TW201803892A - Ｇｄｆ１５融合蛋白及其用途 - Google Patents
Ｇｄｆ１５融合蛋白及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TW201803892A TW201803892A TW106115164A TW106115164A TW201803892A TW 201803892 A TW201803892 A TW 201803892A TW 106115164 A TW106115164 A TW 106115164A TW 106115164 A TW106115164 A TW 106115164A TW 201803892 A TW201803892 A TW 201803892A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- fusion protein
- gdf15
- seq
- group
- linker
- Prior art date
Links
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 232
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 232
- 101000893549 Homo sapiens Growth/differentiation factor 15 Proteins 0.000 title claims abstract description 177
- 102100040896 Growth/differentiation factor 15 Human genes 0.000 title claims abstract description 171
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 52
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims abstract description 35
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 57
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 57
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 51
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 51
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 42
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 42
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 41
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 30
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 20
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 20
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 20
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 18
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 15
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims description 14
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims description 14
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 claims description 12
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 claims description 11
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 claims description 11
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 claims description 11
- 208000037906 ischaemic injury Diseases 0.000 claims description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 15
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 6
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 99
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 89
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 71
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 57
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 54
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 50
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 45
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 45
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 38
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 31
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 25
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 25
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 24
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 22
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 21
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 20
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 17
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 16
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 15
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N Rosiglitazone Chemical compound C=1C=CC=NC=1N(C)CCOC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 12
- 238000007410 oral glucose tolerance test Methods 0.000 description 12
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 12
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 10
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 9
- 235000018770 reduced food intake Nutrition 0.000 description 9
- 208000016261 weight loss Diseases 0.000 description 9
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 235000021316 daily nutritional intake Nutrition 0.000 description 8
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 8
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 7
- 230000000291 postprandial effect Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 7
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 7
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 102000046181 human GDF15 Human genes 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 6
