5aaおよびR5aaaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
L1は、ヒアルロン酸のベータ−1,3−D−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており、
L2は、単一化学結合、または場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−およびC(O)N(R3aa)から選択される基によって独立に置き換えられ、OHおよびC(O)N(R3aaR3aaa)から独立に選択される1つまたはそれ以上の基により場合により置換されたC1−20アルキル鎖であり、R3aaおよびR3aaaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
L2は、以下からなる群から選択される末端基を介してL1に結合しており;
Zは、場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−およびC(O)N(R6aa)から選択される基によって独立に置き換えられたC1−16アルキル鎖であり、R6aaは、水素またはC1−4アルキルであり;または
Zは、
Xは、C(R4R4a)またはN(R4)であり;
R1、R1aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R2、R2aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R4、R4aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R2、R2a、R4またはR4aのうち1つはL2に結合している)であり;
Yは、式(Ib)を有するペプチド部分
His−D−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−X14−Glu−Ser−Lys−Ala−Ala−Gln−Asp−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Ala−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser(Ib)
であり、
X14は、−NH2側鎖基が(S)−4−カルボキシ−4−ヘキサデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたLysを表し;
またはYは、式(Ic)を有するペプチド部分
His−dSer−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−X14−Asp−Glu−Gln−Leu−Ala−Lys−Asp−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Ala−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser(Ic)
であり、
X14は、−NH2側鎖基が(S)−4−カルボキシ−4−オクタデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたLysを表し;
R20は、OHまたはNH2である、
前記コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩である。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の0.2〜20mol%が−L1−Z−OH基を有する、上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の0.2〜10mol%が−L1−Z−OH基を有する、上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルが−L1−Z−OH基を有し、
Zは、場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−およびC(O)N(R6aa)から選択される基によって独立に置き換えられたC1−16アルキル鎖であり、R6aaは、水素またはC1−4アルキルであり;または
Zは、
上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルが−L1−Z−OH基を有し、
Zは、場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−によって独立に置き換えられたC1−8アルキル鎖であり;または
Zは、
上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルが−L1−Z−OH基を有し、
Zは、−CH2−CH2−であり;または
Zは、
Zは、以下からなる群から選択される末端基を介してL1に結合しており;
上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルが−L1−Z−OH基を有し、
Zは、−CH2−CH2−であり;
Zは、以下からなる群から選択される末端基を介してL1に結合しており;
上述の架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルであって、
単量体二糖単位の0.001〜20mol%がジビニルスルホンにより架橋され;
単量体二糖単位の0.5〜5mol%が−L1−L2−L−Y−R20基を有し;
−L1−L2−L−Y基は式(IIIb)により表される構造を有し;
L1は、ヒアルロン酸のベータ−1,3−D−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており;
Yは、配列番号5を有するペプチド部分である、
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルであって、
単量体二糖単位の0.001〜20mol%がジビニルスルホンにより架橋され;
単量体二糖単位の0.5〜5mol%が−L1−L2−L−Y−R20基を有し;
−L1−L2−L−Y基は式(IIIb)により表される構造を有し;
L1は、ヒアルロン酸のベータ−1,3−D−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており;
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の0.2〜30mol%が−L1−Z−OH基を有し;
Zは、−CH2−CH2−であり;
Zは、末端基を介してL1に結合しており;
Yは、配列番号5を有するペプチド部分である、
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲル
を含むコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩である。
ヒアルロン酸ヒドロゲル合成
架橋ヒアルロン酸は、種々の方法により得ることができる。HAと架橋剤との反応、修飾(活性化)HAと架橋剤との反応、2つの異なる修飾HAと架橋剤との反応である。例は、Ohら、Journal of Controlled Release、141巻(2010年)、2〜12頁に記載されている。実施例7に、スキーム1に示されるモノ二官能性架橋剤である、ジビニルスルホンによる非修飾HAの架橋について記載する。架橋剤による非修飾HAの架橋は、ヒドロキシル媒介アルキル化(スキーム2)、1−メチル−2−クロロピリジニウムヨージドによる自己架橋(スキーム3)、アミド形成(スキーム4)およびジオール−エポキシド化学反応(スキーム5)によっても達成可能である。
非天然アミノ酸、およびリシン内などのアミノ基の側鎖修飾を含むペプチドを製造する好ましい方法は、適切な樹脂での固相合成法(SPPS)である。
a)2位にD−Serを含むYのペプチド配列を樹脂上に構築する工程;
b)1位にFmoc−His(Trt)−OHとしてHisを結合させる工程;
c)Fmocを脱保護する工程;
d)式Iaaのリンカー試薬L2*−L−を結合させる工程
PAはOHまたはp−ニトロフェニルエステルなどの活性化基である);
e)14位のMmtを脱保護する工程;
f)14位にPalm−Glu(γОSu)−OtBuまたはStea−Glu(γОSu)−OtBuを結合させる工程;.
g)樹脂から切断し、保護されたすべての基から脱保護する工程
を含む、リンカーコンジュゲートL2*−L−Yの製造方法を提供することであった。
L2*は、−O−およびC(O)N(R3aa)から選択される1つの基によって場合により中断されているC1−6アルキル鎖であり、R3aaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;チオールまたはマレイミドから選択される化学官能基を含む。
L2*は−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−C(O)NH−または−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−CH2−であり、
化学官能基としてチオール基を含む。
a)2位にD−Serを含むYのペプチド配列を樹脂上に構築する工程;
b)1位にFmoc−His(Trt)−OHとしてHisを結合させる工程;
c)Fmocを脱保護する工程;
d)式Iabのリンカー試薬L2*−L−を結合させる工程
e)14位のMmtを脱保護する工程;
f)14位にPalm−Glu(γОSu)−OtBuまたはStea−Glu(γОSu)−OtBuを結合させる工程;.
g)樹脂から切断し、保護されたすべての基から脱保護する工程
を含む、リンカーコンジュゲートL2*−L−Yの製造方法を提供することである。
a)2位にD−Serを含むYのペプチド配列を樹脂上に構築する工程;
b)1位にFmoc−His(Trt)−OHとしてHisを結合させる工程;
c)Fmocを脱保護する工程;
d)式Iccのアミノ酸を結合させる工程
e)Fmocを脱保護する工程;
f)式Icdのリンカー試薬L2*−L*−を結合させる工程
g)14位のMmtを脱保護する工程;
h)14位にPalm−Glu(γОSu)−OtBuまたはStea−Glu(γОSu)−OtBuを結合させる工程;
i)樹脂から切断し、保護されたすべての基から脱保護する工程
を含み;
R1、R1a、R2aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
L2*−は上述のように定義される、
L中のXがNHであるリンカーコンジュゲートL2*−L−Yの製造方法を提供することである。
a)2位にD−Serを含むYのペプチド配列を樹脂上に構築する工程;
b)1位にFmoc−His(Trt)−OHとしてHisを結合させる工程;
c)Fmocを脱保護する工程;
d)Fmoc−Aib−OHを結合させる工程;
e)Fmocを脱保護する工程;
f)式Iacのリンカー試薬L2*−L*−を結合させる工程;
h)14位にPalm−Glu(γОSu)−OtBuまたはStea−Glu(γОSu)−OtBuを結合させる工程;.
