WO2023191553A1 - 신축성 자가치유 하이드로젤 - Google Patents

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WO2023191553A1
WO2023191553A1 PCT/KR2023/004300 KR2023004300W WO2023191553A1 WO 2023191553 A1 WO2023191553 A1 WO 2023191553A1 KR 2023004300 W KR2023004300 W KR 2023004300W WO 2023191553 A1 WO2023191553 A1 WO 2023191553A1
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hyaluronic acid
hydrazide
hydrogel
self
oxidized
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PCT/KR2023/004300
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Inventor
이근용
김현승
Original Assignee
한양대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
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    • C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
    • C08B37/0072—Hyaluronic acid, i.e. HA or hyaluronan; Derivatives thereof, e.g. crosslinked hyaluronic acid (hylan) or hyaluronates
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    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/24—Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C08J3/24—Crosslinking, e.g. vulcanising, of macromolecules
    • C08J3/243—Two or more independent types of crosslinking for one or more polymers

Definitions

  • the present invention relates to a stretchable self-healing hydrogel.
  • Hydrogel also called hydrogel, is a network structure in which water-soluble polymers form three-dimensional crosslinks through physical bonds (hydrogen bonds, van der Waals forces, hydrophobic interactions, etc.) or chemical bonds (covalent bonds). It refers to a substance that can contain a significant amount of water without dissolving in an aqueous environment. Because hydrogels can be made from various water-soluble polymers, they have various chemical compositions and physical properties. Additionally, it has high biocompatibility due to its high moisture content and physicochemical similarity to the extracellular matrix. Due to these properties, hydrogels have attracted attention as one of the most attractive materials for medical and pharmacological applications. In particular, when injecting hydrogels containing cells or drugs, the self-healing characteristics of hydrogels are important to repair cracking caused by shear force.
  • Republic of Korea Patent No. 10-1865168 discloses a self-healing hydrogel based on oxidized hyaluronate and its use for delivering bioactive substances.
  • the self-healing hydrogel had a problem in that its mechanical strength was weak and the shape or structure of the hydrogel could not be maintained for a long time under physiological conditions.
  • the present inventors studied a hydrogel that has strong mechanical properties, elasticity, and self-healing properties, and used an aqueous solution of hydrazide-hyaluronic acid (hHA) and adipic acid dihydrazide and oxidized hyaluronic acid. It was confirmed that when an aqueous solution containing (oHA) was mixed, hHA and oHA were double cross-linked through electrostatic interaction and chemical bonding to form an elastic hydrogel. In addition, it was confirmed that the hydrogel has self-healing properties because adipic acid dihydrazide induces a competitive reaction, and the mechanical properties of the hydrogel were also improved by using ultra-high molecular hyaluronic acid.
  • hHA hydrazide-hyaluronic acid
  • oHA adipic acid dihydrazide and oxidized hyaluronic acid
  • the purpose of the present invention is to provide a stretchable self-healing hydrogel and a method for producing the same.
  • one aspect of the present invention is
  • the hydrazide-hyaluronic acid is a structure in which adipic acid dihydrazide is covalently bonded to a hyaluronic acid chain,
  • the aldehyde group of the oxidized hyaluronic acid forms a covalent bond with the hydrazide group of hydrazide-hyaluronic acid
  • the carboxyl group of the oxidized hyaluronic acid forms an ionic bond with the hydrazide group of hydrazide-hyaluronic acid
  • the oxidized hyaluronic acid reacts competitively with adipic acid dihydrazide and hydrazide-hyaluronic acid, providing a stretchable self-healing hydrogel composition.
  • hydrogel refers to a three-dimensional structure of hydrophilic polymers that retain a sufficient amount of moisture
  • stretchable self-healing hydrogel refers to a hydrogel that exhibits both elasticity and self-healing properties. do.
  • elastic self-healing hydrogel composition refers to a composition capable of producing a hydrogel that exhibits both elasticity and self-healing properties.
  • oxidized hyaluronic acid refers to a hyaluronic acid derivative in which the diol group of hyaluronic acid is oxidized to an aldehyde group, and the degree of oxidation is determined by the number of aldehyde groups generated.
  • the oxidation degree of the oxidized hyaluronic acid may be 10% to 50%, preferably 20% to 40%, and most preferably 34%.
  • the hydrogel composition of the present invention can control the physical properties of the hydrogel by controlling the oxidation degree of oxidized hyaluronic acid. As the degree of oxidation increases, the number of aldehyde groups increases, and thus the bonding with hydrazide-hyaluronic acid (hHA) increases, so the physical properties of the hydrogel can be adjusted.
  • hHA hydrazide-hyaluronic acid
  • the hydrazide-hyaluronic acid refers to a hyaluronic acid derivative in which adipic acid dihydrazide is bound to hyaluronic acid through a carbodiimide bond, and a positively charged hydrazide group is introduced into hyaluronic acid.
  • the positive charge of hyaluronic acid increases.
  • the degree of substitution of the hydrazide-hyaluronic acid may be 20% to 70%, preferably 20% to 60%, and most preferably 30% to 30%. It can be.
  • the degree of substitution refers to the number of covalently bonded adipic acid dihydrazide per 100 repeating units of hyaluronic acid, and in the present invention, it is expressed as %. According to one embodiment of the present invention, the degree of substitution affects the rigidity of the hydrogel, and as the degree of substitution increases, the storage modulus of the hydrogel increases (FIG. 6). However, since a high degree of substitution exhibits cytotoxicity ( Figure 5), the degree of substitution within the above range is suitable for producing hydrogels.
  • the molecular weight of hydrazide-hyaluronic acid also affects the rigidity of the hydrogel.
  • hydrazide-hyaluronic acid has a weight-average molecular weight of 1x10 5 to 20x10 6 g/mol, preferably 1.5x10 5 to 10x10 6 g/mol, more preferably 1.5x10 5 to 2x10. It may be 6 g/mol. If the molecular weight is too large, it is difficult to prepare a homogeneous hydrazide-hyaluronic acid solution, so the above molecular weight range is suitable.
  • the oxidized hyaluronic acid and the hydrazide-hyaluronic acid are added to the composition at a ratio of 1 to 5: 0.1 to 5 (wt/wt), preferably at a ratio of 1 to 4: 0.1 to 3 (wt/wt).
  • this range may vary depending on the oxidation degree of oxidized hyaluronic acid, the molecular weight of hydrazide-hyaluronic acid, and the degree of substitution.
  • the hydrazide-hyaluronic acid may be included in an amount of 0.1 to 5 wt%, preferably 1 to 4 wt%, based on the total weight of the composition, but this range is limited to hydrazide-hyaluronic acid. It may vary depending on the molecular weight and degree of substitution.
  • Adipic acid dihydrazide included in the composition imparts self-healing properties to the hydrogel through a competitive reaction, and specifically forms an imine bond with oxidized hyaluronic acid through a Schiff base reaction.
  • the adipic acid dihydrazide may be included in an amount of 0.01 to 1 wt%, preferably 0.05 to 0.5 wt%, and more preferably 0.05 to 0.2 wt%, based on the total weight of the composition. If the concentration of adipic acid dihydrazide is too low, self-healing properties do not appear, and if it is too high, the rigidity of the hydrogel decreases (FIG. 13).
  • the stretchable self-healing hydrogel composition of the present invention is characterized in that oxidized hyaluronic acid reacts with both hydrazide-hyaluronic acid and adipic acid dihydrazide (free ADH).
  • oxidized hyaluronic acid reacts with both hydrazide-hyaluronic acid and adipic acid dihydrazide (free ADH).
  • hydrazide-hyaluronic acid and adipic acid dihydrazide competitively react with oxidized hyaluronic acid again to form cross-links, so the hydrogel has self-healing properties.
  • Another aspect of the present invention provides a composition for three-dimensional bioprinting comprising the stretchable self-healing hydrogel composition.
  • the composition for 3D bioprinting refers to a material that can be used as ink for a 3D bioprinter.
  • the stretchable self-healing hydrogel composition of the present invention has self-healing properties when manufactured into a hydrogel due to the adipic acid dihydrazide contained in the composition. Hydrogel compositions with self-healing properties can recover from cracking caused by shear force when printed with a 3D bioprinter.
  • the present inventors confirmed the elasticity and deformability of the structure after printing it using a stretchable self-healing hydrogel composition as ink in a bioprinter, and confirmed that the properties were well maintained even after printing (FIG. 11).
