KR20190003746A - Gdf15 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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주디스 앤 코너
제니퍼 퍼먼
치치 황
마이클 제이. 헌터
시에팬 린-슈미트
세레나 넬슨
샤미나 랭왈라
섀넌 멀리칸
호세 안토니오 차베스
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얀센 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

반감기 연장 단백질, 링커(linker), 및 GDF15 단백질을 함유하는 융합 단백질이 기재된다. 또한, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산, 이의 재조합 세포, 융합 단백질을 포함하는 조성물, 및 대사 질병, 장애 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 융합 단백질의 사용 방법이 기재된다.

Description

GDF15 융합 단백질 및 이의 용도
본 발명은 GDF15 융합 단백질에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 반감기 연장 단백질, 링커(linker) 및 GDF15 단백질을 포함하는 융합 단백질, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 및 발현 벡터, 이의 재조합 세포, 및 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 융합 단백질을 생성하는 방법 및 대사 장애를 치료하기 위해 융합 단백질을 사용하는 방법이 또한 제공된다.
TGFβ 패밀리의 구성원인 GDF15는 25 kDa 동종이량체로서 혈장 중에서 순환되는 분비 단백질이다. GDF15의 혈장 수준은 대부분의 개체에서 150 내지 1150 pg/ml의 범위이다 (문헌[Tsai et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2012, 3: 239-243]). GDF15의 혈장 수준은 손상, 심혈관 질병 및 소정 유형의 암의 상태 하에서 증가된다. 이러한 상향조절은 세포보호 기전인 것으로 여겨진다. GDF15의 높은 혈장 수준은 암에서, 그리고 신부전 및 심부전에서 식욕 부진 및 악액질로 인한 체중 손실과 관련되어 있다. 임상 시험에서, GDF15 수준은 비만 상태의 비당뇨병 대상체에서 인슐린 저항성의 독립적인 예측인자였다 (문헌[Kempf et al., Eur. J. Endo. 2012, 167: 671―678]). 쌍둥이들에서의 연구는 쌍둥이 쌍들 내에서의 GDF15 수준의 차이가 그러한 쌍 내에서의 BMI의 차이와 상관되어 있음을 보여주었는데, 이는 GDF15가 에너지 항상성의 장기 조절인자(long-term regulator)로서의 역할을 함을 시사한다 (문헌[Tsai et al., PLoS One. 2015,10(7):e0133362]).
GDF15는 몇몇 심혈관 및 다른 질병 상태에 대한 바이오마커로서 광범위하게 연구되어 왔지만, 또한 심근 비대 및 허혈성 손상에서의 GDF15의 보호 역할이 기재되어 있다 (문헌[Collinson, Curr. Opin. Cardiol. 2014, 29: 366-371]; 문헌[Kempf et al., Nat. Med. 2011, 17: 581-589]; 문헌[Xu et al., Circ Res. 2006, 98:342-50]). GDF15는 제1형 당뇨병 및 제2형 당뇨병의 마우스 모델에서 신세뇨관 및 신간질성 손상으로부터의 보호에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (문헌[Mazagova et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2013; 305: F1249-F1264]). GDF15는 연령-관련 감각 및 운동 신경 손실에 대해 보호 효과를 갖는 것으로 제안되고, 그것은 말초 신경 손상으로 인한 회복을 개선한다 (문헌[Strelau et al., J. Neurosci. 2009, 29: 13640-13648]; 문헌[Mensching et al., Cell Tissue Res. 2012, 350: 225-238]). 실제로, GDF15 유전자도입 마우스는 그들의 한배 새끼 대조군보다 더 긴 수명을 갖는 것으로 밝혀졌는데, 이는 이 분자가 장기간 생존 인자로서의 역할을 함을 나타낼 수 있다 (문헌[Wang et al., Aging. 2014, 6: 690-700]).
다수의 보고는 GDF15 단백질에 의한 치료 시에 마우스 모델에서의 글루코스 내성 및 인슐린 감수성의 개선을 입증해 왔다. GDF15를 과발현하는 유전자도입 마우스의 2개의 독립적인 개통은 감소된 체중 및 체지방량뿐만 아니라 개선된 글루코스 내성을 갖는다 (문헌[Johnen et al., Nat. Med. 2007, 13:1333-1340]; 문헌[Macia et al., PLoS One. 2012, 7:e34868]; 문헌[Chrysovergis et al., Int. J. Obesity. 2014, 38: 1555-1564]). 전신 에너지 소비 및 산화적 대사의 증가가 GDF15 유전자도입 마우스에서 보고되었다 (문헌[Chrysovergis et al., 2014], 상기 참조). 이들에는, 갈색 지방 조직에서의 발열성(thermogenic) 유전자 발현의 증가 및 백색 지방 조직에서의 지방분해 유전자 발현의 증가가 동반되었다. GDF15 유전자가 결여되어 있는 마우스는 증가된 체중 및 체지방량을 갖는다 (문헌Tsai et al., PLoS One. 2013, 8(2):e55174]). GDF15의 Fc-융합체는, 비만 상태의 사이노몰거스(cynomolgus) 원숭이 모델에서, 6주의 기간에 걸쳐 매주 투여될 때, 체중을 감소시키고 글루코스 내성뿐만 아니라 인슐린 감수성을 개선하는 것으로 밝혀졌다 (국제 특허 출원 공개 WO 2013/113008호).
체중에 미치는 GDF15의 영향은 음식 섭취량의 감소 및 증가된 에너지 소비를 통해 매개되는 것으로 여겨진다. GDF15는 체중-의존적 및 비의존적 기전을 통해 혈당 조절을 개선할 수 있다.
종합하면, 이들 관찰은 GDF15 수준의 증가가 대사 질병에 대한 요법으로서 유익할 수 있음을 시사한다. 대사 질병, 장애, 또는 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있는 GDF15-기반 조성물에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.
본 발명은, 증가된 용해성/안정성을 보여주고 대사 질병, 장애, 또는 질환을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있는 것으로 나타나는 특징을 보이는 GDF15의 융합 단백질을 제공함으로써 이러한 필요성을 만족시킨다. 그러한 특징은, 예를 들어 본 발명의 일 실시 형태에 따른 융합 단백질이 투여된 대상체의 감소된 체중, 증가된 글루코스 내성, 및 개선된 인슐린 감수성을 포함한다.
일 일반적인 태양에서, 본 발명은 융합 단백질에 관한 것으로, 상기 융합 단백질은 (a) 반감기-연장 단백질, (b) 링커, 및 (c) GDF15 단백질을 포함하며, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 (a)-(b)-(c)의 순서대로 배열되어 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, GDF15 단백질은 인간 GDF15 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 특정 실시 형태에서, GDF15 단백질은 성숙 GDF15 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 더 특정한 실시 형태에서, GDF15 단백질은 서열 번호 6-11과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정한 실시 형태에서, GDF15 단백질은 서열 번호 11의 아미노산 서열, 예컨대 서열 번호 6-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 반감기 연장 단백질은 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 이의 기능적 변이체이다. 특정 실시 형태에서, 반감기 연장 단백질은 서열 번호 1과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정한 실시 형태에서, 반감기 연장 단백질은 서열 번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 링커는 가요성 링커이다. 특정 실시 형태에서, 가요성 링커는 서열 (GGGGS)n을 함유하며, 여기서 n은 2 내지 20, 바람직하게는 4 내지 10이다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 융합 단백질의 링커는 구조화된 링커이다. 특정 실시 형태에서, 구조화된 링커는 서열 (AP)n 또는 (EAAAK)n을 함유하며, 여기서 n은 2 내지 20, 바람직하게는 4 내지 10이다.
본 발명의 실시 형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 5, 25-30, 36-37, 40, 48, 55-60 또는 64-75와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 실시 형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 5, 25-30, 40, 55-60, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 더 특정한 실시 형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 얻는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 융합 단백질이 생성되는 조건 하에서 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 (2) 숙주 세포에 의해 생성된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 대사 질병, 장애 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량을 대사 질병, 장애 또는 질환의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 대상체에게 피하 또는 정맥내 투여된다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, 제2형 당뇨병, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신경병증, 심근 허혈성 손상, 울혈성 심부전, 또는 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 대사 장애를 치료하는 방법은 서열 번호 5, 25-30, 40, 55-60, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 방법은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 태양, 특징 및 이점은 본 발명 및 그의 바람직한 실시 형태의 상세한 설명을 포함한 하기의 개시내용 및 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
전술한 요약뿐만 아니라 하기의 실시 형태의 상세한 설명도 첨부 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타낸 정확한 실시 형태로 제한되지 않음이 이해되어야 한다.
도면에서:
도 1a 및 도 1b는 GDF15의 결정 구조를 나타내는데, 여기서는 제1 및 제2 시스테인 잔기 (C1-C2)의 이황화물 쌍형성이 단백질의 N 말단에서 루프를 형성하고 있다.
도 2는 C57BL/6 마우스에서의 먹이 섭취량에 대한 본 발명의 실시 형태에 따른 융합 단백질, 예를 들어 융합 단백질 FP1 (서열 번호 60) 및 6xHis-FP1 (서열 번호 26, 6xHis 태그가 N-말단에 부착됨)의 피하 투여의 효과를 나타내는데, 투여 후 24시간째의 누적 먹이 섭취량이 도시되어 있다. 막대 내에 표시된 값은 비히클(PBS)군 대비 % 감소 ± SEM이며; 모든 그룹에 대해 동물수 N=8/그룹이며, 예외적으로 FP1 16 nmol/㎏ 그룹에서는 N=9이다. *- p<0.05, vs. 비히클; p 값은 일원 ANOVA 및 터키(Tukey) 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 3은 스프라그-돌리 래트(Sprague-Dawley rat)에서의 먹이 섭취량에 대한 FP1 및 6xHis-FP1 (서열 번호 26, 6xHis 태그가 N-말단에 부착됨)의 피하 투여의 효과를 나타내는데, 투여 후 48시간째의 누적 먹이 섭취량이 도시되어 있다. 막대 내에 표시된 값은 비히클(PBS)군 대비 % 감소 ± SEM이며; 동물수 N=8/그룹이다. *- p<0.05, vs. 비히클; p 값은 일원 ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 4는 FP1에 의한 처리 동안의 식이 유도 비만 (DIO) 마우스의 체중 변화를 나타낸다. 화살표는 초기 투여 (일수 0) 후 피하 투여의 시간 (일)을 나타내며; 동물수 N=8/그룹이다. *- p<0.05, FP1 1 nmol/㎏ 그룹 vs. 비히클; #- p<0.05, FP1 10 nmol/㎏ 그룹 vs. 비히클; p 값은 이원 RM ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 5a 및 도 5b는 FP1을 매 3일마다 (q3d) 투여한지 14일 후의 경구 글루코스 내성 시험 (OGTT) 동안의 DIO 마우스에서의 혈당 수준을 나타내는데, 혈당 수준은 곡선 아래 면적으로 표현되어 있다. 동물수 N=8/그룹. *- p<0.05, FP1 1 nmol/㎏ 그룹 vs. 비히클; p 값은 일원 ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 6은 FP1에 의한 처리 동안의 DIO 마우스에서의 식후 혈당 수준을 나타낸다. 동물수 N=8/그룹. *- p<0.05, vs. 비히클; p 값은 이원 RM ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 7은 FP1의 14일 처리 후의 DIO 마우스에서의 인슐린 저항성의 4시간 공복 항상성 모델 평가 (HOMA-IR)를 나타낸다. 동물수 N=8/그룹. *- p<0.05, vs. 비히클; p 값은 일원 ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 8은 FP1으로 매 3일마다 (q3d) 처리하는 동안의 ob/ob 마우스에서의 체중 변화를 나타낸다. 화살표는 초기 투여 (일수 0) 후 피하 투여의 시간 (일)을 나타내며; 동물수 N=9/그룹이다. *- p<0.05, FP1 10 nmol/㎏ 그룹 vs. 비히클; #- p<0.05, FP1 1 nmol/㎏ 그룹 vs. 비히클; p 값은 이원 RM ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 9는 FP1에 의한 처리 동안의 ob/ob 마우스에서의 혈당 수준을 나타낸다. 화살표는 초기 투여 (일수 0) 후 피하 투여의 시간 (일)을 나타내며; 동물수 N=9/그룹이다. *- p<0.05, FP1 10 nmol/㎏ 그룹 vs. 비히클; #- p<0.05, FP1 1 nmol/㎏ 그룹 vs. 비히클; p 값은 이원 RM ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 10은 C57BI/6 마우스에서의 2 mg/㎏ 정맥내 (IV) 및 피하 (SC) 투여 후의 FP1의 혈청 약물 농도-시간 프로파일의 평균 (± 표준 편차, SD)을 나타낸다.
도 11은 스프라그-돌리 래트에서의 2 mg/㎏ IV 및 SC 투여 후의 FP1의 혈청 약물 농도-시간 프로파일의 평균 (± SD)을 나타낸다.
도 12는 면역검정에 의해 결정된 바와 같은, 사이노몰거스 원숭이에서의 1 mg/㎏ IV 및 SC 투여 후의 FP1의 혈청 약물 농도-시간 프로파일의 평균 (± SD)을 나타낸다.
도 13은 면역친화성 (IA) 포획-LCMS 분석에 의해 결정된 바와 같은, 사이노몰거스 원숭이에서의 단회 IV 투여 후의 시간 경과에 따른 온전한 이량체로서의 FP1의 혈청 농도 (ng/mL)를 나타낸다.
도 14는 면역친화성 포획-LCMS 분석에 의해 결정된 바와 같은, 사이노몰거스 원숭이에서의 단회 SC 투여 후의 시간 경과에 따른 온전한 이량체로서의 FP1의 혈청 농도 (ng/mL)를 나타낸다.
도 15는 면역검정에 의해 결정된 바와 같은, 2명의 인간 대상체 (Sub)로부터 획득된 혈장 중에서의 0, 4, 24, 및 48시간의 생체외(ex vivo) 인큐베이션 후의, 출발 농도의 %로 나타낸 FP1의 농도를 나타낸다.
도 16은 온전한 질량 면역친화성 포획-LCMS 분석에 의해 결정된 바와 같은, 2명의 인간 대상체 (Sub)로부터 획득된 혈장 중에서의 0, 4, 24, 및 48시간의 생체외 인큐베이션 후의 온전한 이량체로서의, 시간 0의 %로 나타낸 FP1의 평균 농도를 나타낸다.
도 17은 GDF15의 다양한 N-말단 결실 변이체의 투여 전과 후의 마른 C57BL6N 수컷 마우스에서의 단시간의 먹이 섭취량을 나타낸다. (서열 번호 92, 111, 및 112는 야생형 융합체와 대비하여 결실이 없다 (서열 번호 26, 6xHis 태그가 N-말단에 부착됨)). 동물수 N=8/그룹; *- p<0.05, vs. 비히클; p 값은 이원 RM ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 18은 C57BL/6 마우스에서의 먹이 섭취량에 대한 FP2의 단회 용량의 효과를 나타내며; 구체적으로는, 투여 후 24시간째의 누적 먹이 섭취량이 나타나 있다. 막대 내에 표시된 값은 PBS 군 대비 % 감소 (평균 ± SEM)이며; 모든 그룹에 대해 동물수 N=8/그룹이며, 예외적으로 6xHis-FP1에서는 N=6이다. **- p<0.01, ***- p<0.001, ****- p<0.0001; p 값은 이원 ANOVA 및 던넷(Dunnett) 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 19는 FP2의 단회 용량의 투여 후 24시간째에 스프라그-돌리 래트에서 측정된 누적 먹이 섭취량을 나타낸다. 막대 내에 표시된 값은 PBS 군 대비 % 감소 (평균 ± SEM)이며; 동물수 N=8/그룹이다. **- p<0.01; p 값은 이원 ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하여 계산하였다.
