KR20160110723A - 아스파탐을 이용하여 rgd 펩타이드를 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아스파탐(aspartame)을 첨가하여 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 제조하는 방법, 아스파탐을 포함하는 RGD 펩타이드 제조용 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 아스파탐을 이용하여 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 저비용, 고효율로 합성할 수 있고, 제조된 RGD 펩타이드는 RGD 펩타이드의 세포 부착능 증가 효과를 나타내므로 생물학적 활성을 갖는 RGD 펩타이드를 간단하고 저렴하게 합성하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아스파탐을 이용하여 RGD 펩타이드를 제조하는 방법{Method for preparing of RGD peptide using aspartame}
본 발명은 아스파탐(aspartame)을 첨가하여 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 제조하는 방법, 아스파탐을 포함하는 RGD 펩타이드 제조용 조성물 및 키트에 관한 것이다.
단백질은 자연의 물질로 우리 인체에서 매우 중요한 역할을 한다. 이들은 효소와 같이 특정 반응을 촉진시키기도 하며, 항체와 같이 특정 항원을 인식하여 면역체계를 완성하기도 한다. 이러한 특성은 단백질이 갖는 고유의 정교한 3차원 구조 때문에 가능하지만 경우에 따라서는 단백질 중 특성 아미노산 서열로 이루어진 짧은 펩타이드 서열에 기인하기도 한다. 일례로 파이브로넥틴은 세포 부착에 중요한 역할을 하지만 실제로 이를 유도하는 것은 파이브로넥틴의 아미노산 서열 중 아르기닌-글리신-아스파르트산(Arg-Gly-Asp; RGD)으로 이어지는 모티프를 갖는 “RGD 펩타이드” 서열이며 이는 인테그린과 결합하는 것으로 알려져 있다.
이와 같이 “RGD 펩타이드”는 세포부착에 중요하게 관여하는 아미노산 서열로, 생리활성을 갖지 못하는 재료표면에 부착시키거나, 이를 포함하는 재료 자체를 만들어 조직재생을 위한 물질로 다양하게 사용되고 있다. 유용한 RGD 펩타이드를 활용하기 위하여 펩타이드 합성 방법을 통해 RGD 펩타이드를 생산하는 방법이 이용되고 있다.
그러나 RGD 펩타이드와 같이 합성 펩타이드를 제조하는 방법은 사용되는 아미노산 단량체 각각의 고가여서 5개의 서열(5-mer)을 갖는 펩타이드 10mg을 합성하는데 200,000-300,000의 가격대가 형성되는 등 비용 상의 단점이 크다. 또한 펩타이드 합성 과정 중 액체상 합성을 이용하는 경우, 1개의 아미노산을 펩타이드 서열에 추가하기 위하여 N 말단을 보호하는 Boc(tert-butyoxycarbonyl)기, 측쇄를 보호하는 Z(benzyloxycarbonyl)기를 아미노산에 각각 추가하고 미-반응물과 부산물을 정제(추출, 용매 제거, 재결정)한 후, 산 처리 등을 통해 Boc를 제거하는 등의 과정을 단계별로 거쳐야 하므로 매우 많은 시간과 비용이 소요되는 단점이 있다. 이와 같은 단점을 해결하기 위하여 사용되고 있는 고체상 합성 방법에서는 반응(coupling agent), 세척, 여과 작업을 통해 아미노산을 합성할 수 있도록 하여 1 사이클이 3시간 정도에 달성될 수 있게 개선하였으나, 아미노산 합성 단계가 증가할수록 반응 수율이 떨어지는 단점이 있고, 각 아미노산을 하나 추가하기 위하여 Boc, Z, F-moc(9-fluorenylmethyl carbamate) 등을 사용하는 전처리 과정 및 이를 제거하기 위한 공정을 수행해야하므로 여전히 비용과 시간의 문제점이 지적되었다.
특히, RGD 에 아스파르트산이 추가된 합성 RGD 펩타이드를 제조하는 경우, 두 개의 카르복실기가 존재하는 아스파르트산의 특성상 하나의 카르복실기를 불활성화 시키는 공정이 반드시 필요하므로 과정이 매우 복잡해지고 추가적인 시간 및 비용이 필요한 문제점이 있어, 이와 같은 문제를 해결하기 위한 새로운 제조방법에 대한 필요성이 있다.