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 229960004586 rosiglitazone Drugs 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 208000032928 Dyslipidaemia Diseases 0.000 description 4
- 208000017170 Lipid metabolism disease Diseases 0.000 description 4
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 241000238145 Cancer pagurus Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 235000020997 lean meat Nutrition 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 102220518385 Ciliogenesis and planar polarity effector 1_W32A_mutation Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 102100040304 GDNF family receptor alpha-like Human genes 0.000 description 2
- 101001038371 Homo sapiens GDNF family receptor alpha-like Proteins 0.000 description 2
- 102220603653 Integrin beta-1-binding protein 1_I89R_mutation Human genes 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101100392289 Mus musculus Gdf15 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- -1 aromatic amines Acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000007845 reactive nitrogen species Substances 0.000 description 2
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 2
- 231100000272 reduced body weight Toxicity 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 2
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000607 toxicokinetics Toxicity 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDUUKBXTEOFITR-BYPYZUCNSA-N 2-methyl-L-serine Chemical compound OC[C@@]([NH3+])(C)C([O-])=O CDUUKBXTEOFITR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 208000021959 Abnormal metabolism Diseases 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000011814 C57BL/6N mouse Methods 0.000 description 1
- 206010007572 Cardiac hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 206010013496 Disturbance in attention Diseases 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229940123457 Free radical scavenger Drugs 0.000 description 1
- 101150085449 Gdf15 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000000597 Growth Differentiation Factor 15 Human genes 0.000 description 1
- 108010041834 Growth Differentiation Factor 15 Proteins 0.000 description 1
- 241000167880 Hirundinidae Species 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000015580 Increased body weight Diseases 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 1
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 208000010886 Peripheral nerve injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 1
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 210000003486 adipose tissue brown Anatomy 0.000 description 1
- 210000000593 adipose tissue white Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- CDUUKBXTEOFITR-UHFFFAOYSA-N alpha-methylserine Natural products OCC([NH3+])(C)C([O-])=O CDUUKBXTEOFITR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 208000022531 anorexia Diseases 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- GCHPUFAZSONQIV-UHFFFAOYSA-N isovaline Chemical compound CCC(C)(N)C(O)=O GCHPUFAZSONQIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 1
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 1
- 230000002366 lipolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000006371 metabolic abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004783 oxidative metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 208000001076 sarcopenia Diseases 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001044 sensory neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 1
- 230000000476 thermogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000009602 toxicology test Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 230000009614 wildtype growth Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
- A61K38/1875—Bone morphogenic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
Abstract
所描述者係含有半衰期延長蛋白、連接子、及GDF15蛋白的融合蛋白。亦描述者係編碼融合蛋白之核酸、其重組細胞、包含融合蛋白之組成物、以及使用融合蛋白以治療或預防代謝疾病、病症或病況之方法。
Description
本發明係關於GDF15融合蛋白。具體而言，本發明係關於一種融合蛋白，其包含半衰期延長蛋白、連接子及GDF15蛋白；編碼該等融合蛋白之核酸及表現載體；其重組細胞；及醫藥組成物，其包含該等融合蛋白。亦提供者係產生融合蛋白及使用該等融合蛋白以治療代謝病症之方法。
GDF15(屬於TGFβ家族的成員)是在血漿中循環且為25kDa同二聚體(homodimer)的分泌蛋白。大多數個體內的血漿GDF15水平是在介於150與1150pg/ml之間的範圍內(Tsai等人，J Cachexia Sarcopenia Muscle.2012,3：239-243)。在受到損傷、心血管疾病、及某些類型的癌症之情況下，血漿GDF15水平會增加。此調升現象被認為係細胞保護機制。高血漿GDF15水平係相關於由於癌症以及腎臟和心臟衰竭中的厭食及惡病質所致之體重流失。在臨床試驗中，在肥胖的非糖尿病性對象中，GDF15水平是胰島素抗性的獨立預測因子(Kempf等人，Eur.J.Endo.2012,167：671-678)。在雙胞胎中的研究顯示，成對雙胞胎內的GDF15水平之差異與該對雙胞胎內的BMI差異具有相關性，此意味著
