KR20030020895A

KR20030020895A - 조직 재생용 기재, 이식용 재료 및 그의 제법

Info

Publication number: KR20030020895A
Application number: KR1020027017665A
Authority: KR
Inventors: 노부히코 유우이; 오오야도오루; 가또마사까즈; 야마모또다께유끼
Original assignee: 가부시키가이샤 재팬 티슈 엔지니어링; 노부히코 유우이
Priority date: 2000-07-03
Filing date: 2000-11-27
Publication date: 2003-03-10
Also published as: EP1316321A4; DE60036029T2; AU2001215528A1; CN1454100A; DE60036029D1; KR100714742B1; EP1316321B1; CN1208094C; JP4753525B2; WO2002002159A1; US20030124168A1; EP1316321A1

Abstract

조직 재생이 가능하며, 조직 재건시에 필요한 역학특성을 구비하고, 조직 재건 후의 생체내에서의 분해소실 특성을 갖는 조직 재생용 기재, 및 이것을 이용한 이식용 재료를 제공한다. 본 발명의 조직 재생용 기재는 복수의 고리형 분자를 관통시킨 선형 분자의 양쪽 말단에 가수분해성 결합에 의하여 부피가 큰 치환기를 갖는 생체친화성 기가 도입된 폴리로탁산, 또는 상기 폴리로탁산에 대하여 이웃하는 폴리로탁산 1 분자 중에 포함되는 고리형 분자끼리, 생체친화성 기끼리 또는 고리형 분자와 생체친화성 기를 가교결합으로 가교한 그물코 구조의 폴리로탁산 히드로겔을 포함한다.

Description

조직 재생용 기재, 이식용 재료 및 그의 제법{BASE MATERIALS FOR TISSUE REGENERATION, TRANSPLANT MATERIALS AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}

최근, 인간 조직을 재형성, 재구축시킴으로써 치료를 행하는 조직공학 (Tissue Engineering) 의 분야가 급속히 발전하고 있다. 이러한 조직공학에서는 1980 년대 초기부터 정형외과 분야 치료 등을 위하여 피부, 연골 또는 신경세포를 분해ㆍ비분해성 재료 중에서 배양하는 시도가 이루어져 왔다.

조직공학에서는 조직 재생의 토대가 되는 매트릭스를 생체내에 이식하고, 생체내 (in vivo) 에서 세포를 증식시킴으로써 치료를 행하는 방법이나, 매트릭스를 토대로 한 세포의 배양, 증식을 생체외 (in vitro) 에서 행한 후, 배양한 세포 (조직) 를 생체내에 매트릭스와 함께 또는 재생조직 단독으로 이식하는 방법 등이 알려져 있다.

또한, 조직 재생의 토대가 되는 매트릭스에 관해서도 다양한 생체 유래의 합성재료 등이 알려져 있으며, 예를 들면 콜라겐이나 폴리글리콜산의 매트릭스 중에서는 세포의 3 차원 배양이 가능하고, 생체내에서 분해ㆍ흡수되는 특징을 갖고 있다.

그러나, 이들 매트릭스의 분해산물은 염증반응을 야기할 가능성이 있으며, 또한 매트릭스가 조직재건 전에 분해되거나, 조직재생 후에도 장기간 분해되지 않는 등, 분해ㆍ소실시간의 제어가 어려웠다.

본 발명은 상기 과제를 감안하여 이루어진 것으로, 조직 재생이 가능하며, 조직 재건시에 필요한 역학특성을 구비하고, 조직 재건후의 생체내에서의 분해소실 특성을 갖는 조직 재생용 기재를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 양호하게 조직을 재건할 수 있고, 조직 재건후의 생체내에서의 분해소실 특성을 갖는 이식용 재료를 제공하는 것과, 또한 그러한 이식용 재료의 제법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명은 정형외과, 구강외과, 성형외과 등의 의료분야에 널리 이용 가능한 조직 재생용 기재, 이식용 재료 및 그의 제법에 관한 것이다.

도 1 은 생분해성 폴리로탁산의 합성 순서를 나타내는 설명도이다.

도 2 는 폴리로탁산 히드로겔의 합성 순서를 나타내는 설명도이다.

도 3 은 폴리로탁산 히드로겔 PRHG-5, 6 의 비효소적 가수분해 양상의 그래프이다.

도 4 는 폴리로탁산 히드로겔 RPHG-5, 6 의 분해패턴을 고찰하기 위한 그래프이다.

도 5 는 폴리로탁산 히드로겔 PRHG-7∼9 의 비효소적 가수분해 양상의 그래프이다.

도 6 은 폴리로탁산 히드로겔 PRHG-7∼9 의 분해패턴을 고찰하기 위한 그래프이다.

도 7 은 PEG 비스아민의 분자량을 일정하게 하여 폴리로탁산의 함유율을 다양하게 변화시킨 폴리로탁산 히드로겔의 분해 양상을 나타내는 그래프이다.

도 8 은 폴리로탁산 함유율과 완전 분해 시간의 관계를 나타내는 그래프이다.

도 9 는 폴리로탁산 함유율과 함수율의 관계를 나타내는 그래프이다.

도 10 은 PEG/α-CD 비와 완전 분해시간의 관계를 나타내는 그래프이다.

도 11 은 횡축을 t/t_∞, 종축을 M_t/M_o로 하였을 때의 분해패턴을 나타내는 그래프이다.

도 12 는 폴리로탁산 히드로겔 PRHG-1, 3 상에서의 토끼 연골세포 배양의 시간 경과에 따른 변화를 나타내는 도면이다.

발명의 개시

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에 따른 조직 재생용 기재는 복수의 고리형 분자를 관통시킨 선형 분자의 양쪽 말단에 가수분해성 결합에 의하여 부피가 큰 치환기를 갖는 생체친화성 기가 도입된 폴리로탁산, 또는 상기 폴리로탁산에 대하여 이웃하는 폴리로탁산 1 분자 중에 포함되는 고리형 분자끼리, 생체친화성 기끼리 또는 고리형 분자와 생체친화성 기를 가교결합으로 가교한 그물코 구조의 폴리로탁산 히드로겔을 포함함을 특징으로 한다.

본 발명의 폴리로탁산 또는 폴리로탁산 히드로겔을 포함하는 조직 재생용 기재를 사용하여, 예를 들면 연골세포를 배양하면, 세포는 연골세포성 형태를 유지하면서 증식한다. 또한, 이 조직 재생용 기재를 단일체로 생체내에 이식해도 세포형태나 증식을 저해하는 일은 없다. 즉, 조직 재생이 가능하다.

또한, 본 발명에서 사용되는 폴리로탁산 또는 폴리로탁산 히드로겔은 조직 재건시에 필요한 역학특성을 구비하고 있다. 이것은, 폴리로탁산 및 폴리로탁산 히드로겔이 초분자 구조, 즉 선형 분자와 고리형 분자와 같은 상이한 분자간의 물리적인 얽힘 (비공유결합) 을 하고 있음으로 인하여, 높은 결정성을 갖고 있기 때문인 것으로 여겨진다.