i)樹脂から切断し、保護されたすべての基から脱保護する工程
を含む、式L2*−L−Yのリンカーコンジュゲートの製造方法を提供することである。
a)2位にD−Serを含むYのペプチド配列を樹脂上に構築する工程;
b)1位にFmoc−His(Trt)−OHとしてHisを結合させる工程;
c)Fmocを脱保護する工程;
d)Fmoc−Aib−OHを結合させる工程;
e)Fmocを脱保護する工程;
f)式Iacのリンカー試薬L2*−L*−を結合させる工程;
h)Fmoc−Glu(tBu)を結合させる工程;
i)Fmocを脱保護する工程;
j)Palm−NHSまたはStea−NHSを結合させる工程;
k)樹脂から切断し、保護されたすべての基から脱保護する工程
を含む、式L2*−L−Yのリンカーコンジュゲートの製造方法を提供することである。
a)2位にD−Serを含むYのペプチド配列を樹脂上に構築する工程;
b)1位にFmoc−His(Trt)−OHとしてHisを結合させる工程;
c)Fmocを脱保護する工程;
d)Fmoc−Aib−OHを結合させる工程;
e)14位のMmtを脱保護する工程;
f)14位にPalm−Glu(γОSu)−OtBuまたはStea−Glu(γОSu)−OtBuを結合させる工程;
g)Fmocを脱保護する工程;
h)式Iadのリンカー試薬L2*−L*−を結合させる工程;
j)S−tBu保護基を還元的に切断する工程
を含む、式L2*−L−Yのリンカーコンジュゲートの製造方法を提供することである。
HS−L2−L−Y(IV)
(式中、L2、LおよびYは、上述の意味を有する。)
本発明の他の態様は、薬学的に許容される賦形剤と共に本発明のコンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物である。該医薬組成物を以下のパラグラフでさらに述べる。
(i)緩衝剤:リン酸、重炭酸、コハク酸、ヒスチジン、クエン酸および酢酸、硫酸、硝酸、塩化、ピルビン酸ナトリウムなどのpHを所望の範囲に維持するための生理学的に耐容される緩衝剤。Mg(OH)2またはZnCO3などの制酸剤も用いることができる。緩衝能は、pH安定性に最も感度の高い条件に適合するように調節することができる。
(ii)等張性調整剤:注射デポ剤における浸透圧差に起因する細胞損傷によってもたらされ得る疼痛を最小限にするため。グリセリンおよび塩化ナトリウムが例である。有効濃度は、血清について285〜315mOsmol/kgの推定オスモル濃度を用いて浸透圧測定により決定することができる。
(iii)保存剤および/または抗菌剤:複数回投与非経口製剤は、患者が注射により感染するリスクを最小限にするのに十分な濃度の保存剤の添加および対応する規制要件が確立されていることを必要とする。一般的な保存剤は、m−クレゾール、フェノール、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸、クロロクレゾールおよび塩化ベンザルコニウムを含む。
(iv)安定剤:安定化は、タンパク質安定化力の強化により、変性状態の不安定化により、またはタンパク質への賦形剤の直接的結合により、達成される。安定剤は、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グリシン、ヒスチジン、リシン、プロリンなどのアミノ酸、グルコース、スクロース、トレハロースなどの糖、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどのポリオール、リン酸カリウム、硫酸ナトリウムなどの塩、EDTA、ヘキサホスフェートなどのキレート化剤、二価金属イオン(亜鉛、カルシウム等)などのリガンド、フェノール誘導体などの他の塩または有機分子であり得る。さらに、シクロデキストリン、デキストラン、デンドリマー、PEGもしくはPVPまたはHSAなどのオリゴマーもしくはポリマーを用いることができる。
(v)吸着防止剤:組成物のもしくは組成物の容器の内表面を被覆するかまたはそれに競合的に吸着するために、主としてイオン性もしくは非イオン性界面活性剤または他のタンパク質もしくは可溶性ポリマーを用いる。例えば、ポロキサマー(Pluronic F−68)、PEGドデシルエーテル(Brij 35)、ポリソルベート20および80、デキストラン、ポリエチレングリコール、PEG−ポリヒスチジン、BSAおよびHSAならびにゼラチンなどである。賦形剤の選択される濃度および種類は、避けるべき影響に依存するが、一般的に界面活性剤の単層がCMC値のすぐ上で界面に形成される。
(vi)凍結乾燥および/または凍結防止剤:凍結乾燥または噴霧乾燥中に、賦形剤は、水素結合の切断および水の除去によってもたらされる不安定化作用を防ぐことができる。この目的のために、糖およびポリオールを用いることができるが、対応する正の効果は、界面活性剤、アミノ酸、非水性溶媒および他のペプチドについても認められた。トレハロースは、水分によってもたらされる凝集の低減に特に効果的であり、水へのタンパク質疎水性基の曝露により引き起こされる可能性がある熱安定性も改善する。マンニトールおよびスクロースも単独の凍結乾燥/凍結防止剤または互いの組合せとして用いることができ、マンニトール:スクロースのより高い比率のものが凍結乾燥ケーキの物理的安定性を高めることが公知である。マンニトールは、トレハロースとも組み合わせることができる。トレハロースをソルビトールと組み合わせるかまたはソルビトールを単独の防止剤としても用いることができる。デンプンまたはデンプン誘導体も用いることができる。
(vii)酸化保護剤:アスコルビン酸、エクトイン、メチオニン、グルタチオン、モノチオグリセロール、モリン、ポリエチレンイミン(PEI)、没食子酸プロピル、ビタミンEなどの抗酸化剤、クエン酸、EDTA、ヘキサホスフェート、チオグリコール酸などのキレート化剤
(viii)増粘剤または粘性増強剤:バイアルおよび注射器中の粒子の沈降を遅らせるものであり、粒子の混合および再懸濁を促進し、懸濁液を注射することをより容易にする(すなわち、注射器のプランジャーへの低い力)ために用いられる。適切な増粘剤または粘性増強剤は、例えば、Carbopol940、Carbopol Ultrez10のようなカルボマー増粘剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(ヒプロメロース、HPMC)またはジエチルアミノエチルセルロース(DEAEまたはDEAE−C)のようなセルロース誘導体、コロイドケイ酸マグネシウム(Veegum)またはケイ酸ナトリウム、ヒドロキシアパタイトゲル、リン酸三カルシウムゲル、キサンタン、SatiaゴムUTC30のようなカラゲナン、ポリ(D,L−もしくはL−乳酸)(PLA)およびポリグリコール酸(PGA)ならびにそれらのコポリマー(PLGA)などの脂肪族ポリヒドロキシ酸、D,L−ラクチド、グリコリドおよびカプロラクトンのターポリマー、ポロキサマー、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンのトリブロック(例えば、Pluronic(登録商標))を構成する親水性ポリオキシエチレンブロックおよび疎水性ポリオキシプロピレンブロック、ポリエチレングリコールテレフタレート/ポリブチレンテレフタレートコポリマーなどの、ポリエーテルエステルコポリマー、スクロースアセテートイソ酪酸(SAIB)、デキストランまたはその誘導体、デキストランおよびPEGの組合せ、ポリジメチルシロキサン、コラーゲン、キトサン、ポリビニルアルコール(PVA)および誘導体、ポリアルキルイミド、ポリ(アクリルアミド−コ−ジアリルジメチルアンモニウム(DADMA))、ポリビニルピロリドン(PVP)、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナンなどのグリコサミノグリカン(GAGs)、ポリラクチド(PLA)もしくはポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)などの疎水性Aブロックおよびポリエチレングリコール(PEG)もしくはポリビニルピロリドンなどの親水性BブロックからなるABAトリブロックまたはABブロックコポリマーである。そのようなブロックコポリマーならびに上述のポロキサマーは、逆熱ゲル化挙動を示し得る(投与を促進する室温における液体状態および注射後の体温でのゾル−ゲル転移温度以上でゲル状態)。
(ix)展着または拡散剤:結合組織の細胞間隙に見いだされるヒアルロン酸、多糖などであるが、これらに限定されない間質腔における細胞外マトリックスの成分の加水分解による結合組織の透過性を変化させる。ヒアルロニダーゼなどであるが、これに限定されない展着剤は、細胞外マトリックスの粘度を一時的に低下させ、注射薬物の拡散を促進する。
(x)他の助剤:湿潤剤、粘度調整剤、抗生物質、ヒアルロニダーゼなど。塩酸および水酸化ナトリウムなどの酸および塩基は、製造中のpHの調整に必要な助剤である。
・ 本発明の組成物を復元溶液と接触させる
工程を含む。