GDF15可作為能量恆定的長期調節劑(Tsai等人，PLoS One.2015,10(7)：e0133362)。
雖然GDF15已作為數種心血管及其他疾病狀態的生物標記而經大量研究，亦已描述GDF15於心肌肥厚症及缺血性損傷的保護性角色(Collinson,Curr.Opin.Cardiol.2014,29：366-371；Kempf等人，Nat.Med.2011,17：581-589；Xu等人，Circ Res.2006,98：342-50)。在第1型與第2型糖尿病的小鼠模型中，GDF15已顯示可在預防腎小管及組織間隙傷害的保護上扮演重要角色(Mazagova等人，Am.J.Physiol.Renal Physiol.2013；305：F1249-F1264)。已提出GDF15對年齡相關性感覺與運動神經元損失具有保護效應，且其改善周邊神經傷害之後的恢復情形(Strelau等人，J.Neurosci.2009,29：13640-13648；Mensching等人，Cell Tissue Res.2012,350：225-238)。事實上，GDF15基因轉殖小鼠顯示出具有較其同窩對照組長的壽命，其可指示此分子作用為長期存活因子(Wang等人，Aging.2014,6：690-700)。
已有許多報導證實，小鼠模型經過GDF15蛋白的治療，葡萄糖耐受性與胰島素敏感性有所改善。在過度表現GDF15的基因轉殖小鼠中，有二個獨立品系的小鼠體重與脂肪量降低，和葡萄糖耐受性改善(Johnen等人，Nat.Med.2007,13：1333-1340；Macia等人，PLoS One.2012,7：e34868；Chrysovergis等人，Int.J.Obesity.2014,38：1555-1564)。在GDF15基因轉殖小鼠中，已報導過全身能量消耗與氧化代謝的增加情形(Chrysovergis等人，2014,Id.)。這些情形伴隨著褐色脂肪組織的產熱基因表現增加，以及白色脂肪組織的脂解基因表現增加。缺乏GDF15基因的小鼠之體重及脂肪質量會增加(Tsai等人，PLoS One.2013,8(2)：e55174)。GDF15的Fc融合在肥胖石蟹獼猴模型中，經過為期六週的每週投予後，已顯示可減輕體重並改善葡萄糖耐受性以及胰島素敏感性(WO 2013/113008)。
GDF15對體重的效果被認為係透過減少攝食量及增加能量消耗而媒介。GDF15可經由體重依賴性與體重獨立性機制改善血糖控制。
綜觀此等現象，意味著GDF15水平增加可有利於代謝疾病治療。在所屬技術領域中，需要基於GDF15之組成物，該組成物可用於治療或預防代謝疾病、病症、或病況。
本發明提供GDF15之融合蛋白以滿足此需要，該等融合蛋白證實可增加溶解度/穩定性，並展現指示其等可用於治療或預防代謝疾病、病症、或病況之特徵。此類特徵包括例如經過投予根據本發明實施例之融合蛋白的對象減輕體重、增加葡萄糖耐受性、且改善胰島素敏感性。
在一個通常態樣中，本發明係關於一種融合蛋白，該融合蛋白包含：(a)半衰期延長蛋白、(b)連接子、及(c)GDF15蛋白，其中該融合蛋白係以(a)-(b)-(c)之順序自N端至C端配置。
在本發明之一實施例中，該GDF15蛋白係人類GDF15蛋白或其功能性變體。在具體實施例中，該GDF15蛋白包含成熟GDF15蛋白或其功能性變體。在更多具體實施例中，該GDF15蛋白包含與SEQ ID NO：6至11具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。在其他具體實施例中，該GDF15蛋白包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列，諸如選自由SEQ ID NO：6至11所組成之群組的胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，該半衰期延長蛋白係人類血清白蛋白(HSA)或其功能性變體。在具體實施例中，該半衰期延長蛋白包含與SEQ ID NO：1具有至少90%同一性的胺基酸序列。在其他具體實施例中，該半衰期延長蛋白包含選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，該連接子係柔性連接子(flexible linker)。在具體實施例中，該柔性連接子含有序列(GGGGS)n，其中n係2至20，較佳的是4至10。在本發明之另一實施例中，該融合蛋白之連接子係結構化連接子(structured linker)。在具體實施例中，該結構化連接子含有序列(AP)n或(EAAAK)n，其中n係2至20，較佳的是4至10。
在本發明之實施例中，該融合蛋白包含與SEQ ID NO：5、25至30、36至37、40、48、55至60、或64至75具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。在本發明之具體實施例中，該融合蛋白包含選自由SEQ ID NO：5、25至30、40、55至60、及70所組成之群組的胺基酸序列。在本發明之更多具體實施例中，該融合蛋白包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列。
在另一通常態樣中，本發明係關於一種單離核酸分子，該核酸分子編碼本發明之融合蛋白。
在另一通常態樣中，本發明係關於一種表現載體，該表現載體包含編碼本發明之融合蛋白的核酸分子。
在另一通常態樣中，本發明係關於一種重組宿主細胞，該重組宿主細胞包含編碼本發明之融合蛋白的核酸分子。
在另一通常態樣中，本發明係關於一種獲得本發明之融合蛋白之方法。該方法包含：(1)在產生該融合蛋白的條件下培養宿主細胞，該宿主細胞包含編碼該融合蛋白的核酸分子；及(2)回收由該宿主細胞產生的該融合蛋白。
在另一通常態樣中，本發明係關於一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含本發明之融合蛋白及醫藥上可接受之載劑。
在另一通常態樣中，本發明係關於一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含編碼本發明之融合蛋白的核酸分子及醫藥上可接受之載劑。
在另一通常態樣中，本發明係關於一種套組，該套組包含本發明之醫藥組成物。
在另一通常態樣中，本發明係關於一種治療或預防代謝疾病、病症、或病況之方法，該方法包含向有需要之對象投予治療或預防有效量的本發明之醫藥組成物。在一具體實施例中，醫藥組成物係經皮下或靜脈內投予至該對象。
根據本發明之實施例，一種治療有需要之對象的代謝病症之方法，該代謝病症係選自由第2型糖尿病、升高葡萄糖水平、升高胰島素水平、肥胖、異常血脂症、糖尿病性腎病變、心肌缺血性損傷、充血性心臟衰竭、或類風濕性關節炎所組成之群組，該方法包含向該對象投予治療有效量的醫藥組成物，該醫藥組成物包含：融合蛋白，其包含選自由SEQ ID NO：5、25至30、40、55至60、及70所組成之群組的胺基酸序列；及醫藥上可接受之載劑。在一具體實施例中，該方法包含向該對象投予治療有效量之包含含SEQ ID NO：60胺基酸序列之融合蛋白及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
本發明之其他態樣、特徵、及優點，自下文揭露(包括實施方式與其較佳實施例，以及附加之申請專利範圍)觀之，係顯而易見者。
前述發明內容以及下文實施方式在結合附圖閱讀時可更有利理解。應理解的是，本發明並不受限於圖式中所示確切實施例。
在圖式中：圖1A及1B顯示GDF15之晶體結構，其中第一與第二半胱胺酸殘基(C1-C2)的雙硫鍵配對在該蛋白之N端處形成環圈。
圖2顯示皮下投予根據本發明之實施例之融合蛋白，例如融合蛋白FP1(SEQ ID NO：60)及6xHis-FP1(SEQ ID NO：26，具有附接於N端的6xHis標籤)對於C57BL/6小鼠攝食量的效果，即呈現在投予後24小時的累積攝食量。直條內的數值係相較於媒劑(PBS)組的減少幅度+SEM(以%表示)；N=8隻動物/組，適用於所有組別，但以FP1 16nmol/kg組的N=9為例外。*-p<0.05，與媒劑相較；p值是利用單因子ANOVA及杜凱(Tukey)檢定進行多重比較而計算。
圖3顯示皮下投予FP1及6xHis-FP1(SEQ ID NO：26，具有附接於N端的6xHis標籤)對於SD大鼠(Sprague-Dawley rat)攝食量的效果，即呈現在投予後48小時的累積攝食量。直條內的數值係相較於媒劑(PBS)組的減少幅度+SEM(以%表示)；N=8隻動物/組。*-p<0.05，與媒劑相較；p值是利用單因子ANOVA及杜凱(Tukey)檢定進行多重比較而計算。
圖4顯示FP1治療期間膳食誘發肥胖(DIO)小鼠的體重變化。箭頭指示初始給藥(第0天)後皮下投予的時間(天數)；N=8隻動物/組。*-p<0.05，FP1 1nmol/kg組相較於媒劑時；#-p<0.05，FP1 10nmol/kg組相較於媒劑時；p值是利用二因子RM ANOVA及杜凱檢定進行多重比較而計算。
圖5A及5B顯示DIO小鼠經過為期14天的每3天(q3d)FP1給藥之後進行口服葡萄糖耐受性試驗(OGTT)期間的血糖水平，水平以曲線下面積表示。N=8隻動物/組。*-p<0.05，FP1 1nmol/kg組相較於媒劑時；p值是利用單因子ANOVA及杜凱檢定進行多重比較而計算。
圖6顯示DIO小鼠在FP1治療期間的餐後血糖水平。N=8隻動物/組。*-p<0.05，與媒劑相較；p值是利用二因子RM ANOVA及杜凱檢定進行多重比較而計算。
圖7顯示DIO小鼠在經過FP1治療14天後的4小時空腹的胰島素抗性之平衡模型評估(homeostatic model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)。N=8隻動物/組。*-p<0.05，與媒劑相較；p值是利用單因子ANOVA及杜凱檢定進行多重比較而計算。
圖8顯示ob/ob小鼠在經過每3天(qd3)FP1治療期間的體重變化。箭頭指示初始給藥(第0天)後皮下投予的時間(天數)；N=9隻動物/組。*-p<0.05，FP1 10nmol/kg組相較於媒劑時；#-p<0.05，FP1 1nmol/kg組相較於媒劑時；p值是利用二因子RM ANOVA及杜凱檢定進行多重比較而計算。