또한, 본 발명에서 사용되는 폴리로탁산 또는 폴리로탁산 히드로겔은 조직 재건 후의 생체내에서의 분해소실 특성을 구비하고 있다. 이것은, 가수분해성 결합을 갖고 있기 때문에, 생체내에서 가수분해성 결합이 가수분해되어 부피가 큰 생체친화성 기 (즉, 캡) 가 선형 분자의 양쪽 말단에서 떨어지고, 이 선형 분자에서 고리형 분자가 이탈됨으로 인하여 분해소실되는 것으로 여겨진다.

이와 같이 본 발명의 조직 재생용 기재에 의하면, 조직 재생이 가능하며, 조직 재건시에 필요한 역학특성을 구비하는 동시에, 조직 재건 후의 생체내에서의 분해소실 특성을 갖고 있으므로, 세포로부터 조직을 재구축하는데 적합하다.

본 발명의 조직 재생용 기재에 있어서, 선형 분자나 고리형 분자는 생체친화성 (생체에 거의 해를 미치지 않는 성질) 을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않으나, 선형 분자로는, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜과의 공중합체, 및 폴리메틸비닐에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 것이 바람직하다. 이와 같이 구성되는 고리형 분자나 선형 분자로서, 생체친화성이 우수한 것을 선택함으로써, 합성된 폴리로탁산이나 폴리로탁산 히드로겔은 생체친화성이 우수하여, 조직 재생용 이식재료로서 적합하다. 또한, 평균분자량은 200∼50000, 특히 400∼5000 인 것이 바람직하다. 고리형 분자로는, α, β또는 γ-시클로덱스트린인 것이 바람직하지만, 이와 유사한 고리형 구조를 갖는 것이어도 되며, 그러한 고리형 구조로는 고리형 폴리에테르, 고리형 폴리에스테르, 고리형 폴리에테르아민, 고리형 폴리아민 등을 들 수 있다. 선형 분자와 고리형 분자의 조합으로는, α-시클로덱스트린과 폴리에틸렌글리콜의 조합이 바람직하다.

본 발명의 조직 재생용 기재에 있어서, 가수분해성 결합으로는 생체내에서 가수분해되는 결합이면 어떠한 결합이어도 된다. 이 중, 생체내에서 빠르게 비효소적으로 가수분해되는 것을 고려하면 에스테르 결합인 것이 바람직하다.

조직 재생용 기재가 폴리로탁산 히드로겔인 경우, 가교결합은 우레탄 결합, 아미드 결합, 카바미드 결합, 에테르 결합, 술피드 결합 또는 시프 염기(Schiff base)형 결합이 바람직하다. 또한, 가교결합은 고리형 분자끼리를 가교하는 경우, 가수분해성 결합보다 물에 대하여 안정적인 것이 바람직하다. 이것은 먼저 가수분해성 결합이 분해되어 선형 분자의 양쪽 말단으로부터 부피가 큰 치환기를 갖는 생체친화성 기가 떨어지고, 가교결합된 고리형 분자가 한번에 이탈됨으로써, 양호한 분해패턴이 얻어지기 때문이다.

본 발명의 조직 재생용 기재에 있어서, 선형 분자의 양쪽 말단의 생체친화성 기로는, 생체에 대한 친화성이 높은 기 (생체에 대하여 안전성이 높은 기) 이면 어떠한 기여도 되는데, 예를 들면 아미노산, 올리고펩티드, 올리고당류 또는 당 유도체인 것이 바람직하다. 아미노산으로는, 예를 들면 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 아스파라긴산, 글루타민산, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 리신, 아르기닌, 히스티딘 등을 들 수 있다. 또한, 올리고펩티드로는 앞서 예시한 아미노산의 다수가 펩티드 결합되어 형성된 것 등을 들 수 있다. 또한, 올리고당류로는 반복단위가 1∼5 이며, 구성 다당으로서 덱스트란, 히알루론산, 키틴, 키토산, 아르긴산, 콘드로이틴황산, 전분으로 이루어지는 것 등을 들 수 있다. 또한, 당 유도체로는 올리고당류, 다당 또는 단당을 아세틸화나 이소프로필화 등의 화학수식한 화합물 등을 들 수 있다. 이 중, 벤젠 고리를 갖는 아미노산, 예를 들면 L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판 등이 바람직하다.

본 발명의 조직 재생용 기재에 있어서, 생체친화성 기가 갖는 부피가 큰 치환기로는, 선형 분자로부터 고리형 분자가 누락되는 것을 방지할 수 있으면 어떠한 기여도 되는데, 예를 들면 1 이상의 벤젠 고리를 갖는 기 또는 1 이상의 제 3 부틸을 갖는 기가 바람직하다. 1 이상의 벤젠 고리를 갖는 기로는, 예를 들면 벤질옥시카르보닐 (Z) 기, 9-프레오닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc) 기, 벤질에스테르 (OBz) 기 등을 들 수 있으며, 또한 1 이상의 제 3 부틸을 갖는 기로는 제 3 부틸카르보닐 (Boc) 기, 아미노산 제 3 부틸에스테르 (OBu 기) 등을 들 수 있는데, 이 중 벤질옥시카르보닐기가 바람직하다.

본 발명의 조직 재생용 기재로는, 상기 선형 분자가 폴리에틸렌글리콜, 상기고리형 분자가 α-시클로덱스트린, 상기 가수분해성 결합이 에스테르 결합, 상기 부피가 큰 치환기를 갖는 생체친화성 기가 벤질옥시카르보닐-L-페닐알라닌인 것이 특히 바람직하다. 또한, α-시클로덱스트린을 폴리에틸렌글리콜에 관통시키는 경우, α-시클로덱스트린과 폴리에틸렌글리콜의 반복단위 (에틸렌옥시드 단위) 비의 화학량론비는 1 : 2 로 알려져 있다.

본 발명의 조직 재생용 기재가 폴리로탁산 히드로겔인 경우에는, 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산의 중량비율 (폴리로탁산 히드로겔 골격에 차지하는 폴리로탁산의 중량비율) 을 변화시킴으로써 폴리로탁산 히드로겔의 분해속도를 컨트롤할 수 있다. 이는 금번 새로이 수득된 지견이지만, 이 지견을 이용하여 다음과 같이 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산의 중량비율을 정하는 것이 바람직하다. 즉, 조직 재생용 기재의 사용상황에 적합한 분해속도를 미리 구해 두고, 그의 분해속도가 되도록 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산의 비율을 정하는 것이다. 이 결과, 사용상황에 적합한 조직 재생용 기재가 수득된다.