  • Another aspect of the invention provides a method for preparing a stretchable self-healing hydrogel comprising the following steps:
  • (+) polar substances (adipic acid dihydrazide, hydrazide-hyaluronic acid) are first mixed according to the polarity of the molecules, and then (-) polar substances are mixed together. It is a process of mixing with (oxidized hyaluronic acid).
  • the mixing order is not limited, and a method of first mixing oxidized hyaluronic acid with adipic acid dihydrazide or hydrazide-hyaluronic acid and then mixing the remaining materials is also possible.
  • oxidized hyaluronic acid, hydrazide-hyaluronic acid, and adipic dihydrazide is the same as that described in the hydrogel composition.
  • the stretchable self-healing hydrogel of the present invention is double cross-linked between components, so no separate process for gelation of the hydrogel is required.
  • Another aspect of the present invention provides a stretchable self-healing hydrogel prepared by the above method and a drug delivery system using the same.
  • the drug delivery system according to the present invention can be produced by a method comprising the following steps:
  • drug refers to a substance that can exert the desired useful effect when introduced into the body, and may be selected from the group consisting of compounds, proteins, peptides, nucleic acids, saccharides, extracellular matrix substances, and cells. You can.
  • the compounds may be antibiotics, anticancer agents, painkillers, anti-inflammatory agents, antivirals, antibacterial agents, etc.
  • proteins and peptides may be hormones, cytokines, enzymes, antibodies, growth factors, transcriptional regulators, blood factors, vaccines, structural proteins. , may be selected from the group consisting of ligand proteins and receptors, cell surface antigens, and receptor antagonists.
  • the nucleic acid may be an oligonucleotide, DNA, RNA, or PNA, and the saccharide may be heparin, heparan sulfate, keratan sulfate, dermatan sulfate, or chondroitin sulfate. sulfate) and hyaluronate.
  • the extracellular matrix substances include collagen, fibronectin, gelatin, elastin, osteocalcin, fibrinogen, fibromodulin, and tenascin. (tenascin), laminin, osteopontin, osteonectin, perlecan, versican, von Willebrand factor and vitronectin ), and the cells may be selected from the group consisting of fibroblasts, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, nerve cells, bone cells, skin cells, chondrocytes, Schwann cells, and stem cells.
  • the stretchable self-healing hydrogel according to an example of the present invention has excellent mechanical properties and stability, and has elasticity and self-healing properties, so it can be usefully used as a hydrogel for drug and cell delivery, and a composition for 3D bioprinters.
  • FIG 1 briefly shows the principle by which the stretchable self-healing hydrogel according to an example of the present invention exhibits self-healing properties.
  • Figure 2 briefly shows the principle by which the stretchable self-healing hydrogel according to an example of the present invention exhibits elasticity.
  • FIG. 3 shows FT-IR spectrum results of hyaluronic acid (HA), oxidized hyaluronic acid (oHA), hydrazide-hyaluronic acid (hHA), and oHA/hHA hydrogel.
  • Figure 4 shows 1 H NMR spectrum results of hydrazide-hyaluronic acid (hHA) with various degrees of substitution.
  • Figure 5 shows the results of confirming cell viability after treating cells with various concentrations of oxidized hyaluronic acid (oHA) solutions with different degrees of substitution.
  • oHA oxidized hyaluronic acid
  • Figure 6 shows the results of confirming the storage shear modulus of oHA/hHA hydrogel by changing the degree of substitution (A), the molecular weight of hHA, the oHA/hHA ratio (B), and the hHA1100 concentration (C).
  • Figure 7A shows the results of confirming the stress-strain curve of oHA/hHA hydrogels made of hHA with different molecular weights.
  • Figure 7B shows images before and after stretching the oHA/hHA hydrogel.
  • Figure 8A shows the results of confirming the complex viscosity of hyaluronic acid (HA), hydrazide-hyaluronic acid (hHA), and HA/hHA mixture.
  • FIG. 8B shows the storage shear modulus (G'; filled symbols) and loss shear modulus (G'') of hyaluronic acid (HA), hydrazide-hyaluronic acid (hHA), and HA/hHA mixtures. ; open symbols): HA-black line; hHA-red line; and HA/hHA-blue line.
  • Figure 9 shows a modification of the stretchable self-healing (oHA/hHA/ADH) hydrogel according to an example of the present invention.
  • Figure 10 shows the results of confirming the self-healing behavior while alternating strain rates to the elastic self-healing (oHA/hHA/ADH) hydrogel.
  • Figure 11 shows 3D printed oHA/hHA hydrogel (-ADH/+P), unprinted oHA/hHA/ADH hydrogel (+ADH/-P), and 3D printed oHA/hHA/ADH hydrogel (+ADH This is the result of confirming the elasticity (A) and self-healing behavior (B) of /+P).
  • Figure 12 shows the results of confirming the cell image (A) and cell survival rate (B) after printing a structure using a stretchable self-healing hydrogel containing cells as bioink.
  • Figure 13 shows the results of confirming the storage shear modulus of the gel after producing elastic self-healing (oHA/hHA/ADH) hydrogels with different concentrations of adipic acid dihydrazide.
  • Hyaluronic acid was purchased from Humedix (1000 kDa, B02-16-010; Anyang, Korea) and Lifecore (200 kDa, 025841; 2000 kDa, 026489; Chaska, MN, USA).
  • 1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide was purchased from Proteochem (Hurricane, UT, USA), and N -hydroxysulfosuccinimide.
  • Sodium salt N -hydroxysulfosuccinimide sodium salt, sulfo-NHS
  • Covachem Loves Park, IL, USA.
  • Adipic acid dihydrazide (ADH), sodium periodate, 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) hydrate ), transferrin human, and activated charcoal were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).
  • Dulbecco's phosphate-buffered saline DPBS
  • FBS fetal bovine serum
  • Dulbecco's modified Eagle's medium nutrient mixture F-12 Dulbecco's modified Eagle's medium nutrient mixture F-12
  • penicillin-streptomycin were purchased from Gibco (Grand Island, NY). , USA).
  • FT-IR Fourier-transform infrared spectroscopy
  • the synthesized oxidized hyaluronic acid sample and dried potassium bromide were ground together and compressed. Each sample was scanned at a resolution of 4 cm -1 .
  • the oxidation reaction of oxidized hyaluronic acid was confirmed using a 1 H NMR spectrophotometer (VNMRS 600 MHz; Varian). D 2 O was used as a solvent, and the degree of oxidation of oxidized hyaluronic acid was determined with 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) (Kim et al., 2019).
  • Hyaluronic acid was dissolved in 0.1 M MES buffer (0.5 wt%, pH 6.0), and adipic acid dihydrazide (ADH), EDC, and sulfo-NHS were added at a mole ratio of 1:0.65:0.65. was added and reacted. The next day, hydrazide-hyaluronic acid (hHA) was precipitated with ethanol (99.9%), and the precipitate was freeze-dried. The synthesis of hydrazide-hyaluronic acid was confirmed using FT-IR and 1 H NMR spectrophotometry. Hydrazide-hyaluronic acid with various degrees of substitution was synthesized by changing the reaction molar ratio between hyaluronic acid and adipic acid dihydrazide.
  • ADH adipic acid dihydrazide
  • the molecular weight of hyaluronic acid derivatives was calculated using SEC-MALLS (size exclusion chromatography with multi-angle laser light scattering; Shimadzu).
  • SEC-MALLS size exclusion chromatography with multi-angle laser light scattering; Shimadzu.
  • the SEC-MALLS system includes a column (PL Aquagel-OH MIXED-H, 7.5 300 mm; Tosoh Bioscience), a multi-angle light scattering detector and a differential refractometer (with multi-angle light scattering photometer and differential refractometer; DAWN HELEOS II and Optilab Rex, Wyatt Technology) is installed.
  • Dextran was used as a standard polymer and PBS was used as a mobile phase, and the flow rate was set at 0.5 mL/min.
  • the dn/dc value of the hyaluronic acid derivative was 0.167 mL/g, and the experiment was conducted at 25°C. Data analysis was performed with ASTRA 6.1 software (Wyatt Technology).
  • Oxidized hyaluronic acid (oHA) and hydrazide-hyaluronic acid (hHA) were each dissolved in PBS, and then the two solutions were mixed to produce a hydrogel with elasticity.
  • a hydrogel with self-healing ability and elasticity was produced by mixing adipic acid dihydrazide solution and hydrazide-hyaluronic acid and then mixing them with oxidized hyaluronic acid solution.