(i)本発明のコンジュゲートを1つまたはそれ以上の賦形剤と混合すること、
(ii)1回または複数回量に相当する量を適切な容器中に移すこと、
(iii)組成物を前記容器中で乾燥すること、および
(iv)容器を密封すること
によって製造される。
好ましくは、製剤は、内径が0.26mm(26ゲージ)より小さな針を介する、より好ましくは内径が0.18mm(28ゲージ)より小さな針を介する、最も好ましくは内径が0.16mm(30ゲージ)より小さな針を介する注射によって投与することができる。
本発明の化合物は、適切な医薬組成物における使用のために製造することができる。適切な医薬組成物は、1つまたはそれ以上の投与単位の形態であってよい。
GLP−1およびグルカゴン受容体に対する二重アゴニストである、本発明のコンジュゲートは、Rote Liste 2016に記載されているすべての薬物のような、他の薬理学的に活性な化合物と、例えば、Rote Liste 2015の1章に記載されているすべての体重減量薬もしくは食欲抑制薬、Rote Liste 2016の58章に記載されているすべての脂質低下薬、Rote Liste 2016に記載されているすべての抗高血圧薬および腎臓保護薬、またはRote Liste 2016の36章に記載されているすべての利尿薬と広く併用することができる。
インスリンおよびインスリン誘導体、例えば:グラルギン/Lantus(登録商標)、270〜330U/mLのインスリングラルギン(欧州特許第2387989号)、300U/mLのインスリングラルギン(欧州特許第2387989号)、グルリシン/Apidra(登録商標)、デテミル/Levemir(登録商標)、リスプロ/Humalog(登録商標)/Liprolog(登録商標)、デグルデク/デグルデクプラス、アスパルト、基礎インスリンおよび類似体(例えば、LY−2605541、LY2963016、NN1436)、PEG化インスリンリスプロ、Humulin(登録商標)、リンジェタ、SuliXen(登録商標)、NN1045、インスリンプラスシムリン、PE0139、即効性および短時間作用型インスリン(例えば、リンジェタ、PH20、NN1218、HinsBet)、(APC−002)ヒドロゲル、経口、吸入可能、経皮および舌下インスリン(例えば、Exubera(登録商標)、Nasulin(登録商標)、アフレッザ、トレゴピル、TPM02、カプスリン、Oral−lyn(登録商標)、Cobalamin(登録商標)経口インスリン、ORMD−0801、NN1953、NN1954、NN1956、VIAtab、Oshadi経口インスリン)。さらに二官能性リンカーによりアルブミンまたは他のタンパク質に結合しているインスリン誘導体も含まれる。
GLP−1、GLP−1類似体およびGLP−1受容体アゴニスト、例えば:リキシセナチド/AVE0010/ZP10/リクスミア、イクセナチド/エキセンディン−4/ビエッタ/ビデュレオン/ITCA650/AC−2993、リラグルチド/ビクトザ、セマグルチド、タスポグルチド、シンクリア/アルビグルチド、デュラグルチド、rExendin−4、CJC−1134−PC、PB−1023、TTP−054、ラングレナチド/HM−11260C、CM−3、GLP−1エリゲン、ORMD−0901、NN−9924、NN−9926、NN−9927、ノデキセン、ビアドール−GLP−1、CVX−096、ZYOG−1、ZYD−1、GSK−2374697、DA−3091、MAR−701、MAR709、ZP−2929、ZP−3022、TT−401、BHM−034.MOD−6030、CAM−2036、DA−15864、ARI−2651、ARI−2255、エキセナチド−XTENおよびグルカゴン−Xten。
DPP−4阻害薬、例えば:アログリプチン/ネシナ、トラジェンタ/リナグリプチン/BI−1356/オンデロ/トラジェンタ/トラドジェンタ/トラエンタ/トラドゼンタ、サキサグリプチン/オングリザ、シタグリプチン/ジャヌビア/キセレビア/テサベ/ジャヌメット/ベルメチア、ガルブス/ビリダグリプチン、アナグリプチン、ゲミグリプチン、テネリグリプチン、メログリプチン、トレラグリプチン、DA−1229、オマリグリプチン/MK−3102、KM−223、エボグリプチン、ARI−2243、PBL−1427、ピノキサシン。
SGLT2阻害薬、例えば:インボカナ/カナグリフロジン、ホルキシガ/ダパグリフロジン、レモグリフロジン、セルグリフロジン、エムパグリフロジン、イプラグリフロジン、トホグリフロジン、ルセオグリフロジン、LX−4211、エルツグリフロジン/PF−04971729、RO−4998452、EGT−0001442、KGA−3235/DSP−3235、LIK066、SBM−TFC−039、
ビグアニド(例えば、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン)、チアゾリジンジオン(例えば、ピオグリタゾン、リボグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン)、二重PPARアゴニスト(例えば、アレグリタザール、ムラグリタザール、テサグリタザール)、スルホニル尿素(例えば、トルブタミド、グリベンクラミド、グリメピリド/アマリル、グリピジド)、メグリチニド(例えば、ナテグリニド、レパグリニド、ミチグリニド)、アルファ−グルコシダーゼ阻害薬(例えば、アカルボース、ミグリトール、ボグリボース)、アミリンおよびアミリン類似体(例えば、プラムリンチド、シムリン)。
GPR119アゴニスト(例えば、GSK−263A、PSN−821、MBX−2982、APD−597、ZYG−19、DS−8500)、GPR40アゴニスト(例えば、ファシグリファム/TAK−875、TUG−424、P−1736、JTT−851、GW9508)。
PPAR−(アルファ、ガンマまたはアルファ/ガンマ)アゴニストまたは調節薬(例えば、アレグリタザール)、
PPAR−デルタアゴニスト、ACAT阻害薬(例えば、アバシミブ)、コレステロール吸収阻害薬(例えば、エゼチミブ)、胆汁酸結合物質(例えば、コレスチラミン、コレセベラム)、回腸胆汁酸輸送阻害薬、MTP阻害薬またはPCSK9の調節薬。
以下のようなHDL上昇化合物:CETP阻害薬(例えば、トルセトラピブ、アナセトラピド、ダルセトラピド、エバセトラピド、JTT−302、DRL−17822、TA−8995)またはABC1調節薬。
ペプチドYY3〜36(PYY3〜36)またはその類似体などのさらなる消化管ペプチド、膵臓ポリペプチド(PP)またはその類似体。
グルカゴン受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、GIP受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、グレリンアンタゴニストまたは逆アゴニスト、キセニンおよびその類似体。
他の態様では、本発明は、GLP−1およびグルカゴンの受容体に結合することによって、またそれらの活性を調節することによって作用を及ぼすことができる疾患または状態の治療または予防に適する医薬を製造するための、組合せパートナーとして上述した活性物質の少なくとも1つと組み合わせた本発明によるコンジュゲートまたはその生理学的に許容される塩の使用に関する。
用いる略語は、次の通りである。
AA アミノ酸
AcOH 酢酸
AcOEt 酢酸エチル
Aib アルファ−アミノ−イソ酪酸
cAMP 環状アデノシン一リン酸
Bn ベンジル
Boc tert−ブチルオキシカルボニル
BOP (ベンゾトリアゾール−1−イルオキシ)トリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
BSA ウシ血清アルブミン
tBu 第三級ブチル
dAla D−アラニン
DBU 1,3−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデセン
DCC N,N−ジシクロヘキシルカルボジイミド
DCM ジクロロメタン
Dde 1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシリデン)−エチル
ivDde 1−(4,4−ジメチル−2,6−ジオキソシクロヘキシリデン)3−メチル−ブチル
DIC N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA N,N−ジイソプロピルエチルアミン
DMAP ジメチルアミノ−ピリジン
DMEM ダルベッコ改変イーグル培地
DMF ジメチルホルムアミド
DMS ジメチルスルフィド
DMSO ジメチルスルホキシド
DTT DLジチオトレイトール
DVS ジ−ビニルスルホン
EDC 1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド
EDT エタンジチオール
EDTA エチレンジアミン四酢酸
eq 化学量論的等価
EtOH エタノール
FA ギ酸
FBS ウシ胎児血清
Fmoc フルオレニルメチルオキシカルボニル