본 발명의 조직 재생용 기재가 폴리로탁산 히드로겔로서, 이웃하는 폴리로탁산 1 분자 중에 포함되는 고리형 분자끼리 (또는 생체친화성 기끼리, 또는 고리형 분자와 생체친화성 기) 를 가교용 선형 분자를 통하여 가교 결합으로 가교한 구조인 경우에는, 그의 가교용 선형 분자의 평균분자량을 변화시킴으로써 폴리로탁산 히드로겔의 분해속도나 분해패턴을 컨트롤 할 수 있다. 이것도 금번에 새로이 수득된 지견이지만, 이 지견을 이용하여 다음과 같이 가교용 선형 분자의 평균분자량을 정하는 것이 바람직하다. 즉, 조직 재생용 기재의 사용상황에 적합한 분해속도나 분해패턴을 미리 정해 두고, 그 분해속도나 분해패턴이 되도록 가교용 선형 분자의 평균분자량을 정하는 것이다. 이 결과, 사용상황에 적합한 조직 재생용 기재가 수득된다.

여기서 분해패턴으로는, 생체내에서 서서히 분해되어 가는 패턴, 또는 생체내에서 어느 정도의 시간이 경과할 때까지는 거의 분해되지 않고, 그 후 급속히 분해되는 패턴 등이 있다. 또한, 가교용 선형 분자로는 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜과의 공중합체 등의 생체친화성 폴리머가 바람직하며, 그의 평균분자량은 0∼50000 의 범위에서 정하는 것이 바람직하다. 또한, 가교부분의 분자량이 0 인 경우에는 가교용 선형 분자를 통하지 않고 직접 결합되어 있음을 의미한다. 또한, 가교용 선형 분자를 통하여 가교할 때, 가교용 선형 분자의 양쪽 말단에서 가교하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조직 재생용 기재는 복수의 고리형 분자를 관통시킨 선형 분자의 양쪽 말단에 가수분해성 결합에 의하여 부피가 큰 치환기를 갖는 생체친화성 기가 도입된 폴리로탁산에 대하여, 이웃하는 폴리로탁산 1 분자 중에 포함되는 고리형 분자끼리를 가교용 선형 분자를 통하여 가교결합으로 가교한 그물코 구조의 폴리로탁산 히드로겔을 포함하며, 하기 (a) 및/또는 (b) 의 성질을 갖는 것이 바람직하다.

(a) 폴리로탁산 히드로겔이 완전히 가수분해되기까지의 시간이 폴리로탁산 히드로겔 중의 함수율에 의존하지 않고, 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산 함유율이 감소함에 따라, 또는 고리형 분자에 대한 가교용 선형 분자의 몰비가 증가함에 따라, 또는 가교용 선형 분자의 평균분자량이 감소함에 따라 길어진다.

(b) 폴리로탁산 히드로겔이 완전히 가수분해되기까지의 시간을 t_∞, 경과시간을 t, 초기 수팽윤 상태에서의 폴리로탁산 히드로겔의 중량을 M_o, 시간 t 에서의 폴리로탁산 히드로겔 중량을 M_t로 하고, 횡축에 t/t_∞, 종축에 M_t/M_o를 취하여 그래프를 그렸을 때의 분해패턴이 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산 함유율에 의존하지 않고, 가교용 선형 분자의 분자량에 의존하여 정해진다.

상기 (a) 의 성질을 갖는 경우에는, 조직 재생용 기재의 사용상황에 적합한 분해속도를 미리 정해 두고, 그러한 분해속도가 되도록 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산의 비율 (함유율) 을 정하거나, 또는 고리형 분자에 대한 가교용 선형 분자의 몰비를 정하거나, 또는 가교용 선형 분자의 평균분자량을 정함으로써, 사용상황에 적합한 조직 재생용 기재가 수득된다.

한편, 상기 (b) 의 성질을 갖는 경우에는, 조직 재생용 기재의 사용상황에 적합한 분해패턴을 미리 구해 두고, 그러한 분해패턴이 되도록 가교용 선형 분자의 평균분자량을 정함으로써, 사용상황에 적합한 조직 재생용 기재가 수득된다. 또한, 실제로 생체내에서 사용할 때에 어느 정도의 시간이 경과할 때까지는 거의 분해되지 않고, 그 후에 급속히 분해되는 패턴을 수득하고자 하면, 예를 들면, 가교용 선형 분자의 평균분자량을 4000∼10000 으로 하는 것이 바람직하다.

상기 (a) 및/또는 (b) 의 성질을 갖는 조직 재생용 기재로는, 예를 들면 고리형 분자가 α-시클로덱스트린, 선형 분자가 폴리에틸렌글리콜, 가수분해성 결합이 에스테르 결합, 가교용 선형 분자가 폴리에틸렌글리콜비스아민이며, 이웃하는 폴리로탁산 1 분자 중에 포함되는 α-시클로덱스트린의 OH 기끼리를 폴리에틸렌글리콜비스아민의 양쪽 말단의 NH₂기로 우레탄 결합에 의하여 가교한 그물코 구조의 폴리로탁산 히드로겔을 포함하는 것을 들 수 있다.

본 발명의 조직 재생용 기재는 세포를 배양 또는 혼입(incorporation) 가능한 형태이면 특별히 어떠한 형태이든 한정되지 않는다. 예를 들면, 필름 형상으로 하여 그 위에 세포를 접종하거나, 겔 형상으로 하여 그 위에 세포를 접종하거나, 용매에 녹여 그 용액에 세포를 접종하거나, 용매에 현탁시켜 그 현탁액에 세포를 접종해도 된다. 특히, 세포를 유지ㆍ배양하기 용이하게 하는 점을 고려하면, 폴리로탁산 또는 폴리로탁산 히드로겔의 다공체를 이용하는 것이 바람직하다. 이 때의 공(孔)에 대해서는 세포를 유지할 수 있는 크기ㆍ밀도이면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 세포와 조합되지 않고 조직 재생용 기재를 단일체로 생체내에 이식하는 경우에도, 조직 재생용 기재의 형태가 한정되는 일은 없다. 바람직하게는 이식 주변 조직으로부터의 세포가 증식하기에 적합한 환경을 부여하기 위하여, 다공체로 하는 것이 바람직하다. 이 때, 공의 크기, 밀도는 이식 주변 조직으로부터 세포가 침입하고, 혈관 신생이 가능하기에 적합한 크기, 밀도로 하면 되며, 특별히 한정되지는 않는다. 또한, 다공체의 제법으로는 주지의 방법을 적용 가능하며, 예를 들면 염화나트륨 존재하에서 겔화하는 방법, 또는 함수(含水)히드로겔을 진공동결건조하는 방법 등이 적용 가능하다.

본 발명의 조직 재생용 기재는 그의 표면이 세포접착 촉진물질에 의하여 피복되어 있어도 된다. 세포접착 촉진물질은, 세포의 접착을 촉진시키는 성질을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 콜라겐, 젤라틴 등을 들 수 있다. 피복방법은 특별히 제한되지 않고, 통상의 방법에 따라 실시할 수 있지만, 간편하게는 다공체를 조제한 후, 세포접착 촉진물질에 침지시키고, 그 후 다시 동결건조하는 방법을 들 수 있다.