  • Hydrogel formation was confirmed by FT-IR spectrophotometry.
  • the viscoelastic properties of the hydrogel were investigated at 5 Pa, 1 Hz using a rotational viscometer (Bohlin Gemini 150) equipped with a cone-and-plate fixture (20 mm diameter, 4° cone angle). .
  • the stress-strain curve of the hydrogel was measured at a speed of 2.5 mm/min with an Instron 5966 equipped with a 10 N load cell (Submersible Pneumatic Side Action Grips, Instron). Hydrogel samples (25 mm long, 8 mm wide, 1 mm thick) were manufactured to fit the sample holder, and the sample holder was connected to the load cell.
  • 3D structures were produced with a 3D printer (Invivo, Rokit; Korea).
  • the self-healing oHA/hHA/ADH hydrogel was filled into a syringe equipped with a 25-gauge needle used as a nozzle.
  • the motor pressure and fill density were kept constant at 300 N and 80%, respectively, and the printing speed was fixed at 300 mm/min.
  • a hydrogel containing ATDC5 cells at a concentration of 5x10 6 cells/ml was printed in a disk shape (10 mm diameter, 1 mm thickness). This disc was cultured for 3 days at 37°C and 5% CO 2 conditions. Cell viability was assessed using the LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kit (Invitrogen; USA) according to the manufacturer's instructions. Cell images were taken with a confocal laser scanning microscope (TCS SP5; Leica Microsystems, Germany).
  • Oxidized hyaluronic acid (hereinafter referred to as oHA) having an aldehyde group was prepared by partially oxidizing HA with sodium periodate. The oxidation reaction was confirmed by FT-IR and 1 H NMR spectroscopy. The peak corresponding to the aldehyde group of oHA was observed at 1730 cm -1 in the FT-IR spectrum (FIG. 3). The new peaks at 4.5 ppm and 5.0 ppm in the 1H NMR spectrum support the formation of aldehyde groups in oHA ( Figure 4) (Park, Kim, Lee, & Lee, 2017). The number of aldehyde groups in oHA was determined by TNBS analysis (Kim et al., 2019). The degree of oxidation (%), defined as the number of oxidation units per 100 repeating units of hyaluronic acid, was calculated to be 34%.
  • hHA with various degrees of substitution ranging from 30 to 70% were synthesized by adding various amounts of ADH to HA. DS values were quantified by 1 H NMR spectrum (Table 1). The molecular weight of the HA derivative was determined by SEC-MALLS, and the results are listed in Table 1.
  • the number after hHA indicates the weight-average molecular weight.
  • oHA/hHA hydrogels prepared without excipient cross-linking molecules were investigated.
  • the aldehyde group of oHA and the hydrazide group of hHA can form a reversible acylhydrazone bond to form oHA/hHA hydrogel.
  • the formation of the acylhydrazone bond between oHA and hHA is caused by the disappearance of the aldehyde peak (1730 cm -1 ) of oHA in the FT-IR spectrum and the appearance of a new peak corresponding to the carbonyl band (1640 cm -1 ) of the acylhydrazone bond. This was confirmed (Figure 3) (Sun et al., 2019).
  • conventional polysaccharide-based hydrogels are generally weak and brittle (Lee & Mooney, 2001).
  • HA/bacterial cellulose hydrogel and HA/silk fibroin hydrogel cross-linked with 1,4-butanediol diglycidyl ether can be stretched to approximately 40% and 50% of their original length, respectively.
  • HA/gelatin hydrogels can also be stretched by approximately 60% (Chang et al., 2021).
  • Common stretchable hydrogel systems contain synthetic polymers such as polyacrylamide (PAAm). Alginate/PAAm hydrogel and acrylamide/poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogel were highly elastic (Ge et al., 2021; Sun et al., 2012).
  • oHA/hHA hydrogels composed solely of HA derivatives without the use of additional synthetic polymers can be stretched to approximately 2.1 times their original length, finding many useful biomedical applications, including the field of tissue engineering.
  • Double cross-linked hydrogels show improved elasticity and toughness (Sun et al., 2012; Wu et al., 2018; Yang & Yuan, 2019).
  • the double cross-linked hydrogel is maintained by two different cross-links. When stress is applied, the first bridge ruptures and the energy is dissipated. The second cross-link then maintains elasticity and can withstand greater stress (Chen et al., 2016; Zhang et al., 2018).
  • Ionic cross-linking and covalent cross-linking are commonly utilized to prepare duplex networks (Bakarich et al., 2013; Bakarich et al., 2012; Stevens, Calvert, & Wallace, 2013; Sun et al., 2012).
  • the improved elasticity of the oHA/hHA hydrogel may also be due to the formation of double cross-links in the gel.
  • HA is inherently negatively charged due to its carboxyl group (Jeon, Yoo & Park, 2015), but conjugation of ADH and HA can increase the positive charge due to the hydrazide group of ADH.
  • the significant increase in complex viscosity of the HA/hHA simple mixture compared to HA or hHA alone may be explained by the electrostatic interaction between HA and hHA ( Figure 8). Additionally, the significant increase in the G' value of the HA/hHA mixture and the intersection of the modulus curves at various frequencies demonstrate that a gel-like structure is formed through ionic cross-linking between HA and hHA ( Figure 8).
  • the self-healing ability of oHA/hHA/ADH hydrogel was investigated.
  • the hydrogel was cut into two pieces, reattached, and then manually stretched after 15 minutes.
  • the self-healed hydrogel was able to stretch to about twice its original length without breaking.
  • the oHA/hHA/ADH hydrogel was elastic and could be formed into various shapes and stretched while maintaining a bent, twisted, or knotted structure (Figure 9).
  • the self-healing properties of the oHA/hHA/ADH hydrogel were further evaluated using a rotational viscometer.
  • the strain was alternated from 1% to 400%, and it was confirmed that the G' value of the gel was recovered when the high strain (400% strain) was removed (FIG. 10).
  • a 3D structure was created using oHA/hHA/ADH hydrogel.
  • a tensile test confirmed that there was no difference in elasticity between the oHA/hHA hydrogel ( Figure 7a) and the oHA/hHA/ADH hydrogel (+ADH/-P in Figure 11), indicating that the addition of ADH did not affect elasticity. Confirmed.
  • the 3D printed oHA/hHA hydrogel (-ADH/+P) lacked self-healing ability, resulting in decreased elongation at break.
  • the oHA/hHA/ADH hydrogel maintained its elasticity even after the printing process (+ADH/+P), which was almost 90% of that of the unprinted gel (+ADH/-P) ( Figure 11).
  • ATDC5 cells were encapsulated in oHA/hHA/ADH hydrogel, and their viability was assessed by LIVE/DEAD assay. As a result of the evaluation, printing (+P) did not affect cell viability. After 3 days of culture, approximately 85% of the cells survived within the printed oHA/hHA/ADH hydrogel ( Figure 12).
  • 3D printable oHA/hHA/ADH hydrogel system may have potential in tissue engineering, including 3D printing of customized tissue structures.
  • HA-based inks for bioprinting require an additional cross-linking process and have limited use due to the inherent brittleness of the gel.
  • Methacrylated HA is a widely used bioink in 3D printing, which typically requires UV irradiation to form a gel.
  • Alginate is also widely used in extrusion-based bioprinting. However, alginate also requires gelation using calcium ions after printing to form solid structures (Mallakpour, Azadi, & Hussain, 2021; Piras & Smith, 2020).
  • the oHA/hHA/ADH hydrogel according to the present invention does not require additional processes to form a solid structure after 3D printing, which is advantageous when printing biological materials such as proteins and cells.
  • polysaccharide-based hydrogels are generally weak and brittle (Kumar et al., 2019; Xiao & Grinstaff, 2017).
  • alginate hydrogels cross-linked with calcium ions are brittle and cannot be used as tissue replacements and cannot be stretched properly (Ibrahim, Azam, & Amin, 2019; Drury, Dennis, & Mooney, 2004; Kunwar et al. ., 2019; Serrano-Aroca, Iskandar, & Deb, 2018).
  • oHA/hHA/ADH hydrogels are also physically strong, including chemical cross-linking (i.e., reversible acylhydrazone bonds) and physical cross-linking (i.e., electrostatic interactions), which can overcome the inherent weaknesses of HA-based hydrogels. There is an advantage.
  • Hyaluronate-alginate hybrid hydrogels modified with biomimetic peptides for controlling the chondrocyte phenotype Carbohydrate polymers , 197, 422-430.
