WO2021235662A1 - 펩타이드 가교제를 이용한 히알루론산 기반의 하이드로겔 및 이의 제조 방법 - Google Patents

펩타이드 가교제를 이용한 히알루론산 기반의 하이드로겔 및 이의 제조 방법 Download PDF

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peptide
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강준구
이성진
김석진
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Definitions

  • the present invention relates to a hyaluronic acid-based hydrogel and a method for preparing the same, and more particularly, to a cross-linked product of hyaluronic acid-peptide obtained by cross-linking hyaluronic acid using a peptide cross-linking agent and a method for preparing the same.
  • Hyaluronic acid is a biocompatible material, which is a major raw material for dermal fillers, but has a very short half-life (> 1 day).
  • the hyaluronic acid-crosslinking process using a crosslinking agent can increase the decomposition period of hyaluronic acid and physical properties such as viscoelasticity.
  • crosslinking agents such as DVS (Divinyl sulfone) and PEGDGE (Poly (ethylene glycol) diglycidyl ether) have been used.
  • the crosslinking reaction with hyaluronic acid is formed by the reaction of the primary alcohol group of hyaluronic acid with the epoxide group of BDDE in a basic aqueous solution as shown in Scheme 1 below to form an ether bond.
  • an amount of about 5 to 10 mol% of the BDDE crosslinking agent is reacted with hyaluronic acid to form a hyaluronic acid-crosslinking filler.
  • hyaluronic acid-crosslinking filler a lot of time and money are incurred in the purification process of removing the used BDDE crosslinking agent, and after injecting the filler into the body with the BDDE compound that has not been removed later, adverse reactions and side effects occur.
  • the present invention cross-links hyaluronic acid or a salt thereof using a peptide cross-linking agent, has few side effects, is safe, has a high elastic ratio, and is a peptide cross-linking agent and a hyaluronic acid-peptide cross-linked product obtained through this cross-linking process
  • An object of the present invention is to provide a hydrogel based on hyaluronic acid. This hyaluronic acid-based hydrogel is useful as a filler for human injection.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a hydrogel based on such a peptide crosslinking agent and hyaluronic acid.
  • the present invention provides a hyaluronic acid-based hydrogel comprising a peptide cross-linking agent and hyaluronic acid or a salt thereof, the peptide cross-linking agent and the hyaluronic acid-based hydrogel, and a method for producing the peptide cross-linking agent do.
  • the hyaluronic acid-based hydrogel is a hyaluronic acid-peptide crosslinked product crosslinked with hyaluronic acid using the peptide crosslinking agent.
  • Hyaluronic acid is an anionic glycosaminoglycan distributed in epithelial and neural tissues. It is a major component of the extracellular matrix and is necessary for wound healing due to its important role in tissue regeneration, inflammatory response and angiogenesis. It is a substance that performs various functions in relation to human skin by playing an important role in re-epithelialization in which the skin surface that has been removed from the epidermis re-proliferates even in normal epidermis.
  • a hyaluronic acid-peptide crosslinked product formed by using such hyaluronic acid as a monomer and the peptide crosslinking agent, that is, a hyaluronic acid-based hydrogel.
  • the salt of hyaluronic acid may be, for example, at least one selected from the group consisting of sodium hyaluronate, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, zinc hyaluronate, cobalt hyaluronate, and tetrabutylammonium hyaluronate, but is limited thereto no.
  • the hyaluronic acid or salt may have a weight average molecular weight (Mw) of 200 to 5,000 kDa, 500 to 4,000 kDa, 6 00 to 3,000 kDa, or 700 to 1,000 kDa.
  • Mw weight average molecular weight
  • hyaluronic acid or a salt thereof within the weight average molecular weight range, reactivity with a crosslinking agent and ease of hydrogel production can be improved, and physical properties of the prepared hydrogel can be improved.
  • the hyaluronic acid-based hydrogel according to the present invention includes a peptide crosslinking agent and hyaluronic acid, and through a crosslinking reaction, the carboxylic acid group of hyaluronic acid and the amine group of the peptide crosslinking agent react to form an amide ( amide) bond is formed, and may preferably have a structure of the following formula (1).
  • n is an integer of 500 to 1,400, and L includes 3 to 10 amino acids.
  • the L is a structure formed by a peptide crosslinking agent and may include 3 to 9 types, 3 to 8 types, 3 to 7 types, 3 to 6 types, or 3 to 5 types of amino acids.
  • the amino acid may be used without limitation as long as it is an amino acid capable of forming a peptide, for example, glutamic acid (Glu), aspartic acid (Asp), glutamine (Gln), asparagine (Asn), histidine (His), lysine (Lys) ), arginine (Arg), serine (Ser), cysteine (Cys), beta alanine ( ⁇ -Ala), alanine (Ala), glycine (Gly), leucine (Leu), isoleucine (Ile), valine ( Val), threonine (Thr), methionine (Met), proline (Pro), phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr) and tryptophan (Trp) may be an amino acid selected from the group consisting of.
  • the L preferably includes one or more lysine.
  • the hyaluronic acid contained in the hyaluronic acid-based hydrogel according to the present invention has a molecular weight of 200,000 to 300,000 Da, 200,000 to 400,000 Da, 200,000 to 500,000 Da, 200,000 to 600,000 Da, 200,000 to 700,000 Da, 200,000 to 800,000 Da, 200,000 to 900,000 Da, 200,000 to 1,000,000 Da, 200,000 to 1,100,000 Da, 200,000 to 1,200,000 Da, 300,000 to 400,000 Da, 300,000 to 500,000 Da, 300,000 to 600,000 Da, 300,000 to 700,000 Da, 300,000 to 800,000 Da, 300,000 to 900,000 Da, 300,000 to 1,000,000 Da, 300,000 to 1,100,000 Da, 300,000 to 1,200,000 Da, 400,000 to 500,000 Da, 400,000 to 600,000 Da, 400,000 to 700,000 Da, 400,000 to 800,000 Da, 400,000 to 900,000 Da, 400,000 to 1,000,000 Da, 400,000 to 1,100,000 Da, 400,000 to 600,000
  • crosslinking in the term “crosslinking agent” refers to a bonding reaction that connects one polymer chain to the same or another chain. Such a connection may be in the form of a covalent bond or an ionic bond. As the number of cross-links increases, solubility and thermoplasticity decrease, but mechanical strength increases and the elasticity of the polymer compound increases.
  • Crosslinking agents used to crosslink hyaluronic acid include conventional BDDE (1,4-Butanediol diglycidyl ether), DVS (Divinyl sulfone), PEGDGE (Poly (ethylene glycol) diglycidyl ether), and 1,6-hexanediol diglycidyl ether.
  • Diyl ether (1,6-hexanediol diglycidyl ether), propylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether (poly(propylene glycol) diglycidyl ether), polytedramethylene glycol di
  • glycidyl ether poly(tetramethylene glycol) diglycidyl ether
  • Cross-linked hyaluronic acid forms a matrix, which may have a network of cross-linked or non-cross-linked polysaccharides in solution or gel form.
  • the peptide crosslinking agent is a primary alcohol group of hyaluronic acid and an epoxide group of BDDE in a basic aqueous solution of BDDE, which is commonly used for crosslinking of hyaluronic acid in the prior art.
  • BDDE basic aqueous solution of BDDE
  • the peptide crosslinking agent may include 3 to 10, 3 to 9, 3 to 8, 3 to 7, 3 to 6, or 3 to 5 amino acids.
  • the amino acid may be used without limitation as long as it is an amino acid capable of forming a peptide, for example, glutamic acid (Glu), aspartic acid (Asp), glutamine (Gln), asparagine (Asn), histidine (His), lysine (Lys) ), arginine (Arg), serine (Ser), cysteine (Cys), beta alanine ( ⁇ -Ala), alanine (Ala), glycine (Gly), leucine (Leu), isoleucine (Ile), valine ( Val), threonine (Thr), methionine (Met), proline (Pro), phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr) and tryptophan (Trp) may be an amino acid selected from the group consisting of.
  • the peptide cross may be
  • the peptide crosslinking agent according to the present invention may have any one of the structures of Formulas 2 to 4 below.
  • X 3 , Y 4 and Z 5 are each independently lysine (Lys),
  • X 1 , X 2 , Y 1 , Y 2 , Y 3 , Z 1 , Z 2 , Z 3 and Z 4 are each independently glutamine (Gln), asparagine (Asn), serine (Ser), cysteine (Cys), Beta Alanine ( ⁇ -Ala), Alanine (Ala), Glycine (Gly), Leucine (Leu), Isoleucine (Ile), Valine (Val), Threonine (Thr), Methionine (Met), Proline (Pro) , may be selected from the group consisting of phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr) and tryptophan (Trp), but is not limited thereto.
  • the lysine of X 3 , Y 4 and Z 5 may include an amide group (-CONH 2 ) instead of a carboxyl group (-COOH).