아스파탐은 N-L-α-Aspartyl-L-phenylalanine Methyl Ester의 화학명을 갖는 물질로, 고감미 감미료의 하나이다. 체내에서는 일반 단백질처럼 분해, 소화, 흡수될 수 있으며 의약품이나 커피 등의 쓴맛을 줄여주는 효과가 있어 식품, 음료, 제약 분야에서 첨가물로 다양하게 활용되고 있다. 그러나 아직까지 아스파탐을 이용하여 유용한 합성 펩타이드를 제조하는 방법에 대해서는 알려진 바 없다.
본 발명자들은 RGD 펩타이드를 고효율, 저비용으로 합성하기 위한 방법에 대하여 연구하던 중, 아스파탐(aspartame)을 이용하는 경우 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 저비용, 고효율로 합성할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 아스파탐을 첨가하여 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 제조하는 방법, 아스파탐을 포함하는 RGD 펩타이드 제조용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 제공하기 위하여, 본 발명은 아스파탐(aspartame)을 첨가하여, 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 아스파탐을 포함하는 RGD 펩타이드 제조용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 아스파탐을 포함하는 RGD 펩타이드 제조용 키트를 제공한다.
본 발명은 아스파탐을 이용하여 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 저비용, 고효율로 합성할 수 있고, 제조된 RGD 펩타이드는 RGD 펩타이드의 세포 부착능 증가 효과를 나타내므로 생물학적 활성을 갖는 RGD 펩타이드를 간단하고 저렴하게 합성하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 아스파탐을 도입하여 제조된 RGD 펩타이드의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 아스파탐을 도입하여 제조된 RGD 펩타이드인 소듐알지네이트-R-G-아스파탐의 세포 부착능 증진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (RGDF: 소듐알지네이트-R-G-아스파탐, 비-변형: 소듐 알지네이트 단독)(t-test 통계 분석, **p <0.005).
본 발명은 아스파탐(aspartame)을 첨가하여 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 하기 식 1의 RGD 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
[식 1]
Xn-R-G-아스파탐
상기 식 1에서, X는 펩타이드 합성에 사용되는 아미노산 단량체일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나 예컨대 천연 아미노산 단량체 및 변형 아미노산 단량체를 포함할 수 있고, 바람직한 예시로는 20종의 아미노산인 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 시스테인, 프롤린, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라진, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 아미노산일 수 있다.
또한, 상기 n은 아르기닌-글리신(R-G) 모티프의 N 말단에 결합할 수 있는 아미노산 단량체의 개수이며, 펩타이드 합성 방법에 의하여 합성될 수 있는 아미노산 개수를 만족하는 것이라면 0 및 0보다 큰 정수의 범위 내에서 자유롭게 선택될 수 있으나, 바람직하게는 0 내지 50의 정수, 더욱 바람직하게는 0 내지 30의 정수, 더더욱 바람직하게는 0 내지 5의 정수일 수 있다. 상기 n 이 0인 경우 합성되는 RGD 펩타이드는 아르기닌-글리신(R-G) 의 N 말단에 추가적으로 결합된 아미노산 단량체가 없는 것을 말한다. n이 1 이상인 경우, 선택되는 아미노산 단량체 X는 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.
상기 식 1에서 R은 아르기닌, G는 글리신의 아미노산 표기 약어이다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 제조하기 위하여 아스파르트산, 페닐알라닌을 각각 단량체로 추가하여야 하는 단계를 아스파탐 첨가 단계로 단일화 할 수 있으며, 아스파르트산의 카르복실기를 불활성화 시키는 전처리 공정 또한 생략 가능한 장점이 있다. 또한, 아스파르트산 단량체(A1330000, Sigma-aldrich)가 현재 50mg에 250,000원, 페닐알라닌 단량체(P1150000, Sigma-aldrich)가 현재 60mg에 250,000원에 유통되고 있는 것과 비교하여 아스파탐(47135, Sigma-aldrich)은 50mg에 4300원에 유통되므로 상대적으로 매우 저렴한 비용으로 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 제조할 수 있다는 장점이 있어 산업적으로 매우 유용하다.
따라서 본 발명은 아스파탐(aspartame)을 첨가하여 식 1(Xn-R-G-아스파탐)로 표시되는 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 제조하는 방법을 제공하며,
상기 식 1에서, X는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 시스테인, 프롤린, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라진, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 아미노산이고, 상기 n은 0 내지 50의 정수, 상기 R은 아르기닌, 상기 G는 글리신이다.