圖9顯示ob/ob小鼠在FP1治療期間的血糖水平。箭頭指示初始給藥(第0天)後皮下投予的時間(天數)；N=9隻動物/組。*-p<0.05，FP1 10nmol/kg組相較於媒劑時；#-p<0.05，FP1 1nmol/kg組相較於媒劑時；p值是利用二因子RM ANOVA及杜凱檢定進行多重比較而計算。
圖10顯示C57BI/6小鼠經過2mg/kg靜脈內(IV)與皮下(SC)投予之後，其FP1的血清藥物濃度-時間曲線平均值(±標準差(SD))。
圖11顯示SD大鼠經過2mg/kg IV與SC投予之後，其FP1的血清藥物濃度-時間曲線平均值(±SD)。
圖12顯示石蟹獼猴經過1mg/kg IV與SC投予之後，其依免疫檢定所測定的FP1之血清藥物濃度-時間曲線平均值(±SD)。
圖13顯示石蟹獼猴經過單次IV投予之後，其依免疫親和性(IA)捕捉LCMS分析所測定之隨時間的呈完整二聚體的血清FP1濃度(ng/mL)。
圖14顯示石蟹獼猴經過單次SC投予之後，其依免疫親和性捕捉LCMS分析所測定之隨時間的呈完整二聚體的血清FP1濃度(ng/mL)。
圖15顯示在獲自二名人類對象(Sub)的血漿中離體培養0、4、24、及48小時之後，依免疫檢定測定的FP1濃度，以開始濃度的%表示。
圖16顯示在獲自二名人類對象(Sub)的血漿中離體培養0、4、24、及48小時之後，依完整質量免疫親和性捕捉LCMS分析測定的呈完整二聚體之平均FP1濃度，以時間0的%表示。
圖17顯示對瘦小C57BL6N雄性小鼠投予GDF15的各種N端缺失變體前後的短時間攝食量。(SEQ ID NO：92、111、及112，相較於沒有缺失之野生型融合(SEQ ID NO：26，具有附接於N端的6xHis標籤))。N=8隻動物/組；*-p<0.05，與媒劑相較；p值是利用二因子RM ANOVA及杜凱檢定進行多重比較而計算。
圖18顯示FP2的單次給藥對C57BL/6小鼠攝食量的效果；確切而言，其顯示投予後24小時的累積攝食量。直條內的數值係相較於PBS組的減少幅度(平均值+SEM)，以%表示；N=8隻動物/組，適用於所有組別，但以6xHis-FP1組的N=6為例外。**-p<0.01，***-p<0.001，****-p<0.0001；p值是利用二因子ANOVA及鄧奈特(Dunnett)檢定進行多重比較而計算。
圖19顯示SD大鼠在FP2的單次劑量投予後24小時所測得的累積攝食量。直條內的數值係相較於PBS組的減少幅度(平均值+SEM)，以%表示；N=8隻動物/組。**-p<0.01，p值是利用二因子ANOVA及杜凱檢定進行多重比較而計算。
圖20顯示以FP2 q3d治療DIO小鼠的期間，其體重的變化百分比。箭頭指示FP2的皮下注射時間；N=6隻動物/組；*-p,0.05，與媒劑相較，利用二因子ANOVA及杜凱檢定進行多重比較；圖21A及21B顯示DIO小鼠經過為期14天的FP2 q3d給藥後進行OGTT試驗期間的血糖濃度水平之曲線下面積(AUC)。*-p<0.05，利用單因子ANOVA及杜凱多重比較檢定，採用n=8隻動物/組。
圖22A顯示DIO小鼠經過為期8天的FP2 q3d給藥後進行OGTT期間的血漿胰島素水平。*-p<0.05，媒劑與FP2(0.3nmol/kg)；FP2(10
nmol/kg)；及羅格列酮(Rosiglitazone)。#-p<0.05，與羅格列酮(10mg/kg)相較，利用二因子RM ANOVA及杜凱多重比較檢定。
圖22B顯示DIO小鼠經過為期8天的FP2 q3d給藥後進行OGTT期間的血漿胰島素水平之AUC。*-p<0.05，與媒劑相較；#-p<0.05，與羅格列酮相較。
圖23顯示DIO小鼠經過為期8天的FP2 q3d給藥後的餐後血糖水平。*-p<0.05，與媒劑相較，利用二因子RM ANOVA及杜凱多重比較檢定，n=8隻動物/組。
圖24顯示DIO小鼠經過為期14天的FP2 q3d治療且接著在第14天空腹5小時後的空腹HOMA-IR。*-p<0.05，與媒劑相較，利用單因子ANOVA及杜凱多重比較檢定，n=8隻動物/組。
圖25顯示C57Bl/6小鼠經過2mg/kg靜脈內(IV)與2mg/kg皮下(SC)投予後的血清FP2濃度。數值代表平均值±SD(n=每個時間點5個樣本)。
圖26顯示SD大鼠經過2mg/kg靜脈內(IV)與2mg/kg皮下(SC)投予後的血清FP2濃度。N=每個時間點5個樣本。
圖27顯示由免疫檢定分析之在石蟹獼猴中的血漿FP2濃度。數值代表平均值±SD，其中n=3，例外的是，第22天(528hr)IV採n=2。IV-靜脈內，SC-皮下。
圖28顯示由LCMS分析之在石蟹獼猴中呈完整二聚體的血漿FP2濃度。數值代表平均值±SEM，其中n=3，例外的是，168小時皮下(SC)採n=2，120小時與432小時SC採n=1，且168小時與432小時IV(靜脈內)採n=1。
圖29顯示由免疫檢定測得的人類血漿中FP2在48小時內的離體穩定性(標準化回復百分比)。
圖30顯示由完整LC/MS測得的人類血漿中FP2在48小時內的離體穩定性(標準化回復百分比)。
圖31顯示在表現重組人類GFRAL受體的SK-N-AS細胞中利用pAKT分析法所得FP2與HSA-GDF15：GDF15異二聚體(heterodimer)之濃度反應曲線(N=3)。
圖32顯示石蟹獼猴經過FP1的單次給藥前後的每日攝食量。*-p<0.05，針對10mg/kg的FP1，相較於媒劑。
圖33顯示石蟹獼猴經過FP1的單次給藥前後的體重變化百分比。*-p<0.05，針對10mg/kg FP1，與媒劑相較；#-p<0.05，針對3mg/kg，與媒劑相較，利用二因子RM ANOVA及杜凱多重比較檢定，n=8隻動物/組。
圖34顯示石蟹獼猴經過FP2的單次給藥前後的每日攝食量。*-p<0.05，與媒劑相較，利用二因子RM ANOVA及杜凱多重比較檢定，n=8隻動物/組。
圖35顯示石蟹獼猴經過FP2的單次給藥前後的體重變化百分比。*-p<0.05，針對10nmol/kg的FP2，與媒劑相較；#-p<0.05，針對3nmol/kg的FP2，與媒劑相較；&-p<0.05，針對1nmol/kg的FP2，與媒劑相較，利用二因子RM ANOVA及杜凱多重比較檢定，n=8隻動物/組。
各篇公開案、論文、及專利已於先前技術及整份說明書引用或描述；此等參考文獻之各者全文係以引用方式併入本文中。在本說明書中所包括之對於文件、行動、材料、裝置、物品、或其類似物的論述，目的在於提供關於本發明的脈絡。此等論述並非承認，任一或所有此等情事形成了關於任何所揭示或請求之發明的先前技術部分。
除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學用語，均與本發明有關技術領域中具有通常知識者所通常了解之意義相同。在其他方面，在本文中所使用的某些用語具有如本說明書所定之意義。在本文中所引用的所有專利、已公開專利申請案及公開案係以引用方式併入，猶如全文說明於本文中。必須注意的是，本文及附加之申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」皆包括複數指稱，除非上下文另有明確說明。
本發明係關於一種融合蛋白，該融合蛋白包含：(a)半衰期延長蛋白、(b)連接子、及(c)GDF15蛋白，其中該融合蛋白係以(a)-(b)-(c)之順序自N端至C端配置。
已發現的是，當根據本發明之實施例的融合蛋白包含半衰期延長蛋白、連接子、及GDF15蛋白時，其導致GDF15蛋白延長半衰期，且本發明之融合蛋白顯示有代謝效果，該等效果證實了彼等作為用於治療或預防代謝疾病、病症、或病況之治療劑時的適用性。此類效果包括(但不限於)經投予融合蛋白之動物減輕體重、增加葡萄糖耐受性、及改善胰島素敏感性。
如本文中所使用，用語「融合蛋白(fusion protein)」係指一種具有二或更多個共價連接在一起之部分的蛋白質，其中該等部分之各者係衍生自不同蛋白。
根據本發明之實施例的融合蛋白可包括任何GDF15蛋白。如本文中所使用，用語「GDF15蛋白(GDF15 protein)」係指任何天然發生的野生型生長分化因子15蛋白或其功能性變體。GDF15蛋白可來自任何哺乳動物，諸如人類或另一種合適的哺乳動物(諸如小鼠、兔、大鼠、豬、狗、或靈長類動物)。在具體實施例中，該GDF15蛋白係人類GDF15蛋白或其功能性變體。在較佳實施例中，該GDF15蛋白係成熟GDF15蛋白或其功能性變體。
如本文中所使用，用語「成熟GDF15蛋白(mature GDF15 protein)」係指GDF15的前原蛋白之部分，該部分是在RXXR弗林(furin)類似裂解位置發生細胞內裂解後自全長蛋白釋放。成熟GDF15蛋白經分泌成為由雙硫鍵連接之同二聚體(homodimer)。在本發明之一個實施例中，一種成熟GDF15蛋白，簡稱GDF15(197-308)(SEQ ID NO：6)，其含有全長人類GDF15蛋白之胺基酸197至308。
如本文中所使用，「功能性變體(functional variant)」係指一種親本蛋白(parent protein)的變體，該變體與該親本蛋白具有實質或顯著的序列同一性，且保留該親本蛋白之至少一種生物活性。親本蛋白之功能性變體可在考量到本揭露內容下利用所屬技術領域中已知手段製備。功能性變體可包括親本蛋白之胺基酸序列經一或多個修改者。該等修改可例如藉由改善多肽的熱穩定性、變更受質特異性、改變pH最佳化、以及其類似者，來改變多肽的物理化學特性。該等修改亦可變更親本蛋白的生物活性，只要彼等不會破壞或消除親本蛋白的所有生物活性。
根據本發明之實施例，親本蛋白之功能性變體包含親本蛋白經取代(較佳的是保守型胺基酸取代)者，該取代不會顯著影響親本蛋白之生物活性。保守型取代包括(但不限於)下列胺基酸之群組內的胺基酸取代：鹼性胺基酸(精胺酸、離胺酸、及組胺酸)、酸性胺基酸(麩胺酸及天冬胺酸)、極性胺基酸(麩醯胺酸及天冬醯胺酸)、疏水性胺基酸(白胺酸、異白胺酸、及纈胺酸)、芳族胺基酸(苯丙胺酸、色胺酸、及酪胺酸)、及小胺基酸(甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、及甲硫胺酸)。非標準或不自然胺基酸(諸如4-羥脯胺酸、6-N-甲基離胺酸、2-胺異丁酸、異纈胺酸、及α-甲基絲胺酸)亦可用來取代親本蛋白中的標準胺基酸殘基。
根據本發明之其他實施例，親本蛋白之功能性變體包含親本蛋白經缺失及/或插入一或更多個胺基酸者。例如，成熟GDF15蛋白之