조직 재생용 기재는 특히 어떠한 세포의 배양 또는 혼입에 사용해도 되며, 예를 들면 간엽(間葉)계 세포, 간세포, 신경세포의 배양에 사용하는 것이 바람직하다. 여기서, 간엽계 세포에는 연골세포, 선유아세포, 골아세포, 근아세포, 지방세포, 내피세포, 상피세포와 이들 전체의 전구세포가 포함되며, 본 발명의 조직 재생용 기재는 연골세포의 배양에 사용하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명의 조직 재생용 기재를 사용하여 조직을 재생시키는 방법으로는, 폴리로탁산 및 폴리로탁산 히드로겔을 단일체로 사용하는 방법, 재생용 기재에 단순히 세포를 이식시켜 사용하는 방법, 또는 재생용 기재에서 세포를 배양하여 사용하는 방법이 고려된다.

또한, 세포를 고정화하는 방법으로는, 예를 들면 폴리로탁산 히드로겔에 있어서는 고농도의 세포배양액을 첨가하고, 겔의 팽윤과 함께 세포를 겔의 구멍내로 주입시킴으로써 고정화하는 방법, 회전배양하는 방법, 세포를 접종한 후 세포에 영향을 미치지 않을 정도로 감압함으로써 고정화하는 방법 등을 들 수 있다.

본 발명의 조직 재생용 기재에서 세포가 배양되고 있거나 또는 세포가 혼입된 이식용 재료를 사용하면, 조직 재생이 가능해진다. 이 이식용 재료를 제조하는 방법으로는, 어떠한 제조방법이어도 되는데, 상기 조직 재생용 기재를 사용 목적에 따라 적당한 크기 또는 형상으로 조제한 후, 이 조직 재생용 기재에 세포를 배양하거나 혼입시킴으로써 이식용 재료를 수득하는 것이 특히 바람직하다. 예를 들면, 귀 연골의 재건에 사용하는 경우에는, 귀의 적용부위에 적합하도록 정형ㆍ가공한 조직 재생용 기재에 세포분산액을 주입하고, 일정기간 배양하여 이식용 재료로 해도 된다. 이 경우, 이 이식용 재료는 귀의 적용부위에 매립된다. 반대로, 조직 재생용 기재에 세포를 배양 또는 혼입시킨 후, 이 이식용 재료의 이용시, 또는 출하시에 적용부위에 따른 적절한 크기 또는 형상으로 조정해도 된다.

폴리로탁산 또는 폴리로탁산 히드로겔을 포함하는 조직 재생용 기재에 예를 들면 연골세포가 배양된 이식용 재료에서는, 배양세포는 연골세포성 형태를 유지하면서 증식하고, 연골기질을 풍부히 생산하고 있다. 연골조직은 연골세포와 그 세포가 생산하는 기질에 의하여 주로 수복(修復)되므로, 미리 이들이 풍부히 함유되어 있는 것은 그 이식용 재료가 높은 조직 재생능력을 가짐을 의미하고 있다. 이와 같이, 배양조작을 행한 경우에는 조직 수복에 필요한 세포를 증식시키는 점, 또는 세포의 생산물질 (기질이나 성장인자 등) 을 이식용 재료 중에 담지할 수 있는 점이 바람직하나, 어떠한 이유에 의해서 세포가 사멸된 경우라도, 세포가 생산한 기질이나 성장인자는 이식용 재료 중에 잔존하므로 조직 재생에는 효과적이다. 또한, 상기 조직 재생용 기재에 예를 들면 연골세포를 접종하였을 뿐, 즉 배양하지않고 단지 이식시킨 것만으로도 세포의 형태가 유지되므로, 이식 직후부터 이들 세포가 조직 재생에 기능하여, 이식용 재료로서 효과적이다.

발명을 실시하기 위한 최적의 형태

본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 이하에서 설명하는데, 본 발명은 이들에 하등 한정되는 것은 아니다.

(1) 생분해성 폴리로탁산의 합성 (도 1 참조)

(1-1) 양쪽 말단에 아미노기를 갖는 PEG 의 합성

분자량 3300 의 폴리에틸렌글리콜 (PEG) (33g, 10mmol) 과 무수 숙신산 (20g, 200mmol) 을 톨루엔 (220㎖) 에 용해시키고, 이 용액을 150℃ 에서 5 시간 환류시켰다. 반응종료 후, 과잉 디에틸에테르에 주입시키고, 여과분리ㆍ감압건조하여 조(粗)생성물을 얻었다. 이것을 디클로로메탄에 용해시키고, 불용물을 원심분리에 의하여 제거하고, 과잉 디에틸에테르에 주입하여 여과분리ㆍ감압건조 후에 양쪽 말단에 카르복실기를 갖는 PEG (화합물 A) 를 백색분말로 수득하였다.

이 화합물 A (20g, 5.7mmol) 와 N-히드록시숙신이미드 (HOSu) (17.1g, 148.2mmol) 를 1,4-디옥산과 디클로로메탄의 혼합용액 (350㎖, 체적비 1:1) 에 용해시키고, 빙냉 후 디시클로헥실카보디이미드 (DCC) (23.5g, 114mmol) 를 첨가하였다. 빙냉시킨 상태에서 1 시간 교반하고, 그 후 실온에서 종액교반하였다. 부생성물인 디시클로우레탄을 여과분리하고, 여과액은 농축하고나서 과잉 디에틸에테르에 주입하였다. 여과분리ㆍ감압건조 후에 카르복실기가 활성화된 PEG (화합물 B) 를 백색분말로 수득하였다.

에틸렌디아민 (0.4㎖, 6mmol) 을 용해시킨 디클로로메탄 (75㎖) 에 화합물 B (10g, 2.7mmol) 를 용해시킨 디클로로메탄 (75㎖) 을 적하하고, 적하종료 후부터 실온에서 1 시간 교반하였다. 반응종료 후, 용액을 과잉 디에틸에테르에 주입하고, 여과분리ㆍ감압건조 후에 양쪽 말단에 아미노기를 갖는 PEG (화합물 C) 를 백색분말로 수득하였다.

(1-2) 유사 폴리로탁산의 조제

α-시클로덱스트린 (α-CD) (48g, 49.2mmol) 의 포화수용액 (311㎖) 에 화합물 C (4g, 1.12mmol) 의 수용액 (20㎖) 을 실온에서 적하하였다. 1 시간 초음파를 조사하면서 교반하고, 그 후 실온에서 24 시간 교반하였다. 원심분리에 의하여 백색의 침전물을 회수하고, 50℃ 에서 감압건조를 실시하여, 백색 분말의 유사 폴리로탁산을 수득하였다.

또한, 폴리로탁산은, 다수의 고리형 분자 (예를 들면, 시클로덱스트린) 에 선형 분자 (예를 들면 PEG) 가 관통하고, 그 선형 분자의 양쪽 말단을 부피가 큰 치환기로 캡을 씌운 것을 말하며, 유사 폴리로탁산은, 폴리로탁산의 양쪽 말단을 아직 부피가 큰 치환기로 캡을 씌우지 않은 것을 말한다.