도 20은 DIO 마우스에서의 FP2 q3d에 의한 처리 동안의 % 체중 변화를 나타낸다. 화살표는 FP2의 피하 주사의 시간을 나타내며; 동물수 N=6/그룹이며; *- p,0.05, vs. 비히클, 이원 ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용한다.
도 21a 및 도 21b는 DIO 마우스에서의 FP2의 14일의 q3d 투여 후의 OGTT 시험 동안의 혈당 농도 수준에 대한 곡선 아래 면적 (AUC)을 나타낸다. *- p<0.05, 일원 ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하고, 동물수 n=8/그룹을 사용한다.
도 22a는 DIO 마우스에서의 FP2의 8일의 q3d 투여 후의 OGTT 동안의 혈장 인슐린 수준을 나타낸다. *- p<0.05, 비히클 vs. FP2 (0.3 nmol/㎏); FP2 (10 nmol/㎏); 및 로시글리타존. #- p<0.05, vs. 로시글리타존 (10 mg/㎏), 이원 RM ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용한다.
도 22b는 DIO 마우스에서의 FP2의 8일의 q3d 투여 후의 OGTT 동안의 혈장 인슐린 수준에 대한 AUC를 나타낸다. *- p<0.05, vs. 비히클; #- p<0.05, vs. 로시글리타존.
도 23은 DIO 마우스에서의 FP2의 8일의 q3d 투여 후의 식후 혈당 수준을 나타낸다. *- p<0.05, vs. 비히클, 이원 RM ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하고, 동물수 n=8/그룹이다.
도 24는 DIO 마우스에서 FP2 q3d로 14일 처리한 후, 일수 14에서 5시간 절식한 후의 공복 HOMA-IR을 나타낸다. *- p<0.05, vs. 비히클, 일원 ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하고, 동물수 n=8/그룹이다.
도 25는 C57Bl/6 마우스에서의 2 mg/㎏ 정맥내 (IV) 및 2 mg/㎏ 피하 (SC) 투여 후의 FP2의 혈청 농도를 나타낸다. 값은 평균 ± SD (시점당 샘플수 n=5)를 나타낸다.
도 26은 스프라그 돌리 래트에서의 2 mg/㎏ 정맥내 (IV) 및 2 mg/㎏ 피하 (SC) 투여 후의 FP2의 혈청 농도를 나타낸다. 시점당 샘플수 N=5.
도 27은 면역검정에 의해 분석된 사이노몰거스 원숭이에서의 FP2의 혈장 농도를 나타낸다. 값은 n=3의 평균 ± SD를 나타내며, 예외적으로 일수 22 (528 hr)에서의 IV의 경우 n=2이다. IV ― 정맥내, SC ― 피하.
도 28은 LCMS에 의해 분석된 사이노몰거스 원숭이에서의 온전한 이량체로서의 FP2의 혈장 농도를 나타낸다. 값은 n=3의 평균 ± SD를 나타내며, 예외적으로 168시간에서의 피하 (SC)의 경우 n=2, 120시간 및 432시간에서의 SC의 경우 n=1, 그리고 168시간 및 432시간에서의 IV ― 정맥내의 경우 n=1이다.
도 29는 면역검정에 의해 측정된 인간 혈장 중에서의 48시간에 걸친 FP2의 생체외 안전성 (정규화된 % 회수율)을 나타낸다.
도 30은 온전한 LC/MS에 의해 측정된 인간 혈장 중에서의 48시간에 걸친 FP2의 생체외 안전성 (정규화된 % 회수율)을 나타낸다.
도 31은 재조합 인간 GFRAL 수용체를 발현하는 SK-N-AS 세포에서 pAKT 검정을 사용하여 FP2 및 HSA-GDF15:GDF15 이종이량체에 대한 농도 반응 곡선을 나타낸다 (N=3).
도 32는 사이노몰거스 원숭이에서의 FP1의 단회 투여의 전과 후의 일일 먹이 섭취량 (g)을 나타낸다. *- p<0.05, 10 mg/㎏의 FP1 vs. 비히클.
도 33은 사이노몰거스 원숭이에서의 FP1의 단회 투여의 전과 후의 % 체중 변화를 나타낸다. *- p<0.05, 10 mg/㎏의 FP1 vs. 비히클; #- p<0.05, 3 mg/㎏ vs. 비히클, 이원 RM ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하고, 동물수 n=8/그룹이다.
도 34는 사이노몰거스 원숭이에서의 FP2의 단회 투여의 전과 후의 일일 먹이 섭취량 (g)을 나타낸다. *- p<0.05, vs. 비히클, 이원 RM ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하고, 동물수 n=8/그룹이다.
도 35는 사이노몰거스 원숭이에서의 FP2의 단회 투여의 전과 후의 % 체중 변화를 나타낸다. *- p<0.05, 10 nmol/㎏의 FP2 vs. 비히클, #- p<0.05, 3 nmol/㎏의 FP2 vs. 비히클, &- p<0.05, 1 nmol/㎏의 FP2 vs. 비히클, 이원 RM ANOVA 및 터키 다중 비교 검정을 사용하고, 동물수 n=8/그룹이다.
다양한 간행물, 논문 및 특허가 본 명세서의 배경기술에 그리고 전체에 걸쳐 인용되거나 기재되어 있으며; 이들 참고문헌 각각은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 재료, 디바이스, 물품 등에 대한 논의는 본 발명에 대한 상황을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러한 논의는 이들 대상 중 임의의 것 또는 모든 것이 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대하여 종래 기술을 형성하는 것을 인정하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 그렇지 않으면, 본 명세서에 사용되는 소정의 용어는 본 명세서에 제시된 바와 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 모든 특허, 공개된 특허 출원 및 간행물은 마치 본 명세서에 완전히 기재되어 있는 것처럼 참고로 포함된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 (부정 관사 및 정관사)는, 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면, 복수의 지시 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다.
본 발명은 융합 단백질에 관한 것으로, 상기 융합 단백질은 (a) 반감기-연장 단백질, (b) 링커, 및 (c) GDF15 단백질을 포함하며, 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 (a)-(b)-(c)의 순서대로 배열되어 있다.
반감기-연장 단백질, 링커, 및 GDF15 단백질을 포함하는, 본 발명의 일 실시 형태에 따른 융합 단백질은 GDF15 단백질의 증가된 반감기를 가져오고, 본 발명의 융합 단백질은 대사 질병, 장애 또는 질환을 치료 및 예방하기 위한 치료제로서의 그들의 적합성을 입증하는 대사 효과를 나타낸다는 것을 알아내었다. 그러한 효과는 융합 단백질이 투여된 동물의 체중의 감소, 글루코스 내성의 증가, 및 인슐린 감수성의 개선을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "융합 단백질"은 2개 이상의 부분이 함께 공유 결합된 단백질을 지칭하며, 이들 부분 각각은 상이한 단백질로부터 유래된다.
본 발명의 실시 형태에 따른 융합 단백질은 임의의 GDF15 단백질을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "GDF15 단백질"은 천연-발생 야생형 성장 분화 인자 15 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 지칭한다. GDF15 단백질은 임의의 포유동물, 예컨대 인간 또는 다른 적합한 포유동물, 예컨대 마우스, 토끼, 래트, 돼지, 개, 또는 영장류로부터의 것일 수 있다. 특정 실시 형태에서, GDF15 단백질은 인간 GDF15 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다. 바람직한 실시 형태에서, GDF15 단백질은 성숙 GDF15 단백질 또는 이의 기능적 변이체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "성숙 GDF15 단백질"은 RXXR 푸린-유사 절단 부위에서의 세포내 절단 후에 전장(full-length) 단백질로부터 방출되는 GDF15의 프리-프로-단백질(pre-pro-protein)의 일부분을 지칭한다. 성숙 GDF15 단백질은 이황화물 결합에 의해 연결된 동종이량체로서 분비된다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 성숙 GDF15 단백질, 약칭 GDF15(197-308) (서열 번호 6)는 전장 인간 GDF15 단백질의 아미노산 197-308을 함유한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기능적 변이체"는 모 단백질과 실질적이거나 유의한 서열 동일성을 갖는 모 단백질의 변이체를 지칭하며, 모 단백질의 생물학적 활성들 중 적어도 하나를 보유한다. 모 단백질의 기능적 변이체는 본 발명을 고려하여 당업계에 알려진 수단에 의해 제조될 수 있다. 기능적 변이체는 모 단백질의 아미노산 서열에 대한 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 변형은, 예를 들어 폴리펩티드의 열적 안정성을 개선하고, 기질 특이성을 변경시키고, pH 최적 조건을 변화시키는 등에 의해, 폴리펩티드의 물리화학적 특성을 변화시킬 수 있다. 변형은 또한, 그것이 모 단백질의 모든 생물학적 활성을 파괴 또는 소실시키지는 않는 한, 모 단백질의 생물학적 활성을 변경시킬 수 있다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, 모 단백질의 기능적 변이체는 모 단백질의 생물학적 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는 모 단백질에 대한 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 보존적 치환은 염기성 아미노산 (아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산 (글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산 (류신, 아이소류신 및 발린), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산 (글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 군 내에서의 아미노산 치환을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 비표준 또는 비천연 아미노산 (예컨대, 4-하이드록시프롤린, 6-N-메틸 라이신, 2-아미노아이소부티르산, 아이소발린, 및 알파-메틸 세린)이 또한 모 단백질 내의 표준 아미노산 잔기를 치환하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에 따르면, 모 단백질의 기능적 변이체는 모 단백질에 대한 하나 이상의 아미노산의 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 예를 들어, 성숙 GDF15 단백질의 기능적 변이체는 성숙 GDF15 단백질에 대한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 이상의 아미노산의 결실 및/또는 삽입, 바람직하게는 성숙 GDF15 단백질의 N-말단에서의 1 내지 30개의 아미노산의 결실을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 형태에 따르면, 모 단백질의 기능적 변이체는 모 단백질에 대한 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환, 및 결실 및/또는 삽입, 바람직하게는 아미노산의 작은 결실 및/또는 삽입을 포함한다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, 본 발명의 융합 단백질은 성숙 GDF15, 예컨대 GDF15(197-308) (서열 번호 6)의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열; 또는 N-말단에서 절단된(truncated) 성숙 GDF15, 예컨대 GDF15(200-308) (서열 번호 7), GDF15(201-308) (서열 번호 8), GDF15(202-308) (서열 번호 9), GDF15(203-308) (서열 번호 10), 또는 GDF15(211-308) (서열 번호 11)의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 GDF15 단백질을 포함한다. GDF15 단백질은, 그것이 GDF15 단백질의 생물학적 활성들, 예컨대 음식 섭취량, 혈당 수준, 인슐린 저항성, 및 체중 등에 대한 그의 효과들 중 적어도 하나를 유지하는 한, 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10 또는 11에 대한 치환, 삽입 및 결실 중 적어도 하나를 가질 수 있다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하지만 이로 한정되지 않는, 서열 번호 11의 아미노산 서열을 갖는 GDF15 단백질을 포함한다.
임의의 적합한 반감기 연장 단백질이 본 발명의 실시 형태에 따른 융합 단백질에 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "반감기 연장 단백질"은 융합된 단백질의 반감기를 연장시키는 것으로 알려진 임의의 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 그러한 반감기 연장 단백질의 예에는 인간 혈청 알부민 (HSA), 면역글로불린 (Ig)의 불변 단편 도메인 (Fc), 또는 트랜스페린 (Tf)이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 본 발명의 실시 형태에서, 반감기 연장 단백질은 HSA 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 본 발명의 특정 실시 형태에서, 반감기 연장 단백질은 서열 번호 1과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 반감기 연장 단백질은 HSA의 위치 34에서의 시스테인 잔기가 세린 또는 알라닌으로 대체된 HSA 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열 번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 반감기 연장 단백질을 포함한다.
임의의 적합한 링커가 본 발명의 실시 형태에 따른 융합 단백질에 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "링커"는 펩티드 링커를 포함하는 연결 모이어티(linking moiety)를 지칭한다. 바람직하게는, 링커는 올바른 접힘의 확보를 도우며, 입체 장애를 최소화하며, 융합 단백질 내의 각각의 기능적 성분의 구조를 유의하게 방해하지 않는다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 2 내지 120개의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 펩티드 링커는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 또는 120개의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 실시 형태에서, 링커는 융합 단백질 성분들의 가요성을 증가시킨다. 본 발명의 특정 실시 형태에서, 링커는 GS-(GGGGS)n 또는 AS-(GGGGS)n-GT를 포함하지만 이로 한정되지 않는, 서열 (GGGGS)n을 포함하는 가요성 링커일 수 있으며, 여기서 n은 2 내지 20, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 링커는 구조화된다. 본 발명의 특정 실시 형태에서, 링커는 AS-(AP)n-GT 또는 AS-(EAAAK)n-GT를 포함하지만 이로 한정되지 않는, 서열 (AP)n 또는 (EAAAK)n을 포함하는 구조화된 링커일 수 있으며, 여기서 n은 2 내지 20, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15이다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 링커는 서열 (GGGGA)n, (PGGGS)n, (AGGGS)n 또는 GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS를 포함하며, 여기서 n은 2 내지 20이다.
본 발명의 실시 형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 5, 25-30, 36-37, 40, 48, 55-56, 59-60 또는 64-75와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 특정 실시 형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 5, 25-30, 36-37, 40, 48, 55-56, 59-60 및 64-75로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 더 특정한 실시 형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 5, 25-30, 40, 55-56, 55-56, 59-60, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 추가의 더 특정한 실시 형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 92, 서열 번호 60 또는 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함한다. 융합 단백질은 또한 단백질의 아미노- 또는 카르복실-말단에 작은 연장부(들), 예컨대 정제를 촉진시키는 태그, 예컨대 폴리-히스티딘 태그, 항원 에피토프 또는 결합 도메인을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 융합 단백질은 음식 섭취량, 경구 글루코스 내성 시험, 혈당 수준의 측정, 인슐린 저항성 분석, 체중 변화, 약동학적 분석, 독성동태학적(toxicokinetic) 분석, 전장 융합 단백질의 수준 및 안정성의 면역검정 및 질량 스펙트럼 분석, 및 인간 혈장 생체외 안정성 분석에 대한 효과를 포함하지만 이로 한정되지 않는 GDF15 생물학적 활성에 대해 특성화 또는 평가될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 실시 형태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 5, 25-30, 36-37, 40, 48, 55-56, 59-60 또는 64-75와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시 형태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 5, 25-31, 36-37, 40, 48, 55-56, 59-60 및 64-75로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 더 특정한 실시 형태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 5, 25-30, 40, 55-56, 59-60, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 추가의 더 특정한 실시 형태에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 76-91의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시 형태에 따르면, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 발현 벡터 내에 존재할 수 있다. 발현 벡터는 재조합 단백질 발현을 위한 벡터 및 대상체의 조직 내에서의 발현을 위하여 대상체 내로의 핵산의 전달을 위한 벡터, 예컨대 바이러스 벡터를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 바이러스 벡터의 예에는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련성 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 벡터는 또한 비-바이러스 벡터일 수 있다. 비-바이러스 벡터의 예에는 플라스미드, 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파지 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 벡터는 발현 벡터의 통상적인 기능을 확립하기 위한 임의의 요소, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 요소, 종결자, 인핸서, 선택 마커, 또는 복제 기점을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에 따르면, 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자는 본 발명을 고려하여 당업계에 알려진 방법을 사용하여 원하는 숙주 세포, 예컨대 인간 배아 신장 (HEK) 또는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포로부터의 개선된 재조합 발현을 위하여 최적화된 코돈일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 재조합 단백질 발현을 위한 숙주 세포 및 대상체의 조직 내에서의 발현을 위하여 대상체 내로의 핵산의 전달을 위한 숙주 세포를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 숙주 세포의 예에는 HEK 또는 CHO 세포가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 얻는 방법에 관한 것이다. 일반적인 태양에서, 상기 방법은 (1) 융합 단백질이 생성되는 조건 하에서 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 (2) 숙주 세포에 의해 생성된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 융합 단백질은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 추가로 정제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 융합 단백질은 숙주 세포 내에서 발현되고, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 한외여과, 및 투석을 포함하지만 이로 한정되지 않는 하나 이상의 표준 정제 기법들의 조합을 사용하여 그로부터 정제된다. 바람직하게는, 융합 단백질은 어떠한 프로테아제도 존재하지 않도록 정제된다.