  • the peptides cross-linking agent according to the invention to form a carboxylic acid (carboxylic acid) groups and amide (amide) bond in the crosslinked hyaluronic acid proceeds.
  • the present invention provides glutamic acid (Glu), aspartic acid (Asp), glutamine (Gln), asparagine (Asn), histidine (His), lysine (Lys), arginine (Arg), serine (Ser), cysteine (Cys) ), beta alanine ( ⁇ -Ala), alanine (Ala), glycine (Gly), leucine (Leu), isoleucine (Ile), valine (Val), threonine (Thr), methionine (Met), proline ( Pro), phenylalanine (Phe), tyrosine (Tyr) and tryptophan (Trp) It relates to a method for producing a peptide crosslinking agent comprising the step of synthesizing a peptide using 1 to 10 amino acids selected from the group consisting of.
  • peptide synthesis method conventionally known methods for synthesizing peptides (for example, solution phase synthesis method or solid phase synthesis method) can be used without limitation, but preferably, a solid phase peptide synthesis method that is easy to separate and purify and can be automated (Solid phase) peptide synthesis (SPPS) can be used.
  • SPPS Solid phase peptide synthesis
  • a peptide crosslinking agent can be prepared using an amino acid whose N-terminus is protected by a Fmoc (fluorenylmethyloxycarbonyl) protecting group.
  • the method for preparing the peptide crosslinking agent may include the following steps:
  • the polymer support resin used in step i) may be selected from the group consisting of polystyrene, polyamide, glass or silica.
  • Rink Amide MBHA resin was used.
  • the amino acids used in the preparation of the peptide have an amine terminus and side chains Boc (tert-butoxycarbonyl), Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl), Cbz (benzyloxycarbonyl), tBu (tert-butyl), StBu (tert). -butylthio), Trt (triphenylmethyl; trityl), Acm (acetamidomethyl), or Tacm (trimethylacetamido-methyl) may be protected with a protecting group.
  • it is protected with a Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) protecting group.
  • At least one of the amino acids constituting the peptide in step iii) is lysine.
  • the coupling agent used in step iii) is NHS (N-hydroxysulfosuccinimide), HOBt (1-hydroxybenzotriazole), HOOBt (3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), of HOAt (1-hydroxy-7-azabenzotriazole), Sul-NHS (Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide) and TBTU [O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate] It may be one selected from the group consisting of salts or a mixture thereof, preferably HOBt (1-hydroxybenzotriazole), but is not limited thereto.
  • reaction solvent of the present invention dichloromethane, dimethylformamide, dimethylacetamide, N-methylpyrrolidinone, or a mixed solvent thereof, which are generally used in chemical reactions, are used as the reaction solvent, and preferably, dichloromethane , a dimethylformamide solvent and a mixed solvent.
  • the reaction temperature of the reactions disclosed herein is not limited thereto, but preferably ranges from 0°C to 70°C, more preferably from 20°C to 40°C.
  • the reaction time is in the range of 10 minutes to 48 hours, preferably in the range of 1 hour to 24 hours in consideration of the reactivity of each reactant and the productivity of the product after the reaction. However, when the reaction does not proceed as much as desired, the same reaction may be performed 2 to 5 more times to increase the reaction yield.
  • the present invention may further include the step of determining whether a reaction occurs when amino acids are bound using the coupling agent.
  • the reaction was confirmed by Kaiser test. This step of checking whether the coupling reaction is carried out may be preferably performed after step iii) in which the reaction is performed.
  • the N-terminal protecting group preferably the Fmoc group
  • a DMF solution specifically, a DMF solution diluted with 20% piperidine
  • the resin and the protecting group can be separated by adding a weakly acidic cleavage solution such as an aqueous solution of trifluoroacetic acid (TFA), an aqueous solution of triisopropylsilane (TIS), a mixed aqueous solution of TFA:TIS, or dichloromethane (DCM).
  • a weakly acidic cleavage solution such as an aqueous solution of trifluoroacetic acid (TFA), an aqueous solution of triisopropylsilane (TIS), a mixed aqueous solution of TFA:TIS, or dichloromethane (DCM).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • TFS triisopropylsilane
  • DCM dichloromethane
  • the present invention relates to a method for preparing a hyaluronic acid-based hydrogel, which is a crosslinked hyaluronic acid-peptide, comprising the following steps:
  • step i) After adding distilled water to hyaluronic acid, the peptide crosslinking agent, coupling agent, auxiliary coupling agent, and base synthesized in step i) are added to prepare a hyaluronic acid crosslinker including a peptide crosslinking agent.
  • Step i) of the hyaluronic acid-based hydrogel preparation method may be performed by a solid-phase peptide synthesis method.
  • the peptide crosslinking agent used in step ii) of the hyaluronic acid-based hydrogel manufacturing method is 0.01-0.1 equivalent compared to the disaccharides (D-glucuronic acid and N-acetylglucosamine), which are components of hyaluronic acid.
  • the coupling agent is EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), ETC [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide], CMC [1-cyclohexyl-3-( 2-morpholinoethyl) carbodiimide] and salts thereof, or a mixture thereof, preferably EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride). It is not limited.
  • the auxiliary coupling agent is NHS (N-hydroxysulfosuccinimide), HOBt (1-hydroxybenzotriazole), HOOBt (3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), HOAt ( 1-hydroxy-7-azabenzotriazole), Sul-NHS (Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide), TBTU [O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate] and their It may be one selected from the group consisting of salts or a mixture thereof, preferably HOBt (1-hydroxybenzotriazole), but is not limited thereto.
  • the base is one selected from the group consisting of DIPEA [N,N-Diisopropylethylamine], TEA (triethylamine), TDA-1 ⁇ Tris[2-(2-methoxyethoxy)ethyl]amine ⁇ and salts thereof Or it may be a mixture thereof, preferably DIPEA [N,N-Diisopropylethylamine], but is not limited thereto.
  • Step ii) of the preparation method may be carried out at a temperature of 2 hours, 4 hours, 8 hours, 16 hours or 24 hours, and at a temperature of 20° C. to 40° C., and preferably the reaction may proceed at room temperature for 24 hours.
  • step iii) washing the crosslinked product prepared in step ii) with a phosphate-buffered saline (PBS) solution to remove unreacted substances;
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the washing with the phosphate buffered saline solution in step iii) may be performed several times.
  • the crosslinked product may be pulverized to a particle size of about 100 to 500 ⁇ m, and in step v) may be sterilized at a temperature of 8 to 20 minutes and 121°C to 135°C, preferably 121°C It may be to sterilize for 15 minutes in
  • the physical properties of the hyaluronic acid-based hydrogel according to the present invention were analyzed using a rotational rheometer.
  • Rheometer analysis was measured in the frequency range of 0.1 to 1 Hz, and after adding the sample to the Plate-Plate, it was rotated at a shear rate of 10 -1 for 0.1 second and the upper part was rotated at a rate of 0.1 mm/s.
  • the value of the normal force (Normal Force) when the plate was dropped was measured.
  • the injection ability of the prepared crosslinked product was measured by installing a syringe containing 1 ml of the crosslinked product in a syringe ability test machine and analyzing it at a speed of 12 mm/min. . Through physical property analysis, elasticity, viscosity, tan ⁇ , complex viscosity, and injection force can be measured.
  • elasticity refers to a property that when a force is applied to a substance or an object, the shape changes when a force is added, but returns to its original state when the force is removed.
  • G ⁇ elastic modulus, storage modulus
  • Pa the unit is expressed as Pa.
  • viscosity refers to the resistance of fluids that appear when the shape changes or the property that parts that are attached to each other do not fall off. This viscosity is expressed as G ⁇ (viscous modulus, loss modulus), and the unit is expressed as Pa.
  • Tan ⁇ is a numerical value indicating whether a substance is closer to a solid or a liquid, and is expressed as G ⁇ /G’. The lower the Tan ⁇ is, the more solid it is, and the higher the Tan ⁇ is, the more liquid it is.
  • composite viscosity is a method of expressing a viscosity including G' and G', and it is dependent on the value of the frequency ( ⁇ ), and the value is obtained by the following formula. These complex viscosities are
  • injection force refers to the value of the force when the needle 27G is connected to the syringe to which the crosslinking filler is added, and the syringe pusher is pushed at a speed of 12.0 mm/min, and the unit of this injection force is denoted by N.
  • the complex viscosity over time of the samples was checked with a rheometer, similar to the viscosity, to confirm the resolution of the crosslinked product.
  • the crosslinked product and the phosphate buffer are added to the falcon tube and stirred. After the mixture was left at 37° C. for 72 hours, a Coomassie Brilliant Blue solution was added to confirm layer separation and color difference. Using the layer separation as a boundary, the volume of the hyaluronic acid-peptide complex hydrogel submerged in the lower layer was confirmed and applied to the following Equation 1 to confirm the absorption capacity.