(1-3) 말단 캡제의 조제

α-CD 의 이탈을 방지하는 부피가 큰 치환기로서 벤질옥시카르보닐-L-페닐알라닌 (Z-L-Phe, Z 는 벤질옥시카르보닐기를 나타낸다) 을 도입하기 위하여, Z-L-Phe 의 카르복실기의 활성화를 실시하였다.

즉, Z-L-Phe (100g, 334mmol) 을 1,4-디옥산 (800㎖) 에 용해시키고, 빙냉시키면서 HOSu (38.42g, 334mmol) 을 첨가하였다. 1 시간 후에 DCC (75.7g, 367mmol) 를 용해시킨 1,4-디옥산 용액 (200㎖) 을 천천히 첨가하고, 빙냉시킨 상태에서 1 시간 교반하고, 그 후 실온에서 종액교반하였다. 부생성물인 디시클로우레탄을 여과분리하고, 여과액은 농축하고나서 과잉 디에틸에테르에 주입하여, 여과분리ㆍ감압건조 후에 조생성물을 수득하였다. 실온에서 가능한한 포화농도가 될 때까지 조생성물을 디클로로메탄에 용해시킨 후, 석유 에테르를 적량 첨가하여 냉장하고, 재결정을 실시하였다. 결정을 여과분리ㆍ감압건조하여 백색 침형상 결정의 Z-L-Phe 의 숙신이미드에스테르 (Z-L-Phe-OSu) 를 수득하였다.

(1-4) 생분해성 폴리로탁산의 조제

Z-L-Phe-OSu (80g, 200mmol) 을 디메틸술폭시드 (DMSO) (60㎖) 에 용해시키고, 유사 폴리로탁산 (45g, 2mmol) 을 첨가하였다. 이 불균일 용액을 실온에서 교반하면서, 균일해지도록 조금씩 DMSO 를 첨가하여 96 시간 교반하였다. 반응종료 후, 반응용액을 과잉 디에틸에테르에 주입하여 조생성물을 수득하였다. 조생성물을 아세톤, 디메틸포름아미드 (DMF) 의 순서로 세척하여 불순물 (미반응 Z-L-Phe-OSu, α-CD, 화합물 C 등) 을 제거하고, 여과분리ㆍ감압건조하여 생분해성폴리로탁산을 백색분말로서 수득하였다. 합성의 확인은¹H-NMR 에 의하여 실시하였다.

(2) 폴리로탁산 히드로겔의 조제 (도 2 참조)

질소 분위기하에서 생분해성 폴리로탁산 (1g, 2.91×10^-5mol, [OH]=16.2mmol) 을 DMSO (10㎖) 에 용해시킨 후에, N,N'-카르보닐디이미다졸 (CDI) (8.13mmol) 을 첨가하고, 실온에서 3 시간 교반하였다. 반응종료 후, 과잉 디에틸에테르에 주입하고, 여과분리ㆍ감압건조하여 백색 분말의 CDI 활성화 폴리로탁산 (CDI-PR) 을 수득하였다.

하기 표 1 에 나타낸 배합량에 따라, CDI-PR 의 DMSO 용액과, PEG 의 비스아민 (PEG-BA, 분자량 600) 과 염화나트륨을 첨가하고, 교반ㆍ탈기 후 테프론스페이서 (Teflon spacer) (직경 13mm, 깊이 2mm) 를 사용하여 35℃ 에서 24 시간 겔화를 실시하였다. 수득된 겔은 DMSO 로 세척하고, 계속해서 물로 중량이 변화되지 않을 때까지 세척하여 폴리로탁산 히드로겔을 수득하였다 (PRHG-1∼4).

이들 폴리로탁산 히드로겔 PRHG-1∼4 는 이웃하는 폴리로탁산 1 분자 중에 포함되는 고리형 분자 (α-시클로덱스트린) 끼리를 가교결합 (우레탄 결합) 에 의하여 PEG 를 통하여 가교하여 3 차원 그물코 구조로 한 것이다. 또한, 염화나트륨 존재하에서 겔화를 실시한 PRHG-1∼3 은 다공체이고 (전자현미경으로 확인완료), 염화나트륨 존재하에서 겔화를 실시한 PRHG-4 는 비다공체였다.

	PRHG-1	PRHG-2	PRHG-3	PRHG-4
히드로겔화의반응조건	반응용액 중의 CDI-PR 의 농도(g/㎖)[ ]안은 PR 환산농도(g/㎖)	0.30[0.20]	0.20[0.12]	0.20[0.12]	0.30[0.20]
	반응용액 중의 PEG-BA 의 농도(g/㎖)< >안은 PEG-BA 의 분자량	0.33<0.6K>	0.26<2.0K>	0.26<0.6K>	0.09<0.6K>
	NaCl 의 사용량(CDI-PR+PEG-BA 에 대한 wt%)	38	100	100	0
히드로겔 중의 폴리로탁산 함유율 (wt%)	38	32	32	70
※히드로겔의물성	함수율 (wt%)	87.1	-	97.1	-
	압축탄성률 (×10⁴Pa)	6.49	-	1.44	-
	가교밀도 (×10^-6mol/㎤)	8.72	-	1.93	-
※비다공체의 측정값이다.

(3) 폴리로탁산 히드로겔의 물성

폴리로탁산 히드로겔의 함수율, 역학강도의 지수가 되는 압축탄성율 및 팽윤시의 가교밀도를 측정하였다 (표 1 참조). 또한, 이들은 비다공체의 측정값이지만, 압축탄성률에 대해서는 다공체라도 동등 내지 1 단계 낮은 정도이고, 가교밀도에 대해서는 다공체라도 동등하다.

함수율은 실온에서 평형팽윤 상태의 폴리로탁산 히드로겔 중량 (W_wet) 및 그 겔을 50℃ 에서 감압건조한 후의 건조 폴리로탁산 히드로겔 중량 (W_dry) 을 측정하여, 하기 수학식 1 로부터 산출하였다.

압축탄성률은 실온에서 열응력변형 측정장치를 사용하여 측정하고, 가교밀도는 압축탄성률을 이용하여 하기 수학식 2 로부터 산출하였다. 또한, 측정에는코르크 보어러(cork borer)를 사용하여 프로브와 거의 동일한 단면적으로 도려낸 평형팽윤 상태의 폴리로탁산 히드로겔을 사용하였다.

Ec = 3RT ×ve/V

Ec : 압축탄성률

ve/V : 가교밀도

R : 기체정수

T : 절대온도

V : 팽윤시의 겔의 체적

(4) 폴리로탁산 히드로겔의 비효소적 가수분해 양상의 해석

(4-1) 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산의 비율에 관한 고찰

상기 (2) 에 있어서, CDI-PR 의 DMSO 용액과 PEG-BA 의 DMSO 용액과 염화나트륨을 첨가하여 겔화를 실시할 때, 폴리로탁산 중량 (CDI-PR 의 DMSO 용액으로부터 환산) 과 PEG-BA 중량의 비를 70 : 30 으로 한 폴리로탁산 히드로겔 (PRHG-5) 과 60 : 40 으로 한 폴리로탁산 히드로겔 (PRHG-6) 을 조제하였다.