본 발명은 또한 본 발명의 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 본 발명의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 조성물은 융합 단백질의 발현을 위한 세포 내로의 핵산 분자의 도입을 위한 전달 비히클을 포함할 수 있다. 핵산 전달 비히클의 예에는 리포좀, 생체적합성 중합체 - 천연 중합체 및 합성 중합체를 포함함 -, 지질단백질, 폴리펩티드, 다당류, 지질다당류, 인공 바이러스 외피, 금속 입자, 및 세균, 바이러스, 예컨대 배큘로바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, 진균 벡터, 및 다양한 진핵생물 숙주에서의 발현에 대해 기재된 당업계에 전형적으로 사용되는 다른 재조합 비히클이 포함된다.
약제학적으로 허용되는 담체는 약제학적으로 허용되는 부형제, 완충제, 안정제 또는 당업자에게 알려진 다른 물질 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예에는 물, 식염수, 완충제, 등장화제, 예컨대 당, 폴리알코올, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 방부제뿐만 아니라 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 그러한 물질은 비독성이어야 하며, 사용되는 투여량 및 농도에서 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로, 예를 들어 근육내, 피하, 경구, 정맥내, 피부, 점막내 (예를 들어, 장), 비강내 또는 복막내 경로에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성유를 포함한다. 생리학적 식염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 또한 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 조성물은 동결건조된 형태로 또는 용액 상태로 저장될 수 있으며, 일반적으로는, 멸균 접근 포트(sterile access port)를 갖는 용기, 예컨대 피하주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내로 넣어진다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가의 성분, 예컨대 다른 활성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 키트는, 본 발명의 건조된 융합 단백질을 갖는 제1 용기와 대상체에게 투여하기 전에 건조된 융합 단백질과 혼합되는 수용액을 갖는 제2 용기를 포함하거나, 또는 본 발명의 액체 약제학적 조성물이 담긴 단일 용기를 포함할 수 있다. 키트는 본 발명의 약제학적 조성물의 단회-용량 투여 단위 또는 다회 용량 투여 단위를 포함할 수 있다. 키트는 또한 하나 이상의 사전충전된 주사기 (예를 들어, 액체 주사기 및 리오시린지(lyosyringe)를 포함할 수 있다. 키트는 또한 이의 사용에 대한 사용설명서를 포함할 수 있다. 사용설명서는 키트 내에 제공되는 물질들의 용도 및 성질을 설명할 수 있으며, 치료되는 정확한 대사 장애에 맞추어질 수 있다.
본 발명은 또한 대사 질병, 장애 또는 질환, 예컨대 제2형 당뇨병, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신경병증, 심근 허혈성 손상, 울혈성 심부전, 또는 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방하기 위한 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 실시 형태에 따르면, 대사 질병, 장애 또는 질환을 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 대사 질병, 장애 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법은 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 약제학적 조성물이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있으며, 이에는 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물이 포함된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체"는 본 발명의 일 실시 형태에 따른 방법에 의해 치료될 것이거나 치료된 적이 있는 임의의 동물, 특히 포유동물, 가장 특히는 인간을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포유동물"은 임의의 포유동물을 포함한다. 포유동물의 예에는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그, 비인간 영장류 (NHP), 예컨대 원숭이 또는 유인원, 인간 등, 더 특히는 인간이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
"대사 질병, 장애 또는 질환"은 비정상 대사와 관련된 임의의 장애를 지칭한다. 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 대사 질병, 장애 또는 질환의 예에는 제2형 당뇨병, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신경병증, 심근 허혈성 손상, 울혈성 심부전, 또는 류마티스성 관절염이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 대상체에서 원하는 치료적 또는 임상적 결과를 달성하기 위하여 대상체에게 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 일 실시 형태에서, 용어 "치료하다", "치료하는", 및 "치료"는 대사 장애, 예컨대 제2형 당뇨병, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신경병증, 심근 허혈성 손상, 울혈성 심부전, 또는 류마티스성 관절염의 진행 또는 발생을 감소, 경감 또는 감속시키기 위하여 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 지칭한다.
용어 "치료적 유효량"은 원하는 생물학적 또는 임상적 효과를 유도하는 데 필요한 치료적으로 활성인 화합물의 양을 의미한다. 본 발명의 실시 형태에 따르면, "치료적 유효량"은 임상적 결과를 포함한 유익한 또는 원하는 결과를 달성하기에 충분한 양이다. 치료적 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 질병 상태의 관점에서, 유효량은 질병을 개선, 안정화, 또는 그의 발생을 지연시키기에 충분한 양이다. 본 발명의 구체적인 실시 형태에 따르면, 치료적 유효량은 대사 질병, 장애 또는 질환, 예컨대 제2형 당뇨병, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신경병증, 심근 허혈성 손상, 울혈성 심부전, 또는 류마티스성 관절염을 치료 또는 예방하는 데 필요한 융합 단백질의 양이다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명을 고려하여 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해, 예컨대 근육내, 피하, 경구, 정맥내, 피부, 점막내 (예를 들어, 장), 비강내 또는 복막내 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 주사 또는 피하 주사에 의해 대상체에게 투여된다.
본 발명의 일 실시 형태에 따른 대상체에 대한 약제학적 조성물의 투여량, 투여 빈도, 및 투여 지속시간과 같은 파라미터는 어떠한 특정 방식으로도 제한되지 않는다. 그러한 파라미터의 최적의 값은 치료하고자 하는 대상체, 치료하고자 하는 특정 대사 질병, 질병의 중증도, 투여 경로 등과 같은 다양한 인자에 좌우될 수 있으며, 당업자는 원하는 치료적 또는 임상적 결과를 달성하기 위하여 그러한 파라미터에 대한 최적의 값을 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 일일 1회, 또는 일일 1회 초과, 예컨대 2회, 3회, 4회 등으로 투여될 수 있다. 전형적인 투여량은 상기에 언급된 것들과 같은 인자에 따라 약 0.1 ㎍/㎏ 내지 최대 약 100 mg/㎏ 또는 그 이상의 융합 단백질의 범위일 수 있다.
실시 형태
실시 형태 1은 융합 단백질로서, (a) 반감기 연장 단백질, (b) 링커, 및 (c) GDF15 단백질을 포함하며; 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 (a)-(b)-(c)의 순서대로 배열되는, 융합 단백질이다.
실시 형태 2는, 실시 형태 1에 있어서, GDF15 단백질은 성숙 GDF15 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 융합 단백질이다.
실시 형태 3은, 실시 형태 1에 있어서, GDF15 단백질은 서열 번호 6-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질이다.
실시 형태 4는, 실시 형태 1에 있어서, GDF15 단백질은 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질이다.
실시 형태 5는, 실시 형태 4에 있어서, GDF15 단백질은 서열 번호 6-11로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질이다.
실시 형태 6은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 5 중 어느 하나에 있어서, 반감기 연장 단백질은 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 융합 단백질이다.
실시 형태 7은, 실시 형태 6에 있어서, 반감기 연장 단백질은 서열 번호 1과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질이다.
실시 형태 8은, 실시 형태 7에 있어서, 반감기 연장 단백질은 서열 번호 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질이다.
실시 형태 9는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 8 중 어느 하나에 있어서, 링커는 가요성 링커인, 융합 단백질이다.
실시 형태 10은, 실시 형태 9에 있어서, 링커는 서열 (GGGGS)n (여기서, n은 2 내지 20임), 예컨대 GS-(GGGGS)x8 또는 AS-(GGGGS)x8-GT를 포함하는, 융합 단백질이다.
실시 형태 11은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 9 중 어느 하나에 있어서, 링커는 구조화된 링커인, 융합 단백질이다.
실시 형태 12는, 실시 형태 11에 있어서, 링커는 서열 (AP)n 또는 (EAAAK)n (여기서, n은 2 내지 20임), 예컨대 AS-(AP)n-GT 또는 AS-(EAAAK)n-GT를 포함하는, 융합 단백질이다.
실시 형태 13은, 서열 번호 5, 25-31, 36-37, 40, 48, 55-60 또는 64-75와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질이다.
실시 형태 14는, 실시 형태 13에 있어서, 서열 번호 5, 25-31, 36-37, 40, 48, 55-60 및 64-75로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질이다.
실시 형태 15는, 실시 형태 14에 있어서, 서열 번호 5, 25-30, 40, 55-60, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질이다.
실시 형태 16은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 15 중 어느 하나의 융합 단백질을 인코딩하는, 단리된 핵산 분자이다.
실시 형태 17은, 서열 번호 76-91의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자이다.
실시 형태 18은, 실시 형태 16 또는 실시 형태 17의 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터이다.
실시 형태 19는, 실시 형태 16 또는 실시 형태 17의 핵산 분자를 포함하는, 숙주 세포이다.
실시 형태 20은 실시 형태 1 내지 실시 형태 15 중 어느 하나의 융합 단백질을 생성하는 방법으로서, (1) 융합 단백질이 생성되는 조건 하에서 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (2) 숙주 세포에 의해 생성된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 21은, 실시 형태 20에 있어서, 회수하는 단계는 융합 단백질을 정제하여 프로테아제를 제거하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 22는, 실시 형태 1 내지 실시 형태 15 중 어느 하나의 융합 단백질의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 23은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 15 중 어느 하나의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물이다.
실시 형태 24는, 실시 형태 22 또는 실시 형태 23에 따른 약제학적 조성물을 포함하는, 키트이다.
실시 형태 25는, 대사 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 실시 형태 22 또는 실시 형태 23에 따른 약제학적 조성물의 유효량을 대사 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 26은, 실시 형태 25에 있어서, 대사 장애는 제2형 당뇨병, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신경병증, 심근 허혈성 손상, 울혈성 심부전, 또는 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법이다.
실시 형태 27은, 실시 형태 25 또는 실시 형태 26에 있어서, 약제학적 조성물은 대상체에게 피하 또는 정맥내 투여되는, 방법이다.
실시 형태 28은, 제2형 당뇨병, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신경병증, 심근 허혈성 손상, 울혈성 심부전, 또는 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 대사 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 서열 번호 5, 25-30, 40, 55-60, 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 피하 또는 정맥내 투여하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 29는, 제2형 당뇨병, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신경병증, 심근 허혈성 손상, 울혈성 심부전, 또는 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 대사 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 대사 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이다.
실시 형태 30은, 실시 형태 25 내지 실시 형태 29 중 어느 하나에 있어서, 약제학적 조성물은 대상체에게 정맥내 또는 피하 투여되는, 방법이다.
실시 형태 31은, 실시 형태 1 내지 실시 형태 15 중 어느 하나에 있어서, 제2형 당뇨병, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신경병증, 심근 허혈성 손상, 울혈성 심부전, 또는 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 대사 장애를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한, 융합 단백질이다.
실시예
본 발명의 하기 실시예는 본 발명의 성질을 추가로 예시하기 위한 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해 결정됨이 이해되어야 한다.
실시예 1: GDF15를 포함하는 융합 분자의 설계 - GDF15 절단의 효과
다른 TGFβ 패밀리 구성원과 마찬가지로, GDF15는 프리-프로-단백질로서 합성되며, 프리-프로-단백질은 소포체 내에서 이량체를 형성하고, 푸린 절단을 거쳐서 분비 성숙 GDF15 (아미노산 197-308)를 생성한다. 분비 성숙 GDF15 동종이량체는 약 25k 달톤이며, 각각의 단량체는 최대 4개의 분자내 이황화물 결합을 형성하는 잠재력을 가지며, 단일 분자간 이황화물이 동종이량체 성분들을 연결한다.
GDF15의 결정 구조를 본 발명에서 결정하였으며, 이는 도 1a 및 도 1b에 도시되어 있다. 결정 구조는, 성숙 GDF15의 C-말단은 이량체 계면 내에 매립되어 있으며, 한편 N-말단은 노출되어 있음을 나타낸다. 이러한 노출된 말단은 GDF15의 N-말단에 대한 융합 단백질, 예컨대 반감기 연장 단백질의 연결을 가능하게 한다.
결정 구조는 또한 GDF15 시스테인 잔기들의 신규한 이황화물 쌍형성 패턴을 도시한다. TGFβ1은 C1-C3 및 C2-C7 쌍형성 (즉, 그의 제1 시스테인 잔기와 제3 시스테인 잔기 사이뿐만 아니라 그의 제2 시스테인 잔기와 제7 시스테인 잔기 사이의 쌍형성)을 갖지만, GDF15는 C1-C2 및 C3-C7 쌍형성을 갖는다 (도 1a 및 도 1b 참조). 이러한 특유의 이황화물 쌍형성은 C1-C2 쌍형성에 의해 루프가 형성되게 하며, 이러한 루프는 단백질의 N-말단에 위치되고, 다른 이황화물 결합을 함유하는 시스테인 노트(knot)로부터 떨어져 있다. 이러한 구조로부터, GDF15의 N-말단이 이량체 형성 또는 전체 단백질 접힘에 중요하지 않을 수 있으며, GDF15 및 이의 N-말단 융합 분자는, C1-C2 루프 내의 잔기인 C1 및 C2, 또는 심지어는 잔기 C-말단에서 C2까지를 결실시키는 N-말단 결실을 참아낼 수 있을 것으로 예측된다.
실시예 2: GDF15를 포함하는 융합 분자의 설계 - 링커의 효과
HSA 분자와 GDF15 분자 사이의 상이한 링커들을 평가하였다. 서열 (GGGGS)n을 함유하는 가요성 링커, 및 서열 (AP)n 또는 (EAAAK)n을 함유하는 구조화된 링커 둘 모두 (여기서, n은 2 내지 20임)를 평가하였다.
상이한 링커들을 포함하는 융합 단백질을 그들의 생물물리학적 특성, 마른 마우스에서의 먹이 섭취량의 효능에 미치는 그들의 효과, 그들의 마우스 약동학적 특성 (PK) 값, 및 인간 혈액 중에서의 그들의 생체외 안정성에 대하여 비교하였다. 시험된 링커 변이체들의 결과가 표 1에 제시되어 있다. (EAAAK)8 링커를 함유하는, 서열 번호 31을 포함하는 분자는 HPLC에 의해 응집을 보여주었다. 표 1에서의 나머지 7개의 링커 변이체는 어떠한 응집도 보여주지 않았다.