功能性變體可包括成熟GDF15蛋白經缺失及/或插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多個胺基酸者，較佳的是成熟GDF15蛋白在N端處經缺失1至30個胺基酸者。
根據本發明之又其他實施例，親本蛋白之功能性變體包含親本蛋白經取代(較佳的是保守型胺基酸取代)者及經缺失及/或插入(較佳的是胺基酸之微小缺失及/或插入)者。
根據本發明之實施例，本發明之融合蛋白包含GDF15蛋白，該GDF15蛋白之胺基酸序列與成熟GDF15之胺基酸序列具有至少90%同一性，後者係諸如GDF15(197-308)(SEQ ID NO：6)；或者該GDF15蛋白之胺基酸序列與N端截短成熟GDF15之胺基酸序列具有至少90%同一性，後者係諸如GDF15(200-308)(SEQ ID NO：7)、GDF15(201-308)(SEQ ID NO：8)、GDF15(202-308)(SEQ ID NO：9)、GDF15(203-308)(SEQ ID NO：10)、或GDF15(211-308)(SEQ ID NO：11)。GDF15蛋白可具有SEQ ID NO：6、7、8、9、10、或11經取代、插入、及缺失之至少一者的序列，只要其維持該GDF15蛋白之至少一種生物活性，諸如其對於攝食量、血糖水平、胰島素抗性、及體重等的效果。
在具體實施例中，本發明之融合蛋白包含具有SEQ ID NO：11之胺基酸序列的GDF15蛋白，該蛋白包括(但不限於)SEQ ID NO：6、7、8、9、10、或11之胺基酸序列。
任何合適的半衰期延長蛋白均可用於根據本發明之實施例的融合蛋白。如本文中所使用，用語「半衰期延長蛋白(half life extension protein)」可係任何蛋白或其片段已知可延長其經融合而成之蛋白質之半衰期者。此類半衰期延長蛋白之實例包括(但不限於)：人類血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋白(Ig)之穩定片段域(Fc)、或輸鐵蛋白(Tf)。在本發明之實施例中，半衰期延長蛋白包含HSA或其功能性變體。在本發明之具體
實施例中，半衰期延長蛋白包含與SEQ ID NO：1具有至少90%同一性的胺基酸序列。在本發明之較佳實施例中，半衰期延長蛋白包含HSA或其功能性變體，其中在該HSA之位置34處的半胱胺酸殘基已經絲胺酸或丙胺酸置換。
在具體實施例中，本發明之融合蛋白包含半衰期延長蛋白，該半衰期延長蛋白具有選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列。
任何合適的連接子均可用於根據本發明之實施例的融合蛋白。如本文中所使用，用語「連接子(linker)」係指連接部分，其包含胜肽連接子。較佳的是，連接子有助於確保摺疊正確，盡量減少空間障礙，且不會對融合蛋白內各功能性組分的結構帶來顯著干擾。在本發明之一些實施例中，胜肽連接子包含2至120個胺基酸。例如，胜肽連接子包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、或120個胺基酸。
在本發明之實施例中，連接子增加融合蛋白組分的柔性。在本發明之具體實施例中，連接子可係包含序列(GGGGS)n之柔性連接子，其包括(但不限於)GS-(GGGGS)n或AS-(GGGGS)n-GT，其中n係2至20，諸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
在本發明之其他實施例中，連接子係經結構化。在本發明之具體實施例中，連接子可係包含序列(AP)n或(EAAAK)n之結構化連接
子，其包括(但不限於)AS-(AP)n-GT或AS-(EAAAK)n-GT，其中n係2至20，諸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在本發明之其他實施例中，連接子包含序列(GGGGA)n、(PGGGS)n、(AGGGS)n、或GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS，其中n係2至20。
在本發明之實施例中，融合蛋白包含與SEQ ID NO：5、25至30、36至37、40、48、55至56、59至60、或64至75具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。在本發明之具體實施例中，融合蛋白包含選自由SEQ ID NO：5、25至30、36至37、40、48、55至56、59至60、及64至75所組成之群組的胺基酸序列。在本發明之更多具體實施例中，融合蛋白包含選自由SEQ ID NO：5、25至30、40、55至56、59至60、及70所組成之群組的胺基酸序列。在本發明之進一步更多具體實施例中，融合蛋白包含SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：60、或SEQ ID NO：26之胺基酸序列。融合蛋白亦可在蛋白質之胺基或羧基末端處包括微小延伸，諸如促進純化進行的標籤，諸如多組胺酸標籤、抗原表位、或結合域。
在本文中所揭示之融合蛋白可在GDF15生物活性方面經表徵或評估，其包括(但不限於)對下列之效果：攝食量、口服葡萄糖耐受性試驗、血糖水平測量、胰島素抗性分析、體重變化、藥物動力學分析、毒物動力學分析、全長融合蛋白之水平與穩定性的免疫檢定與質譜分析、以及人類血漿離體穩定性分析。
本發明亦提供一種編碼本發明之融合蛋白的單離核酸分子。在本發明之實施例中，單離核酸分子編碼融合蛋白，該融合蛋白包含與SEQ ID NO：5、25至30、36至37、40、48、55至56、59至60、或64至75具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。在具體實施例中，單離核酸分子編碼融合蛋白，該融合蛋白包含選自由SEQ ID NO：5、25至31、36至37、40、48、55至56、59至60、及64至75所組成之群組的胺基酸序列。在更多具體實施例中，單離核酸分子編碼融合蛋白，該融合蛋白包
含選自由SEQ ID NO：5、25至30、40、55至56、59至60、及70所組成之群組的胺基酸序列。在進一步更多具體實施例中，單離核酸分子包含SEQ ID NO：76至91之核苷酸序列。
根據本發明之其他實施例，編碼融合蛋白之核酸分子可位於表現載體中。表現載體包括(但不限於)用於重組蛋白表現之載體、及用於輸送核酸進入對象體內以於該對象的組織中表現的載體(諸如病毒載體)。適合用於本發明的病毒載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體等。載體亦可係非病毒載體。非病毒載體之實例包括(但不限於)質體、細菌人工染色體、酵母菌人工染色體、噬菌體等。載體可包括任何用以建立表現載體之習知功能的元件，例如啟動子、核糖體結合區、終止子、增強子、篩選標記、或複製起始序列。
根據本發明之其他實施例，編碼融合蛋白之核酸分子可在考量到本揭露內容下利用所屬技術領域中已知方法，經密碼子最佳化以改善自所欲求宿主細胞(諸如人類腎臟胚胎上皮(HEK)細胞或中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)的重組表現。
本發明亦提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含編碼本發明之融合蛋白的核酸分子。宿主細胞包括(但不限於)用於重組蛋白表現之宿主細胞、及用於輸送核酸進入對象體內以於該對象的組織中表現的宿主細胞。適用於本發明之宿主細胞的實例包括(但不限於)HEK或CHO細胞。
在另一通常態樣中，本發明係關於一種獲得本發明之融合蛋白之方法。在一通常態樣中，該方法包含：(1)在產生融合蛋白的條件下培養宿主細胞，該宿主細胞包含編碼該融合蛋白的核酸分子；及(2)回收由該宿主細胞產生的該融合蛋白。可進一步利用所屬技術領域中已知的方法，純化融合蛋白。
在一些實施例中，融合蛋白可在宿主細胞中表現且自該等宿主細胞純化，純化方式是利用一或多種標準純化技術之組合，該等技術包括(但不限於)親和性層析、尺寸篩除層析、超過濾、及透析。較佳的是，融合蛋白經純化而不含任何蛋白酶。
本發明亦提供一種醫藥組成物，其包含本發明之融合蛋白及醫藥上可接受之載劑。
本發明進一步提供一種組成物，該組成物包含編碼本發明之融合蛋白的核酸分子及醫藥上可接受之載劑。當組成物包含編碼本發明之融合蛋白的核酸分子時，該等組成物可包含輸送載體，該載體用於引入核酸分子於細胞內以表現融合蛋白。核酸輸送載體之實例包括微脂體、生物相容性聚合物(包括天然聚合物及合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多醣、脂多醣、人工病毒套膜、金屬粒子，以及細菌、病毒(諸如桿狀病毒、腺病毒、及反轉錄病毒)、噬菌體、黏質體、質體、真菌載體、及其他所屬技術領域中一般使用之經描述用於各種真核宿主中表現的重組載體。
醫藥上可接受之載劑可包括下列之一或多者：醫藥上可接受之賦形劑、緩衝液、穩定劑、或其他所屬技術領域中具有通常知識者已知的材料。醫藥上可接受之載劑之實例包括(但不限於)下列之一或多者：水、鹽水、緩衝液、等張劑(諸如糖)、多元醇、輔助物質(諸如濕潤劑或乳化劑)、保存劑、以及其組合。此類材料應不具毒性，且應不會干擾活性成分於所使用劑量及濃度上之療效。載劑或其他材料的確切本質，取決於投予途徑，例如肌內、皮下、口服、靜脈內、皮膚、黏膜內(例如，消化道)、鼻內、或腹膜內途徑。例如，液體醫藥組成物通常包括液體載劑，諸如水、石油、動物或蔬菜油、礦物油或合成油。亦可包括生理鹽水溶液、葡萄糖(右旋)或其他醣類溶液、或二醇(例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。用於非經腸投予的組成物可以凍乾形式或於溶液中
儲存，且通常放入具有無菌出入孔的容器，諸如靜脈內注射溶液袋或所具栓塞可由皮下注射針頭刺穿的藥瓶。
根據本發明之實施例，醫藥組成物可包含一或多種額外組分，諸如另一種活性成分。