  • the hyaluronic acid-based hydrogel according to the present invention has high stability and elasticity due to the use of a peptide crosslinking agent, and thus can be used as a composition for injection into the body, and can be very usefully used for cosmetic or therapeutic purposes. Accordingly, the present invention provides a composition for injection into the body comprising the hyaluronic acid-crosslinked body.
  • the composition for injection into the body may be used in various fields, for example, as fillers or implants for facial plastic surgery or tissue repair, anti-adhesion agents, or orthopedic adjuvants. In addition to this, it can be used as a dental filler, a cell support, or a drug delivery system.
  • it may be used in the treatment of temples, subdermal support of the eyebrows, cheek and cheek fat pads, lacrimal gutter, nose, lips, cheeks, periorbital area, suborbital area, facial asymmetry, mandible line, and jaw .
  • the present invention provides a method for improving wrinkles or tissue repair or volume increase, comprising administering the hyaluronic acid-based hydrogel.
  • a method of injecting a composition for injection into the body comprising a hyaluronic acid-based hydrogel, etc. and through this injection method, various wrinkles as exemplified above can be improved, and tissue repair or It can increase the volume of the tissue.
  • the tissue may be a soft tissue such as lips, nose, buttocks, cheeks, or breasts.
  • the hyaluronic acid hydrogel may be administered in a dosage form suitable for this use, preferably an injection, more preferably a pre-filled injection (prefilled syringe).
  • the peptide crosslinked filler of the present invention has fewer side effects than the previous BDDE crosslinker filler, is safer, and has the characteristics of being able to control the physical properties of the filler according to the amount of peptide crosslinking.
  • it in terms of physical properties, it has a higher elastic ratio than existing fillers, so it is useful because it is possible to diversify filler products and satisfy the needs of new consumers.
  • it can be applied to eye drops and knee arthritis, which are products that emphasize safety.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an example of the manufacturing process of a hyaluronic acid-based hydrogel using a peptide crosslinking agent according to the present invention .
  • Tri-peptide synthesis which is a peptide crosslinking agent of the present invention
  • Rink amide MBHA resin (0.502 mmol/g) purchased from Novabiochem was weighed and placed in a reaction vessel. The resin was swelled for 5 minutes using DMF (N,N-Dimethylformamide), and the solvent was removed under reduced pressure.
  • the coupling reaction was confirmed using a qualitative method called the kaiser test (E. Kaiser et al., Anal. Biochem . 1970, 34, 595).
  • the Kaiser solution consists of three types. has been [a. ninhydrin (5 g) + ethanol (100 ml); b. phenol (80 g) + ethanol (20 ml); c. pyridine (98 ml) + 0.002 M aq. KCN (2 ml)]
  • the resin was washed, and then 2-3 drops of three Kaiser test solutions were added, followed by heating at 120° C. for 3 minutes. When the unreacted part remained, the color of the resin showed a blue light, and when it was completely reacted, there was no change in the color of the resin.
  • Example 1d Add 10 ml of distilled water to 1 g of hyaluronic acid, and 0.012 equivalents (Example 1a), 0.014 equivalents (Example 1b), 0.016 equivalents (Example 1c), 0.018 equivalents (Example 1c), 0.018 equivalents of the tri-peptide synthesized in Example 1 Example 1d), and EDC[1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide; 0.01 to 0.1 equivalent], HOBt [1-Hydroxybenzotriazole; 0.01 to 0.1 equivalent], DIPEA [N,N-Diisopropylethylamine; 0.02 to 0.2 equivalent) reagent was added and the reaction was carried out at room temperature for 24 hours.
  • the prepared cross-linked product was washed several times with a phosphate-buffered saline (PBS) solution to remove unreacted substances, and the washed cross-linked product was pulverized to adjust the particle size to a particle size of about 100 ⁇ 500 ⁇ m, and then at 121 °C. was sterilized for 15 min.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the concentration of the crosslinked product was prepared at 20 mg/PBS 1 ml, and then analyzed using a rotational rheometer. At this time, the rheometer analysis was measured in the frequency range of 0.02 Hz, and after adding the sample to the Plate-Plate, it was rotated at a shear rate of 10 -1 for 0.1 second and at a rate of 0.1 mm/s. The value of the normal force when the upper plate was dropped was measured.
  • injection ability (injection power) of the prepared crosslinked product was analyzed at a rate of 12 mm/min after mounting a syringe containing 1 ml of the crosslinked product in a syringe ability test machine, and the injection force The values were measured.
  • Example 2 0.6 g of the hyaluronic acid-peptide cross-linked product (Examples 1a to 1d) was weighed in a micro 2 ml tube, and then 6 ⁇ L of a hyaluronidase solution ( 33 mg/mL) (MP biomedicals). The mixture crosslinked product was sampled at 37° C. for each hour, and the complex viscosity of the samples was checked with a rheometer to confirm the resolution of the crosslinked product.
  • a hyaluronidase solution 33 mg/mL
  • Example 1d it was possible to confirm the resolution of the crosslinked product by confirming the change in the complex viscosity over time.
  • Example 1d it had a viscosity of 3,640,000 at 0 hours, but had a viscosity of 1,740,000 after 4 hours, and it was confirmed that it was decomposed about 52.2% after 4 hours .
  • Example 2 To evaluate the absorption capacity of the prepared Example 2, 0.6 g of a hyaluronic acid-peptide crosslinked product (Examples 1a - 1d) and 10 ml of a phosphate buffer were added to a 50 ml falcon tube, followed by stirring for 5 minutes. After the mixture was left at 37° C. for 72 hours, 100 ⁇ l of a Coomassie Brilliant Blue solution was added to confirm layer separation and color difference. Using the layer separation as a boundary, the volume of the hyaluronic acid-peptide complex hydrogel sinking in the lower layer was confirmed, and the absorption capacity was confirmed by applying Equation 1 below.
  • Example 1a 3.0 0.6 5.00
  • Example 1b 3.0 0.6 5.00
  • Example 1c 2.5 0.6 4.17
  • Example 1d 2.1 0.6 3.50

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Abstract

본 발명은 펩타이드 가교제를 이용하여 가교화된 히알루론산-펩타이드 가교체인 히알루론산 기반의 하이드로겔에 관한 것으로, 보다 상세하게는 종전의 가교제와는 달리 펩타이드 결합을 형성하여 상대적으로 적은 양의 가교제로 새로운 물성의 가교체를 얻고, 부작용이 적고 안전하며 펩타이드 가교량에 따라 필러의 물성을 조절할 수 있고 탄성 비율이 높은 장점을 갖는 히알루론계 하이드로산 기반의 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

펩타이드 가교제를 이용한 히알루론산 기반의 하이드로겔 및 이의 제조 방법
본 발명은 히알루론산 기반의 하이드로겔 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 펩타이드 가교제를 이용하여 히알루론산을 가교화하여 얻어지는 히알루론산-펩타이드의 가교체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
히알루론산 (Hyaluronic acid; HA) 은 생체적합성 소재로써, 더말 필러의 주요한 원재료이지만, 반감기가 매우 짧은 (> 1일) 단점을 가지고 있다. 그러나 가교제를 이용한 히알루론산-가교 결합 과정으로 히알루론산의 분해 기간과 점탄성과 같은 물리적 특성을 증대시킬 수 있다. 이와 같은 가교제 중에서 BDDE (1,4-Butanediol diglycidyl ether) 화합물이 가장 많이 사용되며, 최근에는 DVS (Divinyl sulfone), PEGDGE (Poly (ethylene glycol) diglycidyl ether) 등과 같은 가교제들이 사용되고 있다. 히알루론산과 가교 결합 반응은 아래 반응식 1과 같이 염기성 수용액 상에서 히알루론산의 1차 알코올 (alcohol) 그룹과 BDDE의 에폭사이드 (epoxide) 그룹이 반응하여 에테르 (ether) 결합이 형성되어 이루어지는 것이다.
[반응식 1]
BDDE 가교제를 이용한 히알루론산-가교 결합 방법
Figure PCTKR2021003260-appb-I000001
일반적으로 BDDE 가교제의 5∼10 mol% 정도의 양을 히알루론산과 반응시켜, 히알루론산-가교 결합 필러를 형성한다. 이 때 사용한 BDDE 가교제를 제거하는 정제 과정에서 많은 시간과 비용이 발생하고, 추후에는 제거되지 않은 BDDE 화합물로 필러를 체내에 주입한 후 이상 반응 및 부작용이 발생한다.