  • Hydrogel bioink reinforcement for additive manufacturing a focused review of emerging strategies. Advanced materials , 32(1), 1902026.
  • Bioinks and bioprinting A focused review. Bioprinting , 18, e00080.
  • Alginate hydrogels modified with low molecular weight hyaluronate for cartilage regeneration Carbohydrate polymers , 162, 100-107.

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Abstract

본 발명은 신축성 자가치유 하이드로젤에 관한 것으로 상기 하이드로젤은 기계적 물성과 안정성이 우수하고, 신축성 및 자가치유 특성이 있어 약물, 세포 전달용 하이드로젤, 3D 바이오프린터용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신축성 자가치유 하이드로젤
본 발명은 신축성이 있는 자가치유 하이드로젤에 관한 것이다.
손상된 조직 또는 기관을 대체하기 위한 많은 노력이 있다. 인공 대체물, 동물 유래의 비생물(non-living) 조직 또는 기관 이식술은 환자 치료를 위해 전형적으로 이용되어 온 것들이다. 그러나 이들은 원래의 조직 또는 기관에 비해 이질적인 구성으로 인해 기본적인 해결책이 될 수 없다. 따라서 최근에는 전통적인 외과적 처치에 대안으로 조직공학이 떠오르고 있다. 예를 들어, 체외 배양한 조직 또는 기관 및 생체재료를 이용한 세포 전달이 조직공학 접근법에 적용되고 있으며, 다양한 유형의 생체재료 중에서 하이드로젤이 매우 유용하게 사용되고 있다.
하이드로젤 (hydrogen)은 수화젤이라고도 하며, 수용성 고분자가 물리적 결합 (수소결합, 반데르발스힘, 소수성 상호작용 등) 또는 화학적 결합(공유결합)에 의해 3차원의 가교를 형성하고 있는 망상구조를 가지고, 수상 환경에서 용해되지 않고 상당한 양의 물을 함유할 수 있는 물질을 말한다. 하이드로젤은 다양한 수용성 고분자로부터 만들어질 수 있기 때문에 여러 가지 화학적 조성과 물성을 갖는다. 또한, 높은 함수율과 세포외기질과의 물리화학적 유사성으로 인하여 높은 생체적합성을 갖는다. 이러한 특성들로 인하여 하이드로젤은 의학과 약물학적인 응용에 있어서 상당히 매력적인 물질 중 하나로 주목 받게 되었다. 특히 세포나 약물 등을 함유한 하이드로젤을 주사하는 경우 전단력으로 인한 크랙킹(cracking)을 복구하기 위해 하이드로젤의 자가치유 특징이 중요하다.
대한민국 등록특허 제10-1865168호에는 산화 히알루로네이트 기반의 자가치유 하이드로젤 및 이의 생리활성 물질 전달 용도가 개시되어 있다. 그러나 상기 자가치유 하이드로젤은 기계적 강도가 약하여 생리학적 조건에서 하이드로젤의 형태나 구조를 장시간 유지하지 못하는 문제점이 있었다.
상기와 같은 상황에서 본 발명자들은 기계적 물성이 강하고, 신축성 및 자가치유 특성 또한 갖는 하이드로젤을 연구하였고, 하이드라지드-히알루론산 (hHA)과 아디프산 디하이드라지드를 녹인 수용액과 산화 히알루론산 (oHA)을 녹인 수용액을 혼합시키면 hHA와 oHA가 정전기적 상호작용 및 화학적 결합을 통해 이중가교되어 신축성을 가지는 하이드로젤을 형성하는 것을 확인하였다. 또한, 아디프산 디하이드라지드가 경쟁반응을 유도하므로 하이드로젤이 자가치유 특성을 갖고, 초고분자의 히알루론산을 사용하여 하이드로젤의 기계적 물성도 향상되는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 목적은 신축성 자가치유 하이드로젤 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양상은
산화 히알루론산, 하이드라지드-히알루론산 및 아디프산 디하이드라지드를 포함하고,
상기 하이드라지드-히알루론산은 히알루론산 사슬에 아디프산 디하이드라지드가 공유결합된 구조체이며,
상기 산화 히알루론산의 알데하이드기는 하이드라지드-히알루론산의 하이드라지드기와 공유결합을 형성하고,
상기 산화 히알루론산의 카르복실기는 하이드라지드-히알루론산의 하이드라지드기와 이온결합을 형성하며,
상기 산화 히알루론산은 아디프산 디하이드라지드 및 하이드라지드-히알루론산과 경쟁적으로 반응하는, 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "하이드로젤"은 충분한 양의 수분을 보유하고 있는 친수성 고분자의 3차원적 구조를 의미하며, "신축성 자가치유 하이드로젤"이란 신축성 및 자가치유 특성을 모두 나타내는 하이드로젤을 의미한다. 상기 "신축성 자가치유 하이드로젤 조성물"이란 신축성 및 자가치유 특성을 모두 나타내는 하이드로젤을 제조할 수 있는 조성물을 의미한다.
본 발명에서, 산화 히알루론산이란 히알루론산의 디올기가 알데하이드기로 산화된 히알루론산 유도체를 말하며, 생성된 알데하이드기의 수에 따라 산화도가 결정된다.
본 발명의 일 구체에에 따르면, 상기 산화 히알루론산의 산화도는 10% 내지 50%일 수 있고, 바람직하게는 20% 내지 40%일 수 있으며, 가장 바람직하게는 34%일 수 있다.
본 발명의 하이드로젤 조성물은 산화 히알루론산의 산화도를 조절하여 하이드로젤의 물성을 조절할 수 있다. 산화도가 높아지면 알데하이드기가 많아지게 되고, 이에 따라 하이드라지드-히알루론산 (hHA)과의 결합이 많아지므로 하이드로젤의 물성이 조절될 수 있다.
본 발명에서, 상기 하이드라지드-히알루론산은 히알루로산에 카르보디이미드 결합을 통해 아디프산 디하이드라지드가 결합된 히알루론산 유도체를 말하며, 양전하를 띠는 하이드라지드기가 히알루론산에 도입되어 히알루론산의 양전하가 증가하게 된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 하이드라지드-히알루론산은 치환도가 20% 내지 70%일 수 있고, 바람직하게는 20% 내지 60%일 수 있으며, 가장 바람직하게는 30% 내지 30%일 수 있다.
상기 치환도란 히알루론산의 반복 단위 100개 당 공유결합된 아디프산 디하이드라지드의 수를 의미하며, 본 발명에서는 %로 표시하였다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 치환도는 하이드로젤의 강성에 영향을 미치며, 치환도가 증가할수록 하이드로젤의 저장탄성계수가 늘어났다 (도 6). 그러나 높은 치환도는 세포 독성을 나타내므로 (도 5) 상기 범위의 치환도가 하이드로젤 제작에 적합하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 하이드라지드-히알루론산의 분자량 또한 하이드로젤의 강성에 영향을 미친다. 구체적으로 하이드라지드-히알루론산은 중량 평균 분자량 (weight-average molecular)이 1x105 내지 20x106 g/mol, 바람직하게는 1.5x105 내지 10x106 g/mol, 더욱 바람직하게는 1.5x105 내지 2x106 g/mol일 수 있다. 분자량이 지나치게 크면 균질한 하이드라지드-히알루론산 용액을 제조하기 어려우므로 상기 분자량 범위가 적합하다.
본 발명에서, 상기 산화 히알루론산과 상기 하이드라지드-히알루론산은 조성물에 1 내지 5: 0.1 내지 5 (wt/wt) 비율, 바람직하게는 1 내지 4: 0.1 내지 3 (wt/wt) 비율로 포함될 수 있으나, 이 범위는 산화 히알루론산의 산화도, 하이드라지드-히알루론산의 분자량, 치환도에 따라 달라질 수 있다.
또한, 조성물의 전체 중량을 기준으로 살펴보면 상기 하이드라지드-히알루론산은 조성물의 전체 중량 대비 0.1 내지 5 wt%, 바람직하게는 1 내지 4 wt%로 포함될 수 있으나 이 범위는 하이드라지드-히알루론산의 분자량, 치환도에 따라 달라질 수 있다.
조성물에 포함되는 아디프산 디하이드라지드는 경쟁 반응을 통해 하이드로젤에 자가치유 특성을 부여하며, 구체적으로 산화 히알루론산과 시프 염기(Schiff base) 반응에 의한 이민 결합을 형성한다.