本發明亦關於一種包含本發明之醫藥組成物的套組。套組可含有一第一容器及一第二容器，該第一容器具有本發明之經乾燥融合蛋白，且該第二容器具有在投予至對象前要與該經乾燥融合蛋白混合之水溶液，或者套組可含有單個容器，該容器含有本發明之液體醫藥組成物。套組可含有本發明之醫藥組成物的單次劑量投予單元或多重劑量投予單元。套組亦可包括一或多個預填注射器(例如液體注射器及冷凍注射器)。套組亦可包含其使用說明書。該等說明書可說明套組所提供材料的用途與本質，且可依正在治療之確切代謝病症加以調整。
本發明亦關於本文中所描述之醫藥組成物的用途，其係用於治療或預防代謝疾病、病症、或病況，諸如第2型糖尿病、升高葡萄糖水平、升高胰島素水平、肥胖、異常血脂症、糖尿病性腎病變、心肌缺血性損傷、充血性心臟衰竭、或類風濕性關節炎。根據本發明之實施例，一種治療或預防有治療需要之對象的代謝疾病、病症、或病況之方法包含向該對象投予治療或預防有效量的本發明之醫藥組成物。在本發明之方法中，可使用本文中所述之任何醫藥組成物，其包括包含本發明之融合蛋白的醫藥組成物、或包含編碼該融合蛋白之核酸的醫藥組成物。
如本文中所使用，「對象(subject)」意指將會或已經藉由根據本發明之實施例的方法受到治療的任何動物，具體的是哺乳動物，最具體的是人類。如本文中所使用的用語「哺乳動物(mammal)」，其涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物之實例包括(但不限於)牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、兔、天竺鼠、非人類靈長類(NHP)(諸如猴或猿)、人類等，更具體的是人類。
「代謝疾病、病症、或病況(metabolic disease,disorder or condition)」係指任何與異常代謝相關的病症。可根據本發明之方法治療的代謝疾病、病症、或病況之實例，包括(但不限於)第2型糖尿病、升高葡萄糖水平、升高胰島素水平、肥胖、異常血脂症、糖尿病性腎病變、心肌缺血性損傷、充血性心臟衰竭、或類風濕性關節炎。
如本文中所使用的用語「治療/處理(treat/treating/treatment)」係指投予組成物至對象以在該對象中達到所欲求之治療或臨床成果。在一個實施例中，用語「治療/處理(treat/treating/treatment)」係指投予本發明之醫藥組成物以減少、減輕或減緩代謝病症的進展或發展，該代謝病症係諸如第2型糖尿病、升高葡萄糖水平、升高胰島素水平、肥胖、異常血脂症、糖尿病性腎病變、心肌缺血性損傷、充血性心臟衰竭、或類風濕性關節炎。
用語「治療有效量(therapeutically effective amount)」意指用於引發所欲生物或臨床效果的所需治療活性化合物之量。根據本發明之實施例，「治療有效量(a therapeutically effective amount)」係足以實現有利或所欲結果(包括臨床結果)之量。可採取一或多次投予來投予治療有效量。在疾病狀態方面，有效量係足以改善、穩定、或延遲疾病發展之量。根據本發明之特定實施例，治療有效量係用於治療或預防下列代謝疾病、病症、或病況的所需融合蛋白之量：諸如第2型糖尿病、升高葡萄糖水平、升高胰島素水平、肥胖、異常血脂症、糖尿病性腎病變、心肌缺血性損傷、充血性心臟衰竭、或類風濕性關節炎。
根據本發明之實施例，可在考量到本揭露內容下利用所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何方法，諸如肌內、皮下、口服、靜脈內、皮膚、黏膜內(例如，消化道)、鼻內、或腹膜內投予途徑，將本發明之醫藥組成物投予至對象。在具體實施例中，本發明之醫藥組成物係經由靜脈內注射或皮下注射投予至對象。
根據本發明之實施例投予醫藥組成物至對象的參數，諸如劑量、投予頻率、及投予持續時間，未受限於任何具體方式。此類參數的最佳化數值可取決於各種因素，諸如要治療的對象、要治療的具體代謝疾病、疾病的嚴重性、投予途徑等，且所屬技術領域中具有通常知識者將能夠判定適合此類參數的最佳化數值以達到所欲求之治療或臨床成果。例如，可每日一次，或者每日超過一次(諸如二次、三次、四次等)，投予醫藥組成物。一般劑量範圍係自約0.1μg/kg至高達約100mg/kg或更多的融合蛋白，此取決於各種因素，諸如上文所提及者。
具體實施例1係一種融合蛋白，其包含：(a)半衰期延長蛋白、(b)連接子、及(c)GDF15蛋白；其中該融合蛋白係以(a)-(b)-(c)之順序自N端至C端配置。
具體實施例2係根據具體實施例1之融合蛋白，其中該GDF15蛋白係人類GDF15蛋白或其功能性變體。
具體實施例3係根據具體實施例1之融合蛋白，其中該GDF15蛋白所包含的胺基酸序列與選自由SEQ ID NO：6至11所組成之群組的胺基酸序列具有至少90%同一性。
具體實施例4係根據具體實施例1之融合蛋白，其中該GDF15蛋白包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。
具體實施例5係根據具體實施例4之融合蛋白，其中該GDF15蛋白包含選自由SEQ ID NO：6至11所組成之群組的胺基酸序列。
具體實施例6係根據具體實施例1至5中任一者之融合蛋白，其中該半衰期延長蛋白包含人類血清白蛋白(HSA)或其功能性變體。
具體實施例7係根據具體實施例6之融合蛋白，其中該半衰期延長蛋白包含與SEQ ID NO：1具有至少90%同一性的胺基酸序列。
具體實施例8係根據具體實施例7之融合蛋白，其中該半衰期延長蛋白包含選自由SEQ ID NO：1至3所組成之群組的胺基酸序列。
具體實施例9係根據具體實施例1至8中任一者之融合蛋白，其中該連接子係柔性連接子。
具體實施例10係根據具體實施例9之融合蛋白，其中該連接子包含序列(GGGGS)n，其中n係2至20，諸如GS-(GGGGS)x8或AS-(GGGGS)x8-GT。
具體實施例11係根據具體實施例1至9中任一者之融合蛋白，其中該連接子係結構化連接子。
具體實施例12係根據具體實施例11之融合蛋白，其中該連接子包含序列(AP)n或(EAAAK)n，其中n係2至20，諸如AS-(AP)n-GT或AS-(EAAAK)n-GT。
具體實施例13係一種融合蛋白，其包含與SEQ ID NO：5、25至31、36至37、40、48、55至60、或64至75具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
具體實施例14係根據具體實施例13之融合蛋白，其包含選自由SEQ ID NO：5、25至31、36至37、40、48、55至60、及64至75所組成之群組的胺基酸序列。
具體實施例15係根據具體實施例14之融合蛋白，其包含選自由SEQ ID NO：5、25至3係、40、55至60、及70所組成之群組的胺基酸序列。
具體實施例16係一種單離核酸分子，其編碼具體實施例1至15中任一者之融合蛋白。
具體實施例17係一種單離核酸分子，其包含SEQ ID NO：76至91之核苷酸序列。
具體實施例18係一種表現載體，其包含具體實施例16或17之核酸分子。
具體實施例19係一種宿主細胞，其包含具體實施例16或17之核酸分子。
具體實施例20係產生具體實施例1至15中任一者之融合蛋白的方法，其包含(1)在產生該融合蛋白的條件下培養宿主細胞，該宿主細胞包含編碼該融合蛋白的核酸分子；及(2)回收由該宿主細胞產生的該融合蛋白。
具體實施例21係根據具體實施例20之方法，其中該回收步驟包含純化該融合蛋白以去除蛋白酶。
具體實施例22係一種醫藥組成物，其包含治療有效量的具體實施例1至15中任一者之融合蛋白及醫藥上可接受之載劑。
具體實施例23係一種醫藥組成物，其包含治療有效量的編碼具體實施例1至15中任一者之融合蛋白的核酸分子及醫藥上可接受之載劑。
具體實施例24係一種套組，其包含根據具體實施例22或23之醫藥組成物。
具體實施例25係一種治療或預防代謝病症之方法，其包含向有需要之對象投予有效量的根據具體實施例22及23中任一者之醫藥組成物。
具體實施例26係根據具體實施例25之方法，其中該代謝病症係選自由第2型糖尿病、升高葡萄糖水平、升高胰島素水平、肥胖、異常血脂症、糖尿病性腎病變、心肌缺血性損傷、充血性心臟衰竭、或類風濕性關節炎所組成之群組。
具體實施例27係根據具體實施例25或26之方法，其中該醫藥組成物係經皮下或靜脈內投予至該對象。
具體實施例28係一種治療有需要之對象的代謝病症之方法，該代謝病症係選自由第2型糖尿病、升高葡萄糖水平、升高胰島素水平、肥胖、異常血脂症、糖尿病性腎病變、心肌缺血性損傷、充血性心臟衰竭、或類風濕性關節炎所組成之群組，該方法包含向該對象皮下或靜脈內投予治療有效量的醫藥組成物，該醫藥組成物包含：融合蛋白，其包含選自由SEQ ID NO：5、25至30、40、55至60、及70所組成之群組的胺基酸序列；及醫藥上可接受之載劑。
具體實施例29係一種治療有需要之對象的代謝病症之方法，該代謝病症係選自由第2型糖尿病、升高葡萄糖水平、升高胰島素水平、肥胖、異常血脂症、糖尿病性腎病變、心肌缺血性損傷、充血性心臟衰竭、或類風濕性關節炎所組成之群組，該方法包含向該對象投予治療有效量之包含含SEQ ID NO：60胺基酸序列之融合蛋白及醫藥上可接受之載劑的醫藥組成物。
具體實施例30係根據具體實施例25至29中任一者之方法，其中該醫藥組成物係經皮下或靜脈內投予至該對象。
具體實施例31係具體實施例1至15中任一者之融合蛋白，其係用於治療或預防代謝病症，該代謝病症係選自由第2型糖尿病、升高葡萄糖水平、升高胰島素水平、肥胖、異常血脂症、糖尿病性腎病變、心肌缺血性損傷、充血性心臟衰竭、或類風濕性關節炎所組成之群組。
本發明的下列實例是要進一步說明本發明的本質。應了解的是，下文實例不會對本發明加以限制，且本發明之範疇應藉由附加之申請專利範圍來判斷。
如同其他TGFβ家族成員，GDF15經過合成為前原蛋白，該前原蛋白在內質網中形成二聚體且經歷弗林裂解以產生分泌成熟GDF15(胺基酸197至308)。分泌成熟GDF15同二聚體係約25k道耳吞，且各單體有潛力形成高達4個分子內雙硫鍵，其中以單個分子內雙硫鍵連接該同二聚體組分。
GDF15之晶體結構已於本發明中判定，且描繪於圖1A及1B中。如晶體結構所示，成熟GDF15的C端埋入二聚體界面，而N端則露出。此露出端可允許融合蛋白連接，諸如半衰期延長蛋白與GDF15之N端的連接。