상기와 같은 배경하에서, 본 발명자들은 일반적으로 많이 사용하는 BDDE 가교제를 대신하여, 안전한 펩타이드 가교제를 사용하여 히알루론산-가교 결합 반응을 진행하고자 예의 연구를 거듭하였다. 그 결과, 펩타이드 기반의 가교제를 사용하여 히알루론산을 가교 결합시키는 경우 히알루론산의 카르복실산 (carboxylic acid) 그룹과 펩타이드 가교제의 아민 (amine) 그룹이 반응하여 아마이드 (amide) 결합을 형성하게 되며, 이와 같은 반응은 기존의 결합 방법과는 확연히 다른 방법으로써, 상대적으로 적은 양의 가교제로 새로운 물성의 가교 필러를 얻을 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
[반응식 2]
본 발명에 따른 펩타이드 가교제를 이용한 히알루론산-가교 결합 방법
Figure PCTKR2021003260-appb-I000002
따라서, 본 발명은 펩타이드 가교제를 이용하여 히알루론산 또는 이의 염을 가교화하여 부작용이 적고 안전하며, 탄성 비율이 높은 특성을 가지며, 상기 펩타이드 가교제 및 이러한 가교화 과정을 통해 얻은 히알루론산-펩타이드 가교체인 히알루론산 기반의 하이드로겔을 제공하는 것을 목적으로 한다. 이러한 히알루론산 기반의 하이드로겔은 인체 주입용 필러로서 유용하다.
본 발명의 또 다른 목적은 이러한 펩타이드 가교제 및 히알루론산 기반의 하이드로겔을 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
상기와 같은 목적을 해결하기 위해, 본 발명은 펩타이드 가교제 및 히알루론산 또는 이의 염을 포함하는 히알루론산 기반의 하이드로겔, 상기 펩타이드 가교제 및 상기 히알루론산 기반의 하이드로겔 및 상기 펩타이드 가교제의 제조방법을 제공한다. 상기 히알루론산 기반의 하이드로겔은 상기 펩타이드 가교제를 이용하여 히알루론산 가교시킨 히알루론산-펩타이드 가교체이다.
히알루론산은 상피 및 신경 조직에 분포하고 있는 음이온성 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan) 이다. 세포 외 기질의 주성분이며 조직 재생, 염증 반응 및 혈관 형성에 중요한 역할을 하여 상처 치료에 필요하다. 정상적인 표피에서도 벗어진 살갗 표면이 다시 증식하는 재상피화에 중요한 역할을 하여 사람의 피부와 관련하여 여러 가지 기능을 하는 물질이다. 본 발명에서는 이러한 히알루론산을 단량체로 하고 상기 펩타이드 가교제를 사용하여 형성된 히알루론산-펩타이드 가교체, 즉, 히알루론산 기반의 하이드로겔이다. 상기 히알루론산의 염은 예를 들어, 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 및 히알루론산 테트라부틸암모늄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 히알루론산 또는 염은, 중량 평균 분자량 (Mw)이 200 내지 5,000 kDa, 500 내지 4,000 kDa, 600 내지 3,000 kDa, 또는 700 내지 1,000 kDa일 수 있다. 상기 중량 평균 분자량 범위 내의 히알루론산 또는 이의 염을 사용함으로써 가교제와의 반응성 및 하이드로겔 제조의 용이성을 향상시킬 수 있으며, 제조된 하이드로겔의 물성을 개선할 수 있다.
본 발명에 따른 히알루론산 기반의 하이드로겔은 펩타이드 가교제 및 히알루론산을 포함하며, 가교 결합 반응을 통해 히알루론산의 카르복실산 (carboxylic acid) 그룹과 펩타이드 가교제의 아민 (amine) 그룹이 반응하여 아마이드 (amide) 결합이 형성된 것으로, 바람직하게는 하기 화학식 1의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2021003260-appb-I000003
상기 식에서, n은 500 내지 1,400의 정수이고, L은 3종 내지 10종의 아미노산을 포함한다. 상기 L은 펩타이드 가교제에 의해 형성된 구조로 3종 내지 9종, 3종 내지 8종, 3종 내지 7종, 3종 내지 6종 또는 3종 내지 5종의 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 아미노산은 펩타이드를 형성할 수 있는 아미노산이라면 제한없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 글루탐산 (Glu), 아스파트산 (Asp), 글루타민 (Gln), 아스파라긴 (Asn), 히스티딘 (His), 라이신 (Lys), 아르기닌 (Arg), 세린 (Ser), 시스테인 (Cys), 베타 알라닌 (β-Ala), 알라닌 (Ala), 글라이신 (Gly), 루이신 (Leu), 이소루이신 (Ile), 발린 (Val), 트레오닌 (Thr), 메티오닌 (Met), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 타이로신 (Tyr) 및 트립토판 (Trp) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산일 수 있다. 또한, 상기 L은 1 이상의 라이신을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 히알루론산 기반의 하이드로겔에 포함되는 히알루론산은 분자량이 200,000 내지 300,000 Da, 200,000 내지 400,000 Da, 200,000 내지 500,000 Da, 200,000 내지 600,000 Da, 200,000 내지 700,000 Da, 200,000 내지 800,000 Da, 200,000 내지 900,000 Da, 200,000 내지 1,000,000 Da, 200,000 내지 1,100,000 Da, 200,000 내지 1,200,000 Da, 300,000 내지 400,000 Da, 300,000 내지 500,000 Da, 300,000 내지 600,000 Da, 300,000 내지 700,000 Da, 300,000 내지 800,000 Da, 300,000 내지 900,000 Da, 300,000 내지 1,000,000 Da, 300,000 내지 1,100,000 Da, 300,000 내지 1,200,000 Da, 400,000 내지 500,000 Da, 400,000 내지 600,000 Da, 400,000 내지 700,000 Da, 400,000 내지 800,000 Da, 400,000 내지 900,000 Da, 400,000 내지 1,000,000 Da, 400,000 내지 1,100,000 Da, 400,000 내지 1,200,000 Da, 500,000 내지 600,000 Da, 500,000 내지 700,000 Da, 500,000 내지 800,000 Da, 500,000 내지 900,000 Da, 500,000 내지 1,000,000 Da, 500,000 내지 1,100,000 Da, 500,000 내지 1,200,000 Da, 600,000 내지 700,000 Da, 600,000 내지 800,000 Da, 600,000 내지 900,000 Da, 600,000 내지 1,000,000 Da, 600,000 내지 1,100,000 Da, 600,000 내지 1,200,000 Da, 700,000 내지 800,000 Da, 700,000 내지 900,000 Da, 700,000 내지 1,000,000 Da, 700,000 내지 1,100,000 Da, 700,000 내지 1,200,000 Da, 800,000 내지 900,000 Da, 800,000 내지 1,000,000 Da, 800,000 내지 1,100,000 Da, 800,000 내지 1,200,000 Da, 900,000 내지 1,000,000 Da, 900,000 내지 1,100,000 Da, 900,000 내지 1,200,000 Da, 1,000,000 내지 1,100,000 Da, 1,000,000 내지 1,200,000 Da, 1,100,000 내지 1,200,000 Da 인 히알루론산 일 수 있다.
상기 용어 “가교제”의 “가교”는 하나의 중합체 사슬을, 동일한 또는 다른 사슬에 연결하는 결합 반응을 의미한다. 이러한 연결은 공유 결합 또는 이온 결합의 형태를 가질 수 있고 가교 결합의 수가 많아 질수록 가용성과 열가소성은 줄어들지만 기계적 강도가 커지고 고분자 화합물의 탄성이 커지는 효과가 있다. 히알루론산을 가교화하기 위해 사용되는 가교제로는 종래 BDDE (1,4-Butanediol diglycidyl ether), DVS (Divinyl sulfone), PEGDGE (Poly (ethylene glycol) diglycidyl ether), 1,6-헥산디올 디글리시딜 에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌 글리콜 디글리시딜 에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(propylene glycol) diglycidyl ether), 폴리테드라메틸렌글리콜 디글리시딜 에테르 (poly(tetramethylene glycol) diglycidyl ether) 등을 사용하였으나, 본 발명의 히알루론산 기반의 하이드로겔은 상기 설명된 가교제가 아닌 이하 설명하는 새로운 펩타이드 가교제를 이용하여 가교된 것을 특징으로 한다. 가교화된 히알루론산의 경우 매트릭스를 형성하며, 이러한 매트릭스는 용액 또는 겔 형태의 가교 결합 또는 비가교 결합된 다당류의 네트워크를 가질 수 있다.
본 발명에 따른 히알루론산 기반의 하이드로겔에서, 상기 펩타이드 가교제는 종래 히알루론산의 가교화에 많이 사용되는 BDDE가 염기성 수용액 상에서 히알루론산의 1차 알코올 (alcohol) 그룹과 BDDE의 에폭사이드 (epoxide) 그룹이 반응하여 에테르 (ether) 결합이 형성하는 것과는 달리 히알루론산의 카르복실산 (carboxylic acid) 그룹과 펩타이드 가교제의 아민 (amine) 그룹이 반응하여 아마이드 (amide) 결합을 형성하게 된다.