상기 아디프산 디하이드라지드는 조성물의 전체 중량 대비 0.01 내지 1 wt%, 바람직하게는 0.05 내지 0.5 wt%, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 0.2 wt%로 포함될 수 있다. 아디프산 디하이드라지드의 농도가 너무 낮으면 자기 치유 특성이 나타나지 않고, 너무 높으면 하이드로젤의 강성이 감소하는 문제가 발생한다 (도 13).
상기 기재한 구성 성분들의 특성으로 인해 본 발명의 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물은 산화 히알루론산이 하이드라지드-히알루론산과 아디프산 디하이드라지드 (free ADH) 모두와 반응하는 것이 특징이다. 크랙이 일어나 하이드로젤의 구성 성분 사이에서 가교가 끊어지면 하이드라지드-히알루론산과 아디프산 디하이드라지드가 경쟁적으로 다시 산화 히알루론산과 반응하여 가교를 형성하므로 하이드로젤은 자가치유 특성을 가지게 된다.
또한, 하이드라지드-히알루론산과 산화 히알루론산 간의 정전기적 상호작용 (이온 결합) 및 화학적 결합 (공유 결합)의 이중 가교는 하이드로젤의 신축성을 향상시키는 역할을 한다. 신축이 발생할 때, 화학적 결합은 유지되면서 정전기적 상호작용이 가역적으로 작용하므로 하이드로젤이 신축성을 나타내게 된다.
본 발명의 다른 양상은 상기 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물을 포함하는 3차원 바이오프린팅용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 3차원 바이오프린팅용 조성물은 3차원 바이오프린터의 잉크로 사용될 수 있는 물질을 말한다. 본 발명의 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물은 조성물 내에 포함된 아디프산 디하이드라지드에 의하여 하이드로젤로 제조시 자가치유 특성을 갖는다. 자가치유 특성을 갖는 하이드로젤 조성물은 3차원 바이오프린터로 출력될 때 전단력으로 인한 크래킹(cracking)을 복구할 수 있다.
본 발명자들은 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물을 바이오프린터의 잉크로 사용하여 구조물을 출력한 후 구조물의 신축성 및 변형성을 확인하였고, 프린팅 후에도 상기 특성이 잘 유지되는 것을 확인하였다 (도 11).
본 발명의 다른 양상은 하기 단계를 포함하는 신축성 자가치유 하이드로젤의 제조 방법을 제공한다:
(a) 아디프산 디하이드라지드 용액과 하이드라지드-히알루론산을 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 (a)에 산화 히알루론산 용액을 혼합하는 단계.
상기 방법은 젤화 이전의 이온결합을 방지하기 위해 분자들이 띄는 극성에 따라 (+)극성 물질 (아디프산 디하이드라지드, 하이드라지드-히알루론산)끼리 먼저 혼합한 이후, (-)극성 물질 (산화 히알루론산)과 혼합하는 과정이다. 그러나 상기 혼합 순서에 제한되는 것은 아니며, 산화 히알루론산을 아디프산 디하이드라지드 또는 하이드라지드-히알루론산과 먼저 혼합한 후 나머지 물질을 혼합시키는 방법도 가능하다.
산화 히알루론산, 하이드라지드-히알루론산 및 아디프한 디하이드라지드에 관한 설명은 상기 하이드로젤 조성물에서 설명한 바와 동일하다. 본 발명의 신축성 자가치유 하이드로젤은 구성 성분 사이에서 이중 가교가 이루어지므로 하이드로젤의 젤화를 위한 별도의 과정이 필요하지 않다.
본 발명의 또 다른 양상은 상기 방법으로 제조된 신축성 자가치유 하이드로젤 및 이를 이용한 약물 전달체를 제공한다.
본 발명에 따른 약물 전달체는 하기 단계를 포함하는 방법으로 제작될 수 있다:
(a) 아디프산 디하이드라지드 용액과 하이드라지드-히알루론산을 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 (a)에 산화 히알루론산 용액과 전달하고자 하는 목적 약물을 첨가하는 단계.
본 명세서에 사용된 용어, "약물"은 생체 내에 도입했을 때 목적하는 유용한 효과를 발휘할 수 있는 물질을 말하며, 화합물, 단백질, 펩티드, 핵산, 당류, 세포외기질 물질 및 세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 화합물은 항생제, 항암제, 진통제, 소염제, 항바이러스제, 항균제 등일 수 있고, 단백질 및 펩티드는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질 및 수용체, 세포표면항원 및 수용체 길항물질로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 핵산은 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 PNA일 수 있고, 당류는 헤파린(heparin), 헤파란 설페이트(heaparn sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate), 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 콘드로이틴 설페이트(condroitin sulfate), 히알루로네이트로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 세포외기질 물질은 콜라겐 (collagen), 피브로넥틴 (fibronectin), 젤라틴 (gelatin), 엘라스틴 (elastin), 오스티오칼신 (osteocalcin), 피브리노겐 (fibrinogen), 피브로모듈린 (fibromodulin), 테나신 (tenascin), 라미닌 (laminin), 오스티오폰틴 (osteopontin), 오스티오넥틴 (osteonectin), 퍼레칸 (perlecan), 베르시칸 (versican), 본 윌리브랜드 팩터 (von Willebrand factor) 및 비트로넥틴 (vitronectin)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 상기 세포는 섬유아세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포, 뼈세포, 피부세포, 연골세포, 슈반세포 및 줄기세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 신축성 자가치유 하이드로젤은 기계적 물성과 안정성이 우수하고, 신축성 및 자가치유 특성이 있어 약물, 세포 전달용 하이드로젤, 3D 바이오프린터용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 신축성 자가치유 하이드로젤이 자가치유 특성을 보이는 원리를 간략하게 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따른 신축성 자가치유 하이드로젤이 신축성을 나타내는 원리를 간략하게 나타낸다.
도 3은 히알루론산 (HA), 산화 히알루론산 (oHA) 및 하이드라지드-히알루론산 (hHA) 및 oHA/hHA 하이드로젤의 FT-IR 스펙트럼 결과이다.
도 4는 치환도가 다양한 하이드라지드-히알루론산 (hHA)의 1H NMR 스펙트럼 결과이다.
도 5는 세포에 치환도가 상이한 다양한 농도의 산화 히알루론산 (oHA) 용액을 처리한 후 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 6은 oHA/hHA 하이드로젤의 저장전단탄성계수를 치환도 (A), hHA의 분자량과 oHA/hHA 비율 (B) 및 hHA1100 농도 (C)를 변화시켜 확인한 결과이다.
도 7A는 분자량이 상이한 hHA로 제작한 oHA/hHA 하이드로젤의 응력-변형률 곡선 (Stress-Strain Curve)을 확인한 결과이다.
도 7B는 oHA/hHA 하이드로젤을 늘리기 전후의 이미지를 보여준다.
도 8A는 히알루론산 (HA), 하이드라지드-히알루론산 (hHA) 및 HA/hHA 혼합물의 복합 점도를 확인한 결과이다.
도 8B는 히알루론산 (HA), 하이드라지드-히알루론산 (hHA) 및 HA/hHA 혼합물의 저장 탄성 계수 (storage shear modulus, G'; filled symbols) 및 손실 탄성 계수 (loss shear modulus, G''; open symbols)를 확인한 결과이다: HA-흑색선; hHA-적색선; 및 HA/hHA-청색선.
도 9는 본 발명의 일 예에 따른 신축성 자가치유 (oHA/hHA/ADH) 하이드로젤의 변형 모습을 보여준다.
도 10은 신축성 자가치유 (oHA/hHA/ADH) 하이드로젤에 변형률을 교대로 가하면서 자가치유 거동을 확인한 결과이다.
도 11은 3D 프린팅된 oHA/hHA 하이드로젤 (-ADH/+P), 프린팅하지 않은 oHA/hHA/ADH 하이드로젤 (+ADH/-P) 및 3D 프린팅된 oHA/hHA/ADH 하이드로젤 (+ADH/+P)의 신축성 (A) 및 자가치유 거동(B)을 확인한 결과이다.
도 12는 세포를 포함하는 신축성 자가치유 하이드로젤을 바이오잉크로 사용하여 구조물을 출력한 후 세포 이미지 (A) 및 세포 생존율 (B)을 확인한 결과이다.