gGlu ガンマ−グルタミン酸(γE)
HATU O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HBSS ハンクス平衡塩類溶液
HBTU 2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HEPES 2−[4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−イル]エタンスルホン酸
HOBt 1−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HOSu N−ヒドロキシスクシンイミド
HPLC 高速液体クロマトグラフィー
HTRF 均一時間分解蛍光
IBMX 3−イソブチル−1−メチルキサンチン
LC/MS 液体クロマトグラフィー/質量分析
Mal 3−マレイミドプロピル
Mal−PEG6−NHS N−(3−マレイミドプロピル)−21−アミノ−4,7,10,13,16,19−ヘキサオキサ−ヘンエイコサン酸NHSエステル
Me メチル
MeOH メタノール
Mmt 4−メトキシトリチル
MS 質量スペクトル/質量分析
MTBE メチルtert−ブチルエーテル
MW 分子質量
NHS N−ヒドロキシスクシンイミド
Palm パルミトイル
iPrOH 2−プロパノール
PBS リン酸緩衝生理食塩水
PEG ポリエチレングリコール
PK 薬物動態
PyBOP ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
Phth フタルイミド
RP−HPLC 逆相高速液体クロマトグラフィー
rpm 毎分回転数
RT 室温
SEC サイズ排除クロマトグラフィー
Stea ステアリル
TCEP トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩
TES トリエチルシラン
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
TMEDA N,N,N’N’−テトラメチルエチレンジアミン
Tris トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン
Trt トリチル
UPLC 超高速液体クロマトグラフィー
UV 紫外線
V 容積
材料:
異なるRink−Amide樹脂(4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂、Merck Biosciences;4−[(2,4−ジメトキシフェニル)(Fmoc−アミノ)メチル]フェノキシアセトアミドメチル樹脂、Agilent Technologies)を0.2〜0.7mmol/gの範囲の担持量でペプチドアミドの合成に用いた。
Waters XBridge BEH130 3.5μm C18カラム(2.1×150mm)を用いるAgilent1100Series HPLC systemで、40℃で、流量0.5mL/分の勾配溶出により分析用HPLCを実施し、215および280nmでモニターした。勾配は、15分にわたり10%B〜90%B、次いで1分で90%B、または12.5分にわたり15%B〜50%B、次いで3分にわたり50%B〜90%Bに設定した。緩衝液A=水中0.1%ギ酸、B=アセトニトリル中0.1%ギ酸。
粗ペプチドをAkta Purifier SystemまたはJasco semiprep HPLC Systemのいずれかで精製した。精製する粗ペプチドの量によって、異なるサイズの分取RP−C18−HPLCカラムおよび異なる流量を用いた。アセトニトリル+0.1%TFA(B)および水+0.1%TFA(A)を溶出液として用いた。生成物含有画分を収集し、凍結乾燥して、精製された生成物を得た。
カラム: Aeris Widepore、3.6μm、100×2.1mm、40℃
溶媒: H2O+0.1%TFA:ACN+0.1%TFA(流量1.5ml/分)
勾配: 90:10(0分)〜10:90(10分)〜10:90(10.67分)〜90:10(11分)〜90:10(12分)
ペプチドバッチの溶解度および安定性の試験の前に、その含量を測定した。したがって、その純度(HPLC−UV)およびバッチの塩担持の量(イオンクロマトグラフィー)の2つのパラメータを検討した。
残存ペプチド%=[(ペプチドピーク面積 t7)×100]/ペプチドピーク面積 t0
可溶性分解生成物%={[(不純物のピーク面積の合計 t7)−(不純物のピーク面積の合計 t0)]×100}/ペプチドピーク面積 t0
沈殿物%=100−([残存ペプチド%]+[可溶性分解生成物%])
機器:Dionex ICS−2000、プレ/カラム:Ion Pac AG−18 2×50mm(Dionex)/AS18 2×250mm(Dionex)、溶出液:水性水酸化ナトリウム、流量:0.38mL/分、勾配:0〜6分:22mM KOH、6〜12分:22〜28mM KOH、12〜15分:28〜50mM KOH、15〜20分:22mM KOH、サプレッサー:ASRS 300 2mm、検出:伝導度
配列番号5および6のペプチド化合物を、国際公開第2014056号に記載される方法に従って製造した。GLP−1およびグルカゴン受容体におけるペプチド化合物の効力は、ヒトグルカゴン受容体(hGlucagon R)またはヒトGLP−1受容体(hGLP−1 R)を発現する細胞を列挙した漸増濃度の化合物に曝露し、形成されたcAMPを測定することによって決定した。受容体に対するペプチドのアゴニズムは、ヒトGIP、GLP−1またはグルカゴン受容体を安定に発現するHEK−293細胞株のcAMP応答を測定する機能アッセイにより決定された。
ヒアルロン酸ヒドロゲル中のマレイミド含量の推定
HAヒドロゲルに取り込まれたマレイミド基の推定は、比色分析法により実施した。5−チオ2−ニトロ安息香酸は、pH7.5のPBS緩衝液中トリス−(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)による5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)の還元により調製した。20mol%過剰の5,5’−ジチオビス−(2−ニトロ安息香酸)を用いて、TCEPとの副反応を防いだ。所定の量のマレイミド官能基化ヒドロゲルをpH3.5の20mMコハク酸緩衝生理食塩水(SBS)に懸濁した。上記の5−チオ2−ニトロ安息香酸溶液をヒドロゲル懸濁液に加え、反応混合物をボルテックス混合し(2×10秒)、その後、25℃で45分間緩やかに撹拌した。その後、懸濁液を25℃で10分間遠心分離し、上清の一定分量を採取した。上清の吸光度を412nmで測定した。溶液中の5−チオ2−ニトロ安息香酸の濃度を、校正曲線を用いて推定した。ヒドロゲル中のマレイミド濃度は、加えた5−チオ2−ニトロ安息香酸の量と上清中に存在するその量との差から計算される、反応したチオールのモル数に相当する。
所定の量のHAヒドロゲルペプチドコンジュゲートをCHES緩衝液(pH9.5)に懸濁し、懸濁液を70℃で緩やかに撹拌した。懸濁液を遠心分離し、一定分量をHPLC法によりペプチド含量について分析した。HPLC法は、Agilent1100LCを用いてqC−18Kineticsカラム(内径=4.6mmおよび長さ=100mm、粒径2.6μm、Phenomenex)を用いることを含む。移動相Aの組成は、90%水/10%アセトニトリル/0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)であり、移動相Bは、10%アセトニトリル/90%水/0.09%TFAである。勾配は、8分で移動相25%B〜55%Bである。流量は、1mL/分を維持した。純ペプチドを標準として用いて、ヒドロゲルから放出されたペプチドを定量した。
HA−ヒドロゲルコンジュゲートの特性決定に、固体または(ゲル)MAS(マジック角回転)プロトンNMRを用いた。一バージョンでは、得られるNMRスペクトルの線形を増強するためにサンプルをD2Oで適宜膨潤させ、ZrO2(二酸化ジルコニウム)ローターに加えた。マジック角(54.7°)条件下でサンプルを高回転(4〜13KHz)速度で回転させることができる400MHz磁石に取り付けられたMASプローブにローターを入れた。線形を顕著に狭めることで、以下を推定するのに有用なNMRスペクトル取得につながる。
− 架橋の程度(p.e.DVS)
− ヒドロゲル官能基化の程度(p.e.マレイミド)
− HAヒドロゲルのペプチド担持量
− ポリマー主鎖に結合していない遊離ペプチドの量
− 残留遊離低分子、例えば溶媒または試薬の決定
− コンジュゲート純度の決定
保存溶液:
正確な量のマレイン酸5〜10mgを秤量して5mLフラスコに入れ、2,2,2−トリフルオロエタノール−d3 1.5mLを加えた。次いでD2Oでフラスコを5mLに満たした。この混合物を、後の凍結乾燥HA物質の膨潤のための保存溶液として用いた。