바람직하게, 상기 펩타이드 가교제는 3종 내지 10종, 3종 내지 9종, 3종 내지 8종, 3종 내지 7종, 3종 내지 6종 또는 3종 내지 5종의 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 아미노산은 펩타이드를 형성할 수 있는 아미노산이라면 제한없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 글루탐산 (Glu), 아스파트산 (Asp), 글루타민 (Gln), 아스파라긴 (Asn), 히스티딘 (His), 라이신 (Lys), 아르기닌 (Arg), 세린 (Ser), 시스테인 (Cys), 베타 알라닌 (β-Ala), 알라닌 (Ala), 글라이신 (Gly), 루이신 (Leu), 이소루이신 (Ile), 발린 (Val), 트레오닌 (Thr), 메티오닌 (Met), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 타이로신 (Tyr) 및 트립토판 (Trp) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산일 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 가교제는 1 이상의 라이신을 포함하는 것이 바람직하다.
바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 펩타이드 가교제는 하기 화학식 2 내지 4중 어느 하나의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2021003260-appb-I000004
[화학식 3]
Figure PCTKR2021003260-appb-I000005
[화학식 4]
Figure PCTKR2021003260-appb-I000006
상기 식에서,
X3, Y4 및 Z5은 각각 독립적으로 라이신 (Lys)이고,
X1, X2, Y1, Y2, Y3, Z1, Z2, Z3 및 Z4는 각각 독립적으로 글루타민 (Gln), 아스파라긴 (Asn), 세린 (Ser), 시스테인 (Cys), 베타 알라닌 (β-Ala), 알라닌 (Ala), 글라이신 (Gly), 루이신 (Leu), 이소루이신 (Ile), 발린 (Val), 트레오닌 (Thr), 메티오닌 (Met), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 타이로신 (Tyr) 및 트립토판 (Trp) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 2 내지 4에서 X3, Y4 및 Z5의 라이신은 카복실기 (-COOH) 대신 아마이드기 (-CONH2)를 포함할 수 있다.
상기 화학식 2 내지 4에서도 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 가교제는 히알루론산의 카르복실산 (carboxylic acid) 그룹과 아마이드 (amide) 결합을 형성하여 가교화를 진행시킨다.
또한, 본 발명은 글루탐산 (Glu), 아스파트산 (Asp), 글루타민 (Gln), 아스파라긴 (Asn), 히스티딘 (His), 라이신 (Lys), 아르기닌 (Arg), 세린 (Ser), 시스테인 (Cys), 베타 알라닌 (β-Ala), 알라닌 (Ala), 글라이신 (Gly), 루이신 (Leu), 이소루이신 (Ile), 발린 (Val), 트레오닌 (Thr), 메티오닌 (Met), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 타이로신 (Tyr) 및 트립토판 (Trp) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 10종의 아미노산을 사용하여 펩타이드를 합성하는 단계를 포함하는 펩타이드 가교제의 제조방법에 관한 것이다.
펩타이드의 합성 방법에는 종래 공지된 펩타이드의 합성 방법(예를 들어 용액상 합성 방법 또는 고체상 합성 방법)을 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게, 분리 정제가 간편하고 자동화가 가능한 고체상 펩타이드 합성 방법(Solid phase peptide synthesis; SPPS)을 사용할 수 있다. 본 발명에서는 고체상 펩타이드 합성 방법에 따라 펩타이드 합성시, 아미노산의 N-말단이 Fmoc (fluorenylmethyloxycarbonyl) 보호기로 보호되어 있는 아미노산을 이용하여 펩타이드 가교제를 제조할 수 있다.
구체적인 일 양태로서, 상기 펩타이드 가교제의 제조방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
i) 고분자 지지체 수지에 첫 번째 아미노산의 측쇄 또는 C-말단을 결합시키는 단계;
ii) 상기 첫 번째 아미노산 N-말단의 보호기를 제거하는 단계;
iii) 커플링제를 사용하여 아미노산을 순차적으로 결합시켜 펩타이드를 합성하는 단계; 및
iv) 단계 iii)에서 합성된 펩타이드로부터 수지 및 보호기를 제거하는 단계.
상기 단계 i)에서 사용되는 고분자 지지체 수지는 폴리스티렌, 폴리아미드, 유리 또는 실리카로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 일 실시예에서는 Rink Amide MBHA 수지를 사용하였다.
본 발명에 따른 제조방법에서, 펩타이드의 제조에 사용되는 아미노산은 아민 말단 및 측쇄가 Boc(tert-butoxycarbonyl), Fmoc(9- fluorenylmethoxycarbonyl), Cbz(benzyloxycarbonyl), tBu(tert-butyl), StBu(tert-butylthio), Trt(triphenylmethyl; trityl), Acm(acetamidomethyl) 또는 Tacm(trimethylacetamido-methyl)로 선택되는 보호기로 보호된 것일 수 있다. 바람직하게는 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 보호기로 보호된 것이다.
바람직하게는 상기 단계 iii)에서 펩타이드를 구성하는 아미노산 중 1 이상은 라이신이다.
또한 상기 단계 iii)에서 사용되는 커플링제는 NHS (N-hydroxysulfosuccinimide), HOBt(1-hydroxybenzotriazole), HOOBt (3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), HOAt (1-hydroxy-7-azabenzotriazole), Sul-NHS (Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide) 및 TBTU [O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate] 의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 이들의 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 HOBt (1-hydroxybenzotriazole) 일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 반응 용매로는 화학반응에서 일반적으로 사용되는 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리디논, 또는 이들의 혼합 용매를 반응 용매로 사용하며, 바람직하게는, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드 용매 및 혼합 용매이다. 본 명세서에 개시된 반응들의 반응 온도는 그 제한은 없으나, 바람직하게는 0℃ 내지 70℃, 보다 바람직하게는 20℃ 내지 40℃의 범위이다. 반응시간은 10분 내지 48시간의 범위이며, 바람직하게는 각 반응물질의 반응성과 반응 후 생성물의 생산성을 고려할 때, 1시간 내지 24시간의 범위이다. 단, 원하는 만큼 반응이 진행되지 않았을 경우에는 동일 반응을 2회 내지 5회 더 수행하여 반응 수율을 높일 수 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 커플링제를 사용하여 아미노산이 결합된 경우 반응이 되었는지 여부를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 실시예에서는 반응 여부를 Kaiser test로 확인하였다. 이러한 커플링 반응 여부 확인 단계는 바람직하게는 상기 반응이 이루어지는 단계 iii) 후에 수행될 수 있다.
또한, 상기 ii) 단계에서 N-말단의 보호기, 바람직하게 Fmoc 그룹은 DMF 용액(구체적으로, 20% 피페리딘으로 희석된 DMF 용액)을 이용하여 제거할 수 있다.
상기 iv) 단계에서 수지 및 보호기는 TFA(trifluoroacetic acid) 수용액, TIS(triisopropylsilane) 수용액, TFA:TIS 혼합 수용액, 또는 DCM(dichloromethane) 등의 약산성 분해(cleavage) 용액을 첨가하여 분리할 수 있다. 본 발명에 따른 일 실시예에서는 cleavage cocktail [TFA:H2O=95:5 (v/v)] 용액을 이용하여 제거할 수 있었다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 히알루론산-펩타이드 가교체인 히알루론산 기반의 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다:
i) 글루탐산 (Glu), 아스파트산 (Asp), 글루타민 (Gln), 아스파라긴 (Asn), 히스티딘 (His), 라이신 (Lys), 아르기닌 (Arg), 세린 (Ser), 시스테인 (Cys), 베타 알라닌 (β-Ala), 알라닌 (Ala), 글라이신 (Gly), 루이신 (Leu), 이소루이신 (Ile), 발린 (Val), 트레오닌 (Thr), 메티오닌 (Met), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 타이로신 (Tyr) 및 트립토판 (Trp) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 내지 10종의 아미노산을 사용하여 펩타이드 가교제를 제조하는 단계: 및
ii) 히알루론산에 증류수를 첨가한 후, 단계 i)에서 합성된 펩타이드 가교제, 커플링제, 보조 커플링제, 염기를 첨가하여 펩타이드 가교제를 포함하는 히알루론산 가교체를 제조하는 단계.
상기 히알루론산 기반의 하이드로겔 제조방법의 단계 i)은 고체상 펩타이드 합성 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 히알루론산 기반의 하이드로겔 제조방법의 단계 ii)에서 사용되는 펩타이드 가교제는, 히알루론산의 구성 성분인 2당류 (D-glucuronic acid와 N-acetylglucosamine) 대비 0.01-0.1당량이다.
상기 단계 ii)에서 커플링제는 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), ETC [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide], CMC [1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide] 및 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 이들의 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 ii)에서 보조 커플링제는 NHS (N-hydroxysulfosuccinimide), HOBt(1-hydroxybenzotriazole), HOOBt (3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), HOAt (1-hydroxy-7-azabenzotriazole), Sul-NHS (Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide), TBTU [O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate] 및 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 이들의 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 HOBt (1-hydroxybenzotriazole) 일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 ii)에서 염기는 DIPEA [N,N-Diisopropylethylamine], TEA (triethylamine), TDA-1 {Tris[2-(2-methoxyethoxy)ethyl]amine} 및 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 이들의 혼합물일 수 있고, 바람직하게는 DIPEA [N,N-Diisopropylethylamine] 일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법 단계 ii)는 2시간, 4시간, 8시간, 16시간 또는 24시간 및 20℃ 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있고 바람직하게는 24시간 동안 실온에서 반응을 진행할 수 있다.