[표 1]
Figure pct00001
마우스에서의 생체내(in vivo) 연구에 의해 그리고 인간 전혈 및 혈장 샘플에서의 생체외 안정성 연구에 의해 이들 변이체에 대해 링커 안정성을 또한 평가하였다. 2가지 형태의 검출을 사용하여 이들 연구로부터의 결과를 분석하였다. 항-GDF15 포착 및 항-HSA 검출 항체 쌍을 사용한 면역검정을 사용하여, 링커의 양쪽에 있는 두 분자 모두의 존재를 측정함으로써 링커가 얼마나 온전한지를 평가하였다. 더 넓은 시점의 전체-분자 완전성(whole-molecule integrity)을 HSA 및 GDF15 둘 모두로부터의 상이한 대리(surrogate) 펩티드 서열들을 사용하여 액체 크로마토그래피-질량 분석 (LC-MS) 분석에 의해 분석하였다. 면역검정은 모든 링커 변이체에 대해 안정한 PK 프로파일을 보여주었으며, 48시간에 걸쳐 관찰된 임의의 링커 변이체에 대해서는 스파이킹된(spiked) 혈장 샘플 농도의 무손실을 보여주었다. LC-MS 결과는 면역검정과 일치하였는데, 이는 HSA 및 GDF15 분자의 상이한 부분들로부터의 대리 펩티드들이 온전함을 보여주었다. 대리 펩티드들을 사용하여 LC-MS에 의해 분석된 링커 변이체의 PK 프로파일은 상이한 링커 변이체들에 대해 유사한 경향을 보여주었는데, 여기서 이들은 모두 일수 7에서 검출가능한 수준을 가졌다. 서열 번호 31을 제외한 표 1에서의 모든 변이체는 바람직한 생물물리학적 특성 및 PK 값을 가졌다.
마른 마우스에서 먹이 섭취 연구를 수행함으로써, 링커 변이체들을 그들의 생체내 활성에 대해 평가하였다. 표 2는 감소하는 먹이 섭취량에 있어서의 융합 단백질의 효능에 대한 링커 변이체들의 영향을 제시한다. 효능에 대한 링커의 명백한 영향이 있었다. 가요성 (GGGGS)n 링커에 대하여, 2에서 4로, 이어서 8로의 링커 길이의 증가는 융합 단백질 효능을 대폭 증가시켰다. 더 강성한 (AP)n 링커의 경우, 그러한 경향은 덜 명백하였는데, 이는 융합 단백질 내의 GDF15 분자의 자유도가 그의 효능에 있어서 중요한 역할을 함을 시사한다.
[표 2]
Figure pct00002
실시예 3: GDF15를 포함하는 융합 분자의 설계 - HSA 돌연변이의 효과
반감기 연장 단백질인 인간 혈청 알부민이 링커를 통해 GDF15의 N-말단에 융합된 재조합 단백질을 설계하였다. 이러한 설계는 GDF15 이량체화 계면이 교란되지 않은 상태로 유지되는 것을 가능하게 하고, 천연 사슬간 이황화물 결합의 형성을 가능하게 하여, HSA 융합이 각각의 GDF15 아암(arm)으로부터 연장된 GDF15 동종이량체를 생성하게 될 것이다. 이러한 접근법의 경우, 단지 하나의 유전자만이 HSA-GDF15 동종이량체를 생성하는 데 필요하다.
천연 인간 혈청 알부민 단백질은 35개의 시스테인 (Cys, C) 잔기를 함유하며 이들 잔기가 17개의 이황화물 결합을 형성하는데, 이때 Cys-34 잔기는 분자 내의 유일한 유리 시스테인이다. 이러한 유리 Cys-34는 다수의 반응성 산소종 (ROS) 및 반응성 질소종 (RNS)을 포획함으로써, 자유 라디칼 스캐빈저로서 기능하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서, 이러한 유리 Cys를 돌연변이시켜 산화로 인한 불균일성의 위험을 최소화하였다.
HSA의 위치 34의 유리 시스테인을 세린 또는 알라닌으로 돌연변이시키고, HSA(C34S) 또는 HSA(C34A) 돌연변이를 갖는 GDF15 융합 분자를 분석하였다. 3-단계 정제 방법을 사용하여 두 분자 모두를 정제하였다: (i) 이온-교환 크로마토그래피, (ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 (iii) 크기-배제 크로마토그래피. 이들이 최초로 생성되었을 때, HPLC 분석은 두 분자 모두가 순수하고 무응집임을 보여주었다 (표 3).
그러나, 생성 후 2주째에, HSA(C34A) 돌연변이 (서열 번호 48을 포함함)를 함유하는 융합 단백질은 HPLC에 의해 응집을 보여준 반면, HSA(C34S) 돌연변이 (서열 번호 40)를 함유하는 융합 단백질은 4주 후에 무응집 상태로 남아 있었다.
[표 3]
Figure pct00003
실시예 4: GDF15에 대한 프로테아제 절단 경향
GDF15의 아미노산 위치 198에서의 아르기닌 잔기 (R198)가 HSA-GDF15 융합 분자 내에서 프로테아제 분해에 취약하다는 것이 본 발명자들에 의해 관찰되었다. 그러한 분해는 불균일한 집단을 초래하고, 치료적 조성물에 바람직하지 않다. 이러한 절단은 프로테아제 억제제 칵테일에 의해 방지될 수 있다. 프로테아제의 제거를 위한 정제 방법을 조사하였다. 표 4는, HPLC에 의해 측정된 바와 같은, HSA-GDF15 융합 단백질의 정제에 대해 시험된 2가지 유형의 HSA 친화성 컬럼을 열거한다. 정제 시점에서, 두 방법 모두에 의해 정제된 HSA-GDF15 융합 단백질은 100% 순수하고 온전하였다. 저농도 (2 내지 5 mg/ml)에서는, 두 방법 모두에 의해 정제된 단백질이 4주의 전체 시험 기간 동안 온전하게 유지되었다. 그러나, 고농도 (40 내지 50 mg/ml)에서는, 단지 항체-기반 HSA 수지 (CaptureSelect)만이 전체 4주의 시험 기간 동안 온전하게 유지되는 프로테아제-무함유 단백질을 생성하였다. HSA-리간드-기반 수지 (Albupure)는, 초기에는 온전하였지만 고농도로 저장될 때 시간 경과에 따라 분해를 보여준 단백질을 생성하였다. 프로테아제 억제제 칵테일 (PI) 및 EDTA를 첨가함으로써, Albupure 수지를 사용하여 정제된 고농도 HSA-GDF15 융합 단백질 배치(batch)의 분해를 완전히 정지시켰다. 따라서, 정제 방법은 안정한 치료적 조성물의 생성에 있어서 중요한 역할을 한다. 상응하는 분해는 생체내 또는 생체외에서 관찰되지 않았는데, 이는, 일단 치료적 조성물이 프로테아제-무함유 상태로 제조되면, 융합 단백질의 분해가 생체내에서 문제가 되지 않음을 시사한다. 따라서, 생성 동안 잠재적인 프로테아제를 효과적으로 제거할 수 있는 정제 방법, 예컨대 CaptureSelect 수지를 사용하는 것이 균일하고 온전하고 안정한 GDF15 치료제를 성공적으로 제조하는 데 있어서 핵심이다.
[표 4]
Figure pct00004
실시예 5: GDF15의 N-말단 결실 변이체
도 1a 및 도 1b에 도시된 GDF15 결정 구조로부터, 결실 변이체에 관여하는 GDF15의 N-말단이 이량체 형성 및 전체 단백질 접힘에 중요하지 않을 것으로 예측된다. 또한, 그러한 N-말단 결실은 어떠한 잠재적인 수용체 상호작용에도 영향을 주지 않을 것으로 예측된다. GDF15의 N 말단의 다양한 결실을 포함하는 HSA-GDF15 융합 단백질을 생체내 활성에 대해 시험하였다.
GDF15에 있는 프로테아제 절단 부위 (R198)를 제거한 GDF15 N-말단 결실 변이체를 설계하였다. R198 잔기 바로 뒤에는, 잔기 N199-G200에 잠재적인 탈아미드화 부위가 있으며, 기질 탈아미드화 역시 치료적 조성물에 유리하지 않다. GDF15 N-말단 결실은 단백질 분해적 절단 부위 및 탈아미드화 부위 둘 모두를 동시에 제거할 수 있다. HSA를 갖는 융합 단백질 내로 포함된, 결과적인 GDF15 결실 변이체는 GDF15 (201-308; 서열 번호 8), GDF15 (202-308; 서열 번호 9), 및 GDF15 (211-308; 서열 번호 11)를 포함하였다. 마우스에서의 생체내 연구는 GDF15의 N-말단 결실 변이체가 먹이 섭취량을 감소시키는 데 있어서 여전히 활성임을 보여주었다 (도 17). 실험 결과는 그러한 GDF15 N-말단 결실 변이체가 적절하게 발현되고, 적절한 이량체를 형성하고, 생체내에서 활성임을 확인시켜 주었다.
실시예 6: GDF15의 불활성 돌연변이체
표 5는 GDF15 생체내 활성을 없애도록 한 GDF15의 12개의 돌연변이체를 열거하고, GDF15의 기능적 에피토프를 보여준다. 이들 돌연변이체는 5개의 단일 돌연변이체, 2개의 이중 돌연변이체, 및 5개의 삼중 돌연변이체를 포함한다. 이들 돌연변이를 포함하는 HSA-GDF15 융합 단백질을 그들의 생물물리학적 특성 및 활성에 대해 특성화하였다 (표 5). 12개의 돌연변이체 중에서, 하나는 발현되지 않았고 4개는 시간 경과에 따라 응집체를 형성하였는데, 이는 이들 돌연변이가 단백질 접힘 및 생물물리학적 특성을 방해함을 나타낸다. 나머지 7개의 돌연변이체 중에서, 이들 중 4개는 GDF15의 단일 돌연변이를 함유하였으며, 이들 돌연변이체를 야생형과 대비하여 먹이 섭취량 감소에 대해 마우스에서 시험하였다. 단일 돌연변이체들 중 3개 (I89R, I89W 및 W32A)는 생체내 활성을 손실하였으며, 한편 나머지 돌연변이체 (Q60W)는 야생형 정도로 활성이다. 이들 결과는 I89R, I89W 또는 W32A 돌연변이가 수용체/공-수용체와 GDF15의 상호작용을 방해함을 나타내었는데, 이는 GDF15의 기능적 에피토프가 잔기 I89 및 W32 주위에 있음을 시사한다. 돌연변이의 넘버링은 융합 단백질에 존재하는 성숙 GDF15에 기초하는데, 예를 들어 "1"은 성숙 GDF15의 첫 번째 아미노산 (서열 번호 6)을 지칭하고, "89"는 성숙 GDF15 단백질의 89번째 아미노산을 지칭한다.
[표 5]
Figure pct00005
실시예 7: 발현 및 정제 방법
발현
20 ml 및 그 이상의 발현을 위하여, Expi293™ 발현 배지 중에서 성장된 HEK Expi293™ 세포를 사용하여 발현을 행하였다. 8% CO2 하에서 125 RPM으로 진탕하면서, 세포를 37℃에서 성장시켰다. Expi293™ 발현 키트를 사용하여 2.5 × 106개 세포/ml로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포 1 리터마다, 1 mg의 총 DNA를 25 ml의 Opti-MEM 중에 희석시키고, 2.6 ml의 Expi293™ 시약을 25 ml의 Opti-MEM 중에 희석시키고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 희석된 DNA 및 희석된 Expi293 시약을 배합하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, DNA 복합체를 세포에 첨가하였다. 세포를 진탕 중인 인큐베이터 내에 하룻밤 넣어두었다. 형질감염 후 당일날, 키트로부터의 5 ml의 증강제(Enhancer) 1을 키트로부터의 50 ml의 증강제 2 중에 넣어서 희석시키고, 2개의 증강제의 총 부피를 세포에 첨가하였다. 형질감염된 세포를 그들이 수집될 때까지 4일 동안 인큐베이터 내로 다시 넣어 두었다. 세포를 6,000g로 30분 동안 원심분리함으로써 농축시키고, 이어서 0.2 um 필터를 사용하여 여과한 후, 정제 단계를 수행하였다.
발현은 또한 CHO 세포에서도 행하였다. 플라스미드를 정제하고 특성화하였다. 형질감염 전에, HSA-GDF15의 코딩 영역을 함유하는 플라스미드 DNA의 200 ㎍의 하나의 분취물을 Acl I을 사용한 제한 효소 분해에 의해 선형화하였다. 이러한 제한 엔도뉴클레아제에 의한 분해는 암피실린 저항성 유전자의 제거를 보장한다. 2개의 선형화된 15 ㎍ DNA 분취물을 BTX ECM 830 Electro Cell Manipulator (미국 매사추세츠주 홀리스턴 소재의 Harvard Apparatus)를 사용하여 2개의 1 × 107 CHO 세포 (지정된 형질감염 풀(pool) A 및 B) 내로 형질감염시켰다. 세포를 4 mm 갭 큐벳(gap cuvette) 내에서 15 밀리초 펄스 길이 및 5초 펄스 간격으로 250 볼트에서 3회 전기천공하였다. 형질감염된 세포를 진탕 플라스크 내의 MACH-1 + L-글루타민에 옮기고, 1일 동안 인큐베이션하였다. 형질감염 풀 A 및 형질감염 풀 B를 원심분리하고, MACH-1 + MSX 중에 재현탁하고, 진탕 플라스크에 옮겨서 6일 동안 인큐베이션하였다. 형질감염 풀 A 및 형질감염 풀 B로부터의 형질감염된 HSA-단백질 융합체-생성 세포를 풀링(pooled)하고, 전기천공 후 일수 8에 메틸셀룰로스 중에서 플레이팅하였다.
정제
CaptureSelect 수지 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 2-단계 정제를 사용하였다. 일시적으로 형질감염된 Expi293™ 세포로부터의 세포 상층액을 수지 1 ml당 10 mg 단백질의 대략적인 용량으로 사전-평형화된 (PBS (pH 7.2)) HSA CaptureSelect 컬럼 (ThermoFisher Scientific로부터의 CaptureSelect Human Albumin Affinity Matrix) 상에 로딩하였다. 로딩 후에, 10 컬럼 부피 (CV)의 PBS (pH 7.2)로 컬럼을 세척함으로써 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 컬럼에 결합된 HSA-GDF15를 20 mM Tris (pH 7.0) 중 2M MgCl2의 10 CV로 용리하였다. 피크 분획을 풀링하고, 여과하고 (0.2 μ), 4℃에서 PBS (pH 7.2)에 대해 투석시켰다. 투석 후에, 단백질을 다시 여과하고 (0.2 μ), 적절한 부피로 농축시킨 후, 26/60 Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 상에 로딩하였다. (SDS-PAGE에 의해 결정된) 고순도를 갖는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 컬럼으로부터 용리된 단백질 분획을 풀링하였다. BioTek Synergy HT™ 분광광도계 상에서의 280 nm에서의 흡광도에 의해 단백질의 농도를 결정하였다. 정제된 단백질의 품질을 SDS-PAGE 및 분석용 크기 배제 HPLC (SE-HPLC, Dionex HPLC 시스템)에 의해 평가하였다. LAL 검정 (Pyrotell®-T, Associates of Cape Cod)을 사용하여 내독소 수준을 측정하였다.
Albupure 수지 및 SEC를 사용한 2-단계 정제를 또한 사용하였다. 고정화된 합성 트라이아진 리간드를 이용하여 HSA와 선택적으로 결합하는 AlbuPure 수지 (ProMetic BioSciences Ltd)를 사용하여 실온에서 HSA-GDF15 융합 단백질을 정제하였다. 발현 상층액을 AlbuPure 수지에 적용하였다. 이어서, 수지를, 먼저 4 CV의 PBS (pH 7.2)로 세척한 후, 이어서 4 CV의 50 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl 완충액으로 세척하였다. 컬럼에 결합된 HSA-GDF15를 100 mM Na 옥타노에이트를 함유하는 4 CV의 PBS (pH 7.2) 완충액으로 용리하였다. 단백질-함유 분획을 30,000 kDa 분자량 컷오프 스핀 농축기 (Amicon)를 사용하여 10 mL 부피로 농축시키고, 이어서 PBS (pH 7.2) 완충액 중에서 평형화된 26/60 Superdex S200pg 컬럼 (GE)에 적용하였다. HSA-GDF15 동종이량체를 함유하는 SEC 분획을 SDS-PAGE를 통해 확인하고, 분석을 위하여 풀링하였다. SDS-PAGE 및 SE-HPLC에 의해 단백질 순도를 평가하였다.