正確な量のHAコンジュゲート3〜5mgを秤量してEppendorf−Capに入れ、保存溶液150μLを加えた。ゲル形成が開始される前にEppendorf−Capをボルテクサーで振盪した。ゲルを室温に終夜維持した。次いでゲルをHR−MAS−ローターに入れた。固体NMR分光計において、プロトン共鳴の400.13MHzに対応する9.39Tでローターを測定した。双極子間相互作用を低下させるため、ローターをマジック角約54.7°に調節し、10KHzで回転させた。プロトンスペクトルを待ち時間(Recycle Delay)25秒および2048スキャンで記録した。
データを記録した後、FID(自由誘導減衰)に窓乗算(window multiplication)およびフーリエ変換を行った。スペクトルを位相補正し、シグナル積分前にベースライン補正ルーチンをスペクトルに適用した。7.5〜約7ppmの芳香族官能基のプロトンシグナルを積分し、ペプチドの芳香族プロトンの対応する数に計算した。同じことを内部標準のマレイン酸シグナルについて行った。ペプチド担持量の推定のため、両値を比にした。コンジュゲートのその他の構造上の構成については、表2に示されるプロトンシグナルを用いた。
配列番号5を有するAib−リンカー−ペプチドコンジュゲートの合成
Novabiochem Rink−Amide樹脂(4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂)、100〜200メッシュ、担持量0.34mmol/gで、固相合成法を行った。HBTU/DIPEAによる活性化を用いてFmoc合成法を適用した。固相合成法プロトコールにおいて、14位にはFmoc−Lys(Mmt)−OH、1位にはFmoc−His(Trt)−OHを用いた。次いでFmoc−Aib−OHを結合させた。
配列番号5を用いてのAsn−リンカー−ペプチドコンジュゲートの合成
方法に記載されるように、Rink−Amide樹脂(4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmoc−アミノメチル)−フェノキシアセトアミド−ノルロイシルアミノメチル樹脂)で固相合成法を行った。HBTU/DIPEAによる活性化を用いてFmoc合成法を適用した。固相合成法プロトコールにおいて、14位にはFmoc−Lys(ivDde)−OH、1位にはFmoc−His(Trt)−OHを用いた。
塩化m−メトキシトリチル(3g、9.71mmol)をDCM(20mL)に溶解し、DCM(20mL)中エチレンジアミン(6.5mL、97.1mmol)の溶液に1滴ずつ加えた。2時間後に溶液をジエチルエーテル(300mL)中に注加し、30/1(容積/容積)ブライン/0.1M NaOH溶液(各50ml)で3回、ブライン(50ml)で1回洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、揮発性物質を減圧下で除去した。Mmt保護中間体(3.18g、9.56mmol)をさらなる精製を行わずに次の工程に用いた。
収量:5.69g(8.09mmol)
MS:m/z705.4=[M+H]+(計算MW=705.0)
無水THF(50mL)中5a(3.19g、4.53mmol)の溶液にBH3・THF(1M溶液、8.5mL、8.5mmol)を加え、溶液を室温で16時間撹拌した。さらなるBH3・THF(1M溶液、14mL、14mmol)を加え、室温で16時間撹拌した。メタノール(8.5mL)の添加により反応を停止させた。N,N−ジメチル−エチレンジアミン(3mL、27.2mmol)を加え、溶液を加熱還流し、3時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、次いで酢酸エチル(300mL)で希釈し、飽和Na2CO3水溶液(2×100mL)および飽和NaHCO3水溶液(2×100mL)で洗浄した。有機相をNa2SO4上で乾燥し、揮発性物質を減圧下で除去して、粗アミン中間体(3.22g)を得た。
MS:m/z791.4=[M+H]+、519.3=[M−Mmt+H]+(計
算MW=791.1)
収量:2.52g(3.19mmol)
MS:m/z519.3=[M+H]+(計算MW=519.8g/mol)
中間体5b(985mg、1.9mmol)およびクロロギ酸p−ニトロフェニル(330mg、2.5mmol)を無水THF(10mL)に溶解した。DIPEA(0.653mL、3.7mmol)を加え、混合物を室温で2時間撹拌した。溶液を酢酸(1mL)の添加により酸性化した。5cをRP−HPLCにより精製した。
収量:776mg、(1.13mmol)
MS m/z706.3=[M+Na]+(計算MW=706.3)
収量:593mg(1.52mmol)
MS:m/z377.35=[M+Na]+、(計算=377.14)
収量:285mg(TFA塩として0.436mmol)
MS:m/z562.54=[M+Na]+、(計算=562.67)
収量:1.4g(94%)
MS:m/z934.7=[M+Na]+、(計算=934.5)
収量:780mg(60%)
MS:m/z878.8=[M+Na]+、(計算=878.40)
収量:154mg(0.161mmol)
MS:m/z953.4=[M+H]+、(計算=953.43)
MS:m/z390.2=[M+H]+(計算MW=389.6)
収量:0.82g(1.46mmol)
MS:m/z563.3=[M+H]+(計算MW=562.8)
収量:579mg(1.34mmol)
MS:m/z433.3=[M+H]+(計算MW=432.7)
収量:339mg(0.57mmol)
MS:m/z598.3=[M+H]+(計算MW=597.8)
GLP−1受容体およびグルカゴン受容体に対する効能に関するin vitro細胞アッセイ
配列番号5および6のペプチド化合物を、国際公開第2014056号に記載される方法に従って製造した。GLP−1およびグルカゴン受容体におけるペプチド化合物の効力は、上述の方法により、ヒトグルカゴン受容体(hGlucagon R)またはヒトGLP−1受容体(hGLP−1 R)を発現する細胞を曝露して決定した。
実施例7
ジビニルスルホン架橋ヒアルロン酸
実施例7a
0.2M水酸化ナトリウム(168.9g)に溶解するまで撹拌しながら塩化ナトリウム(23.4g)を加えた。2時間続けた迅速な機械的撹拌下の溶液にヒアルロン酸ナトリウム(25.4g、400〜500kDa)を加えた。得られたポリマー溶液は、約12重量/重量%の濃度を有する。イソプロパノール(1.6mL)中ジビニルスルホン(0.41mL、0.48g)の溶液を調製し、約30秒にわたって加えた(5×0.4mL)。混合物をさらに2分間撹拌し、23×28×6.5cmガラストレー中に注加し、プラスチックカバーで密封した。室温で4時間放置した後、ゲルを一片として0.9%食塩水(3kg)中1M塩酸(100.1g)の溶液に移した。それを室温で緩やかに撹拌した。24時間後に溶液のpHは、2.28であった。溶液を捨て、ゲル(416.2g)を残した。次いでゲルに0.9%食塩水(3kg)を加え、それを室温で18時間緩やかに撹拌した。混合物に0、2、4、6および8時間目に1M水酸化ナトリウム(9.7mL)を加えた。ゲルを室温でさらに24時間緩やかに撹拌し、ゲルのその時点のpHは、6.65であった。ゲルを2〜8℃で120時間保存し、次いで10mMリン酸ナトリウム溶液pH7.4(2L)を加えた。ゲルをさらに21時間撹拌し、洗浄液を捨てて、2.4%の最終ポリマー濃度を有するゲル(1036.2g)を残した。
ジビニルスルホン架橋ヒアルロン酸の代替合成
ヒアルロン酸ナトリウム35gに滅菌水946mLを加えた。反応混合物を2〜8℃に7日間保持し、その間に透明溶液が形成された。この溶液に1.0M水酸化ナトリウム溶液111mLを加え、得られた反応混合物を5分間激しく撹拌した。反応混合物を2〜8℃に90分間保持した。その後、滅菌水10mL中ジビニルスルホン6.7mLの懸濁液をポリマー溶液に加え、得られた反応混合物を5分間激しく撹拌した。その後、反応混合物を2〜8℃で150分間、その後、25℃で90分間保存した。そのように形成されたポリマーゲルを0.9%滅菌食塩水で4日間洗浄した。懸濁液のpHを1.0M NaOHまたは1.0M HClのいずれかで7.0に調整した。ゲル懸濁液の最終濃度は、0.58%であった。
1−(tert−ブトキシカルボニル)アミノ3−(3−マレイミドプロピル)アミノプロパンの合成
1−アミノ3−(3−マレイミドプロピル)アミノプロパンメチルスルホネートの合成
3−(3−マレイミド−プロピル)アミノプロパン官能基化HAヒドロゲルの合成の一般的方法