보다 구체적으로 상기 방법은 1) 기질에 아르기닌을 첨가하여 기질-아르기닌 펩타이드를 제조하는 단계; 2) 상기 제1) 단계의 기질-아르기닌 펩타이드에 글리신을 첨가하여 기질-아르기닌-글리신 펩타이드를 제조하는 단계; 및 3) 상기 제2)단계의 기질-아르기닌-글리신 펩타이드에 아스파탐을 첨가하여 기질-아르기닌-글리신-아스파탐 펩타이드를 제조하는 단계;를 포함하는 RGD 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 3) 단계 이후 기질을 제거하는 단계;를 추가적으로 포함하는 RGD 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 “RGD 펩타이드”는 아르기닌-글리신-아스파르트산(Arg-Gly-Asp; RGD)으로 이어지는 모티프를 포함하는 펩타이드 서열이며 세포부착능을 개선시키는 효과가 있다. 따라서 본 발명에서 사용되는 RGD 펩타이드는 아르기닌, 글리신, 아스파르트산만으로 구성된 펩타이드만을 의미하는 것이 아니라, 아르기닌-글리신-아스파르트산(Arg-Gly-Asp; RGD)으로 이어지는 모티프를 포함하는 펩타이드 서열로, 세포 부착능을 증가시킬 수 있는 펩타이드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 특히 본 발명의 제조방법으로 제조된 RGD 펩타이드는 아르기닌-글리신의 모티프의 글리신 C 말단에 아스파탐이 결합되어 아스파르트산과 페닐알라닌 모티프를 제공하는 것을 특징으로 하며, 아르기닌-글리신 모티프의 아르기닌 N 말단에 추가적인 아미노산 단량체가 결합되어 있을 수 있다.
본 발명의 “RGD 펩타이드를 제조하는 방법”에 있어서 제조란 아미노산 단량체 또는 아미노산 모티프를 제공할 수 있는 물질, 예컨대 아스파탐을 펩타이드 결합을 통해 연결하여 2이상의 아미노산이 연결된 펩타이드를 합성 또는 생산하는 것을 포함한다. 이와 같은 제조방법으로는 당 분야에 공지된 합성 펩타이드 및 고분자/ 펩타이드 합성 방법을 제한없이 이용할 수 있고, 바람직하게는 액체상 기반의 펩타이드 합성법, 고체상 기반의 펩타이드 합성법, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BPC 화합법(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989)등을 이용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 액체상 또는 고체상 기반의 펩타이드 합성법, 더더욱 바람직하게는 고체상 기반의 펩타이드 합성법을 이용할 수 있다.
따라서 본 발명은 고체상 기반의 펩타이드 합성법을 이용하여 수행되는 것인 RGD 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 상기 고체상 기반의 펩타이드 합성법은 아미노산이 부착되는 기질을 이용하는 것이며, 기질은 카르복실기(carboxyl group) 또는 아민기(amine group)를 갖는 것인, RGD 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.
이 때 사용되는 기질은 고체상 기반의 펩타이드 합성법에서 당 분야의 기술자들에게 알려진 고분자와 같은 기질을 제한없이 사용할 수 있으며, 고체상 지지체에 합성 고분자와 같은 기질을 먼저 고정한 후 펩타이드를 합성하거나 펩타이드를 먼저 합성한 후 기질을 결합시키는 방법을 모두 포함할 수 있다. 바람직한 일예로 펩타이드의 C 말단을 먼저 합성하는 경우 고체상 지지체에 기질을 먼저 고정시킨 후 펩타이드의 합성을 진행할 수 있으며, 이 경우 기질은 아민기를 갖고 있는 있는 물질을 사용한다. 반면 펩타이드 합성 후 기질을 결합시키는 경우 카르복실기를 갖는 기질을 사용하며 펩타이드의 N 말단에 기질이 결합될 수 있다. 본 발명에서는 바람직한 일예로 RGD 펩타이드 유도체의 결합을 위하여 카르복실기를 갖는 고분자를 사용하는 방법을 제시한다.