실시예 8 내지 실시예 14, 및 실시예 19는 서열 번호 60의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 예시적인 융합 단백질의 특성화를 포함한다. 이러한 융합 단백질은 글리신 및 세린 잔기로 이루어진 42-아미노산 링커, GS-(GGGGS)8을 통한 HSA와 성숙 인간 GDF15의 융합체의 동종이량체로서 존재하는 완전 재조합 단백질이다. 이러한 융합 단백질의 예측된 분자량은 162,696 달톤이며, HSA의 위치 34에 있는 단일 천연 유리 시스테인이 세린으로 돌연변이되었다. 이러한 특정 HSA-GDF15 융합 단백질은 간소함을 위하여 하기 실시예들에서는 간단히 "FP1"로 지칭될 것이다. AS-(GGGGS)x8-GT 링커를 함유하는, FP1의 6xHis-태그된 변이체 (6xHis-FP1, 서열 번호 26)를 하기 실시예들 중 일부에서 비교를 위하여 사용하였다.
실시예 8: C57B1/6 마우스의 먹이 섭취량에 대한 FP1의 효과
이 실험의 목적은 C57Bl/6 마우스에서의 먹이 섭취량의 억제에 대한 FP1의 용량-반응성 효과를 입증하는 것이었다.
수컷 C57Bl/6 마우스를 BioDAQ 케이지 내에서 최소 72시간 동안 순응시켰다. 이어서, 마우스를 이전 24시간에서의 먹이 섭취량에 기초하여 8 마리씩 6개의 그룹으로 나누었다. 4:00 pm과 5:00 pm 사이에, 동물들의 체중을 측정하고, 비히클 또는 FP1을 포함하는 조성물을 피하 주사를 통해 투여하였다. 각각의 케이지에 대한 먹이 중량의 변화를 주사 후 48시간의 기간 동안 BioDAQ 시스템에 의해 연속해서 기록하였다. 6xHis-FP1을 본 연구에서 비교를 위하여 사용하였다.
결과 (도 2 및 표 6)를 주어진 시간 간격 동안의 누적 먹이 섭취량의 평균으로서 표현하였다. 결과는, C57BL/6 마우스에 대한 FP1의 피하 투여가 시험된 모든 용량 및 시점에서 비히클-처리된 동물과 대비하여 먹이 섭취량을 유의하게 억제하였음을 나타내었다. 6xHis-FP1은 8 nmol/㎏의 용량에서 먹이 섭취량을 감소시켰다.
[표 6]
Figure pct00006
실시예 9: 스프라그 돌리 래트에서의 먹이 섭취량에 대한 FP1의 효과
이 실험의 목적은 스프라그 돌리 래트에서의 먹이 섭취량의 억제에 대한 FP1의 용량-반응성 효과를 입증하는 것이었다.
수컷 스프라그 돌리 래트를 BioDAQ 케이지 내에서 최소 72시간 동안 순응시켰다. 이어서, 래트를 이전 24시간에서의 먹이 섭취량에 기초하여 8 마리씩 6개의 그룹으로 나누었다. 4:00 pm과 5:00 pm 사이에, 동물들의 체중을 측정하고, 비히클 또는 융합 단백질을 포함하는 조성물을 피하 주사를 통해 투여하였다. 각각의 케이지에 대한 먹이 중량의 변화를 주사 후 48시간의 기간 동안 BioDAQ 시스템에 의해 연속해서 기록하였다. 6xHis-FP1을 본 연구에서 비교를 위하여 사용하였다.
결과는 도 3 및 표 7에 나타나 있다. FP1의 피하 투여는 비히클-처리된 동물과 대비하여 2.5 nmol/㎏ 및 10 nmol/㎏의 용량에서 먹이 섭취량을 억제하였다. 억제는, 투여 후 24 및 48시간째에, 시험된 최고 용량 (10 nmol/㎏)에 대해서만 통계학적 유의성에 도달하였다. FP1은 8 nmol/㎏의 용량에서 먹이 섭취량을 감소시켰으며, 이 효과는 24 및 48시간째에 유의하였다.
[표 7]
Figure pct00007
실시예 10: 식이-유도 비만 (DIO) 마우스에서의 글루코스 항상성 및 체중에 대한 FP1의 효과
이 실험의 목적은 DIO C57Bl/6 마우스에서의 2주의 처리 내내 먹이 섭취량, 체중, 및 글루코스 항상성에 대한 FP1의 효과를 평가하는 것이었다.
수컷 DIO 마우스의 체중을 측정하고, FP1을 일수 0, 3, 6, 9, 및 12에서 3일마다 (q3d) 2 mL/㎏으로 피하 투여하였다. 비히클 및 로시글리타존 처리군에 유사한 계획(regimen)으로 PBS를 투여하였다. 대조군 로시글리타존은 자유식(ad libitum)으로 0.015%로 식이 내에 제공하였다. 마우스 및 먹이 중량을 매일 기록하였다. 혈당측정기 (One Touch®Ultra®, 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재의 Lifescan)를 사용하여 글루코스를 측정하였다. Bruker Mini-Spec LF110을 사용하여 시간-도메인 NMR (TD-NMR)에 의해 의식있는 마우스에서 체지방량 및 제지방량을 정량화하였다. 경구 글루코스 내성 시험 (OGTT)을 위하여, 마우스를 4시간 동안 절식시켰다. 10 mL/㎏으로 2 g/㎏의 글루코스의 경구 위관영양법(oral gavage) 투여 후 0, 30, 60, 90, 및 120분째에 꼬리 자름(tail snip)을 통해 혈당을 측정하였다. 글루코스 투여 후 0, 30, 및 90분째에 인슐린을 측정하였다.
본 연구의 종료 시점에서, CO2 흡입을 통해 마우스를 안락사시키고, 말단 혈액(terminal blood) 샘플을 수집하였다. 혈청을 젖은 얼음 상의 96웰 플레이트 내로 넣고, 이어서 -80℃에서 저장하였다. 간을 적출하고, 간 절편의 총 질량에 대한 지방 함량을 제조자의 사용설명서에 따라 Bruker MiniSpec mq60을 구비한 TD-NMR을 사용하여 평가하였다.
인슐린 저항성의 공복 항상성 모델 평가 (HOMA-IR)를 공복 글루코스 (단위: mg/dL)와 인슐린 (단위: mU/L)의 곱을 계수 405로 나눈 값에 기초하여 계산하였다.
1 nmol/㎏ 및 10 nmol/㎏의 FP1 q3d에 의한 DIO 마우스의 처리는 체중 (표 8) 및 먹이 섭취량 (표 9)을 감소시켰다. 감소는 하기에 기재된 바와 같이 단지 소정의 시점에서만 통계학적 유의성에 도달하였다.
Fp1은 DIO 마우스에서 1 (일수 2 내지 14) 및 10 nmol/㎏ (일수 1 내지 14)의 용량에서 체중을 감소시켰다 (표 8 및 도 4). 먹이 섭취량의 유의한 감소가 1 nmol/㎏의 용량에서는 본 연구의 일수 1 및 2에서 그리고 10 nmol/㎏의 용량에서는 일수 1, 8 및 9에서 관찰되었다 (표 9).
[표 8]
Figure pct00008
[표 9]
Figure pct00009
본 연구의 일수 14에서 수행된 OGTT에서, FP1은 시험된 모든 3개의 용량에서 시간 0 후의 모든 시점에서 비히클-처리된 동물과 대비하여 글루코스 수준을 유의하게 낮추었다 (표 10). 이것을 총 곡선 아래 면적 (AUC) 및 델타 AUC로서 추가로 정량화하였는데, 이들은 시험된 모든 3개의 용량에 대해 비히클과 대비하여 유의하게 더 낮았다 (표 10 및 도 5a 및 도 5b).
[표 10]
Figure pct00010
본 연구의 시작일 (일수 0), 일수 7 및 일수 13에서 식후 혈당 수준을 측정하였다 (표 11 및 도 6). FP1은 본 연구의 일수 13에서 1 nmol/㎏ 및 10 nmol/㎏의 용량에서 통계학적으로 유의한 방식으로 혈당을 감소시켰다.
[표 11]
Figure pct00011
OGTT 동안의 혈장 인슐린 수준은 30분째에 0.1 nmol/㎏의 용량의 경우 상응하는 비히클군보다 FP1에 대해 유의하게 더 높았으며, 동일한 시점에서 1 및 10 nmol/㎏의 용량에서는 더 낮았다 (표 12). 총 AUC에 의해 측정된 바와 같은, OGTT 동안의 인슐린 일탈(insulin excursion)은 FP1의 0.1 nmol/㎏의 용량의 경우에는 비히클군보다 더 높았으며 (표 12), 1 및 10 nmol/㎏의 용량에서는 더 낮았다. 두 경우 모두, 단지 최저 용량에서만 통계학적 유의성에 도달하였다. 90분 시점에서, 1 및 10 nmol/㎏의 FP1로 처리된 마우스는 더 낮은 인슐린 수준을 가졌지만; 이러한 효과는 통계학적 유의성을 달성하지는 못하였다. 인슐린 감수성의 척도로서 사용된 HOMA-IR은 본 연구의 일수 14일에서 측정하였다. 이 시점에서, FP1은 10 nmol/㎏에서, HOMA-IR을 감소시키거나, 또는 인슐린 감수성을 개선하였다 (표 13 및 도 7).
[표 12]
Figure pct00012
[표 13]
Figure pct00013
일수 13까지 달성된 중량 손실의 크기는 어떠한 용량에서도 절대 체지방량 또는 % 체지방량에 있어서 측정가능한 변화를 가져오지 않았다 (표 14). 10 nmol/㎏의 용량에서는, 절대 제지방량에 있어서 유의한 감소가 있었다. 이러한 감소는 % 제지방량으로 표현될 때에는 관찰되지 않았다. 본 연구의 일수 15에서 종점 부검 동안 간 중량을 측정하였다 (표 15). FP1은 10 nmol/㎏의 용량에서 절대 간 중량 및 체중의 백분율로서의 간 중량을 감소시켰다. 1 nmol/㎏의 용량에서 감소가 관찰되었지만, 이것은 어느 한 파라미터에 대해서도 통계학적 유의성에 도달하지 못하였다. 생검 시에 NMR에 의해 간 지방을 측정하였다 (표 16). FP1 융합 단백질은 1 및 10 nmol/㎏의 용량에서 간 생검 중량의 백분율로 표현된 간 지방 함량을 감소시켰다. 감소는 더 높은 용량에서 유의하였다.
[표 14]
Figure pct00014
[표 15]
Figure pct00015
[표 16]
Figure pct00016
실시예 11: ob/ob 마우스에서의 혈당 수준 및 체중에 대한 FP1의 효과
본 실험의 목적은 비만, 고혈당, 렙틴-결핍 ob/ob 마우스에서의 8일의 처리에 걸쳐 체중 및 혈당 수준에 대한 FP1의 효과를 평가하는 것이었다.
수컷 ob/ob 마우스의 체중을 측정하고, FP1을 일수 0, 3 및 6에서 3일마다 (q3d) 2 mL/㎏으로 피하 투여하였다. 마우스 및 먹이 중량을 매일 기록하였다. 혈당측정기를 사용하여 글루코스를 매일 측정하였다. 본 연구의 종료 시점에서, 마우스를 안락사시키고, 말단 혈액 샘플을 수집하였다.
1 nmol/㎏의 용량의 FP1은 비히클-처리된 마우스와 대비하여, 일수 2에서 시작하여 일수 8까지 ob/ob 마우스에서 체중을 유의하게 감소시켰다 (시작 체중의 백분율로 표현됨). 10 nmol/㎏의 용량의 FP1은 비히클-처리된 마우스와 대비하여, 일수 1에서 시작하여 일수 8까지 ob/ob 마우스에서 체중을 감소시켰다 (시작 체중의 백분율로 표현됨) (표 17 및 도 8).
[표 17]
Figure pct00017
10 nmol/㎏의 용량의 FP1은 비히클-처리된 마우스와 대비하여 연구 일수 1 및 2에서 그리고 일수 4에서 일수 8까지 ob/ob 마우스에서 식후 혈당 값을 감소시켰다. 혈당의 감소가 1 nmol/㎏에서 관찰되었지만; 이러한 효과는 통계학적 유의성에 도달하지 못하였다 (표 18 및 도 9).
[표 18]
Figure pct00018
실시예 12: 다중종 약동학적 특성(Multispecies Pharmacokinetics)
마우스 약동학적 특성
FP1을 PBS (pH 7) 중 2 mg/㎏ IV 및 SC의 용량으로 암컷 C57Bl/6 마우스에 투여하였다. 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 처리하고, 양쪽 투여 경로 후 최대 7일까지 약물 농도를 측정하였다. 면역검정 방법을 사용하여 FP1의 농도를 결정하였다. 혈청 약물 농도-시간 프로파일이 표 19 및 표 20에 요약되어 있고 도 10에 예시되어 있다.
[표 19]
Figure pct00019
[표 20]
Figure pct00020
약동학적 분석은 C57Bl/6 마우스에서 FP1에 대하여, SC 및 IV 투여 후 각각 1.67 및 1.57일의 최종 반감기를 보여주었다 (표 21). FP1은 SC 투여 후 약 71%의 평균 생체이용률을 보여주었다.
[표 21]
Figure pct00021
래트 약동학적 특성
FP1을 PBS (pH 7) 중 2 mg/㎏ IV 및 SC의 용량으로 암컷 스프라그 돌리 래트에 투여하였다. 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 처리하고, 양쪽 투여 경로 후 최대 7일까지 약물 농도를 측정하였다. 면역검정 방법을 사용하여 FP1의 농도를 결정하였다. 혈청 약물 농도-시간 프로파일이 표 22 및 표 23에 요약되어 있고 도 11에 예시되어 있다.
[표 22]
Figure pct00022
[표 23]
Figure pct00023
약동학적 분석은 스프라그 돌리 래트에서 FP1에 대하여, SC 및 IV 투여 후 각각 1.34 및 1.51일의 최종 반감기를 보여주었다 (표 24). FP1은 SC 투여 후 약 23%의 평균 생체이용률을 보여주었다.
[표 24]
Figure pct00024
원숭이 약동학적 특성
FP1을 PBS (pH 7) 중 1 mg/㎏ IV 및 SC의 용량으로 나이브(
Figure pct00025
) 수컷 사이노몰거스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))에 투여하였다. 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 처리하고, 면역검정 생물분석을 사용하여 양쪽 투여 경로 후 최대 21일까지 약물 농도를 측정하였다. 혈청 약물 농도-시간 프로파일이 표 25 및 표 26에 요약되어 있고, 도 12에 예시되어 있다.
[표 25]
Figure pct00026
[표 26]
Figure pct00027
약동학적 분석은 사이노몰거스 원숭이에서 FP1에 대하여, SC 및 IV 투여 후 각각 8.5 내지 9.2일의 최종 반감기를 보여주었으며, 이때 평균 생체이용률은 SC 투여 후 약 88%였다 (표 27).