適切な量のジビニスルホン架橋HA懸濁液(実施例11b)に滅菌生理食塩水を加えて、約1重量/容積%のゲル濃度を得た。得られた懸濁液を25℃で15〜30分間撹拌した。水混和性有機溶媒(好ましくはエタノール)を懸濁液に加え、得られた懸濁液をさらに30〜60分間撹拌した。この懸濁液に適切な量の4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチル−モルホリニウムクロリド(DMT−MM)のエタノール溶液を加えた。DMT−MM溶液を含む容器をエタノールで2回すすぎ、洗液を上記の懸濁液に加えた。得られた反応混合物を25℃で90分間撹拌した。適切な量の1−(tert−ブトキシカルボニル)アミノ3−(3−マレイミドプロピル)アミノプロパンをジクロロメタンに溶解した。この溶液にトリフルオロ酢酸を加えて、1:1(容積/容積)を得た。室温で60〜90分間撹拌した後、反応混合物を減圧下で蒸発乾固した。残留物をエタノールに溶解し、上記の懸濁液に加えた。マレイミド誘導体を含む容器をエタノールで2回すすぎ、洗液を懸濁液に加えた。懸濁液のpHを有機または無機塩基(例えば、エタノール中10%N−メチルモルホリン)を用いてpH6.4〜6.6に調整した。25℃で16〜20時間撹拌した後、懸濁液を60〜65容積/容積%までエタノールで処理した。120Gでの遠心分離の後に上清をデカントすることにより、またはN2ガスのわずかな過圧を系にかけ、ガラスフリットもしくはフィルター膜を介して濾過することにより、溶媒を反応混合物から除去した。その後、残留物をpH3.8の滅菌済み20mMコハク酸生理食塩水(0.9%)で約15〜20分間処理し、60〜65容積/容積%の容積までエタノールを加えることによって沈殿させた。上記の手順に従うことによって溶媒を反応混合物から除去した。この手順をもう1回繰り返した。
マレイミド官能基化HAヒドロゲルへのリンカーチオールペプチドのコンジュゲーション
マレイミド官能基化HAヒドロゲルに対するチオール末端トレースリンカー保有ペプチドでの一般的手順
中多孔質フリットまたはフィルターを備えた滅菌済みおよび発熱性物質除去処理済み反応器に適切な量のマレイミド修飾HAヒドロゲル(実施例10)を入れた。その後、適切な量の濾過滅菌済み20mMоl SB緩衝液(15容積/容積%プロピレングリコールおよび0.01重量/容積%Tween20、pH3.8を含む)を、得られる懸濁液の濃度が約1重量/重量%となるように反応に加えた。懸濁液を緩やかに振盪しながら30〜90分間混合した。この時間の終了時に、濾過滅菌済み20mMоl SB緩衝液(15容積/容積%プロピレングリコールおよび0.01重量/容積%Tween20、pH3.8を含む)に溶解した適切な量のチオール末端トレースリンカー保有ペプチドを反応器に加え、得られた反応混合物を周囲温度で1.5〜24時間緩やかに振盪した。反応の終了時に、窒素のわずかな過剰な圧力を用いた濾過によりまたは懸濁液の遠心分離により上清を除去した。残留物を、濾過滅菌済み20mM SBS緩衝液(15容積/容積%プロピレングリコールおよび0.01重量/容積%Tween20、pH3.0を含む)で処理して、0.7重量/容積%懸濁液を調製し、3分間振盪し、遠心分離し、デカントにより上清を除去した。このプロセスを5回繰り返した。残留物を、濾過滅菌済み20mM SBS緩衝液(15容積/容積%プロピレングリコールおよび0.01重量/容積%Tween20、pH3.0を含む)に溶解した1−ヒドロキシ−2−メルカプトエタンの10mM溶液で処理して、約1重量%の懸濁液を調製し、緩やかな振盪/混合により30分間緩やかに撹拌した。上述のように遠心分離とそれに続くデカントによって溶媒を除去した。1−ヒドロキシ−2−メルカプトエタン処理のこのプロセスを4回繰り返した。残留物を濾過滅菌済み20mM SBS緩衝液(15容積/容積%プロピレングリコールおよび0.01重量/容積%Tween20、pH3.0を含む)に懸濁して、約0.5重量%の濃度の懸濁液を調製し、3分間混合した後、遠心分離およびデカントにより除去した。得られた残留物を20mM SBS緩衝液(15容積/容積%プロピレングリコールおよび0.01重量/容積%Tween20、pH6.5を含む)に懸濁して、0.7重量%の懸濁液を調製し、20分間撹拌し、濾過した。このプロセスをもう1回繰り返した後、残留物を、20mM SBS緩衝液(15容積/容積%プロピレングリコールおよび0.01重量/容積%Tween20、pH4.5を含む)に懸濁して、0.5重量%の懸濁液を調製し、15分間撹拌し、濾過した。このプロセスを1回繰り返した。残留物を滅菌水(pH4.5)に懸濁し、5分間撹拌し、濾過した。このプロセスを5回繰り返した。残留物を滅菌済み膜フィルターを用いて無菌的に濾過し、凍結乾燥した。
HA−Aib−リンカー−ペプチド配列番号5コンジュゲートの代替合成
ジビニルスルホン架橋Haヒドロゲル懸濁液(乾燥質量0.92g(0.00229mol))40gに0.9%NaCl水溶液100mlを加え、得られた懸濁液を25℃で10分間撹拌し、0.9%NaCl 20mlとともに反応器に移した。70mLを濾別した。
可溶性マレイミド官能基化HAの合成
100mLフラスコにヒアルロン酸ナトリウム塩(分子量=500kDa)200mgおよびDI水24mLを入れた。透明溶液が得られるまでそれを撹拌した。迅速撹拌HA溶液にエタノール16mL、その後、水/エタノール中4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウムクロリド(55mg、0.2mmol)およびN−メチルモルホリン(20μl、0.2mmol)を加えた。反応混合物を1時間撹拌した。次いで、1−(2−(2−アミノエトキシ)エチル)−1H−ピロール−2,5−ジオン・トリフルオロ酢酸塩(60mg、0.2mmol)の水溶液を加え、得られた反応混合物を14時間撹拌した。反応物のpHをわずかに酸性に調整した。反応混合物を、あらかじめ洗浄したAmberlite(登録商標)CG−120樹脂(Na+型)15mlで処理し、得られた反応混合物を20分間撹拌した。樹脂を濾別し、脱イオン水で洗浄した。合わせた濾液を、あらかじめ洗浄したAmberlite(登録商標)CG−120樹脂(Na+型)15mlで再び処理し、上記の手順に従った。Amberlite(登録商標)樹脂処理をもう1回繰り返した。濾液を水で希釈して、<20%エタノールを含む水性溶液を形成した。4つのPALL Macrosep(登録商標)遠心分離装置30kDa分子量カットオフを用いて、速度5000rpmで15分間溶液を遠心濾過した。膜は、その上にスパチュラを緩やかになでつけ、密閉装置を激しく振盪することによって毎回清掃した。保持液を脱イオン水(>200ml)で数回洗浄した。得られた濃縮物を合わせ、凍結乾燥し、50〜75%の範囲の収量で灰色がかった白色固体を得た。1NMR分光法により推定されるマレイミド組込みの程度は約20モル%であることが見いだされた。
HAヒドロゲルのin vivo滞留時間の決定
皮下腔におけるin vivoでのヒドロゲルの滞留時間を、CEST(化学交換飽和移動)技術(ZihlらMagn.Reson Med 2011、65巻(4)927〜948頁)と組み合わせた磁気共鳴撮像法(MRI)により検討した。ヒドロゲルの内部の水プロトンコントラストの強度を用いて、in vivoでのヒドロゲルの滞留時間を評価した。この目的のために、C57Bマウスを動物4匹の群2つにおいて用いた。Aib−リンカーを有するHAコンジュゲートペプチド配列番号5の溶液(可溶性)または懸濁液(ジビニルスルホン架橋ヒドロゲル)のいずれかを動物に注射した。投与されたサンプルは薬物物質HA誘導体を1〜3重量%含んでいた。すべての承認済み動物管理プロトコールに従って31G針を用いてヒドロゲルを注射した。
植え込まれたHAをMRI技術によりモニターした。標準的(上側)およびCEST(下側)撮像技術の両方により得られた代表的なMRI画像。
1ppmでのピーク大きさをプロットすることにより分解速度論を決定した。
in vitoでの放出速度論
配列番号5のペプチドを有するGLP−1/グルカゴンアゴニストAib−リンカーヒドロゲル(0.5mg GLP−1/グルカゴンアゴニスト)の一定分量を、フィルターフリットを取り付け、pH7.4リン酸緩衝液(60mM、3mM EDTA、0.01%Tween−20)で5回洗浄した注射器に移した。ヒドロゲルを同じ緩衝液に懸濁し、37℃でインキュベートした。規定の時点(1〜7日間の各インキュベーション時間の後)に上清を交換し、放出されたGLP−1/グルカゴンアゴニストをRP−HPLCにより215nmで定量した。放出されたGLP−1/グルカゴンアゴニストに相関するUVシグナルを積分し、インキュベーション時間に対してプロットした。
曲線当てはめソフトウエアを適用して、放出の対応する半減期を推定した。
給餌された、雄糖尿病db/dbマウスにおける血糖に対する、配列番号5の皮下処理後の効果
雄糖尿病肥満BKS.CG−m+/+Lepr(db)/JマウスをCharles Riverから取り寄せ、受領すると群で木くずの寝床とともに収容した。試験開始時、マウスは約13〜14週齢であった。
雌食事誘導性肥満(DIO)C57BL/6マウスにおける血糖、体重、全身脂肪含量、および餌消費に対する、皮下処理後の効果