상기 “기질”은 원하는 펩타이드 합성을 위하여 액체상 또는 고체상 기반의 펩타이드 합성을 위하여 이용할 수 있는 당 분야에 공지된 물질을 사용가능하며, 사용가능한 기질은 폴리스티렌(polystyrene), 메리필드(Merrifield) 레진, 왕 레진(Wang resin), 2-CTC(2-Chlorotrityl chloride) 레진, MBHA 레진, RAM 레진, 하이드록시메틸 폴리스티렌-비닐벤젠 코폴리머, 폴리아미드, 페닐아세트아미도, 벤즈하이드릴아민 유도체, 소듐 알지네이트, 폴리(에틸렌-코-아크릴산)(Poly(ethylene-co-acrylic acid)), 키토산, 키토산 유도체, TEMPO-셀룰로오스, 키틴 및 키틴 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있으며, 세포 부착능을 확인하기 위해서 가장 바람직하게 사용될 수 있는 기질로는 예컨대 소듐 알지네이트를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 아스파탐을 포함하는, 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 식 1의 RGD 펩타이드 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명의 아스파탐은 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 제조함에 있어서, 아스파르트산, 페닐알라닌 단량체를 대신할 수 있으므로 아스파르트산, 페닐알라닌을 각각 별개의 단량체로 이용하지 않아도 되고, 아스파르트산의 카르복실기를 불활성화 시킬 필요가 없어 저비용, 고효율로 RGD 펩타이드를 생산할 수 있도록 한다.
상기 RGD 펩타이드 제조용 조성물은 아스파탐 외에도 RGD 펩타이드를 합성하는데 필요한 추가적인 물질, 예컨대 반응 촉진을 위한 촉매, 약학적으로 허용되는 부형제, 담체 등을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 “아스파탐”은 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 RGD 펩타이드에 제공하는 것임을 특징으로 하며, N-L-α-Aspartyl-L-phenylalanine Methyl Ester의 화학명을 갖는 물질을 말한다. 본 발명의 아스파탐은 RGD 펩타이드 합성에 있어서 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 제공할 수 있는 물질이라면 구입 또는 합성된 것을 제한없이 포함할 수 있고 일부 화학적 변형을 한 아스파탐도 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 RGD 펩타이드가 세포부착 증진용인 것을 특징으로 하는 RGD 펩타이드 제조용 조성물을 제공한다.
상기 “세포부착 증진”은 세포의 부착 능력이 RGD 펩타이드의 부재시와 비교하여 증가되는 것을 말하며, 이와 같은 세포부착 증진은 세포 치료에 있어서 원하는 적용 부위에 세포가 생착(engrafting)되어 치료 효과가 개선될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 RGD 펩타이드는 아르기닌-글리신-아스파르트산(R-G-D) 모티프를 포함하고 있으므로, RGD 펩타이드로 형성되는 필름 상에 세포의 부착이 증가되는 등 우수한 세포 부착 증진 효과를 나타낼 수 있다.
또한 본 발명은 아스파탐을 포함하는, 식 1로 표시되는 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드 제조용 키트를 제공한다.
상기 키트는 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 제조하기 위한 목적으로 생산되는 키트이며, RGD 펩타이드 제조 시 아스파탐을 첨가할 수 있도록 구성된 키트를 의미한다.
상기 키트는 복수개의 구획으로 이루어질 수 있으며, 제1구획에는 합성 펩타이드를 제조하는데 필요한 1-ethyl-3- 3-dimethylaminopropyl carbodiimide (EDC), N-Hydroxysuccinimide (NHS) 등이 포함될 수 있고, 제2구획에는 목적하는 펩타이드 합성을 위한 아미노산 단량체, 제3구획에는 아스파탐이 포함될 수 있다. 상기 키트는 편리성 및 휴대성을 높이기 위해 각 단계의 제조에 필요한 용량으로 나누어 한 용기 내에 함유하거나 또는 상이한 여러 개의 소 용기 내에 함유할 수 있다. 따라서 각 용기 내에는 배열 방법에 따라 여러 개의 소용기가 존재할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 사용에 필요한 장비 및 각 구성성분의 사용 방법을 기재한 지시 자료 등을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 제조예 및 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 제조예 및 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 아스파탐을 이용한 RGD 펩타이드의 제조
아스파탐(aspartame, TCI, 45A8F-CM)을 이용하여 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 제조하였다. 본 실시예에 사용된 아스파탐은 하기 화학식 1에 나타내었다.