[표 27]
Figure pct00028
면역친화성 포획(immuno-affinity capture)-LCMS 분석을 사용하여, IV 및 SC 투여 후 사이노몰거스 원숭이의 혈청에 존재하는 온전한 이량체의 농도를 정량화하였다 (표 28 및 표 29 및 도 13 및 도 14). 이러한 방법에 의해 결정된 농도는 면역검정 (IA)에 의해 결정된 농도와 유사하였는데, 이는, FP1이 사이노몰거스 원숭이에서 검출가능한 대사 결함 없이 온전한 이량체로서 순환함을 입증한다.
[표 28]
Figure pct00029
[표 29]
Figure pct00030
IV 및 SC 투여 후의 사이노몰거스 원숭이 혈청 중의 분석물의 농도를 또한 면역친화성 포획-트립신 분해-LC-MS/MS 분석에 의해 측정하였다 (표 30 및 표 31). 선택된 트립신 분해 펩티드, 즉 ALV (ALVLIAFAQYLQQSPFEDHVK), ASL (ASLEDLGWADWVLSPR), 및 TDT (TDTGVSLQTYDDLLAK)는 FP1 내의 각각 HSA 영역의 N-말단, GDF15의 N-말단, 및 GDF15의 C-말단 부근에 위치된다. 이들 펩티드를 FP1의 대리 펩티드로서 모니터링하였다. 모든 대리 펩티드의 농도는 서로 그리고 면역검정에 의해 측정된 농도와 유사하였는데, 이는 FP1 내의 GDF15 서열이 생체내에서 온전하게 그리고 완전 HSA 서열에 연결된 상태로 유지됨을 입증한다.
[표 30]
Figure pct00031
[표 31]
Figure pct00032
인간 혈장 안정성 검정
본 연구의 목적은 인간 혈장에서의 FP1의 생체외 안정성을 분석하는 것이었다. 신선한 비동결 인간 혈장을 원심분리에 의해 2명의 대상체 (한 명은 남성이고 한 명은 여성임)로부터의 헤파린 첨가 혈액으로부터 생성하였다. FP1을 0, 4, 24 및 48시간 동안 온화하게 혼합하면서 37℃에서 이 기질 중에서 인큐베이션하였다. 면역검정 방법을 사용하여 FP1의 농도를 결정하였다. 출발 농도 (0시간)로부터의 평균 % 차이는 -4.1 내지 -12.9의 범위였고 시간 경과에 따라 증가되지 않았는데, 이는 FP1이 생체외에서 최대 48시간 동안 인간 혈장 중에서 안정함을 입증한다 (표 32 및 도 15).
[표 32]
Figure pct00033
면역친화성 포획-LCMS를 사용하여, 인간 혈장 중에서의 인큐베이션 후에 존재하는 온전한 이량체의 농도를 정량화하였다. 이 방법에 의해 결정된 농도는 시간 경과에 따라 (0, 4, 24, 및 48시간) 안정하였는데, 이는 FP1이 생체외에서 인간 혈장 중에서 최대 48시간까지 온전한 이량체를 유지함을 입증한다 (표 33 및 도 16).
[표 33]
Figure pct00034
실시예 13: IR 전략
동물 및 임상 샘플에서 항-약물 항체 (ADA) 검출을 위하여 면역 반응 (IR) 검정이 개발될 것이다. IR 검정은 약동학적/독성동태학적 (PK/TK) 결과와의 ADA 상태의 비교를 위하여 ADA-양성 샘플을 확인하여, FP1 노출 및 약동학적 특성의 평가를 가능하게 할 것이다. 임상 IR 검정은, 혈청 샘플을 스크리닝하고, ADA-양성 샘플의 특이성을 확인시켜 주고, 확인된 양성 샘플에 대한 ADA 역가(titer)를 결정하는 데 사용될 것이다. 이 프로그램의 1상(Phase 1)에 있는 ADA-양성 대상체로부터 확인된 양성 샘플에서의 사용을 위하여 중화 항체 (NAb) 검정 개발이 뒤따를 것이다. 추가적으로, 이 프로그램의 2상에서의 사용을 위하여 내인성 GDF15와의 ADA 교차-반응성의 결정이 뒤따를 것이다. FIH (first in human, 인간을 대상으로 한 최초의 시험) 연구 전에 면역원성 위험 평가가 수행될 것이며, 추가의 면역 반응 특성화 검정이 보장된다면 이들이 구현될 수 있다.
실시예 14: 독성 계획(Toxicology Plan)
GDF15에 대한 내인성 표적 수용체가 확인되어 있지 않기 때문에, FP1에 대한 시험관내 결합 및 기능적 데이터가 결여되어 있다. 그러나, 래트, 마우스 및 사이노몰거스 원숭이에서의 단회 및 다회 용량 약리학 및 효능 연구는 이들 종에서의 FP1의 활성을 보여주었는데, 이러한 활성은 먹이 섭취량의 감소, 체중 감소 및 경구 글루코스 내성의 조절에 대한 그의 효과를 나타낸다. 래트 및 원숭이는 효능 결과에 기초하여 각각 설치류 및 비설치류 독성 시험종이 될 것이며, 이때 (인간의 것과 대비하여) 이들 종에서의 수용체에 대한 FP1의 고유 효능은 완전히 특성화되지 않은 것으로 이해된다.
실시예 15 내지 실시예 19는, (서열 번호 92 (코돈 최적화 1) 및 110 (코돈 최적화 2)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된) 서열 번호 92의 아미노산 서열을 갖는, 실시예 5에 기재된 본 발명의 다른 예시적인 융합 단백질의 특성화를 포함한다. 이러한 융합 단백질은 글리신 및 세린 잔기로 이루어진 42-아미노산 링커, GS-(GGGGS)8을 통한 HSA (C34S)와 성숙 인간 GDF15의 결실 변이체 (201-308; 서열 번호 8)의 융합체의 동종이량체로서 존재하는 완전 재조합 단백질이다. HSA의 위치 34에 있는 단일 천연 유리 시스테인이 세린으로 돌연변이되었다. 이러한 특정 HSA-GDF15 융합 단백질은 간소함을 위하여 하기 실시예들에서는 "FP2"로 지칭될 것이다.
실시예 15: C57Bl/6 마우스의 먹이 섭취량에 대한 FP2의 효과
FP2를 단회 투여 후에 수컷 C57Bl/6 마우스에서 먹이 섭취량을 감소시키는 그의 능력에 대하여 평가하였다. Taconic Biosciences (미국 뉴욕주 허드슨 소재)로부터 입수된 수컷 C57Bl/6N 마우스 (10 내지 12주령)를 본 연구에 사용하였다. 마우스를 12시간 명/암 주기 (6 am/6 pm)를 갖는 온도-제어된 방 내에 단독으로 수용하고, 물 및 사료에 자유식으로 접근할 수 있게 하였다. 수컷 C57Bl/6 마우스를 BioDAQ 케이지 내에서 최소 72시간 동안 순응시키고; 이어서, 마우스를 마지막 24시간에서의 먹이 섭취량에 기초하여 각각 8 마리씩 6개의 그룹으로 나누었다. 4:00 pm과 5:00 pm 사이에, 동물들의 체중을 측정하고, 비히클 또는 조성물을 피하 주사를 통해 투여하였다. 각각의 케이지에 대한 먹이 중량의 변화를 화합물 투여 후 48시간의 기간 동안 BioDAQ 시스템에 의해 연속해서 기록하였다. 6xHis-FP1을 본 연구에서 비교물로서 사용하였다.
FP2는 시험된 모든 용량 수준에서 투여 후 12, 24 및 48시간째에 먹이 섭취량을 감소시키는 데 유의한 효과를 가졌다 (표 34). 마우스에서 모든 시점 및 모든 용량 수준에서 PBS와 대비하여 먹이 섭취량의 변화 (%)에 있어서 감소가 있었다 (표 35).
[표 34]
Figure pct00035
[표 35]
Figure pct00036
실시예 16: 스프라그 돌리 래트에서의 먹이 섭취량에 대한 FP2의 효과
FP2를 단회 투여 후에 수컷 스프라그-돌리 래트에서 먹이 섭취량 및 체중 획득을 감소시키는 그의 능력에 대하여 평가하였다. 동물들을 200 내지 225 g의 체중으로 Charles River Labs (미국 매사추세츠주 윌밍턴 소재)로부터 입수하고, 전달한지 1주 이내에 사용하였다. 이들을 케이지당 1 마리씩, 12시간 명/암 주기를 갖는 온도-제어된 방 내에서 풍부화(enrichment)를 위한 플라스틱 튜브 및 Alpha dri 잠자리에 수용하였다. 이들은 물에 자유식으로 접근되게 하고, 실험실용 설치류 식이가 급식되었다: Irradiated Certified PicoLab® 설치류 식이(Rodent Diet) 20, 5K75* (미국 펜실베이니아주 퀘이커타운 소재의 ASAP를 통해 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Purina Mills로부터 공급됨). 투여 전에 각각의 래트에 대해 동물 체중을 측정하고 기록하였다.
동물들을 BioDAQ 케이지 내에서 최소 72시간 동안 순응시키고; 이어서, 래트를 마지막 24시간에서의 먹이 섭취량에 기초하여 각각 8 마리씩 6개의 그룹으로 나누었다. 4:00 pm과 5:00 pm 사이에, 동물들의 체중을 측정하고, 비히클 또는 조성물을 피하 주사를 통해 투여하였다. 각각의 케이지에 대한 먹이 중량의 변화를 화합물 투여 후 48시간의 기간 동안 BioDAQ 시스템에 의해 연속해서 기록하였다. 6XHis-FP1을 본 연구에서 비교물로서 사용하였다.
FP2의 단회 투여 후에 먹이 섭취량의 용량-의존성 감소를 시험하였다. 0.3 nmol/㎏의 용량에서 먹이 섭취량에 있어서 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 1 nmol/㎏에서는, 먹이 섭취량의 감소에 있어서의 유의한 효과가 12시간째에는 관찰되었지만, 24 또는 48시간째에는 관찰되지 않았다. 3 및 10 nmol/㎏의 용량 수준에 대해서는, 먹이 섭취량에 있어서의 유의한 감소가 모든 시점에서 관찰되었다 (표 36, 도 19). 모든 시점 및 모든 용량 수준에서 PBS와 대비하여 먹이 섭취량의 변화 (%)에 있어서 감소가 있었다 (표 37).
[표 36]
Figure pct00037
[표 37]
Figure pct00038
실시예 17: 식이-유도 비만 (DIO) C57Bl/6 마우스에서의 먹이 섭취량, 체중 및 글루코스 항상성에 대한 FP2의 효과
FP2를 8일의 기간에 걸쳐 수컷 DIO C57Bl/6 마우스에서 반복 투여 시에 먹이 섭취량 및 체중을 감소시키고 글루코스 항상성을 개선하는 그의 능력에 대해 평가하였다. Taconic Biosciences (미국 뉴욕주 허드슨 소재)로부터 입수된 수컷 DIO C57Bl/6 마우스 (21주령, 15주 동안 고지방 급식)를 본 연구에 사용하였다. 마우스를 12시간 명/암 주기 (6 am/6 pm)를 갖는 온도-제어된 방 내에 단독으로 수용하고, 물에 자유식으로 접근할 수 있게 하고 Research Diet D12492 (미국 뉴저지주 뉴브런즈윅 소재의 Research Diets)를 급식하였다. 마우스를 실험 전에 마우스 수용실 내에서 1주 넘게 순응시켰다. 본 연구의 종점은 먹이 섭취량, 체중, 신체 조성 및 혈당 종점 (OGTT, 혈당)의 측정이었다. 투여 하루 전날, 동물들의 체중을 측정하고 체중 (BW)에 의해 그룹을 나누었다. 마우스에 피하 주사를 투여하였다. FP2가 투여되는 동물은 이 화합물을 일수 0, 일수 3, 및 일수 6, 일수 9 및 일수 12에서 제공받았다. 비히클군 및 로시글리타존군도 마찬가지로 이들 날짜에 멸균 PBS s.c.를 제공받았다. 로시글리타존은 자유식으로 0.015% w/w로 식이 내에 제공하였다. BW 및 먹이 섭취량을 15일의 기간에 걸쳐 매일 기록하였다. 혈당을 일수 0, 7 및 13에서 측정하였다. 경구 글루코스 내성 시험 (OGTT)을 일수 14에서 수행하였다. OGTT 동안 선택된 시점에서 인슐린 수준을 측정하였다. 일수 15에서 마우스를 CO2로 안락사시키고, 심장 천자를 통해 노출을 위하여 말단 혈액 샘플을 수집하였다. 용량군당 3 마리의 마우스씩 총 15 마리의 마우스를 사용하여 별개의 PK 시험군을 실시하였다.
DIO 마우스에서 FP2에 대한 노출-반응 (E-R) 분석
약력학적 특성 (PD) (효능) 시험군 내의 대부분의 동물들은 연구 마지막 날에, 약동학적 특성 (PK) 샘플을 획득하였을 때, 검출 불가능한 약물 농도를 가졌는데, 이는 잠재적으로 면역원성에 기인한다. 따라서, PD 시험군으로부터의 개별 PK 대신에, PK 시험군으로부터의 평균 PK 프로파일을 사용하여, 상응하는 용량 수준에서 PD 시험군에서 기저선으로부터의 % 중량 변화에 대하여 (각각 일수 3, 6 및 9로부터) 노출-반응을 수행하였다. 이 방법은 약물 노출의 관점에서 PK 시험군이 PD 시험군과 유사하게 거동한다고 가정한다.
Emax 모델 (GraphPad Prism 6, 로그(효능제(agonist)) vs. 반응)을 사용하여 노출을 반응 데이터 (로그 변환된 약물 농도)와 상관시켰다. 힐 기울기(Hill Slope)를 1로 설정하였다. 모델 적합화된 EC10 내지 EC50 값이 일수 3, 6 및 9 중에서, Emax 추산치가 상이하였음에도 불구하고 (각각 Emax = -4.26%, -8.18% 및 -9.85%), 2배 이내에 있었음에 유의한다. 일수 9에서 일부 동물들은 또한, 잠재적인 ADA 형성으로 인해 약물 노출의 손실을 나타내었으며, 이에 따라, 일수 9 데이터에 기초한 E-R 파라미터 추산치는 주의해서 해석해야 한다.
먹이 섭취량, 체중, 글루코스 항상성, 및 간 지방 함량에 대한 FP2의 2주간의 노출 효과를 식이 유도 비만 수컷 C57Bl/6 마우스에서 평가하였다. 0.3 nmol/㎏ 처리군에 대해서는 1.7 내지 3.3 nM FP2, 1.0 nmol/㎏ 처리군에 대해서는 7.1 내지 14 nM, 3.0 nmol/㎏ 처리군의 처리군에 대해서는 20.8 내지 41.6 nM, 그리고 10 nmol/㎏ 처리군에 대해서는 28.5 내지 112.9 nM FP2의 트로프(trough) 노출을 본 연구의 PK 시험군에서 일수 9까지 유지하였다 (n = 2 또는 3, 표 49). 일수 9 후에는, 계속된 q3d 투여에도 불구하고 대부분의 동물에서 순환 수준의 감소가 관찰되었다 (표 49). 이러한 가속된 제거율과 일치되게, 본 연구의 PD 시험군 내의 대부분의 동물은 일수 15에서 FP2의 검출 불가능한 순환 수준을 가졌다 (표 50).