도 13은 아디프산 디하이드라지드의 농도가 다른 신축성 자가치유 (oHA/hHA/ADH) 하이드로젤을 제작한 후 젤의 저장전단탄성계수를 확인한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 시약
히알루론산 (hyaluronic acid, HA)은 Humedix (1000 kDa, B02-16-010; 안양, 대한민국) 및 Lifecore (200 kDa, 025841; 2000 kDa, 026489; 채스카, 미네소타주, 미국)에서 구입하였다. 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카보디이미드 (1-ethyl-3-(dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC)는 Proteochem (허리케인, 유타주, 미국)에서 구입하였고, N-하이드록시술포포숙시니미드 나트륨염 (N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt, sulfo-NHS)은 Covachem (러브스 파크, 일리노이주, 미국)에서 구입하였다.
아디프산 디하이드라지드 (adipic acid dihydrazide, ADH), 과요오드산 나트륨 (sodium periodate), 2-(N-모르포리노)에테인술폰산 수화물 (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) hydrate), 인간 트랜스페린 (transferrin human) 및 활성탄 (activated charcoal)은 Sigma Aldrich (세인트 루이스, 미주리주, 미국)에서 구입하였다. DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline), 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS), DMEM/F-12 (Dulbecco's modified Eagle's medium nutrient mixture F-12), 및 페니실린-스트렙토마이신은 Gibco (그랜드 아일랜드, 뉴욕주, 미국)에서 구했다.
2. 산화 히알루론산 제조 및 확인
히알루론산 (HA) 1 g를 탈이온수 100 ㎖에 밤새 용해시킨 후 과요오드산 나트륨 0.26735 g을 히알루론산 용액에 첨가하였다. 24시간 후에 반응액을 증류수에 대하여 4일 동안 투석하고 (분자량 컷-오프=3,500 g/mol) 0.22 ㎛ 필터로 여과하였다. 푸리에 변환 적외선 분광광도계 (Fourier-transform infrared spectroscopy, FT-IR; Nicolet IS50, Thermo Fisher Scientific)로 산화 히알루론산 (oxidized hyaluronic acid, oHA) 합성 여부를 확인하였다. 히알루론산과 과요오드산 나트륨을 다양한 비율로 반응시켜 산화도가 다양한 산화 히알루론산을 합성하였다.
합성한 산화 히알루론산 샘플 및 건조 브롬화 칼륨을 같이 분쇄하여 압축시켰다. 각 샘플은 4 ㎝-1의 분해능 (resolution)에서 스캔하였다. 1H NMR 분광광도계 (VNMRS 600MHz; Varian)로 산화 히알루론산의 산화 반응을 확인하였다. D2O는 용매로 사용하였고, 산화 히알루론산의 산화 정도는 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산 (2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)으로 결정하였다 (Kim et al., 2019).
3. 하이드라지드-히알루론산 제조 및 확인
히알루론산을 0.1 M MES 버퍼 (0.5 wt%, pH 6.0)에 용해시키고, 아디프산 디하이드라지드 (ADH), EDC 및 sulfo-NHS를 몰 비 (mole ratio)가 1:0.65:0.65가 되도록 첨가하여 반응시켰다. 다음날, 에탄올 (99.9%)로 하이드라지드-히알루론산 (hydrazide-hyaluronate, hHA)을 침전시키고, 침전물은 동결건조시켰다. FT-IR 및 1H NMR 분광광도계로 하이드라지드-히알루론산의 합성 여부를 확인하였다. 히알루론산과 아디프산 디하이드라지드의 반응 몰 비를 변환시켜 치환 (substitution) 정도가 다양한 하이드라지드-히알루론산을 합성하였다.
4. SEC-MALLS
히알루론산 유도체들 (oHA 및 hHA)의 분자량은 SEC-MALLS (size exclusion chromatography with multi-angle laser light scattering; Shimadzu)로 계산하였다. 상기 SEC-MALLS 시스템에는 컬럼 (PL Aquagel-OH MIXED-H, 7.5 300 mm; Tosoh Bioscience), 다각 광 산란 검출기 및 미분 굴절계 (with multi-angle light scattering photometer and differential refractometer; DAWN HELEOS Ⅱ and Optilab Rex, Wyatt Technology)가 장착되어 있다.
덱스트란을 표준 폴리머로, PBS를 이동상으로 사용하였고, 유속은 0.5 ㎖/분으로 설정했다. 히알루론산 유도체의 dn/dc 값은 0.167 ㎖/g이었으며, 실험은 25℃에서 진행했다. 데이터 분석은 ASTRA 6.1 software (Wyatt Technology)로 수행하였다.
5. 하이드로젤 제조 및 특성 확인
PBS에 산화 히알루론산 (oHA) 및 하이드라지드-히알루론산 (hHA)을 각각 용해시킨 후 두 용액을 혼합하여 신축성을 갖는 하이드로젤을 제작하였다. 또한, 아디프산 디하이드라지드 용액과 하이드라지드-히알루론산을 혼합한 후 여기에 산화 히알루론산 용액을 혼합하여 자가치유능 및 신축성을 갖는 하이드로젤을 제작하였다.
하이드로젤 형성은 FT-IR 분광광도계로 확인하였다. 원추 편판형 고정구 (cone-and-plate fixture; 20 ㎜ 직경, 4° 원추 각도)가 구비된 회전식 점도계 (rotational viscometer; Bohlin Gemini 150)로 5 Pa, 1 Hz 조건에서 하이드로젤의 점탄성 특성을 조사하였다.
하이드로젤의 응력-변형률 곡선 (stress-strain curve)은 10 N 로드 셀 (load cell; Submersible Pneumatic Side Action Grips, Instron)이 장착된 Instron 5966으로 2.5 ㎜/분 속도로 측정하였다. 하이드로젤 샘플 (25 ㎜ 길이, 8 ㎜ 폭, 1 ㎜ 두께)은 샘플 홀더에 맞추어 제작하였고, 샘플 홀더는 상기 로드 셀에 연결시켰다.
6. 3D 프린팅
다양한 3D 구조물들을 3D 프린터 (Invivo, Rokit; 대한민국)로 제작하였다. 자가치유 oHA/hHA/ADH 하이드로젤을 노즐로 사용되는 25-게이지 니들이 구비된 주사기에 채웠다. 모터 압력과 채움 밀도 (fill density)는 각각 300 N과 80%로 일정하게 유지하고, 프린팅 속도는 300 ㎜/분으로 고정하였다.
7. 세포 배양 및 인 비트로 ( in vitro ) 세포 생존율 실험
모델 세포로 사용한 ATDC5 세포 (RIKEN cell bank; 일본)를 10% FBS 및 1% PS가 포함된 DMEM/F-12 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 세포에 각 샘플 ([폴리머]=0.01 내지 0.5 wt%)을 처리하고, EZ-cytox solution (DoGen Bio; 대한민국)을 첨가하여 4시간 인큐베이션하였다. 흡광도를 450 ㎚에서 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.
ATDC5 세포를 5x106 세포/㎖ 농도로 포함하는 하이드로젤을 디스크 형태 (10 ㎜ 직경, 1 ㎜ 두께)로 프린팅하였다. 이 디스크를 37℃, 5% CO2 조건에서 3일 동안 배양하였다. 제조사 지시에 따라 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity kit (Invitrogen; 미국)로 세포 생존율을 평가하였다. 공초점 레이저 스캔 현미경 (TCS SP5; Leica Microsystems, 독일)으로 세포 이미지를 촬영하였다.
8. 통계 분석
모든 데이터는 평균±표준편차로 기재하였다. 통계 분석은 Student's t-test로 수행하였다. P 값이 0.05 또는 0.01 미만일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다 (*P < 0.05, **P < 0.01).
실험 결과
1. oHA 및 hHA의 제조 및 확인
HA를 과요오드산나트륨으로 부분적으로 산화시켜 알데히드기를 갖는 산화 히알루론산 (이하, oHA로 기재함)을 제조하였다. 산화 반응은 FT-IR 및 1H NMR 분광법으로 확인하였다. oHA의 알데히드기에 해당하는 피크는 FT-IR 스펙트럼의 1730 ㎝-1에서 관찰되었다 (도 3). 1H NMR 스펙트럼에서 4.5 ppm과 5.0 ppm의 새로운 피크는 oHA에서 알데히드기의 형성을 뒷받침한다 (도 4) (Park, Kim, Lee, & Lee, 2017). TNBS 분석으로 oHA에서 알데하이드기의 수를 결정하였다 (Kim et al., 2019). 히알루론산의 반복 단위 100개당 산화 단위 수로 정의되는 산화도(%)는 34%로 계산되었다.