[화학식 1]
- 아스파탐
Figure pat00001

먼저 상온에서 50ml 탈이온수(초순수)에 소듐 알지네이트(Sodium alignate) 0.5g을 녹여 1%(w/w) 농도가 되도록 하였다. 1M 의 HCl을 이용하여 용액의 pH를 pH 5.5로 조정한 후, 용액을 교반하면서 1-ethyl-3-3-dimethylaminopropyl carbodiimide (EDC)를 소듐 알지네이트에 존재하는 카르복실기(carboxyl group) 몰수의 2배가 되도록 0.775g 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 교반하여 반응시켰다. 교반 후 N-Hydroxysuccinimide (NHS)를 소듐 알지네이트에 존재하는 카르복실기 몰수의 2배인 0.575g 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 추가 교반하였다. 교반이 완료된 용액에 1M의 NaOH를 첨가하여 용액의 pH를 pH6.5로 조절하였다. 이 후 용액에 소듐 알지네이트에 존재하는 카르복실기 몰수의 1.5배가 되도록 0.65g의 아르기닌(arginine, R, Sigma, 16407)을 넣고 6시간 동안 4℃에서 교반하였다. 교반된 용액을 투석막(Spectra/Por® dialysis membrane, 13268)에 넣고 탈이온수를 이용하여 4일 동안 투석하여 잔여물로 존재하는 EDC, NHS, 아르기닌을 제거하였다. 투석이 완료된 용액에 1M의 HCl을 첨가하여 pH 5.5로 조절하였다. 이후 앞서 수행한 EDC 첨가 및 교반, NHS 첨가 및 교반, pH 6.5 조절 단계를 다시 한 번 동일하게 수행하여 혼합 용액을 얻었다. 얻어진 용액에 소듐 알지네이트의 카르복실기 몰수의 1.5배가 되도록 0.28g의 글리신(glycine, G, USB, 16407)을 첨가하고 6시간 동안 4℃에서 교반하였다. 교반된 용액을 투석막에 넣고 탈이온수에서 4일 동안 투석하여 잔여물로 존재하는 EDC, NHS, 글리신을 제거하였으며 투석이 완료되면 1M의 HCl을 첨가하며 pH 5.5로 용액의 pH를 조절하였다. EDC 첨가 및 교반, NHS 첨가 및 교반, pH 6.5 조절 단계를 다시 동일하게 수행하여 혼합 용액을 얻었으며, 여기에 소듐 알지네이트의 카르복실기 몰수의 1.5배가 되도록 1.1g의 아스파탐(aspartame, APM)을 첨가하고 6시간 동안 4℃에서 교반하였다. 얻어진 교반 용액을 투석막에 넣고 탈이온수에서 4일 동안 투석하여 잔여물로 존재하는 EDC, NHS, 아스파탐을 제거하여 아르기닌(R), 글리신(G) 및 아스파탐을 갖는 RGD 펩타이드, 이하 ‘소듐 알지네이트-R-G-아스파탐’을 제조하였다. 제조된 소듐 알지네이트-R-G-아스파탐은 말단에 아스파탐이 부착되어 있으며, 아스파탐은 구조적으로 L-아스파르트산(D)과 L-페닐알라닌(F)을 가지고 있으므로, 아르기닌, 글리신 및 ‘아스파르트산-페닐알라닌(DF)' 모티프를 가지는 RGD 펩타이드(RGDF)이다. 합성된 소듐 알지네이트-R-G-아스파탐의 간략화 구조를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 제조된 RGD 펩타이드는 아스파탐에서 유래된 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는다. 이와 같은 결과에 따라, 아스파르트산의 카르복실 작용기를 불활성화시키는 전처리 과정과 두 번에 걸친 아스파르트산과 페닐알라닌의 도입과정을 생략하고, 아스파탐을 이용하여 '아스파르트산-페닐알라닌' 모티프를 갖는 RGD 펩타이드를 효과적으로 제조할 수 있음을 확인하였다.
상기 수행 공정을 반응식 1에 간략히 나타내었다.
[반응식 1]
1) 소듐 알지네이트 → EDC/NHS 커플링 → 아르기닌 첨가 → 소듐 알지네이트-아르기닌 제조
2) 소듐 알지네이트-아르기닌 → EDC/NHS 커플링 → 글리신 첨가 → 소듐 알지네이트-아르기닌-글리신 제조
3) 소듐 알제네이트-아르기닌-글리신 → EDC/NHS 커플링 → 아스파탐 첨가 → 소듐 알지네이트-아르기닌-글리신-아스파탐(아스파르트산-페닐알라닌 모티프 포함) 제조
상기 반응식에 사용된 성분들의 화학식은 다음과 같다.