FP2 q3d에 의한 DIO 마우스의 처리는 비히클 처리와 대비하여 먹이 섭취량 (표 38), 체중 (표 39, 표 40 및 도 20) 및 식후 혈당 (표 43 및 도 23)을 감소시켰다. 먹이 섭취량의 유의한 감소가, 0.3 nmol/㎏의 경우에는 일수 2, 일수 5, 및 일수 8에서, 1.0 nmol/㎏의 경우에는 일수 1 내지 일수 7에서, 3.0 nmol/㎏의 경우에는 일수 1, 일수 2, 일수 4 내지 일수 6, 및 일수 8에서, 그리고 10.0 nmol/㎏의 경우에는 일수 1, 일수 3 내지 일수 6, 일수 8 및 일수 9에서 관찰되었다. % 체중 변화는, 0.3 nmol/㎏의 경우에는 일수 5 내지 일수 13, 1.0 nmol/㎏ 및 10.0 nmol/㎏의 경우에는 일수 3 내지 일수 13, 그리고 3.0 nmol/㎏의 경우에는 일수 4 내지 일수 13에서 유의하였다. 체중의 그램 변화는, 0.3 nmol/㎏의 경우에는 일수 8, 1.0 nmol/㎏의 경우에는 일수 6, 3.0 nmol/㎏의 경우에는 일수 7, 그리고 10.0 nmol/㎏의 경우에는 일수 5에서 유의하였다. 식후 혈당 수준의 감소는 3.0 nmol/㎏의 용량 수준의 동물의 경우에는 일수 7에서 유의하였으며, 3.0 및 10.0 nmol/㎏의 용량 수준의 동물의 경우에는 일수 13에서 유의하였다.
FP2 q3d로 처리된 DIO 마우스는 경구 글루코스 시험투여 동안 비히클 처리와 대비하여 일수 14에서 개선된 글루코스 내성을 가졌다 (표 41; 도 21a 및 도 21b). 글루코스는, 0.3 nmol/㎏ 그룹의 경우에는 30분에서, 1.0 nmol/㎏ 그룹의 경우에는 60분 및 120분에서, 3.0 nmol/㎏ 그룹의 경우에는 120분에서, 그리고 10.0 nmol/㎏ 그룹의 경우에는 30, 90, 및 120분에서 유의하게 더 낮았다. 총 곡선 아래 면적은 모든 용량군에 대하여 유의하였다. 글루코스 시험투여 동안의 인슐린 수준은 0.3 및 10.0 nmol/㎏ 그룹의 경우 30분에서 유의하게 더 낮았다 (표 42; 도 22a 및 도 22b). 게다가, 비히클 처리된 동물과 대비하여, 10.0 nmol/㎏의 FP2 q3d에 의한 14일의 처리 후에 DIO 마우스에서 계산된 공복 HOMA-IR에 있어서 유의한 감소가 있었는데, 이는 개선된 인슐린 감수성을 나타낸다 (표 44 및 도 24).
연구 시작 전 일수 -1에서 그리고 일수 13에서 MRI에 의해 신체 조성을 측정하였다 (표 47 및 표 48). 1.0 nmol/㎏ 및 10.0 nmol/㎏의 FP2로 처리된 DIO 마우스는 일수 13에서 체지방량의 유의한 감소를 가졌으며, 한편 어떠한 처리군에 대해서도 제지방량의 변화는 없었다. 일수 13에서, 10.0 nmol/㎏ 처리군은 비히클 처리군과 대비하여 % 제지방량의 유의한 감소 및 % 체지방량의 유의한 감소를 가졌다. 일수 -1에서 일수 13까지의 변화는, 0.3 nmol/㎏, 1.0 nmol/㎏, 및 10.0 nmol/㎏ 처리군에서 제지방량에 대해 유의하였으며, 1.0, 3.0, 및 10.0 nmol/㎏ 처리군에서 % 제지방량에 대해 유의하였다. 일수 -1에서 일수 13까지의 변화는 비히클과 대비하여 모든 처리군에서 체지방량 및 % 제지방량에 대해 유의하였다.
15일 동안 비히클 처리된 동물과 FP2 q3d로 처리된 마우스 사이에 내인성 마우스 GDF15 혈청 수준의 유의한 감소는 없었다 (표 46).
결론: 이들 결과는 더 높은 약물 노출이 일수 3, 6 및 9에서 연구 용량군에 걸쳐 집단 수준에서 기저선으로부터의 더 높은 % 중량 변화와 대체로 관련되어 있음을 시사한다.
DIO 마우스에서 2주에 걸친 FP2에 대한 노출은 감소된 먹이 섭취량, 감소된 체중, 감소된 혈당, 개선된 글루코스 내성 및 인슐린 감수성으로 이어졌다. 다수 날에 걸친 먹이 섭취량의 유의한 감소는 1.0, 3.0, 및 10.0 nmol/㎏ q3d에서 달성되었다. 체중은, 본 연구의 개시 후 3일에서 시작하여 5일까지 유의하게 감소되었다. 일수 13에서의 식후 혈당은 3.0 및 10.0 nmol/㎏의 FP2의 q3d 투여 후에 유의하게 감소되었다. 유의하게 감소된 공복 HOMA-IR로 나타낸 인슐린 감수성은 10.0 nmol/㎏ FP2가 q3d로 투여된 후 14일째에 달성되었다. 일수 13에서, 10.0 nmol/㎏ FP2로 q3d로 처리된 DIO 마우스에서, % 제지방량의 유의한 감소 및 % 체지방량의 유의한 감소가 관찰되었다.
[표 38]
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[표 39]
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[표 40]
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[표 41]
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[표 42]
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[표 43]
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[표 44]
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[표 45]
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[표 46]
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[표 47]
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[표 48]
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[표 49]
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[표 50]
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실시예 18: FP2 다중종 약동학적 특성 및 면역 반응
마우스 약동학적 특성
암컷 C57Bl/6 마우스에 피하 투여될 때, FP2의 약동학적 특성을 평가하였다. FP2를 PBS (pH 7.3 내지 7.5) 중 2.0 mg/㎏의 용량 수준으로 암컷 C57Bl/6 마우스 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sage Laboratories)에 피하 (시점당 샘플수 n = 5) 및 정맥내 (시점당 샘플수 n = 5) 투여하였다. 마지막 시점에서의 샘플의 수집을 말단 출혈(terminal bleed)을 통해 행하였다. 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 처리하고, 최대 168시간까지 약물 농도를 측정하였다. 면역검정 방법을 사용하여 FP2의 수준을 측정하였다. 혈장 중에서의 약물 농도 프로파일이 표 51 및 표 52에 요약되어 있고 도 25에 예시되어 있다.
C57Bl/6 마우스에서의 FP2의 약동학적 분석은 IV 및 SC 투여 후 각각 약 1.51 및 약 1.76일의 최종 반감기를 보여주었으며, 이때 평균 생체이용률은 SC 투여 후 약 61%였다.
[표 51]
Figure pct00052
[표 52]
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[표 53]
Figure pct00054
래트 약동학적 특성
FP2를 PBS (pH 7.3 내지 7.5) 중 2.0 mg/㎏의 용량 수준으로 암컷 스프라그-돌리 래트 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sage Laboratories)에 피하 (시점당 샘플수 n = 5) 및 정맥내 (시점당 샘플수 n = 5) 투여하였다. 마지막 시점에서의 샘플의 수집을 말단 출혈을 통해 행하였다. 혈액 샘플을 수집하고, 혈청을 처리하고, 최대 168시간까지 약물 농도를 측정하였다. 면역검정 방법을 사용하여 FP2의 수준을 측정하였다. 혈장 중에서의 약물 농도 프로파일이 표 54 및 표 55에 요약되어 있고 도 26에 예시되어 있다. 이들 데이터로부터 계산된 약동학적 파라미터가 표 56에 요약되어 있다.
스프라그 돌리 래트에서의 FP2의 약동학적 분석은 IV 및 SC 투여 후 각각 약 1.46 및 약 1.37일의 최종 반감기를 보여주었으며, 이때 평균 생체이용률은 SC 투여 후 약 28%였다.
[표 54]
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[표 55]
Figure pct00056
[표 56]
Figure pct00057
원숭이 약동학적 특성
FP2를 3 마리의 수컷 사이노몰거스 원숭이에, 각각 PBS (pH 7.0 내지 7.6) 중, 1 mg/㎏으로 피하 그리고 1 mg/㎏으로 정맥내 투여하였다. 혈액 샘플을 수집하고, 혈장을 처리하고, 최대 21일까지 약물 농도를 측정하였다.
사이노몰거스 원숭이에서 단회 용량 IV (1.0 mg/㎏) 및 SC (1.0 mg/㎏)의 투여 후 FP2의 약동학적 특성 (PK)을 특성화하였다. SC 투여 후의 혈장 약물 농도-시간 프로파일이 면역검정 및 LCMS 분석에 대해 각각 표 57 및 표 58에 그리고 IV 투여 후의 혈장 약물 농도-시간 프로파일이 면역검정 및 LCMS 분석에 대해 각각 표 59 및 표 60에 요약되어 있다. 면역검정 데이터는 도 27에 그래프로 나타나 있으며, LCMS 데이터는 도 28에 나타나 있다.
면역검정 분석으로부터의 결과를 사용하여, FP2에 대한 평균 NCA-기반 최종 반감기 (t1/2)는 IV 및 SC 투여 후 각각 약 7.05 및 약 8.51일이었다. IV 및 SC 투여 후의 평균 PK 파라미터가 표 61에 요약되어 있다. 면역검정 생물분석으로부터의 결과를 사용하여, FP2에 대한 평균 비구획 모델 추산 최종 반감기 (t1/2)는 IV 및 SC 투여 후 각각 7.05 및 8.51일이었다. FP2의 평균 생체이용률 (F%)은 SC 투여 후 사이노몰거스 원숭이에서 AUC0-last에 기초하여 약 98.5%인 것으로 추산되었고, AUC0-inf에 기초하여 약 109.2%인 것으로 추산되었다.
[표 57]
Figure pct00058
[표 58]
Figure pct00059
[표 59]
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[표 60]
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[표 61]
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인간 혈장 안정성 검정
37℃의 신선한 헤파린 첨가 혈장 중에서 최대 48시간 동안 FP2의 생체외 안정성을 검사하였다. 신선한 비동결 인간 혈장을 원심분리에 의해 2명의 대상체 (한 명은 남성이고 한 명은 여성임)로부터의 헤파린 첨가 혈액으로부터 생성하였다. FP2를 0, 4, 24 및 48시간 동안 온화하게 혼합하면서 37℃에서 이 기질 중에서 인큐베이션하였다. 면역검정 방법을 사용하여 FP2의 농도를 결정하였다. LCMS 방법에 후속하여 독립적인 면역친화성 포획을 사용하여, 검정 조건 하에서 이 기질 내에 존재하는 온전한 이량체의 농도를 정량화하였다.
면역검정 방법에서, 출발 농도로부터의 % 회수율은 104.8 내지 94.1의 범위이고 시간 경과에 따라 감소하지 않았는데, 이는 FP2가 생체외에서 최대 48시간 동안 인간 혈장 중에서 안정함을 입증한다 (도 29 및 표 62). LCMS 방법은 농도가 시간 경과에 따라 안정함을 보여주었는데, 이는 JNJ-64739090이 생체외에서 최대 48시간 동안 인간 혈장 중에서 온전한 이량체를 유지함을 입증한다 (도 30 및 표 63).
[표 62]
Figure pct00063
[표 63]
Figure pct00064
실시예 19: 사이노몰거스 원숭이에서의 FP1 및 FP2의 효능
나이브 사이노몰거스 원숭이에서의 단회 용량 후에 먹이 섭취량 및 체중에 대한 FP1 및 FP2의 효과를 평가하였다.
FP1을 나이브 사이노몰거스 원숭이의 코호트에 다음 3개의 용량 수준으로 피하 투여하였다: 1, 3 및 10 nmol/㎏. 비히클 처리군을 또한 포함시켰다. 동물들을 맹검 방식으로 처리하였다. 본 연구는 총 6주간 지속되었는데, 2주간은 기저선 먹이 섭취량 측정 및 데이터 수집을 행하였고, 4주간은 화합물의 단회 투여 후 데이터 수집을 행하였다. 투여 후 일수 1, 7, 14, 21, 및 28에서 혈장 약물 노출을 측정하였다.
FP1의 단회 용량에 의한 사이노몰거스 원숭이의 처리는 비히클 처리와 대비하여 먹이 섭취량 및 체중을 감소시켰다 (도 32 및 도 33). 일일 먹이 섭취량의 유의한 감소가, 10 nmol/㎏의 용량 수준에 대해 일수 4, 5, 6, 및 8 내지 12에서 관찰되었다 (도 32). 일일 먹이 섭취량의 주간 평균은 10 nmol/㎏의 용량 수준에 대해 투여 후 주수 2 동안 감소되었다. 3 nmol/㎏의 용량 수준은 투여 후 주수 2에서 투여 전의 평균 주간 먹이 섭취량으로부터 유의한 % 감소를 가졌으며, 10 nmol/㎏의 용량 수준은 투여 후 주수 1 및 2에서 투여 전의 평균 주간 먹이 섭취량으로부터 유의한 % 감소를 가졌다. 일수 0으로부터의 % 체중 변화의 유의한 감소가, 3 nmol/㎏의 용량 수준에 대해서는 일수 28에서, 그리고 10 nmol/㎏의 용량 수준에 대해서는 일수 14, 21, 및 28에서 관찰되었다 (도 33).
FP2를 나이브 사이노몰거스 원숭이의 코호트에 다음 3개의 용량 수준으로 피하 투여하였다: 1, 3 및 10 nmol/㎏. 비히클 처리군을 또한 포함시켰다. 동물들을 맹검 방식으로 처리하였다. 본 연구는 총 11주간 지속되었는데, 5주간은 기저선 먹이 섭취량 측정 및 데이터 수집을 행하였고, 1주간은 처리를 행하였고, 5주간은 세척 단계 데이터 수집을 행하였다. 투여 후 일수 1, 7, 14, 21, 28, 35, 및 42에서 혈장 약물 노출을 측정하였다.
FP2의 단회 용량에 의한 사이노몰거스 원숭이의 처리는 비히클 처리와 대비하여 먹이 섭취량 및 체중을 감소시켰다 (도 34 및 도 35). 일일 먹이 섭취량의 유의한 감소가, 3 nmol/㎏의 용량 수준에 대해서는 일수 3, 5 내지 8, 10 및 12에서, 그리고 10 nmol/㎏의 용량 수준에 대해서는 일수 3 내지 38 및 일수 40에서 관찰되었다 (도 34). 일일 먹이 섭취량의 주간 평균은 3 nmol/㎏의 용량 수준에 대해서는 투여 후 주수 1 동안 유의하게 감소되었고, 10 nmol/㎏의 용량 수준에 대해서는 주수 1 내지 6 동안 유의하게 감소되었다. 3 nmol/㎏의 용량 수준은 투여 후 주수 2에서 주간 평균 일일 먹이 섭취량에 있어서 투여 전주로부터 유의한 % 감소를 가졌으며, 10 nmol/㎏의 용량 수준은 투여 후 주수 1 내지 6에서 주간 평균 일일 먹이 섭취량에 있어서 투여 전주로부터 유의한 % 감소를 가졌다. 일수 0으로부터의 % 체중 변화의 유의한 감소가, 1 nmol/㎏의 용량 수준에 대해서는 일수 21 내지 42에서, 3 nmol/㎏의 용량 수준에 대해서는 일수 14 내지 42에서, 그리고 10 nmol/㎏의 용량 수준에 대해서는 일수 7 내지 42에서 관찰되었다 (도 34).
실시예 20: HSA-GDF15:GDF15 이종이량체
HSA-GDF15:GDF15 이종이량체의 생물활성을 조사하였다.