HA는 카르보디이미드 결합을 통해 ADH와 접합되어 하이드라지드-히알루론산 (이하, hHA로 기재함)을 형성하였다. ADH와의 접합 여부는 FT-IR로 확인하였다 (도 3). hHA에서 아미드기 (C=O)에 해당하는 피크는 1710 ㎝-1에서 확인되었다. hHA의 합성은 1H NMR 분광법으로도 확인하였다 (도 4). hHA에서 ADH에 해당하는 양성자 피크를 관찰할 수 있었다 (도 4b 및 4c). 1.9 ppm의 피크는 HA의 N-아세틸-D-글루코사민 잔기의 아세트아미도 부분에 해당하였다 (도 4a). 30~70% 범위의 다양한 치환도 (DSs)를 갖는 hHA는 HA에 다양한 양의 ADH를 첨가하여 합성하였다. DS 값은 1H NMR 스펙트럼으로 정량하였다 (표 1). HA 유도체의 분자량은 SEC-MALLS로 결정하였고, 결과를 표 1에 기재하였다.
샘플a Mw b (g/mol) Rg,z c (nm) Theoretical DS (%) Actual DS (%)
oHA 2.5x103 25.8 - -
hHA210 2.1x105 52.0 - -
hHA600 6.0x105 105.3 - -
hHA1100 1.1x106 138.5 30 28.5
50 47.6
70 67.5
a hHA 뒤의 숫자는 중량 평균 분자량 (weight-average molecular)을 나타냄
b SEC-MALLS 측정에 의해 결정된 hHA의 중량 평균 분자량
c SEC-MALLS 측정에 의해 결정된 Z 평균 제곱 평균 제곱근 반경.
다음으로 hHA의 세포독성을 시험관내에서 ATDC5 세포를 사용하여 평가하였다. 세포 생존율은 다양한 폴리머 농도에서 hHA1100-DS30 및 hHA1100-DS50에 의해 크게 영향을 받지 않았다 (도 5). 그러나 세포 생존율은 hHA1100-DS70의 농도에 따라 감소하였으며, [hHA1100-DS70] = 0.5 wt%에서는 생존율이 80% 미만이었다. 이러한 결과는 양전하를 띤 하이드라지드 그룹을 HA에 도입하여 hHA의 양전하가 증가했기 때문일 수 있다. 세포독성을 고려할 때, 세포를 포함하여 oHA를 첨가하여 추가로 겔을 형성하는데 있어 hHA1100-DS70은 적합하지 않다는 결론을 내렸다.
2. 신축성 oHA/hHA 하이드로젤
부형제 가교 분자 없이 제조된 oHA/hHA 하이드로젤을 조사하였다. oHA의 알데하이드 그룹과 hHA의 하이드라지드 그룹은 가역적인 아실히드라존 (acylhydrazone) 결합을 형성하여 oHA/hHA 하이드로젤을 형성할 수 있다. oHA와 hHA 사이의 아실히드라존 결합의 형성은 FT-IR 스펙트럼에서 oHA의 알데히드 피크(1730cm-1)의 소멸과 아실히드라존 결합의 카르보닐 밴드(1640cm-1)에 해당하는 새로운 피크의 출현으로 확인하였다 (도 3) (Sun et al., 2019).
hHA의 DS가 하이드로젤 강성 (stiffness)에 미치는 영향은 회전 점도계로 확인하였다 (도 6). hHA의 분자량과 고분자 농도는 일정하게 유지하였다 ([oHA] = 3 wt%, [hHA1100] = 1.5 wt%). oHA/hHA 하이드로젤의 저장전단탄성계수 (storage shear modulus, G')는 DS가 증가할수록 증가하였다. 그러나 DS70인 hHA는 ATDC5 세포에 대해 세포독성을 나타냈기 때문에 (도 5), DS50인 hHA를 선택하여 추가 실험에 사용했다.
다음으로 하이드로젤 강성에 대한 hHA 분자량의 효과를 조사했다. 젤의 폴리머 농도가 동일할 때 G' 값은 hHA의 분자량 증가에 따라 증가하였다. hHA 농도는 일정하게 유지하고 ([hHA] = 1.5wt%) oHA 농도를 변화시켰을 때 oHA/hHA 하이드로젤의 G' 값은 젤의 oHA 농도가 증가할 때 증가하였다 (도 6). 그러나 [oHA]/[hHA] = 3 (wt/wt)으로 hHA1100을 사용하여 하이드로젤을 제조한 경우 G' 값이 상당히 감소하였다. hHA1100의 매우 높은 분자량은 이 실험 조건에서 oHA와의 결합 형성을 방해했을 수 있다.
다음으로, oHA의 농도를 3 wt%로 유지하면서 hHA1100 농도를 0.5 wt%에서 1.5 wt%로 변경하여 조사하였다. 분자량이 크기 때문에 1.5 wt% 이상의 농도로 균질한 hHA1100 용액을 제조하기 어려웠다. oHA/hHA 하이드로젤에서 hHA 농도는 겔의 G' 값에 크게 영향을 미쳤다 (도 6). 이러한 결과를 바탕으로 [oHA] = 3wt% 및 [hHA1100-DS50] = 1.5wt%로 제조된 하이드로젤을 선택하여 추가 연구에 사용했다.
다음으로 oHA/hHA 하이드로젤의 인장 시험을 수행하였다. 폴리머 농도는 동일하게 유지하면서 hHA의 분자량을 변화시켰다. 파단 연신율 (elongation at break)은 hHA의 분자량에 따라 달라졌다 (도 7). 흥미롭게도 oHA/hHA1100 하이드로젤은 원래 길이의 두 배 이상 늘어날 수 있었다 (도 7).
반면에 기존의 다당류 기반 하이드로젤은 일반적으로 약하고 부서지기 쉽다 (Lee & Mooney, 2001). 예를 들어, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (butanediol diglycidyl ether)와 가교된 HA/박테리아 셀룰로오스 하이드로젤과 HA/실크 피브로인 하이드로젤은 각각 원래 길이의 약 40% 및 50%까지 늘어날 수 있다 (Elia et al., 2013; Tang). 외, 2021). HA/젤라틴 하이드로젤도 약 60%까지 늘어날 수 있다 (Chang et al., 2021). 일반적인 신축성 하이드로젤 시스템에는 폴리아크릴아미드 (PAAm)와 같은 합성 고분자가 포함되어 있다. 알지네이트/PAAm 하이드로젤 및 아크릴아미드/폴리(에틸렌 글리콜) 디아크릴레이트 하이드로젤은 신축성이 매우 뛰어났다 (Ge et al., 2021; Sun et al., 2012).
추가적인 합성 고분자를 사용하지 않고 HA 유도체만으로 구성된 oHA/hHA 하이드로젤은 원래 길이의 약 2.1배까지 늘어날 수 있어 조직 공학 분야를 포함하여 많은 유용한 생물 의학 응용 분야를 찾을 수 있다.
이중 가교 하이드로젤은 향상된 신축성과 인성을 보여준다 (Sun et al., 2012; Wu et al., 2018; Yang & Yuan, 2019). 상기 이중 가교 하이드로젤은 두 개의 서로 다른 가교로 유지된다. 응력이 가해지면 첫 번째 가교가 파열되어 에너지가 흩어진다. 그런 다음 두 번째 가교는 탄력성을 유지하고 더 큰 스트레스를 견딜 수 있다 (Chen et al., 2016; Zhang et al., 2018). 이온 가교 및 공유 가교는 일반적으로 이중 네트워크를 준비하는 데 이용된다 (Bakarich et al., 2013; Bakarich et al., 2012; Stevens, Calvert, & Wallace, 2013; Sun et al., 2012).
oHA/hHA 하이드로젤의 향상된 신축성은 또한 젤의 이중 가교 형성에 기인한 것일 수 있다. HA는 카르복실기 때문에 본질적으로 음전하를 띠지만 (Jeon, Yoo & Park, 2015) ADH와 HA의 접합 (conjugation)은 ADH의 하이드라지드기 때문에 양전하를 증가시킬 수 있다. HA 또는 hHA 단독과 비교하여 HA/hHA 단순 혼합물의 복합 점도 (complex viscosity)의 상당한 증가는 HA와 hHA 사이의 정전기적 상호 작용을 설명할 수 있다 (도 8). 또한, HA/hHA 혼합물의 G' 값의 현저한 증가와 다양한 프리퀀시에서 모듈러스 곡선의 교차는 HA와 hHA 사이의 이온 가교를 통해 젤과 같은 구조가 형성됨을 입증한다 (도 8).
oHA/hHA 하이드로젤이 늘어나면 첫 번째 결합 (정전기적 상호작용에 의한 결합)은 파괴되는 반면 두 번째 결합 (즉, 아실히드라존 결합에 의한 가교)은 유지되어 하이드로젤이 탄성을 유지하게 된다. 따라서, oHA/hHA 하이드로젤에서 이온 결합 및 공유 결합은 모두 겔의 신축성을 향상시킬 수 있다.