晶體結構亦呈現GDF15半胱胺酸殘基的新穎雙硫鍵配對型態。當TGFβ1具有C1-C3與C2-C7配對(即，其第一與第三半胱胺酸殘基之間，以及其第二與第七半胱胺酸殘基之間的配對)時，GDF15具有C1-C2與C3-C7配對(參見圖1A及1B)。此獨特的雙硫鍵配對使得C1-C2配對形成環圈，該環圈位於蛋白之N端且遠離含有其他雙硫鍵的半胱胺酸結。該結構預測，GDF15之N端對於二聚體形成或整體蛋白摺疊可能不重要，且GDF15及其N端融合分子可承受屬於C1及C2缺失的N端缺失、C1-C2環圈內的殘基、或甚至C端至C2的殘基。
已評估HSA分子與GDF15分子之間的不同連接子。柔性連接子與結構化連接子兩者皆經過評估，該柔性連接子含有序列
(GGGGS)n，且該結構化連接子含有序列(AP)n或(EAAAK)n，其中n係2至20。
將包含不同連接子之融合蛋白，就彼等之生物物理特性、彼等對於瘦小小鼠攝食量之療效上效果、彼等之小鼠藥物動力學(PK)值、及彼等於人類血液中的離體穩定性方面，作出比較。所測試連接子變體的結果列示於表1。包含SEQ ID NO：31(其含有(EAAAK)8連接子)之分子，藉由HPLC顯示出聚集現象。表1中其餘七種連接子變體未展示出聚集現象。
亦藉由小鼠體內研究，並藉由人類全血及血漿樣本中的離體穩定性研究，評估此等變體的連接子穩定性。二種檢測形式係用來分析自此等研究得到的結果。採用抗GDF15捕捉與抗HSA檢測抗體配對的免疫檢定，測量位於連接子任一側的兩者分子存在情形，藉以評估該連接子的完整程度。藉由液相層析質譜術(LC-MS)分析，使用來自HSA與
GDF15的不同代表性胜肽(surrogate peptide)序列，分析較為廣泛的整體分子完整性狀況。經過48小時觀察，免疫檢定展示出所有連接子變體皆呈現穩定PK曲線，而且並未有任何連接子變體出現加標(spiked)血漿樣本濃度損失。LC-MS結果與免疫檢定一致，此顯示來自HSA與GDF15分子之不同部分的代表性胜肽係屬完整。由LC-MS利用代表性胜肽分析的連接子變體之PK曲線，其顯示出不同連接子變體的類似趨勢，其中彼等皆在第7天具有可檢測出之水平。表1中的所有變體，除了SEQ ID 31以外，皆具有所欲生物物理特性及PK值。
連接子變體的體內活性，是藉由進行瘦小小鼠的攝食量研究來評估。表2顯示連接子變體對於融合蛋白減少攝食量之療效上的影響。連接子對於療效存在了明確影響。就柔性(GGGGS)n連接子而言，其從2延長至4至8的連接子長度，即以驚人程度增加了融合蛋白療效。就更為剛性的(AP)n連接子而言，其趨勢較不明顯，這意味著融合蛋白內的GDF15分子自由度在其療效上扮演關鍵角色。
已設計重組蛋白，該重組蛋白的半衰期延長蛋白人類血清白蛋白經由連接子與GDF15之N端融合。此設計應可讓GDF15二聚化界
面持續不受干擾，且可形成自然的鏈間雙硫鍵連接，使得GDF15同二聚體與HSA的融合延伸自各GDF15分枝。利用此方法，僅需要單一基因來產生HSA-GDF15同二聚體。
天然人類血清白蛋白含有35個半胱胺酸(Cys,C)殘基，該等殘基形成17個雙硫鍵，其中Cys-34殘基係分子中僅有的游離殘基。此游離Cys-34已顯示可捕獲多種反應性氧物種(ROS)及反應性氮物種(RNS)，以作為自由基清除劑使用。因此，此游離Cys經過突變而將因氧化作用所招致的異質性風險降到最低。
HSA之位置34處的游離半胱胺酸經過突變而成為絲胺酸或丙胺酸，且具有HSA(C34S)或HSA(C34A)突變的GDF15融合分子經過了分析。兩者分子皆利用三步驟純化方法純化：(i)離子交換層析法、(ii)疏水性交互作用層析、及(iii)尺寸篩除層析。彼等開始產生時，HPLC分析顯示兩者分子已純化且沒有聚集(表3)。
然而，其產生後二週，含有HSA(C34A)突變的融合蛋白(包含SEQ ID NO：48)經由HPLC顯示有聚集，而含有HSA(C34S)突變的融合蛋白(SEQ ID NO：40)在四週後仍沒有聚集。
發明人所觀察到的是，在GDF15之胺基酸位置198的精胺酸殘基(R198)易在HSA-GDF15融合分子內受到蛋白酶降解。此類裂解結果會在異質群體中產生，且對治療組成物來說係非所欲。裂解現象可藉由
混合的蛋白酶抑制劑預防。純化方法已經過蛋白酶去除方面的探討。表4列出了二種類型的HSA親和性管柱，該等管柱經過了關於HSA-GDF15融合蛋白純化的測試，利用HPLC進行測量。進行純化時，藉由兩種方法所純化的HSA-GDF15融合蛋白具有100%純度及完整性。呈低濃度(2-5mg/ml)時，藉由兩種方法所純化的蛋白質可持續整個4週測試時期維持完整。然而，呈高濃度(40-50mg/ml)時，僅有抗體性HSA樹脂(CaptureSelect)所產生的不含蛋白酶之蛋白質，可持續整個4週測試時期維持完整。HSA-配體性樹脂(Albupure)所產生的蛋白質，其最初具完整性，但於高濃度儲存時則展示出會隨時間降解。當高濃度HSA-GDF15融合蛋白批次係利用Albupure樹脂純化時，則添加混合的蛋白酶抑制劑(PI)及EDTA，會完全抑制該批次的降解。因此，在產生穩定的治療組成物時，純化方法扮演了關鍵角色。在體內或離體情形下，並未觀察到對應的降解現象，此意味著，一旦製得不含蛋白酶的治療組成物，融合蛋白的降解不會成為體內情形下的問題。因此，可在生產期間有效去除潛在蛋白酶之純化方法，諸如該等使用CaptureSelect樹脂之方法，是成功製造均質、完整且穩定之GDF15治療劑的關鍵所在。
圖1A及1B中所描繪的GDF15晶體結構，其預測涉入缺失變體之GDF15之N端對於二聚體形成與整體蛋白摺疊並不重要。其亦預測到的是，此類N端缺失應不會影響到任何潛在的受體交互作用。包含各種GDF15之N端缺失的HSA-GDF15融合蛋白經過了關於體內活性的測試。
GDF15N端缺失變體在經過設計下，移除了於GDF15處的蛋白酶裂解位置(R198)。緊接在殘基R198之後，殘基N199-G200處有潛在脫醯胺位置，而且受質脫醯胺亦不利於治療組成物。GDF15之N端缺失可同時移除蛋白酶裂解位置與脫醯胺位置兩者。與HSA合併成為融合蛋白的所得GDF15缺失變體，其包括GDF15(201-308；SEQ ID NO：8)、GDF15(202-308；SEQ ID NO：9)、及GDF15(211-308；SEQ ID NO：11)。小鼠的體內研究顯示，GDF15之N端缺失變體在減少攝食量方面仍具活性(圖17)。經過實驗結果確認，此類GDF15之N端缺失變體具有恰當表現，形成適當二聚體，且於體內具有活性。
表5列出GDF15的十二種突變體，該等突變體係經製造以消除GDF15的體內活性且識別GDF15的功能性表位。突變體包括五種單突變體、二種雙突變體、及五種三突變體。包含此等突變之HSA-GDF15融合蛋白係在其等生物物理特性及活性方面經表徵(表5)。在12種突變體中，有一種並未表現，且有四種隨時間形成聚集，其指示突變中斷了蛋白摺疊及生物物理特性。在其餘七種突變體中，其中四種含有GDF15的單一突變，且在小鼠中測試此等突變體在相較於野生型下的攝食量減少情形。有三種單一突變體(I89R、I89W、及W32A)失去體內活性，而其餘突變體(Q60W)的活性同於野生型。此等結果指出，I89R、I89W、或W32A突變中斷了受體/輔受體與GDF15之交互作用，其意味著GDF15之
功能性表位係位在殘基I89與W32周圍。突變是根據融合蛋白中存在的成熟GDF15加以編號，例如，「1」係指成熟GDF15(SEQ ID NO：6)的第1個胺基酸，且「89」係指成熟GDF15的第89個胺基酸。
對於20ml及更多量的表現，表現過程是利用在Expi293TM Expression培養基中生長的HEK Expi293TM細胞進行。細胞是在37℃下生長，同時在125RPM與8% CO2的條件下振盪。使用Expi293TM Expression套組，以2.5×106個細胞/ml進行細胞轉導。以每公升的轉導細胞而言，將1mg的總DNA稀釋於25ml的Opti-MEM中，並將2.6ml的Expi293TM試劑稀釋於25ml的Opti-MEM中且在室溫下培養5分鐘。將稀釋DNA與
稀釋Expi293試劑組合，並在室溫下培養20分鐘。然後，將DNA錯合物加至該些細胞。將細胞置入振盪培養箱整夜。經過轉導之後的該天，將來自套組的5ml之Enhancer 1稀釋於來自套組的50ml之Enhancer 2，然後將總體積的二者Enhancer加至細胞。將轉導細胞放回培養箱4天，直到彼等經過收穫為止。將細胞在6,000g下離心30分鐘，藉此濃縮細胞，然後在進行純化步驟前用0.2um過濾器加以過濾。
亦在CHO細胞中完成表現。將質體純化並加以表徵。進行轉導前，將1等分試樣的200μg含HSA-GDF15之編碼區的質體DNA，藉由採Acl I之限制酶分解加以線性化。利用限制內核酸酶進行分解，確保胺芐青黴素抗性基因的移除。使用BTX ECM 830 Electro Cell Manipulator(Harvard Apparatus,Holliston,MA)，將二份15μg DNA等分試樣轉導入二份1×107CHO細胞(分配轉導儲集A與B)。在4mm間隙透光管中，在250伏特下，使用15毫秒脈衝長度與5秒脈衝間隔，對細胞進行電穿孔3次。使用搖瓶將轉導細胞轉移至MACH-1+L-麩醯胺酸，並將該等細胞培養1天。將轉導儲集A與轉導儲集B離心，重新懸浮於MACH-1+MSX，且轉移至搖瓶以培養6天。在電穿孔後第8天，將來自轉導儲集A與轉導儲集B的轉導HSA-融合蛋白產生細胞加以儲集且鍍覆於甲基纖維素中。
採用二步驟純化(使用CaptureSelect樹脂)及尺寸篩除層析。以每ml樹脂10mg蛋白質的大約交換容量，將來自短時間轉導Expi293TM細胞的細胞上清液裝載於經預平衡(PBS,pH 7.2)的HSA CaptureSelect管柱(購自ThermoFisher Scientific的CaptureSelect Human Albumin Affinity Matrix)。經過裝載之後，用10倍管柱體積(CV)的PBS(pH7.2)清洗管柱，藉以去除未結合的蛋白質。用10CV的2M MgCl2溶液
(於20mM Tris中，pH 7.0)，洗提結合於管柱的HSA-GDF15。將峰值流份加以儲集、過濾(0.2μ)，且在4℃下以PBS(pH 7.2)透析。經過透析之後，在裝載於26/60 Superdex 200管柱(GE Healthcare)之前，再次將蛋白質過濾(0.2μ)且濃縮成適當體積。當自尺寸篩除層析(SEC)管柱洗提的蛋白質流份具有高純度(由SDS-PAGE判定)時，將該等流份儲集。利用BioTek Synergy HTTM分光光度計於280nm之吸光度來測定蛋白質的濃度。利用SDS-PAGE與分析性尺寸篩除HPLC(SE-HPLC,Dionex HPLC system)，評估經純化之蛋白質品質。利用LAL分析法(Pyrotell®-T,Associates of Cape Cod)，測量內毒素水平。