HSA-GDF15:GDF15 이종이량체를 생성하기 위하여, 2개의 작제물을 설계하였다. 제1 작제물은 글리신-세린 링커 (서열 번호 93)를 통해 성숙 GDF15 (AA 203-308)의 N-말단에 융합된 HSA를 함유하였다. 제2 작제물은 글리신-세린 링커 및 HRV3C 프로테아제 절단 부위 (서열 번호 94)를 통해 성숙 GDF15 (AA 197-308)의 N-말단에 융합된 6x 히스티딘 태그된 HSA를 함유하였다. 이들 플라스미드를 제조자의 프로토콜에 따라 Expi293™ 발현 시스템 (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 1:1 비로 공동-형질감염시켰다. 펩티드들은 이종이량체 및 동종이량체 형태 둘 모두를 포함한 HSA-GDF15 단백질로서 분비되었으며, 여기서 단량체들은 이황화물 결합에 의해 연결되었다.
일시적으로 형질감염된 Expi293™ 세포로부터의 세포 상층액을 형질감염 후 5일째에 수집하고, 원심분리에 의해 청징화하고, 멸균 여과하였다(0.2 μ PES 막, Corning). 청징된 상층액을 20 mM 인산나트륨, 500 mM NaCl (pH 7.4)로 평형화된 Histrap HP 컬럼 (GE Healthcare) 상에 로딩하였다. 로딩 후에, 평형 완충액으로 컬럼을 세척함으로써 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 이종이량체 및 동종이량체 형태 둘 모두를 포함한 HSA-GDF15 단백질은 컬럼에 결합되었으며, 20 mM 인산나트륨, 150 mM 이미다졸 (pH 7.4)로 용리하였다. 용리 분획을 풀링하고, 6x 히스티딘 태그된 HRV3C 효소 (Janssen)의 존재 하에서 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하여 HSA-GDF15:GDF15 이종이량체를 생성하였다. 인큐베이션 후에, 단백질 용액을 평형 완충액 내로 투석시켜, 이미다졸을 제거한 후, 한번 더 HisTrap HP 컬럼에 적용하였다. HSA-GDF15:GDF15 이종이량체는 20 mM 인산나트륨, 50 mM 이미다졸 (pH 7.4) 세척 단계에서 용리되었으며, 한편 히스티딘 태그된 단백질은 체류되었다. 이종이량체를 1x DPBS (pH 7.2) 중에서 평형화된 HiLoad 26/60 Superdex 200 pg 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)로 추가로 정제하였다. HSA-GDF15:GDF15 이종이량체의 (SDS-PAGE에 의해 결정된) 고순도를 갖는 SEC로부터의 용리 분획을 풀링하고 여과하였다. BioTek SynergyHT™ 분광광도계 상에서 280 nm에서의 흡광도에 의해 단백질 농도를 결정하였다. 정제된 단백질의 품질을 SDS-PAGE 및 분석용 크기 배제 HPLC (Ultimate3000 HPLC 시스템)에 의해 평가하였다. LAL 검정 (Pyrotell®-T, Associates of Cape Cod)을 사용하여 내독소 수준을 측정하였다. 정제된 단백질은 4℃에서 저장하였다.
GDF15 수용체 (GFRAL)를 안정하게 발현하는 SK-N-AS 세포 (ATCC)를 검정 24시간 전에 96웰 플레이트 내에서 성장 배지 (10% FBS) 중에 시딩(seeding)하였다. 24시간 후에, 37℃ 인큐베이터 내에서 3시간 동안 1% HI 말 혈청이 보충된 200 μl의 DMEM 배지로 배양 배지를 교체함으로써 세포를 기아 상태에 두었다. 이어서, 1% HI 말 혈청이 보충된 배지를 200 μl의 AB1로 교체하고, 37℃ 인큐베이터 내에서 추가 2시간 동안 인큐베이션하였다. 본 검정을 수행하기 위하여, AB1을 모든 웰로부터 흡인하고, AB2 중 가변 농도의 시험 화합물 100 μl를 첨가하고, 플레이트를 37℃ 인큐베이터 내에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 15분 후에, 시험 용액을 제거하고, 30 μl의 용해 완충액 (검출 키트 내에 제공됨)을 첨가하고, 플레이트 진탕기 상에서 실온에서 30분 동안 플레이트를 진탕하였다. 검출을 위하여, 16 μl의 용해된 샘플을 384웰 검정 플레이트에 옮기고, 4 μl의 HTRF pAKT 검출 항체를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 하룻밤 인큐베이션하고, 이어서 Envision (Perkin Elmer) 상에서 HTRF 신호를 판독하였다.
GraphPad Prism® 비선형 회귀(Nonlinear Regression) (곡선 적합)를 사용하여 EC50 값을 계산하였다. 데이터는 데이터 포인트당 3개의 반복시험물에 의한 3개의 별개의 실험으로부터 평균 ± 표준 오차 (SE)로 표현된다. HSA-GDF15:GDF15 이종이량체의 분자 정체가 질량 분석에 의해 확인되었다. 이종이량체 곡선의 좌측 이동은, HSA-GDF15:GDF15 이종이량체가 pAKT를 유도함에 있어서 추가의 알부민을 갖는 관련 동종이량체 분자보다 더 강력함을 시사하였다.
실시예 21: 링커 열안정성
HSA와 GDF15를 연결시키는 다양한 링커에 대하여 열안정성을 조사하였다. 단편 및 응집체에 대한 잠재성을 평가하기 위하여, 다양한 링커를 갖는 HSA-GDF15 융합 단백질을 10 mg/ml로 희석시켰다. EDTA 및 메티오닌의 첨가 후에, 샘플을 40℃에서 14일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 1 mg/ml의 농도로 희석시키고, 크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC) 하에서 평가하였다. 온전한 단백질뿐만 아니라 응집체 및 단편의 %를 이들 단백질에 대해 정량화하였다. 표 64는 AP 반복부로 이루어진 링커를 갖는 HSA-GDF15 단백질이 열응력 하에서 단편에 대해 가장 안정함을 나타낸다.
이들 링커가 GDF15와 그의 수용체의 상호작용에 영향을 주는지의 여부를 평가하기 위하여, GDF15 (Janssen) 및 HSA (미국 매사추세츠주 보스턴 소재의 Kerafast, Inc.)에 대한 단일클론 항체를 사용하여, 항-GDF15 또는 항-HSA 검출 및 플레이트 상에 코팅된 GFRAL-Fc 융합 단백질에 의한 면역검정을 수행하였다. 검정은 표 66에서의 모든 이들 링커 변이체가 수용체에 대한 유사한 결합성을 가짐을 보여주었다.
[표 64]
Figure pct00065
본 발명이 상세히 그리고 그의 구체적인 실시 형태를 참조하여 설명되어 있지만, 본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않고서 거기서 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
본 출원에서 언급된 서열이 하기 표에 제공된다:
WT ― 야생형
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SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. <120> GDF15 FUSION PROTEINS AND USES THEREOF <130> JBI5086WOPCT <150> US 62/333,886 <151> 2016-05-10 <160> 128 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HSA variant <400> 1 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 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660 caacggttcc cgaaggccga gttcgccgaa gtgtcgaagc tggtcaccga cctgacgaaa 720 gtgcacaccg aatgttgtca cggcgatctg ctggaatgcg ccgatgacag agccgatttg 780 gccaagtaca tctgcgaaaa ccaggacagc atttcgtcaa agctgaagga atgctgcgaa 840 aagcccttgc tggaaaagtc ccactgcatc gcggaagtgg agaacgacga gatgcccgcc 900 gacctcccgt ccctggccgc cgatttcgtg gagtcgaagg atgtgtgcaa gaactacgca 960 gaagccaagg acgtgttcct gggaatgttt ctgtatgagt acgcccgccg ccacccggac 1020 tactcggtcg tgctcctgct gcgactggca aagacctacg aaaccactct ggagaagtgc 1080 tgcgccgccg cggacccgca cgagtgctac gcaaaggtgt tcgacgagtt caagccactt 1140 gtcgaggagc ctcagaacct gatcaagcag aactgcgaac tgttcgagca gctgggagag 1200 tacaaattcc agaacgcgct tctcgtgcgc tacaccaaga aggtccccca ggtgtccact 1260 ccgaccctgg tggaagtgtc caggaacctg ggaaaggtcg gctccaagtg ttgcaagcat 1320 cccgaggcta agcgcatgcc ctgcgccgag gactacttgt ccgtggtgct gaatcagctg 1380 tgcgtgctcc atgaaaagac cccagtgtcc gacagagtga ccaagtgctg taccgaatcg 1440 ctcgtgaacc ggcggccgtg cttttccgca ctggaggtgg acgaaaccta cgtgccgaag 1500 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Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Glu Gly Lys Ser 580 585 590 Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Glu Gly Lys Ser Ser Gly 595 600 605 Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gly Gly Ser Asp His Cys Pro Leu 610 615 620 Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu 625 630 635 640 Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val 645 650 655 Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met 660 665 670 His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val 675 680 685 Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile 690 695 700 Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu 705 710 715 720 Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 725 <210> 128 <211> 2181 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein coding sequence <400> 128 gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60 gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt ccccatttga agatcatgta 120 aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180 aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240 cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300 tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360 gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420 gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480 tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540 aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600 gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660 cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720 gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780 gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840 aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900 gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960 gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020 tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080 tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140 gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200 tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260 ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320 cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380 tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca cgaaatgctg tacagaatcc 1440 ctcgtgaata gaaggccctg cttctctgcc cttgaggtgg acgagactta cgtccctaag 1500 gagtttaacg ccgagacctt tacttttcat gctgatattt gcaccctttc cgaaaaggag 1560 cggcagatca agaaacaaac agccttggtg gaactcgtaa aacataaacc caaagccacc 1620 aaggaacaac ttaaagctgt tatggatgac ttcgcagcct tcgtcgagaa atgttgcaag 1680 gcggatgata aggaaacgtg ttttgctgag gaagggaaga agttggttgc tgcctctcaa 1740 gcggctctgg ggcttggcgg atcagagggg aagtcctccg ggtccggtag cgagtccaaa 1800 tctacggaag ggaagtcatc cggttctggg tcagagtcca aatccacagg aggatcagac 1860 cattgcccat tgggaccagg acgatgttgt cgcctgcata cggtaagagc gtctctggag 1920 gatctcggct gggccgattg ggttctctca ccacgagaag tacaggtcac aatgtgcata 1980 ggagcttgtc cgagccaatt ccgggcggct aatatgcacg cacagatcaa gacctctttg 2040 caccgcttga agcccgatac cgtgccagca ccgtgttgcg tcccagcatc ttacaaccct 2100 atggttttga tacagaaaac tgacacaggt gtgagcctcc agacatatga tgatttgctg 2160 gctaaggatt gccactgtat a 2181

Claims (45)

  1. 융합 단백질로서,
    a. 반감기 연장 단백질,
    b. 링커(linker), 및
    c. GDF15 단백질을 포함하며,
    상기 융합 단백질은 N-말단에서 C-말단으로 (a)-(b)-(c)의 순서대로 배열되는, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 GDF15 단백질은 성숙 GDF15 단백질 또는 이의 기능적 변이체인, 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 GDF15 단백질은 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10 또는 11과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 GDF15 단백질은 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10 및 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반감기 연장 단백질은 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 이의 기능적 변이체인, 융합 단백질.
  6. 제5항에 있어서, 상기 반감기 연장 단백질은 서열 번호 1과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 반감기 연장 단백질은 서열 번호 1, 2 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 가요성 링커인, 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 링커는 서열 (GGGGS)n을 포함하며, 여기서 n은 2 내지 20인, 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 구조화된 링커인, 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 링커는 서열 (AP)n 또는 (EAAAK)n을 포함하며, 여기서 n은 2 내지 20인, 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 (GGGGA)n, (PGGGS)n, (AGGGS)n 또는 GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 2 내지 20인, 융합 단백질.
  13. 서열 번호 5, 25-30, 36-37, 40, 48, 55-56, 59-60, 64-75, 92, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 또는 127과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 서열 번호 5, 25-30, 40, 55-56, 59-60, 70, 92, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 및 127로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  16. 제15항에 있어서, 서열 번호 76-91, 95, 109, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 및 128과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 단리된 핵산 분자.
  17. 제16항에 있어서, 서열 번호 76-91, 95, 109, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 및 128로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 서열 번호 76-91, 및 95, 109, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 및 128로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 벡터.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 숙주 세포.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 생성하는 방법으로서,
    (1) 상기 융합 단백질이 생성되는 조건 하에서 상기 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (2) 상기 숙주 세포에 의해 생성된 상기 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  24. 대사 장애를 치료 또는 예방하는 방법으로서,
    제22항 또는 제23항의 약제학적 조성물의 유효량을 대사 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제2형 당뇨병, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신경병증, 심근 허혈성 손상, 울혈성 심부전, 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 대사 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 장애를 치료하는 방법으로서,
    서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  26. 제2형 당뇨병, 상승된 글루코스 수준, 상승된 인슐린 수준, 비만, 이상지질혈증, 당뇨병성 신경병증, 심근 허혈성 손상, 울혈성 심부전, 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 대사 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 장애를 치료하는 방법으로서,
    서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 이량체로서,
    2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 각각의 사슬은 N-말단에서 C-말단으로 HSA 영역, 링커, 및 GDF15 영역을 포함하며, 상기 HSA 영역은 서열 번호 1, 2, 또는 3과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 GDF15 영역은 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 이량체.
  28. 제27항에 있어서, 상기 HSA 영역은 서열 번호 1, 2, 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이량체.
  29. 제27항에 있어서, 상기 GDF15 영역은 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10, 및 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이량체.
  30. 제27항에 있어서, 상기 2개의 폴리펩티드 사슬은 이황화물 결합에 의해 연결되는, 이량체.
  31. 제27항에 있어서, 상기 HSA 영역과 상기 GDF15 영역은 폴리펩티드 링커에 의해 결합되는, 이량체.
  32. 제31항에 있어서, 상기 HSA 영역과 상기 GDF15 영역은 가요성 링커에 의해 결합되는, 이량체.
  33. 제32항에 있어서, 상기 폴리펩티드 링커는 서열 (GGGGS)n을 포함하며, 여기서 n은 2 내지 20인, 이량체.
  34. 제31항에 있어서, 상기 HSA 영역과 상기 GDF15 영역은 구조화된 링커에 의해 결합되는, 이량체.
  35. 제34항에 있어서, 상기 폴리펩티드 링커는 서열 (AP)n 또는 (EAAAK)n을 포함하며, 여기서 n은 2 내지 20인, 이량체.
  36. 제31항에 있어서, 상기 링커는 (GGGGA)n, (PGGGS)n, (AGGGS)n 또는 GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 2 내지 20인, 이량체.
  37. 이량체로서, (i) N-말단에 있는 제1 HSA 영역, 링커, 및 C-말단에 있는 제1 GDF15 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 (ii) 제2 GDF15 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 상기 HSA 영역은 서열 번호 1, 2, 또는 3과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제1 GDF15 영역은 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 GDF15 영역은 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 이량체.
  38. 제37항에 있어서, 상기 HSA 영역은 서열 번호 1, 2, 및 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이량체.
  39. 제37항에 있어서, 상기 GDF15 영역은 서열 번호 6, 7, 8, 9, 10, 및 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 이량체.
  40. 제37항에 있어서, 상기 링커는 (GGGGS)n, (AP)n, (EAAAK)n, (GGGGA)n, (PGGGS)n, (AGGGS)n 및 GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 2 내지 20인, 이량체.
  41. 제37항에 있어서, 상기 2개의 폴리펩티드 사슬은 이황화물 결합에 의해 연결되는, 이량체.
  42. 서열 번호 7, 8, 9, 10, 및 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  43. 서열 번호 96-108로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 핵산 분자.
  44. 서열 번호 96-108로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  45. 서열 번호 96-108로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는, 숙주 세포.
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