雌C57BL/6NHsdマウスを、Envigo RMS Inc.から群で収容された状態で取り寄せ、群で収容された状態で輸送し、投与前期38日目まで木くずの寝床を有する使い捨てシューボックスケージにおいて、輸送されたケージ仲間とともに群で収容された状態のままにした。試験開始時、マウスは25〜26週齢であった。
雌C57BL/6マウスにおける薬物動態
雌C57BL/6マウス30匹を本試験に使用した。全試験期間を通して動物に飼料および水を自由に摂取させた。HA−Aib−リンカー−配列番号5の懸濁液4.5mg/kgを動物に投与した。2、8、24、48、72、144、192、240、312および336時間で血漿サンプルを採取した。ペプチドについてサンプルを分析した。定量結果はすべて、LC−MS/MSにより決定した。平均濃度の計算では、定量化の下限(LLOQ=血漿中1ng/mL)を下回る値をゼロに設定した。プログラムWinNonlin6.4により、ノンコンパートメントモデルおよび線形台形補間計算を用いて薬物動態パラメータを計算した。
雌Gottingenミニブタにおける薬物動態
平均体重35000gの、雌糖尿病Gottingenミニブタ4匹を本試験に使用した。全試験期間を通して動物に飼料および水を自由に摂取させた。HA−Aib−リンカー−配列番号5の16.05%懸濁液0.623mg/kgを動物に投与した。0、1、4、8、24、48時間、および3〜21日目は1日1回同じ時間に血漿サンプルを採取した。ペプチドについてサンプルを分析した。定量結果はすべて、LC−MS/MSにより決定した。平均濃度の計算では、定量化の下限(LLOQ=血漿中1ng/mL)を下回る値をゼロに設定した。プログラムWinNonlin6.4により、ノンコンパートメントモデルおよび線形台形補間計算を用いて薬物動態パラメータを計算した。図7は、1回の投与後の、時間に対する血漿濃度値を示す。
注射可能性試験
20mg/mL HA−ペプチドコンジュゲートの懸濁液(1)を適切な量のペプチドコンジュゲートをpH4.5の20mM酢酸緩衝液に分散させることによって注射器内で調製した。他の注射器において、天然HAの20mg/mL溶液(2)を、凍結乾燥HAをpH4.5の20mM酢酸緩衝液に溶解することによって調製した。4:1の比で、連結具を介して(1)を(2)と混合し、得られた懸濁液(3)を2〜8℃で終夜保存した。(3)を室温に調節し、次いで注射可能性実験に使用した。1mL BDプラスチックルアーロック注射器では、27G×1/2”または29G×1/2”針を注射器に連結した。PFS実験の場合、(3)を手作業で注射器に真空充填した。(3)を含む注射器をLF Plus装置の注射器ホルダーに装着した。異なる注射器について注射速度を1mL/10秒に調節した。2つの異なる化合物(HAコンジュゲート配列番号5、Aibリンカー)についての結果を表6に示す。
給餌された、雄糖尿病db/dbマウスにおける血糖に対する、配列番号5の皮下処理後の効果 − 純ペプチド配列番号5の、配列番号5の架橋HAコンジュゲート(バッチC)との比較
雄糖尿病肥満BKS.CG−m+/+Lepr(db)/JマウスをCharles Riverから取り寄せ、受領すると群で木くずの寝床とともに収容した。試験開始時、マウスは約13〜14週齢であった。
ペプチド配列番号5:投与期の0日目に、1.7nmol/kgのs.c.注射(27G針)で動物を処理した。投与を午前08:30〜09:30の間に開始および完了し、13日目まで毎日繰り返した。
配列番号5の架橋HAコンジュゲート:投与期の0日目に、50nmol/kgのs.c.注射(27G針)で1回動物を処理した。
Claims (37)
- 架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルを含むコンジュゲートであって、
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルは、
単量体二糖単位の0.001〜20mol%が架橋剤により架橋され;
単量体二糖単位の0.2〜20mol%が−L1−L2−L−Y−R20基を有し;
L1は、場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−、NH(R5aa)およびC(O)N(R5aa)から選択される基によって置き換えられ、OHおよびC(O)N(R5aaR5aaa)から独立に選択される1つまたはそれ以上の基により場合により置換されたC1−20アルキル鎖であり、R5aaおよびR5aaaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
L1は、ヒアルロン酸のベータ−1,3−D−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており、
L2は、単一化学結合、または場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−およびC(O)N(R3aa)から選択される基によって置き換えられ、OHおよびC(O)N(R3aaR3aaa)から独立に選択される1つまたはそれ以上の基により場合により置換されたC1−20アルキル鎖であり、R3aaおよびR3aaaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
L2は、以下からなる群から選択される末端基を介してL1に結合しており;
Lは、式(Ia)のリンカー
Xは、C(R4R4a)またはN(R4)であり;
R1、R1aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R2、R2aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R4、R4aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R2、R2a、R4またはR4aのうち1つはL2に結合している)であり;
Yは、式(Ib)を有するペプチド部分
His−D−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−×14−Glu−Ser−Lys−Ala−Ala−Gln−Asp−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Ala−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser(Ib)
であり、
×14は、−NH2側鎖基が(S)−4−カルボキシ−4−ヘキサデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたLysを表し;
またはYは、式(Ic)を有するペプチド部分
His−dSer−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−×14−Asp−Glu−Gln−Leu−Ala−Lys−Asp−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Ala−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser(Ic)
であり、
×14は、−NH2側鎖基が(S)−4−カルボキシ−4−オクタデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたLysを表し;
R20は、OHまたはNH2である、
前記コンジュゲート
またはその塩もしくは溶媒和物。 - 単量体二糖単位の0.001〜20mol%が架橋剤により架橋され;
単量体二糖単位の0.2〜20mol%が−L1−L2−L−Y−R20基を有し;
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の0.2〜30mol%が−L1−Z−OH基を有する該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルを含み;
L1は、場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−、NH(R5aa)およびC(O)N(R5aa)から選択される基によって置き換えられ、OHおよびC(O)N(R5aaR5aaa)から独立に選択される1つまたはそれ以上の基により場合により置換されたC1−20アルキル鎖であり、R5aaおよびR5aaaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
L1は、ヒアルロン酸のベータ−1,3−D−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており、
L2は、単一化学結合、または場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−およびC(O)N(R3aa)から選択される基によって置き換えられ、OHおよびC(O)N(R3aaR3aaa)から独立に選択される1つまたはそれ以上の基により場合により置換されたC1−20アルキル鎖であり、R3aaおよびR3aaaは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