상기 히알루론산 기반의 하이드로겔 제조방법에서 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다:
iii) 단계 ii)에서 제조된 가교체를 인산완충생리식염수 (Phosphate-buffered saline; PBS) 용액으로 세척하여 미반응물을 제거하는 단계;
iv) 단계 iii)에서 세척된 가교체를 분쇄하는 단계; 및
v) 단계 iv)에서 분쇄된 가교체를 멸균하는 단계.
상기 iii) 단계에서 인산완충생리식염수 용액으로 세척하는 것은 여러 번 수행될 수 있다.
상기 iv) 단계에서 가교체를 100 ~ 500 μm 정도의 입자 크기로 분쇄할 수 있고 v) 단계에서 에서 8분 내지 20분 및 121℃ 내지 135℃의 온도에서 멸균할 수 있고, 바람직하게는 121℃에서 15분간 멸균하는 것일 수 있다.
구체적인 일 실시예에서, 본 발명에 따른 히알루론산 기반의 하이드로겔을 회전형 레오미터 (Rotational rheometer)를 사용하여 물성을 분석하였다. 레오미터 분석은 0.1~1 Hz의 진동수 범위에서 측정하였으며, Plate-Plate에 샘플을 첨가한 후, 0.1초 동안 10-1의 전단속도 (Shear rate)로 회전을 시키고 0.1 mm/s의 속도로 상부 플레이트를 떨어뜨렸을 때의 수직력 (Normal Force) 값을 측정하였다. 또한, 제조된 가교체의 주사능은 주사능 시험기기 (Syringe ability test machine)에 가교체 1 ml이 포함된 실린지를 장착한 후, 12 mm/min의 속도로 분석하여, 주입력 값을 측정하였다. 물성 분석을 통해 탄성, 점성, tan δ, 복합 점도 및 주입력을 측정할 수 있다.
상기 레오미터로 측정한 물성과 관련하여, “탄성”은 물질 또는 물체에 힘을 가했을 때 힘을 더하면 형태가 바뀌지만, 힘을 빼면 원래대로 돌아오는 성질을 의미한다. 이러한 탄성은 G´(elastic modulus, storage modulus)으로 나타내며, 단위는 Pa로 표시를 한다. 탄성값이 클수록 젤이 단단하고 변형에 대하여 저항하는 능력이 크기 때문에, 필러의 주름 개선 효과 측면에서 중요한 의미를 갖는다.
상기 용어 “점성”은 형태가 변화할 때 나타나는 유체의 저항 또는 서로 붙어 있는 부분이 떨어지지 않으려는 성질을 말하며, 잘 흐르는 물체일수록 점성의 값이 작다. 이러한 점성은 G˝(viscous modulus, loss modulus)으로 나타내며, 단위는 Pa로 표시를 한다.
상기 용어 “Tan δ”는 물질이 고체, 액체 중 어느 쪽에 가까운지를 나타내는 수치로써, G˝/ G´으로 나타낸다. Tan δ가 낮을수록 고체 성질을 갖게 되며, 반대로 Tan δ가 높을수록 액체 성질을 갖게 된다.
상기 용어 “복합 점도”는 G´과 G˝값이 포함된 점도를 표현하는 방법으로, 진동수 (ω)의 값에 의존적이며, 하기 식에 의하여 값을 구하게 된다. 이러한 복합 점도는 |η*| (complex viscosity)으로 나타내며, 단위는 mPa·s로 표시를 한다.
Figure PCTKR2021003260-appb-I000007
또한, 상기 용어 “주입력”은 가교 필러를 첨가한 주사기에, 주사침 (27G)을 연결하고, 12.0 mm/min의 속도로 주사기 밀대를 밀어낼 때의 힘의 값을 말하며, 이러한 주입력의 단위는 N 으로 표시를 한다.
본 발명에 따른 히알루론산-펩타이드 가교체의 분해능 평가를 위해 점성과 마찬가지로 레오미터 (Rheometer) 장비로 샘플들의 시간 경과에 따른 복합 점도를 확인하여, 가교체의 분해능을 확인하였다.
본 발명에 따른 히알루론산-펩타이드 가교체의 흡수능 평가를 위해 팔콘 튜브에 가교체와 인산 완충액을 첨가한 후, 교반시킨다. 이와 같은 혼합물을 37 ℃에서 72시간 방치한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue) 용액을 첨가하여, 층 분리 및 색의 차이를 확인한다. 층 분리를 경계로 삼아, 아래 층에 가라앉아 있는 히알루론산-펩타이드 복합체 하이드로겔의 부피를 확인하여 하기 수학식 1에 적용하여, 흡수능을 확인하였다.
[수학식 1]
흡수용매량 = 팽윤된 부피 ÷ 검체의 무게 (ml/g) 식
본 발명에 따른 히알루론산 기반의 하이드로겔은 펩타이드 가교제를 사용함으로 인해 높은 안정성 및 탄성을 가져 체내 주입용 조성물로 사용될 수 있고, 미용 또는 치료적 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 히알루론산-가교체를 포함하는 체내 주입용 조성물을 제공한다. 상기 체내 주입용 조성물은 다양한 분야, 예를 들어 안면 성형용 또는 조직 수복용 필러 또는 임플란트, 유착방지제 또는 정형외과용 보조제로서 사용될 수 있다. 이뿐만 아니라, 치과용 충전재, 세포지지체 또는 약물 전달체 등으로도 다용하게 사용될 수 있다. 이러한 용도의 구체적인 예시로서, 주름, 잔주름, 미간 주름, 비구순 주름, 턱 주름, 마리오네트 주름, 구강 교련, 입주위 주름살, 눈가 잔주름, 피부 함몰부, 흉터, 상처 또는 결손된 피부 (skin depression) 수복용 충전물로 사용, 관자, 눈썹의 진피하 지지부, 광대 및 볼 지방 패드, 눈물 도랑, 코, 입술, 뺨, 입주위 영역, 안와 하 영역, 안면 비대칭, 아래턱선, 및 턱의 치료에 사용될 수 있다.
일 양태로서 본 발명은 상기 히알루론산 기반의 하이드로겔을 투여하는 단계를 포함하는 주름의 개선 방법 또는 조직의 수복 또는 용적의 증가 방법을 제공한다. 히알루론산 기반의 하이드로겔 등을 포함하는 체내 주입용 조성물의 체내 주입 방법에 관하여는 당업계에 잘 알려져 있으며, 이러한 주입 방법을 통해 상기 예시한 바와 같은 다양한 주름을 개선할 수 있고, 조직의 수복 또는 조직의 용적을 증가시킬 수 있다. 구체적으로 상기 조직은 입술, 코, 엉덩이, 볼 또는 가슴과 같은 연조직일 수 있다. 상기 히알루론산 하이드로겔은 이러한 용도에 알맞은 투여형태로 투여될 수 있고, 바람직하게는 주사제, 더욱 바람직하게는 사전충전형 주사제 (프리필드 시린지)일 수 있다.
본 발명의 펩타이드 가교 필러는 이전의 BDDE 가교제 필러보다 부작용이 적고, 안전하며, 펩타이드 가교량에 따라서 필러의 물성을 조절할 수 있는 특징을 가지고 있다. 또한, 물성 측면에서도 기존의 필러보다 탄성 비율이 높은 특징을 가지고 있어, 필러 제품의 다양화 가능성 및 새로운 소비자의 니즈를 충족시킬 수 있어 유용하다. 또한, 안전성이 강조되는 제품인 점안제와 무릎 관절염 분야로의 적용도 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 펩타이드 가교제를 이용한 히알루론산 기반의 하이드로겔의 제조 과정의 일예를 도식화한 도면이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 본 발명에 따른 펩타이드 가교제인 Ala-Leu-Lys-NH2의 합성
본 발명에 따른 펩타이드 가교제 제조를 위하여, [반응식 3]의 공정을 실시하였다.
[반응식 3]
본 발명의 펩타이드 가교제인 트리-펩타이드 합성
Figure PCTKR2021003260-appb-I000008
1) Novabiochem 회사로부터 구입한 Rink amide MBHA resin (0.502 mmol/g) 996 mg (500 umol)을 측량하여, 반응 용기에 넣었다. 레진을 DMF (N,N-Dimethylformamide)를 이용하여, 5분간 팽윤 (swelling)을 하고, 감압 하에서 용매를 제거했다. 레진이 포함된 반응 용기에 20% 피페리딘으로 희석된 DMF 용액을 이용하여, Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl)을 제거한 후에, 아미노산 (3 당량)과 HOBt (1-hydroxybenzotriazole) (3 당량), HBTU ( N,N,N,N - Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uranium hexafluorophosphate) (3 당량), DIPEA (N,N-Diisopropylethylamine) (6 당량)을 첨가하여, 4 시간 동안 반응을 시켰다.