평형팽윤 상태의 폴리로탁산 히드로겔 PRHG-5, PRHG-6 을 0.1 M 인산 완충용액 (PBS) (pH=8.0) 에 침지시키고, 37℃ 에서 진탕하면서, 소정시간마다 물을 닦아내고 겔의 중량변화를 측정하였다. 이 중량변화를 비효소적 가수분해 양상의 평가로 하였다. 결과를 도 3 에 나타낸다.

폴리로탁산 히드로겔의 분해패턴은 초기에는 중량이 증가해 가고, 그 후에는감소하여 결국에는 0 이 되는 패턴이다. 여기서, 중량이 증가하고 있는 동안은 폴리로탁산 히드로겔의 가교점이 감소하여 3 차원 구조의 그물코의 매스가 넓어짐으로써 수분을 유지하기 쉬워져 함수율이 향상된 것으로 여겨지지만, 폴리로탁산 히드로겔의 3 차원 구조는 유지되어 있는 것으로 여겨진다. 한편, 폴리로탁산 히드로겔의 3 차원 구조를 유지할 수 없게 될 만큼 가교점이 감소하면, 용해되어 중량이 감소하여 0 에 이르는 것으로 여겨진다. 따라서, 중량변화의 측정을 개시하고나서 중량이 0 에 이르기까지의 시간이 분해속도를 나타낸다.

도 3 에 의하면, PRHG-6 보다 PRHG-5 쪽이 분해속도가 빠르므로, 폴리로탁산 히드로겔의 분해속도는 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산의 중량비율이 많을수록 빨라진다고 할 수 있다.

또한, 폴리로탁산 히드로겔의 분해패턴을 고찰하기 위하여, 실험개시 전의 수팽윤 상태시의 히드로겔의 중량 M_o, 폴리로탁산 히드로겔이 완전히 분해되기까지의 시간 (완전분해시간이라 한다) t_∞를 이용하여 규격화를 실시하고, 폴리로탁산 히드로겔을 침수시킨 후의 경과시간 t 을 t_∞로 나눈 값 t/t_∞, 시간 t 에서의 겔중량 M_t를 M_o로 나눈 값 M_t/M_o를 규격화한 수치로 하여 도 4 의 그래프를 작성하였다. 분해패턴을 고찰할 때의 시점의 하나는, t/t_∞의 수치가 얼마일 때 폴리로탁산 히드로겔의 분해가 개시되었는가 (M_t/M_o가 피크에 달했는가) 라는 점에 있다. 분해개시시의 t/t_∞의 수치가 작다는 것은 분해되기 시작하고나서 완전히 분해되기까지 요하는 시간이 길다는 것이며, 반대로 분해개시시의 t/t_∞의 수치가 크다는 것은 분해되기 시작하고나서 완전히 분해되기까지 요하는 시간이 짧다는 것이다.

도 4 에 의하면, PRHG-5 및 PRHG-6 모두에서 분해개시시의 t/t_∞의 수치는 거의 동일 (약 0.5) 하므로, 폴리로탁산 히드로겔의 분해패턴은 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산의 비율에 의존하지 않는다고 할 수 있다.

(4-2) 폴리로탁산 히드로겔 중의 가교부분의 분자량에 관한 고찰

상기 (2) 에 있어서, CDI-PR 의 DMSO 용액에 PEG-BA 와 염화나트륨을 첨가하여 겔화를 실시할 때, CDI-PR 에 포함되는 α-CDI 분자당 PEG-BA 의 주입비가 1.0 이 되도록 하여, 분자량 600 의 PEG-BA 를 이용한 폴리로탁산 히드로겔 (PRHG-7) 과, 분자량 2000 의 PEG-BA 를 이용한 폴리로탁산 히드로겔 (PRHG-8), 분자량 4000 의 PEG-BA 를 이용한 폴리로탁산 히드로겔 (PRHG-9) 을 조제하였다.

평형팽윤 상태의 폴리로탁산 히드로겔 PRHG-7, PRHG-8, PRHG-9 를 0.1 M 인산 완충용액 (PBS) (pH = 7.4) 에 침지시키고, 37℃ 에서 진탕하면서, 소정시간마다 물을 닦아내고 겔의 중량변화를 측정하였다. 이 중량변화를 비효소적 가수분해 양상의 평가로 하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다.

도 5 에 의하면, 폴리로탁산 히드로겔의 분해속도는 폴리로탁산 히드로겔 중의 가교부분의 분자량이 작을수록 빨라짐을 시사하고 있다. 즉, 이 결과는 폴리로탁산 히드로겔 중의 가교부분의 분자량을 변화시키면 분해속도를 컨트롤할 수 있음을 시사하고 있다.

또한, 폴리로탁산 히드로겔의 분해패턴을 고찰하기 위하여, 도 4 와 동일하게 하여, 도 6 의 그래프를 작성하였다. 도 6 에 의하면, PRHG-7 의 분해개시시의 t/t_∞는 0.50 부근이며, PRHG-8 의 분해개시시의 t/t_∞는 0.85 부근이며, PRHG-9 의 분해개시시의 t/t_∞는 0.90 부근이다. 이로부터, 폴리로탁산 히드로겔의 분해패턴에서의 분해개시시의 t/t_∞는 폴리로탁산 히드로겔 중의 가교부분의 분자량이 클수록 커진다고 할 수 있다.

(4-3) 요약

이상의 결과로부터, 폴리로탁산 히드로겔의 분해속도를 컨트롤하려면 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산의 중량비율을 변화시키거나, 폴리로탁산 히드로겔 중의 가교부분의 분자량을 변화시키면 됨을 알 수 있다. 즉, 조직 재생용 기재로서 폴리로탁산 히드로겔을 이용하는 경우, 조직 재생용 기재의 사용상황에 적합한 분해속도를 구하고, 그러한 분해속도가 수득되도록 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산의 중량비율을 정하거나, 폴리로탁산 히드로겔 중의 가교부분의 분자량을 정하면 된다.

또한, 폴리로탁산 히드로겔의 분해패턴 (분해개시시의 t/t_∞) 을 컨트롤하려면 폴리로탁산 히드로겔 중의 가교부분의 분자량을 변화시키면 됨을 알 수 있다. 즉, 조직 재생용 기재로서 폴리로탁산 히드로겔을 이용하는 경우, 조직 재생용 기재의 사용상황에 적합한 분해패턴을 구하고, 그러한 분해패턴이 수득될 수 있는 폴리로탁산 히드로겔 중의 가교부분의 분자량을 정하면 된다.

(5) 폴리로탁산 히드로겔의 비효소적 가수분해 양상의 해석 - 2

앞서 예시한 CDI-PR (4.2 ×10^-5mol, N-아실카보네이트기 : 10.7mmol) 을 DMSO (5㎖) 에 용해시키고, 이어서 용융시킨 다양한 PEG 비스아민을 첨가하였다. 그의 합성조건을 표 2 에 정리하였다. 반응혼합물의 가스를 빼고, 테프론스페이서에 주입시켜, 35℃ 에서 24 시간 유지하였다. 그 후, 수득된 생성물을 DMSO 로 세척하고, 실온에서 물에 침지시켜, 2 일간에 걸쳐 완전히 수화시켰다. 이로써 폴리로탁산 히드로겔을 수득하였다.