L2は、以下からなる群から選択される末端基を介してL1に結合しており;
Zは、場合により1つまたはそれ以上の炭素原子が、−O−およびC(O)N(R6aa)から選択される基によって置き換えられたC1−16アルキル鎖であり、R6aaは、水素またはC1−4アルキルであり;または
Zは、
Zは、以下からなる群から選択される末端基を介してL1に結合しており;
Lは、式(Ia)のリンカー
Xは、C(R4R4a)またはN(R4)であり;
R1、R1aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R2、R2aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R4、R4aは、HおよびC1−4アルキルからなる群から独立に選択され;
R2、R2a、R4またはR4aのうち1つはL2に結合している)であり;
Yは、式(Ib)を有するペプチド部分
His−D−Ser−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−×14−Glu−Ser−Lys−Ala−Ala−Gln−Asp−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Ala−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser(Ib)
であり、
×14は、−NH2側鎖基が(S)−4−カルボキシ−4−ヘキサデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたLysを表し;
またはYは、式(Ic)を有するペプチド部分
His−dSer−Gln−Gly−Thr−Phe−Thr−Ser−Asp−Leu−Ser−Lys−Gln−×14−Asp−Glu−Gln−Leu−Ala−Lys−Asp−Phe−Ile−Glu−Trp−Leu−Lys−Ala−Gly−Gly−Pro−Ser−Ser−Gly−Ala−Pro−Pro−Pro−Ser(Ic)
であり、
×14は、−NH2側鎖基が(S)−4−カルボキシ−4−オクタデカノイルアミノ−ブチリルにより官能基化されたLysを表し;
R20は、OHまたはNH2である、
請求項1に記載のコンジュゲート
またはその塩もしくは溶媒和物。 - 架橋剤はジビニルスルホンである、請求項1〜4のいずれか1項に記載のコンジュゲート。
- Yが、配列番号5から選択されるGLP−1/グルカゴンアゴニストである、
請求項1〜10のいずれか1項に記載のコンジュゲート。 - Yが、配列番号6から選択されるGLP−1/グルカゴンアゴニストである、
請求項1〜10のいずれか1項に記載のコンジュゲート。 - 架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルであって、
単量体二糖単位の0.001〜20mol%がジビニルスルホンにより架橋され;
単量体二糖単位の0.5〜5mol%が−L1−L2−L−Y−R20基を有し;
−L1−L2−L−Y基は式(IIIb)により表される構造を有し;
L1は、ヒアルロン酸のベータ−1,3−D−グルクロン酸のカルボキシ基とアミド結合を形成して、末端アミノ基を介してヒドロゲルに結合しており;
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルの単量体二糖単位の0.2〜30mol%が−L1−Z−OH基を有し;
Zは、−CH2−CH2−であり;
Zは、末端基を介してL1に結合しており;
Yは、配列番号5を有するペプチド部分である、
該架橋ヒアルロン酸ヒドロゲルを含む、請求項1に記載のコンジュゲート。 - 請求項1〜13のいずれか1項に記載のコンジュゲートまたはその薬学的塩を、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤と一緒に含む医薬組成物。
- 請求項14に記載の医薬組成物および粘度調整剤。
- 粘度調整剤がヒアルロン酸である、請求項15に記載の医薬組成物。
- 粘度調整剤は、5〜30重量/容積パーセントの濃度のヒアルロン酸である、
請求項16に記載の医薬組成物。 - 注射用製剤の形態の請求項14〜17のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 内径が0.26mm(26ゲージ)より小さな針を介する注射によって投与することができる、注射用製剤の形態の、請求項14〜18のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 1mLの容積を、26ゲージの針を介して20ニュートンに等しい/未満の力を加えることによって室温で10秒以内に押し出すことができる、注射用製剤の形態の、請求項18または19に記載の医薬組成物。
- 懸濁液の形態の請求項14〜20のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載のコンジュゲートが0.5〜8重量/容積パーセントの濃度を有する、懸濁液の形態の請求項14〜21のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜13いずれか1項に記載のコンジュゲートが1.5〜3重量/容積パーセントの濃度を有する、懸濁液の形態の請求項14〜22のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- コンジュゲートが、1回の適用で治療有効量のGLP1/グルカゴンアゴニストを少なくとも6日間供給するのに十分なように組成物に加えられる、請求項14〜23のいずれか1項に記載の組成物。
- 1回量組成物である、請求項14〜24のいずれか1項に記載の組成物。
- 医薬として使用する請求項1〜13のいずれか1項に記載のコンジュゲートまたは請求項14〜25のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- GLP−1/グルカゴンアゴニストにより治療することができる疾患または障害を治療または予防する方法における使用のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のコンジュゲートまたは請求項14〜25のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 糖尿病を治療または予防する方法における使用のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のコンジュゲートまたは請求項14〜25のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 異脂肪血症を治療または予防する方法における使用のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のコンジュゲートまたは請求項14〜25のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 代謝症候群を治療または予防する方法における使用のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のコンジュゲートまたは請求項14〜25のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 肥満を治療または予防する方法における使用のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のコンジュゲートまたは請求項14〜25のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 肝臓脂肪症を治療または予防する方法における使用のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載のコンジュゲートまたは請求項14〜25のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 1型糖尿病、2型糖尿病、肥満または高血糖の治療方法における使用のための、請求項1〜13のいずれか1項に記載の少なくとも1つのコンジュゲートを含む組成物であって、26ゲージまたはそれより大きい針を有するチューブを含む注射装置を介して皮下投与されることを特徴とし、週1回投与される前記組成物。
- 注射装置であって、1型糖尿病、2型糖尿病、肥満または高血糖の治療方法における使用のための、28またはそれより大きいゲージを有するチューブを含み、請求項1〜13のいずれか1項に記載のコンジュゲートをさらに含む前記注射装置。
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