20 반응 후, 레진의 용매 제거 및 세척을 진행한 다음, 20% 피페리딘으로 희석된 DMF 용액을 이용하여, Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) 제거 반응을 진행했다 (5 min X 2회).
3) 아미노산과 레진과의 커플링 반응은, 아미노산 (3 당량)/HOBt (3 당량)/HBTU (3 당량)/DIPEA (6 당량) 시약을 이용하여 4시간 동안 반응을 진행하였다.
4) 커플링 반응 여부는, kaiser test (E. Kaiser et al., Anal. Biochem. 1970, 34, 595)라는 정성적인 방법을 이용하여, 확인을 하였으며, 이 때 Kaiser 용액은 3가지로 구성이 되어 있다. [a. ninhydrin (5 g) + ethanol (100 ml); b. phenol (80 g) + ethanol (20 ml); c. pyridine (98 ml) + 0.002 M aq. KCN (2 ml)] 커플링 반응이 완료된 후, 레진을 세척한 다음, 3가지의 Kaiser test 용액을 2-3방울 첨가한 후에, 120 ℃에서 3분 동안 열을 가하였다. 미반응한 부분이 남아 있을 경우, 레진의 색깔이 푸른색 빛을 나타내며, 완전히 반응한 경우에는 레진의 색깔 변화가 없었다.
5) 2)-4) 과정을 반복하여 원하는 펩타이드 유도체를 합성한 다음, 레진 및 보호기 제거는 cleavage cocktail [TFA:H2O=95:5 (v/v)] 용액을 이용하였다.
실시예 2. 본 발명에 따른 히알루론산-펩타이드의 가교체의 제조
본 발명에 따른 히알루론산 기반의 하이드로겔 제조를 위하여, 다음과 같은 공정을 실시하였다.
히알루론산 1 g에 증류수 10 ml을 첨가하고, 실시예 1에서 합성한 트리-펩타이드를 0.012 당량 (실시예 1a), 0.014 당량 (실시예 1b), 0.016 당량 (실시예 1c), 0.018 당량 (실시예 1d)이 되도록 하고, EDC[1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide; 0.01∼0.1 당량], HOBt[1-Hydroxybenzotriazole; 0.01∼0.1 당량], DIPEA [N,N-Diisopropylethylamine; 0.02∼0.2 당량) 시약을 첨가하여 실온에서 24 시간 동안 반응을 진행했다. 제조된 가교체는 인산완충생리식염수 (Phosphate-buffered saline; PBS) 용액으로 여러번 세척하여 미반응물을 제거하고, 세척된 가교체를 분쇄하여 100 ~ 500 μm 정도의 입자 크기로 조절한 후에, 121℃에서 15 분간 멸균하였다.
실시예 3. 본 발명에 의해 제조한 히알루론산-펩타이드의 가교체의 물성 분석
제조된 실시예 2의 물성 분석을 위하여 가교체의 농도를 20 mg/PBS 1 ml로 제조한 후에, 회전형 레오미터 (Rotational rheometer)를 사용하여 분석하였다. 이 때, 레오미터 분석은 0.02 Hz의 진동수 범위에서 측정하였으며, Plate-Plate에 샘플을 첨가한 후, 0.1초 동안 10-1의 전단속도 (Shear rate)로 회전을 시키고 0.1 mm/s의 속도로 상부 플레이트를 떨어뜨렸을 때의 수직력 (Normal Force) 값을 측정하였다.
<분석 조건>
(1) 시험장비: MCR　Rheometer (Anton Paar)
(2) Frequency: 1~ 10Hz
(3) Temperature: 25±0.01℃
(4) Strain: 1%
(5) Minimum torque oscillation: 10nN*m
(6) Maximum torque: 150nN*m
(7) Torque resolution: 0.1nN*m
(8) Measuring geometry: 25 mm plate
(9) Measuring Gap: 1.0 mm
또한, 제조된 가교체의 주사능 (주입력)은 주사능 시험기기 (Syringe ability test machine)에 가교체 1 ml이 포함된 실린지를 장착한 후, 12 mm/min의 속도로 분석하여, 주입력 값을 측정하였다.
표 1을 통해, 가교화하는 펩타이드 양에 따라 복합점도가 달라지는 것을 알 수 있었다. 펩타이드 양이 많아질수록 복합점도가 커지기 때문에, 가교화시킬 때 펩타이드 양을 조절하여, 복합점도의 조절이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
가교 샘플 탄성 (G’) 점성 (G”) Tan δ 복합점도 (mPa·s) 주입력 (N)
실시예 1a 101 36 0.35 852,000 15
실시예 1b 169 38 0.22 1,380,000 23
실시예 1c 310 53 0.17 2,500,000 28
실시예 1d 444 108 0.24 3,640,000 31
실시예 4. 본 발명에 의해 제조한 히알루론산-펩타이드의 가교체의 분해능 평가
제조된 실시예 2의 분해능 평가를 위해 마이크로 2 ml 튜브에 히알루론산-펩타이드 가교체 (실시예 1a ~ 1d) 의 0.6 g 무게를 측정한 후, 각각의 튜브에 6 μL의 히알루로니다아제 용액 (33 ㎎/mL)(MP biomedicals)을 첨가했다. 혼합물 가교체를, 37℃에서 시간별로 샘플을 채취하여, 레오미터 (Rheometer) 장비로 샘플들의 복합 점도를 확인하여, 가교체의 분해능을 확인하였다.
표 2를 통해, 시간 경과에 따른 복합 점도 변화를 확인하여 가교체의 분해능을 확인할 수 있었다. 분해되는 정도를 in vitro 로 확인한 결과로, 실시예 1d의 경우 0시간에서는 3,640,000의 점도를 갖지만, 4시간 후에는 1,740,000의 점도를 갖게 되어, 4시간 후에는 52.2% 정도 분해되는 것을 확인할 수 있었다.
가교샘플 시간 경과에 따른 가교체의 복합 점도 (mPa·s)
0 시간 1 시간 2 시간 4 시간
실시예 1a 852,000 321,000 186,000 142,000
실시예 1b 1,380,000 749,000 471,000 313,000
실시예 1c 2,500,000 1,350,000 1190,000 678,000
실시예 1d 3,640,000 2,680,000 2,330,000 1,740,000
실시예 5. 본 발명에 의해 제조한 히알루론산-펩타이드의 가교체의 흡수능 평가
제조된 실시예 2의 흡수능을 평가하기 위해 팔콘 50 ml 튜브에 히알루론산-펩타이드 가교체 (실시예 1a - 1d) 0.6 g과 인산 완충액 10 ml을 첨가한 후, 5분 동안 교반시켰다. 이와 같은 혼합물을 37 ℃에서 72시간 방치한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue) 용액 100 μl를 첨가하여, 층 분리 및 색의 차이를 확인했다. 층 분리를 경계로 삼아, 아래 층에 가라앉아 있는 히알루론산-펩타이드 복합체 하이드로겔의 부피를 확인하고, 아래의 수학식 1에 적용하여, 흡수능을 확인했다.
[수학식 1]
흡수용매량 = 팽윤된 부피 ÷ 검체의 무게 (ml/g) 식
표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 일반적인 필러의 경우 5∼8 사이의 팽윤된 부피를 갖지만, 본 발명에 따른 히알루론산-펩타이드 가교체 (가교 샘플)의 팽윤된 부피는 2∼3 사이의 값을 나타냈다. 이는 펩타이드 필러가 팽윤이 잘 되지 않는 특징을 가지고 있다는 것을 의미한다.
가교 샘플 팽윤된 부피 (ml) 검액 무게 (g) 흡수 용매량 (ml/g)
실시예 1a 3.0 0.6 5.00
실시예 1b 3.0 0.6 5.00
실시예 1c 2.5 0.6 4.17
실시예 1d 2.1 0.6 3.50

Claims (29)

  1. 3종 내지 10종의 아미노산을 포함하는 펩타이드 가교제 및 히알루론산 또는 이의 염을 포함하고,
    상기 3종 내지 10종의 아미노산은 글루탐산 (Glu), 아스파트산 (Asp), 글루타민 (Gln), 아스파라긴 (Asn), 히스티딘 (His), 라이신 (Lys), 아르기닌 (Arg), 세린 (Ser), 시스테인 (Cys), 베타 알라닌 (β-Ala), 알라닌 (Ala), 글라이신 (Gly), 루이신 (Leu), 이소루이신 (Ile), 발린 (Val), 트레오닌 (Thr), 메티오닌 (Met), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 타이로신 (Tyr) 및 트립토판 (Trp) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 히알루론산 기반의 하이드로겔.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 가교제는 하기 화학식 2 내지 4 중 어느 하나의 구조를 갖는 것이고,
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2021003260-appb-I000009
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2021003260-appb-I000010
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2021003260-appb-I000011
    상기 식에서,
    X3, Y4 및 Z5은 각각 독립적으로 라이신 (Lys)이고,
    X1, X2, Y1, Y2, Y3, Z1, Z2, Z3 및 Z4는 각각 독립적으로 글루타민 (Gln), 아스파라긴 (Asn), 세린 (Ser), 시스테인 (Cys), 베타 알라닌 (β-Ala), 알라닌 (Ala), 글라이신 (Gly), 루이신 (Leu), 이소루이신 (Ile), 발린 (Val), 트레오닌 (Thr), 메티오닌 (Met), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 타이로신 (Tyr) 및 트립토판 (Trp) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고,
    상기 화학식 2 내지 4에서 X3, Y4 및 Z5의 라이신은 카복실기 (-COOH) 대신 아마이드기 (-CONH2)를 포함하는,
    히알루론산 기반의 하이드로겔.