코드^※1	PEG 비스아민분자량	폴리로탁산함유율	PEG/α- CD^※2	함유율(%)
E4/RX47E4/RX35E4/RX29E4/RX26E4/RX21	40004000400040004000	4735292621	0.340.540.710.841.11	77.679.680.981.682.2
E2/RX81E2/RX63E2/RX52E2/RX44E2/RX37	20002000200020002000	8163524437	0.140.350.540.760.94	84.883.985.485.485.9
E0.6/RX85E0.6/RX79E0.6/RX73E0.6/RX67	600600600600	85797367	0.360.530.740.98	60.557.657.860.5
※ 1) 「E」뒤에 이어지는 숫자는 PEG 비스아민의 평균분자량의 1/1000 을 나타낸 것이며, 「RX」뒤에 이어지는 숫자는 폴리로탁산의 함유량 (wt%) 을 나타낸 것이다.※ 2) PEG/α-CD 는 폴리로탁산 히드로겔 중의 PEG 비스아민과 α-CD 의 계산상의 몰비를 나타낸다.

가수분해 양상은 하기와 같이 하여 조사하였다. 즉, 전술한 바와 같이 하여 수득된 폴리로탁산 히드로겔의 팽윤물을 1cm ×1cm 의 슬래브 (두께〈 1mm) 로 자르고, 0.02% 의 아지드화 나트륨을 함유하는 0.1 M 인산 완충액 (pH 7.4) 에이들 슬라브(slab)를 37℃ 에서 침지시키고, 진탕기로 130rpm 으로 진탕하였다. 폴리로탁산 히드로겔의 분해는 남은 폴리로탁산 히드로겔의 중량을 측정함으로써 평가하였다. 실험은 3 회 실시하였다. 실험결과를 도 7 ∼ 도 9 에 그래프로 나타내었다.

도 7 은 PEG 비스아민의 분자량을 일정하게 하여 폴리로탁산의 함유율을 다양하게 변화시킨 폴리로탁산 히드로겔의 분해 양상을 나타내는 그래프로서, (a) ∼ (c) 는 각각의 PEG 비스아민의 분자량이 4000, 2000, 600 이다. 또한, 도 8 은 폴리로탁산 함유율과 완전분해시간의 관계를 나타내는 그래프이다. 도 7 및 도 8 로부터 명백하듯이, 완전분해시간은 PEG 비스아민의 분자량이 동일한 경우, 폴리로탁산의 함유율이 감소함에 따라 길어진다. 즉, 폴리로탁산 히드로겔의 분해속도는 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산의 중량비율이 많을수록 빨라진다.

도 9 는 폴리로탁산 함유율과 함수율의 관계를 나타내는 그래프이다. 도 9 에서 명백하듯이, 폴리로탁산 히드로겔 중의 함수율은 PEG 비스아민의 분자량이 동일한 경우, 폴리로탁산 함유율에 관계없이 대략 일정하다. 이러한 결과는 함수율이 완전분해시간을 변화시키는 요인이 아님을 시사하고 있다.

도 10 은 PEG/α-CD 비와 완전분해시간의 관계를 나타내는 그래프이다. 여기서, PEG/α-CD 비는 폴리로탁산 히드로겔 중의 PEG 비스아민과 α-CD 의 몰비이다. 도 10 에서 명백하듯이, 완전분해시간은 PEG 비스아민의 분자량이 동일한 경우, PEG/α-CD 비가 증가함에 따라 길어진다. 즉, 폴리로탁산 히드로겔의 분해속도는 PEG/α-CD 비가 작을수록 빨라진다. 표 2 에 나타낸 바와 같이,PEG/α-CD 비는 항상 2 이하로 조정하였다. 또한, PEG/α-CD 비가 2 를 초과하면, 폴리로탁산 히드로겔은 생리학적 조건 또는 0.1 M 수산화나트륨 수용액하에서 분해되지 않으므로, 여기서는 PEG/α-CD 비가 2 이하인 것을 채택하였다.

도 11 은 도 4 와 마찬가지로, 횡축을 t/t_∞, 종축을 M_t/M_o로 하였을 때의 분해패턴을 나타내는 그래프이다. 도 11 에서 명백하듯이, 이런 분해패턴은 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산 함유율에 의존하지 않고, PEG 비스아민의 분자량이 같으면 동일한 프로필이 된다. 또한, 폴리로탁산 히드로겔의 분해개시점까지의 타임 랙(time-lag)은 PEG 비스아민의 분자량이 증가함에 따라 길어진다. 이런 결과는 절대적인 분해시간과 관계없이, PEG 비스아민의 분자량이 클수록 더욱 분해개시점까지의 타임 랙(time-lag)이 길고, 분해개시 후에는 조기에 분해되는 패턴이 됨을 나타내고 있다.

(6) 연골세포의 배양

표 1 에 나타낸 폴리로탁산 히드로겔 PRHG-1, PRHG-3 을 오토클래이브에 넣고, 121℃ 에서 20분간 처리하여 멸균시켰다. 멸균 후의 폴리로탁산 히드로겔을 96웰 배양용 플레이트에 넣고, 동결보존해 둔 토끼 연골세포를 1웰당 2 ×10⁵세포/100㎛ 씩 접종하고, 37℃, 5% CO₂인큐베이터 내에서 정치하고, 세포를 각 폴리로탁산 히드로겔에 고정시켰다 (고정시간 2 시간 또는 24 시간).

이와 같이 연골세포를 고정시킨 각 폴리로탁산 히드로겔을 24웰 배양용 플레이트로 옮기고, 10v/v% 소태아 혈청 (FBS) 및 50㎍/㎖ 아스코르빈산을 함유하는 둘베코(Dulbecco) 변법 이글 최소 필수배지 (DMEM) (이하, 단순히 배지라 한다) 를 첨가하고, 7일마다 배지교환하여, 합계 6 주간 배양하였다. 배양 후, 10% 포르말린으로 고정시키고, 알시안 블루 (Alcian Blue) (pH 1.0) 로 염색하고, 탈색, 탈수, 침투시킨 후 봉입하였다. 또한, 알시안 블루 염색은 산성 무코다당 (muco-polysaccharide)의 염색법의 하나로 연골조직 염색법의 일종이다.