3. 자가치유능 및 신축성을 갖는 oHA/hHA/ADH 하이드로젤
oHA/hHA/ADH 하이드로젤의 자가치유능을 조사하였다. 하이드로젤을 두 조각으로 자르고 다시 부착시킨 다음 15분 후에 수동으로 늘였다. 자가치유된 하이드로젤은 깨지지 않고 원래 길이의 약 2배로 늘어날 수 있었다. 또한, oHA/hHA/ADH 하이드로젤은 신축성이 있어 다양한 모양으로 만들 수 있었으며, 구부러지거나, 꼬이거나, 매듭 구조를 유지하면서 늘어날 수 있었다 (도 9).
또한 회전 점도계를 사용하여 oHA/hHA/ADH 하이드로겔의 자가치유 특성을 추가로 평가하였다. 변형률은 1%에서 400%로 교대하였고, 높은 변형률 (400% 변형률)을 제거하면 겔의 G' 값이 회복됨을 확인하였다 (도 10).
4. oHA/hHA/ADH 하이드로젤의 3D 프린팅
oHA/hHA/ADH 하이드로젤을 사용하여 3D 구조물을 만들었다. 인장 시험으로 oHA/hHA 하이드로젤 (도 7a)과 oHA/hHA/ADH 하이드로젤 (도 11에서 +ADH/-P)의 신축성에 차이가 없는 것을 확인하여 ADH의 추가가 신축성에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 한편, 3D 프린팅된 oHA/hHA 하이드로젤 (-ADH/+P)은 자기 치유 능력이 부족하여 파단 연신율이 감소하였다. 그러나 oHA/hHA/ADH 하이드로젤은 프린팅 공정(+ADH/+P) 이후에도 신축성을 유지했으며, 이는 프린팅되지 않은 젤 (+ADH/-P)의 거의 90% 수준이었다 (도 11).
다음으로 3D 프린팅 구조의 높은 변형성을 테스트하였다. 메쉬 형태의 3차원 구조물을 추로 압축하고 추를 제거하면 즉시 원래의 형태로 회복되었다 (도 11). 또한, oHA/hHA/ADH 하이드로젤을 사용하여 다양한 3D 구조를 제작할 수 있다 (도 11).
5. oHA/hHA/ADH 하이드로젤에서 세포 생존율 확인
ATDC5 세포를 oHA/hHA/ADH 하이드로젤에 캡슐화하고, 이들의 생존력을 LIVE/DEAD 분석으로 평가했다. 평가 결과, 프린팅 (+P)은 세포 생존율에 영향을 미치지 않았다. 배양 3일 후, 세포의 약 85%가 프린트된 oHA/hHA/ADH 하이드로젤 내에서 생존했다 (도 12).
이 결과는 3D 인쇄 가능한 oHA/hHA/ADH 하이드로젤 시스템이 맞춤형 조직 구조의 3D 인쇄를 포함하여 조직 공학에서 잠재력을 가질 수 있음을 나타낸다.
바이오프린팅을 위한 HA 기반 잉크는 추가 가교 공정이 필요하고 젤의 고유한 불안정성 (brittleness)으로 인해 사용이 제한적이다. 메타크릴화된 HA는 일반적으로 젤을 형성하기 위해 UV 조사가 필요한 3D 프린팅에 널리 사용되는 바이오잉크이다. 알지네이트도 압출 기반 바이오프린팅에 널리 사용된다. 그러나 알지네이트 또한 고체 구조를 형성하기 위해 인쇄 후 칼슘 이온을 사용한 겔화가 필요하다 (Mallakpour, Azadi, & Hussain, 2021; Piras & Smith, 2020).
반면 본 발명에 따른 oHA/hHA/ADH 하이드로젤은 3D 프린팅 후 고체 구조물을 형성하기 위한 추가 공정이 필요하지 않아 단백질 및 세포와 같은 생물학적 물질로 프린팅할 때 유리하다.
한편, 많은 천연 다당류는 단단한 뼈대를 가지고 있으며 다당류 기반 하이드로젤은 일반적으로 약하고 부서지기 쉽다 (Kumar et al., 2019; Xiao & Grinstaff, 2017). 예를 들어, 칼슘 이온과 가교 결합된 알지네이트 하이드로젤은 부서지기 쉬워 조직을 대체하여 사용할 수 없으며 제대로 늘릴 수도 없다 (Ibrahim, Azam, & Amin, 2019; Drury, Dennis, & Mooney, 2004; Kunwar et al., 2019; Serrano-Aroca, Iskandar, & Deb, 2018).
그러나 oHA/hHA/ADH 하이드로젤은 HA 기반 하이드로젤의 고유한 약점을 극복할 수 있는 화학적 가교(즉, 가역적 아실히드라존 결합) 및 물리적 가교(즉, 정전기 상호작용)를 포함하여 물리적으로도 강한 장점이 있다.
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Claims (14)

  1. 산화 히알루론산, 하이드라지드-히알루론산 및 아디프산 디하이드라지드를 포함하고,
    상기 하이드라지드-히알루론산은 히알루론산 사슬에 아디프산 디하이드라지드가 공유결합된 구조체이며,
    상기 산화 히알루론산의 알데하이드기는 하이드라지드-히알루론산의 하이드라지드기와 공유결합을 형성하고,
    상기 산화 히알루론산의 카르복실기는 하이드라지드-히알루론산의 하이드라지드기와 이온결합을 형성하며,
    상기 산화 히알루론산은 아디프산 디하이드라지드 및 하이드라지드-히알루론산과 경쟁적으로 반응하는, 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하이드라지드-히알루론산은 중량 평균 분자량 (weight-average molecular)이 1x105 내지 20x106 g/mol인, 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 하이드라지드-히알루론산은 치환도가 20% 내지 70%인, 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 산화 히알루론산과 하이드라지드-히알루론산은 조성물에 1 내지 5: 0.1 내지 5 (wt/wt) 비율로 포함되는, 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 하이드라지드-히알루론산은 조성물의 전체 중량 대비 0.1 내지 5 wt%로 포함되는, 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 산화 히알루론산은 산화도가 10% 내지 50%인, 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물.
  7. 제1항의 신축성 자가치유 하이드로젤 조성물을 포함하는 3차원 바이오프린팅용 조성물.
  8. (a) 아디프산 디하이드라지드 용액과 하이드라지드-히알루론산을 혼합하는 단계; 및
    (b) 상기 (a)에 산화 히알루론산 용액을 혼합하는 단계;를 포함하고,
    상기 하이드라지드-히알루론산은 히알루론산 사슬에 아디프산 디하이드라지드가 공유결합된 구조체이며,
    상기 산화 히알루론산의 알데하이드기와 하이드라지드-히알루론산의 하이드라지드기는 공유결합을 형성하고,
    상기 산화 히알루론산의 카르복실기와 하이드라지드-히알루론산의 하이드라지드기는 이온결합을 형성하는
    상기 산화 히알루론산은 아디프산 디하이드라지드 및 하이드라지드-히알루론산과 경쟁적으로 반응하는, 신축성 자가치유 하이드로젤의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 하이드라지드-히알루론산은 치환도가 20% 내지 70%인, 신축성 자가치유 하이드로젤의 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 하이드라지드-히알루론산은 하이드로젤의 전체 중량 대비 0.1 내지 5 wt%로 포함되는, 신축성 자가치유 하이드로젤의 제조 방법.
  11. 제8항의 방법으로 제조된 신축성 자가치유 하이드로젤.
  12. 제11항의 신축성 자가치유 하이드로젤을 포함하는 약물 전달체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 약물은 화합물, 단백질, 펩티드, 핵산, 당류 및 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 약물 전달체.
  14. 산화 히알루론산 및 하이드라지드-히알루론산을 포함하고,
    상기 하이드라지드-히알루론산은 히알루론산 사슬에 아디프산 디하이드라지드가 공유결합된 구조체이며,
    상기 산화 히알루론산의 알데하이드기는 하이드라지드-히알루론산의 하이드라지드기와 공유결합을 형성하는, 신축성 하이드로젤 조성물.
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