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 것인, 히알루론산 기반의 하이드로겔:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021003260-appb-I000012
    상기 식에서, n은 500 내지 1,400의 정수이고, L은 3종 내지 10종의 아미노산을 포함한다.
  4. 제1항에 있어서, 상기 히알루론산이 200,000 ∼ 1,200,000 Da의 분자량을 갖는, 히알루론산 기반의 하이드로겔.
  5. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드 가교제가 고체상 펩타이드 합성 방법 (Solid phase peptide synthesis; SPPS)을 이용하여 제조된 것인, 히알루론산 기반의 하이드로겔.
  6. 하기 화학식 2 내지 4 중 어느 하나의 구조를 갖는 펩타이드를 포함하는 펩타이드 가교제:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2021003260-appb-I000013
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2021003260-appb-I000014
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2021003260-appb-I000015
    상기 식에서,
    X3, Y4 및 Z5은 각각 독립적으로 라이신 (Lys)이고,
    X1, X2, Y1, Y2, Y3, Z1, Z2, Z3 및 Z4는 각각 독립적으로 글루타민 (Gln), 아스파라긴 (Asn), 세린 (Ser), 시스테인 (Cys), 베타 알라닌 (β-Ala), 알라닌 (Ala), 글라이신 (Gly), 루이신 (Leu), 이소루이신 (Ile), 발린 (Val), 트레오닌 (Thr), 메티오닌 (Met), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 타이로신 (Tyr) 및 트립토판 (Trp) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이고,
    상기 화학식 2 내지 4에서 X3, Y4 및 Z5의 라이신은 카복실기 (-COOH) 대신 아마이드기 (-CONH2)를 포함하는, 아미노산이다.
  7. i) 고분자 지지체 수지에 첫 번째 아미노산의 측쇄 또는 C-말단을 결합시키는 단계;
    ii) 상기 첫 번째 아미노산 N-말단의 보호기를 제거하는 단계;
    iii) 커플링제를 사용하여 아미노산을 순차적으로 결합시켜 펩타이드를 합성하는 단계; 및
    iv) 단계 iii)에서 합성된 펩타이드로부터 수지 및 보호기를 제거하는 단계를 포함하는 제6항의 펩타이드 가교제의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 i) 단계 고분자 지지체 수지는 폴리스티렌, 폴리아미드, 유리, 실리카 및 Rink Amide MBHA 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 i) 단계 및 iii) 단계에서 아미노산은 글루탐산 (Glu), 아스파트산 (Asp), 글루타민 (Gln), 아스파라긴 (Asn), 히스티딘 (His), 라이신 (Lys), 아르기닌 (Arg), 세린 (Ser), 시스테인 (Cys), 베타 알라닌 (β-Ala), 알라닌 (Ala), 글라이신 (Gly), 루이신 (Leu), 이소루이신 (Ile), 발린 (Val), 트레오닌 (Thr), 메티오닌 (Met), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 타이로신 (Tyr) 및 트립토판 (Trp) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 제조방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 i) 단계 및 iii) 단계에서 아미노산은 아민 말단 및 측쇄가 Boc(tert-butoxycarbonyl), Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl), Cbz(benzyloxycarbonyl), tBu(tert-butyl), StBu(tert-butylthio), Trt(triphenylmethyl; trityl), Acm(acetamidomethyl) 및 Tacm(trimethylacetamido-methyl)로 이루어진 군으로부터 선택되는 보호기로 보호되는 것인, 제조방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 ii) 단계에서 N-말단의 보호기는 20%(v/v) 피페리딘으로 희석된 DMF 용액을 이용하여 제거하는 것인, 제조방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 iii) 단계에서 커플링제는 NHS (N-hydroxysulfosuccinimide), HOBt(1-hydroxybenzotriazole), HOOBt (3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), HOAt (1-hydroxy-7-azabenzotriazole), Sul-NHS (Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide), TBTU [O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate] 및 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 이들의 혼합물인 것인, 제조방법.
  13. 제7항에 있어서, 상기 iii) 단계 후 아미노산 결합 여부를 Kaiser test로 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 제조방법.
  14. 제7항에 있어서, 상기 iv) 단계에서 수지 및 보호기는 TFA(trifluoroacetic acid) 수용액, TIS(triisopropylsilane) 수용액, TFA:TIS 혼합 수용액 및 DCM(dichloromethane) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용액으로 제거되는, 제조방법.
  15. i) 글루탐산 (Glu), 아스파트산 (Asp), 글루타민 (Gln), 아스파라긴 (Asn), 히스티딘 (His), 라이신 (Lys), 아르기닌 (Arg), 세린 (Ser), 시스테인 (Cys), 베타 알라닌 (β-Ala), 알라닌 (Ala), 글라이신 (Gly), 루이신 (Leu), 이소루이신 (Ile), 발린 (Val), 트레오닌 (Thr), 메티오닌 (Met), 프롤린 (Pro), 페닐알라닌 (Phe), 타이로신 (Tyr) 및 트립토판 (Trp) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 내지 10종의 아미노산을 사용하여 펩타이드를 제조하는 단계; 및
    ii) 히알루론산에 증류수를 첨가한 후, 단계 i)에서 합성된 펩타이드 가교제, 커플링제, 보조 커플링제, 염기를 첨가하여 펩타이드 가교제를 포함하는 히알루론산 가교체를 제조하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 기반의 하이드로겔의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단계 i)은 제7항의 합성 방법에 의해 수행되는 것인, 제조방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 단계 ii)에서 사용된 펩타이드 가교제가 히알루론산의 구성 성분인 2당류 (D-glucuronic acid 및 N-acetylglucosamine) 대비 0.01-0.1당량인, 제조방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 단계 ii)에서 사용된 커플링제가 EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), ETC [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide], CMC [1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide] 및 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 이들의 혼합물인 것인, 제조방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 단계 ii)에서 사용된 보조 커플링제가 NHS (N-hydroxysulfosuccinimide), HOBt(1-hydroxybenzotriazole), HOOBt (3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), HOAt (1-hydroxy-7-azabenzotriazole), Sul-NHS (Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide), TBTU [O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate] 및 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 이들의 혼합물인 것인, 제조방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 단계 ii)에서 사용된 염기가 DIPEA [N,N-Diisopropylethylamine], TEA (triethylamine), TDA-1 {Tris[2-(2-methoxyethoxy)ethyl]amine} 및 이들의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 또는 이들의 혼합물인 것인, 제조방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 단계 ii)는 2시간, 4시간, 8시간, 16시간 또는 24시간 및 20℃ 내지 40℃ 온도에서 수행되는 것인, 제조방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 단계 ii) 이후에,
    iii) 단계 ii)에서 제조된 가교체를 인산완충생리식염수 (Phosphate-buffered saline; PBS) 용액으로 세척하여 미반응물을 제거하는 단계;
    iv) 단계 iii)에서 세척된 가교체를 분쇄하는 단계; 및
    v) 단계 iv)에서 분쇄된 가교체를 멸균하는 단계
    를 더 포함하는, 제조방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 단계 iv)에서 가교체를 100 ~ 500 μm 정도의 입자 크기로 분쇄하는, 제조방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 단계 v)에서 8분 내지 20분 및 121℃ 내지 135℃의 온도에서 멸균하는, 제조방법.
  25. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 기반의 하이드로겔을 포함하는, 체내 주입용 조성물.
  26. 제25항에 따른 체내 주입용 조성물을 포함하는 조직 수복용 임플란트.
  27. 제25항에 따른 체내 주입용 조성물을 포함하는 주름, 잔주름, 상처 또는 결손된 피부 (skin depression) 수복용 충전물.
  28. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 기반의 하이드로겔을 체내에 주입하는 단계를 포함하는, 주름의 개선 방법.
  29. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 히알루론산 기반의 하이드로겔을 체내에 주입하는 단계를 포함하는, 조직 수복 또는 용적 증가 방법.
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