고정시간이 2 시간인 경우, 배양개시 후부터 원형세포가 콜로니를 형성하면서 증식을 개시하고, 배양기간과 함께 대형화되었다. 구체적으로는 배양 14 일째, 28 일째, 42 일째에 관찰을 실시하여, 대형화되어 가는 모습을 확인하였다 (도 12 참조). 이들 콜로니는 콜로니의 대형화와 함께 불투명한 기질을 생산하고, 현미경 하에서 탁한 상(像)으로서 관찰되었다. 또한, 4 주간 배양 후에는 세포 콜로니 전체에 매우 강고한 알시안 블루 양성 상이 관찰되었다. 즉, 상기 폴리로탁산 히드로겔을 이용하여 연골세포를 3 차원 형상으로 배양하였을 때, 연골세포는 원래의 형상을 유지하면서 증식하는 동시에 기질 (산성 무코다당류) 도 생산함이 확인되었다. 따라서, 폴리로탁산 히드로겔 (PRHG-1, 3) 을 포함하는 조직 재생용 기재에 연골세포가 3 차원 형상으로 배양된 것을 이식용 재료로서 이용할 수 있다. 또한, 고정시간이 24 시간인 경우에도 대략 동일한 모습이 관찰되었다.

또한, 콜로니의 성장 또는 폴리로탁산 히드로겔의 분해에 수반하여 배양 플레이트 중에 연골세포의 콜로니가 넘쳐 바닥면에 접착되었다. 그 후, 접착된 콜로니로부터, 선유아세포성 형태를 갖는 세포가 생성되었다. 이들은 연골세포의 원형(圓形)의 형태를 유지하고 있지 않고, 알시안 블루 염색도 음성을 나타내었다. 이런 결과는 폴리로탁산 히드로겔 내에서 유지한 연골세포성 콜로니를 취하여 단층배양한 결과, 연골세포성 형질을 잃었기 때문에 탈분화를 일으킨 것으로 추정된다.

본 발명에 의하면, 정형외과, 구강외과, 성형외과 등의 의료분야에 널리 이용 가능한 조직 재생용 기재, 이식용 재료를 제공할 수 있다.

Claims

복수의 고리형 분자를 관통시킨 선형 분자의 양쪽 말단에 가수분해성 결합에 의하여 부피가 큰 치환기를 갖는 생체친화성 기가 도입된 폴리로탁산, 또는 상기 폴리로탁산에 대하여 이웃하는 폴리로탁산 1 분자 중에 포함되는 고리형 분자끼리, 생체친화성 기끼리 또는 고리형 분자와 생체친화성 기를 가교결합으로 가교한 그물코 구조의 폴리로탁산 히드로겔을 포함하는 조직 재생용 기재.
제 1 항에 있어서, 상기 선형 분자가 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜과의 공중합체 또는 폴리메틸비닐에테르이며, 상기 고리형 분자가 α, β또는 γ-시클로덱스트린인 조직 재생용 기재.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 가수분해성 결합이 에스테르 결합인 조직 재생용 기재.
제 3 항에 있어서, 상기 가교결합이 우레탄 결합, 아미드 결합, 카바미드 결합, 에테르 결합, 술피드 결합 또는 시프 염기형 결합인 조직 재생용 기재.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부피가 큰 치환기가 1 이상의 벤젠 고리를 갖는 기 또는 1 이상의 제 3 부틸을 갖는 기인 조직 재생용 기재.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체친화성 기가 아미노산, 올리고펩티드, 올리고당류 또는 당 유도체인 조직 재생용 기재.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선형 분자가 폴리에틸렌글리콜, 상기 고리형 분자가 α-시클로덱스트린, 상기 가수분해성 결합이 에스테르 결합, 상기 부피가 큰 치환기를 갖는 생체친화성 기가 벤질옥시카르보닐-L-페닐알라닌인 조직 재생용 기재.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리로탁산 또는 상기 폴리로탁산 히드로겔이 다공체인 조직 재생용 기재.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리로탁산 히드로겔은 사용상황에 적합한 분해속도가 되도록, 상기 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산의 중량비율이 정해져 있는 것을 특징으로 하는 조직 재생용 기재.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리로탁산 히드로겔은 사용상황에 적합한 분해속도 또는 분해패턴이 되도록 정해진 소정 평균분자량의 가교용 선형 분자를 통하여, 고리형 분자끼리, 생체친화성 기끼리 또는 고리형 분자와 생체친화성 기를 가교결합하여 가교한 것을 특징으로 하는 조직 재생용 기재.
복수의 고리형 분자를 관통시킨 선형 분자의 양쪽 말단에 가수분해성 결합에 의하여 부피가 큰 치환기를 갖는 생체친화성 기가 도입된 폴리로탁산에 대하여, 이웃하는 폴리로탁산 1 분자 중에 포함되는 고리형 분자끼리를 가교용 선형 분자를 통하여 가교결합으로 가교한 그물코 구조의 폴리로탁산 히드로겔을 포함하며, 하기 (a) 의 성질을 갖는 조직 재생용 기재:

(a) 폴리로탁산 히드로겔이 완전히 가수분해되기까지의 시간이 폴리로탁산 히드로겔 중의 함수율에 의존하지 않고, 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산 함유율이 감소함에 따라, 또는 고리형 분자에 대한 가교용 선형 분자의 몰비가 증가함에 따라, 또는 가교용 선형 분자의 평균분자량이 감소함에 따라 길어지는 성질.
복수의 고리형 분자를 관통시킨 선형 분자의 양쪽 말단에 가수분해성 결합에 의하여 부피가 큰 치환기를 갖는 생체친화성 기가 도입된 폴리로탁산에 대하여, 이웃하는 폴리로탁산 1 분자 중에 포함되는 고리형 분자끼리를 가교용 선형 분자를 통하여 가교결합으로 가교한 그물코 구조의 폴리로탁산 히드로겔을 포함하며, 하기 (b) 의 성질을 갖는 조직 재생용 기재:

(b) 폴리로탁산 히드로겔이 완전히 가수분해되기까지의 시간을 t_∞, 폴리로탁산 히드로겔을 침수시킨 후의 경과시간을 t, 초기 수팽윤 상태에서의 폴리로탁산히드로겔 중량을 M_o, 시간 t 에서의 폴리로탁산 히드로겔 중량을 M_t로 하고, 횡축에 t/t_∞, 종축에 M_t/M_o를 취하여 그래프를 그렸을 때의 분해패턴이 폴리로탁산 히드로겔 중의 폴리로탁산 함유율에 의존하지 않고, 가교용 선형 분자의 분자량에 의존하여 정해지는 성질.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서, 고리형 분자가 α-시클로덱스트린, 선형 분자가 폴리에틸렌글리콜, 가수분해성 결합이 에스테르 결합, 가교용 선형 분자가 폴리에틸렌글리콜비스아민이며, 이웃하는 폴리로탁산 1 분자 중에 포함되는 α-시클로덱스트린의 OH 기끼리를 폴리에틸렌글리콜비스아민의 양쪽 말단의 NH₂기로 우레탄 결합에 의하여 가교한 그물코 구조의 폴리로탁산 히드로겔을 포함하는 조직 재생용 기재.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 간엽계 세포, 간세포 또는 신경세포의 배양에 사용되는 조직 재생용 기재.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 조직 재생용 기재에 세포가 배양되어 있거나 또는 혼입되어 있는 것을 특징으로 하는 이식용 재료.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 조직 재생용 기재에 세포를배양하거나 혼입시킴으로써 이식용 재료를 수득하는 것을 특징으로 하는 이식용 재료의 제법.