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
[화학식 4]
Figure pat00004
[화학식 5]
Figure pat00005

실시예 2. 제조된 RGD 펩타이드의 세포 부착능 확인
RGD 펩타이드는 세포 부착에 관여하는 아미노산 서열로 알려져 있으므로 상기 실시예 1에서 제조된 RGD 펩타이드가 세포 부착능을 나타내는지 여부를 확인하였다. RGD 펩타이드의 세포부착능을 검증하기 위해서는 기질이 필요하므로 세포부착능 검증을 위한 기질로 소듐 알지네이트를 사용하였다. 알지네이트는 알지네이트에서의 세포부착능이 매우 떨어지는 것으로 알려져 있는 물질이다. 실시예 1에서 제조된 소듐 알지네이트-R-G-아스파탐 용액을 1% 순수 소듐 알지네이트와 섞어 40%(v/v) 소듐 알지네이트-R-G-아스파탐 용액을 제조하였다. 제조된 용액을 24-웰 플레이트에 각각 1ml 씩 넣고 상온에서 24시간 동안 건조시켰으며, 형성된 필름에 50mM CaCl2 용액 1ml를 넣고 가교 결합(cross-linking) 시켰다. 필름을 탈이온수와 70%(v/v) 에탄올로 충분히 세척하여 살균하였으며 NIH3t3 마우스 섬유아세포를 2x104cells/well 넣고, 6시간 후에 부착된 세포의 양을 비색분석법(colorimetric method)을 이용하여 측정하였다. 보다 구체적으로 세포 계수 키트-9(cell couniting kit-8, CCK-8)을 이용하였으며, 마이크로플레이트 통해 필름에 부착된 세포의 양에 따라 일어나는 색변화를 450nm에서 흡광도 측정을 통해 확인하였다. 이 때 세포를 위한 배지는 우태아혈청(FBS)이 첨가되지 않은 DMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium)을 사용하였으며, 5% CO2, 37℃ 조건에서 세포를 성장시켰다. 대조군으로는 1%(w/v) 순수 소듐 알지네이트 용액으로 만든 필름을 사용하였으며, 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 순수 소듐 알지네이트로 만들어진 필름을 이용한 대조군은 450nm에서 0.15 정도의 흡광도를 나타내었으나 소듐 알지네이트-R-G-아스파탐으로 제조된 필름을 이용한 실험군에서는 0.2 이상의 흡광도가 나타나 유의성 있는 세포 부착능 증가가 확인되었다. 이와 같은 결과에 따라 아스파탐을 이용하여 ‘아스파르트산-페닐알라닌’ 모티프를 갖도록 제조된 RGD 펩타이드가 세포부착능을 증가시키는 효과가 있어 기존 RGD 펩타이드의 특성을 나타낼 수 있는 대체 물질이 될 수 있음을 확인하였다.

Claims (8)

  1. 아스파탐(aspartame)을 첨가하여, 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 갖는 하기 식 1의 RGD 펩타이드를 제조하는 방법.

    [식 1]
    Xn-R-G-아스파탐

    (식 1에서,
    X는 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 트립토판, 메티오닌, 시스테인, 프롤린, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라진, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 아미노산이고,
    n은 0 내지 50의 정수,
    R은 아르기닌, G는 글리신이다)
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 고체상 기반의 펩타이드 합성법을 이용하여 수행되는 것인, RGD 펩타이드를 제조하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 고체상 기반의 펩타이드 합성법은 아미노산이 부착되는 기질을 이용하며, 기질은 카르복실기(carboxyl group) 또는 아민기(amine group)를 갖는 것인, RGD 펩타이드를 제조하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 기질은 폴리스티렌(polystyrene), 메리필드(Merrifield) 레진, 왕 레진(Wang resin), 2-CTC(2-Chlorotrityl chloride) 레진, MBHA 레진, RAM 레진, 하이드록시메틸 폴리스티렌-비닐벤젠 코폴리머, 폴리아미드, 페닐아세트아미도, 벤즈하이드릴아민 유도체, 소듐 알지네이트, 폴리(에틸렌-코-아크릴산)(Poly(ethylene-co-acrylic acid)), 키토산, 키토산 유도체, TEMPO-셀룰로오스, 키틴 및 키틴 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종인, RGD 펩타이드를 제조하는 방법.
  5. 아스파탐을 포함하는 제1항의 RGD 펩타이드 제조용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 아스파탐은 아스파르트산-페닐알라닌 모티프를 제공하는 것인, RGD 펩타이드 제조용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 RGD 펩타이드는 세포부착 증진용인 것을 특징으로 하는, RGD 펩타이드 제조용 조성물.
  8. 아스파탐을 포함하는 제1항의 RGD 펩타이드 제조용 키트.
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