採用二步驟純化(使用Albupure樹脂)及SEC。在室溫下純化HSA-GDF15融合蛋白，其過程使用了AlbuPure樹脂(ProMetic BioSciences Ltd)，該樹脂利用固定化合成三
配體以選擇性結合HSA。將表現上清液施加於AlbuPure樹脂。然後，先用4CV PBS(pH 7.2)清洗樹脂，隨後用4CV的緩衝液(50mM Tris pH 8.0,150mM NaCl)清洗該樹脂。用4CV的PBS pH 7.2緩衝液(含有100mM辛酸Na)，洗提結合於管柱的HSA-GDF15。使用30,000kDa截留分子量旋轉濃縮器(Amicon)，將含蛋白質流份濃縮成10mL體積，然後將該流份施加於26/60 Superdex S200pg管柱(GE)，其以PBS(pH 7.2)緩衝液平衡。含有HSA-GDF15同二聚體之SEC流份，係經由SDS-PAGE識別，且經儲集以進行分析。利用SDSPAGE及SE-HPLC評估蛋白質純度。
實例8至14、及19涉及本發明之例示性融合蛋白的表徵，該融合蛋白具有SEQ ID NO：60之胺基酸序列。此融合蛋白係完全重組蛋白，其存在的是HSA與成熟人類GDF15經由42個胺基酸連接子所融合的同二聚體，該連接子由甘胺酸與絲胺酸殘基(GS-(GGGGS)8)所組成。所預測的融合蛋白分子量係162,696道耳吞，且在HSA的位置34處之單個自然游離半胱胺酸已突變為絲胺酸。具體HSA-GDF15融合蛋白將僅以
「FP1」表示於下文實例中，以求簡化。FP1之6xHis標記變體(6xHis-FP1，SEQ ID NO：26)含有AS-(GGGGS)x8-GT連接子，該變體係於下文一些實例中供比較使用。
此實驗目的是要證實FP1對於C57Bl/6小鼠攝食量抑制的劑量反應效果。
雄性C57Bl/6小鼠持續最短72小時在BioDAQ籠中適應。然後，將小鼠基於先前24小時的攝食量分為六組，每組八隻。在4：00與5：00 pm之間，將動物稱重，並經由皮下注射給予媒劑或包含FP1之組成物。在注射後48小時期間，利用BioDAQ系統連續記錄各籠的食物重量變化。6xHis-FP1係於本研究中供比較使用。
結果(圖2及表6)以給定時間間隔的累積攝食量平均值表示。該等結果指出，在所有測試劑量與時間點上，FP1對C57Bl/6小鼠的皮下投予在相對於媒劑處理動物下，顯著地抑制攝食量。6xHis-FP1在8nmol/kg劑量下減少攝食量。
此實驗目的是要證實FP1對於SD大鼠攝食量抑制的劑量反應效果。
雄性SD大鼠持續最短72小時在BioDAQ籠中適應。然後，將大鼠基於先前24小時的攝食量分為六組，每組八隻。在4：00與5：00pm之間，將動物稱重，並經由皮下注射給予媒劑或包含融合蛋白之組成物。在注射後48小時期間，利用BioDAQ系統連續記錄各籠的食物重量變化。6xHis-FP1係於本研究中供比較使用。
結果示於圖3及表7。相較於媒劑處理動物，FP1在2.5nmol/kg與10nmol/kg之劑量下的皮下投予抑制了攝食量。只有在最高測試劑量(10nmol/kg)下，於投予後24與48小時，抑制現象才達到統計顯著性。FP1在8nmol/kg劑量下減少攝食量，且其在24與48小時的效果具有顯著性。
此實驗目的是要評估FP1對於DIO C57Bl/6小鼠在治療二週期間之攝食量、體重、及葡萄糖恆定的效果。
將雄性DIO小鼠稱重，且在第0、3、6、9、及12天，將FP1每三天(q3d)以2mL/kg進行皮下給藥。採類似方案，對媒劑與羅格列酮(Rosiglitazone)治療組進行PBS的給藥。對照組羅格列酮係以0.015%提供於膳食中任食。每日記錄小鼠體重及食物重量。使用血糖儀(One Touch®Ultra®,Lifescan,Milpitas,CA)測量葡萄糖。使用Bruker Mini-Spec LF110，進行時域NMR(TD-NMR)，藉以對有意識的小鼠定量其脂肪與瘦肉質量。進行口服葡萄糖耐受性試驗(OGTT)時，使小鼠空腹4小時。在2g/kg葡萄糖以10mL/kg餵食管口服投予後0、30、60、90、及120分鐘，經由剪尾巴來測量血糖。在葡萄糖投予後0、30、及90分鐘，測量胰島素。
在研究結束時，經由CO2吸入將小鼠安樂死，然後收集最終血液樣本。將血清置入濕冰上的96孔盤內，然後儲存於-80℃下。取出肝臟，根據製造商之說明書操作Bruker MiniSpec mq60以利用TD-NMR來評估在相對於肝臟切片之總質量下的脂肪含量。
根據空腹葡萄糖(以mg/dL表示)與胰島素(以mU/L表示)之乘積除以因子405，計算空腹的胰島素抗性之平衡模型評估(HOMA-IR)。
DIO小鼠經過1nmol/kg與10nmol/kg下的FP1 q3d治療，其減輕了體重(表8)且減少了攝食量(表9)。如下文所述，減少情形僅在某些時間點達到了統計顯著性。
對DIO小鼠給予1nmol/kg(第2至14天)與10nmol/kg(第1至14天)的劑量時，FP1減輕了體重(表8及圖4)。在1nmol/kg劑量下的第1及2天，以及在10nmol/kg劑量下的第1、8、及9天，出現顯著減少的攝食量(表9)。
在研究的第14天所進行的OGTT中，在所測試的全部三種劑量下，於時間0後所有時間點，FP1在相較於媒劑處理動物下顯著降低葡萄糖水平(表10)。以總曲線下面積(AUC)及△AUC對此進一步定量，則全部三種測試劑量在相較於媒劑下有顯著降低情形(表10，以及圖5A與5B)。
在研究開始時(第0天)、第7天、及第13天，測量餐後血糖水平(表11及圖6)。在研究的第13天，在1nmol/kg與10nmol/kg劑量下的FP1降低了血糖，其具統計顯著性。
就0.1nmol/kg劑量之FP1組而言，其OGTT期間的血漿胰島素水平於30分鐘時係顯著高於對應媒劑組，而1與10nmol/kg劑量之FP1組於相同時間點上則低於該媒劑組(表12)。如總AUC所測得，相較於媒劑組，0.1nmol/kg劑量之FP1組具較高的OGTT期間胰島素變化(表12)，而1與10nmol/kg劑量之FP1組則具較低變化。在兩者情況中，僅有在最低劑量下才達到統計顯著性。在90分鐘之時間點，經過1及10nmol/kg之FP1治療的小鼠具有較低的胰島素水平；然而，此效果並未達到統計顯著性。在研究的第14天測量HOMA-IR，其可作為胰島素敏感性的衡量指標。在此時間點，FP1在10nmol/kg下降低了HOMA-IR，或者改善了胰島素敏感性(表13及圖7)。
無論在任何劑量下，第13天所達到的體重減輕幅度，並未在絕對脂肪質量或脂肪質量百分比上得到可測量的變化(表14)。在10nmol/kg劑量下，絕對瘦肉質量有顯著減少。以瘦肉質量百分比表示時，並未觀察到此減少現象。在研究第15天進行最終屍體剖檢時，測量肝臟重量(表15)。在10nmol/kg劑量下，FP1減輕了絕對肝臟重量，以及以體重之百分比表示的肝臟重量。在1nmol/kg劑量下，已觀察到減輕情形，但此情形並未有任一參數達到統計顯著性。利用NMR進行活檢，藉此測量肝臟脂肪(表16)。在1與10nmol/kg劑量下，FP1融合蛋白減少
了肝臟脂肪含量，其以肝臟活檢重量的百分比表示。在較高劑量下，該減少現象具有顯著性。
此實驗目的是要在肥胖、高血糖、瘦素殘缺的ob/ob小鼠中，評估FP1對於彼等在八天治療期間之血糖水平與體重的效果。
將雄性ob/ob小鼠稱重，且在第0、3、及6天，將FP1每三天(q3d)以2mL/kg進行皮下投予。每日記錄小鼠體重及食物重量。每日使用血糖儀來測量葡萄糖。在研究結束時，將小鼠安樂死，然後收集最終血液樣本。
相對於媒劑處理小鼠，在1nmol/kg劑量之FP1下的ob/ob小鼠在第2天開始直到第8天，其顯著減輕了體重(以開始體重的百分比表示)。相對於媒劑處理小鼠，在10nmol/kg劑量之FP1下的ob/ob小鼠在第1天開始直到第8天，其減輕了體重(以開始體重的百分比表示)(表17及圖8)。
相對於媒劑處理小鼠，FP1在10nmol/kg劑量下，在研究第1及2天以及第4天直到第8天，降低了ob/ob小鼠的餐後血糖值。在1
nmol/kg下，已觀察到血糖下降；然而，此效果並未達到統計顯著性(表18及圖9)。
以於PBS(pH 7)中的2mg/kg IV與SC劑量，將FP1投予至雌性C57Bl/6小鼠。收集血液樣本，將血清加以處理，並在經過兩者投予途徑後長達7天測量藥物濃度。使用免疫檢定方法，測定FP1濃度。血清藥物濃度-時間曲線數據總結於表19及20，且描繪於圖10。
藥物動力學分析顯示，C57Bl/6小鼠經過SC與IV投予之後，FP1的終末半衰期各別係1.67與1.57天(表21)。FP1在經過SC投予後展示出~71%之平均生物利用率。
以於PBS(pH 7)中的2mg/kg IV與SC劑量，將FP1投予至雌性SD大鼠。收集血液樣本，將血清加以處理，並在經過兩者投予途徑後長達7天測量藥物濃度。使用免疫檢定方法，測定FP1濃度。血清藥物濃度-時間曲線數據總結於表22及23，且描繪於圖11。
藥物動力學分析顯示，SD大鼠經過SC與IV投予之後，FP1的終末半衰期各別係1.34與1.51天(表24)。FP1在經過SC投予後展示出~23%之平均生物利用率。
以於PBS(pH 7)中的1mg/kg IV與SC劑量，將FP1投予至原態(naïve)雄性石蟹獼猴(Macaca fascicularis)。收集血液樣本，將血清加以處理，並在經過兩者投予途徑後長達21天利用免疫檢定的生物分析來測量藥物濃度。血清藥物濃度-時間曲線數據總結於表25及26，且描繪於圖12。
藥物動力學分析顯示，石蟹獼猴各別經過SC與IV投予之後，FP1的終末半衰期係介於8.5與9.2天之間，且其在經過SC投予之後的平均生物利用率係~88%(表27)。
利用免疫親和性捕捉LCMS分析，對石蟹獼猴在經過IV與SC投予後的血清中所存在的完整二聚體濃度進行定量(表28與29，以及圖13與14)。此方法所測定的濃度與免疫檢定(IA)所測定的濃度類似，其展示出FP1在石蟹獼猴中呈完整二聚體下進行循環時，不具可檢測出的代謝傾向。
石蟹獼猴經過IV與SC投予之後的血清中分析物濃度，亦利用免疫親和性捕捉胰蛋白酶分解LC-MS/MS分析加以測量(表30及31)。所選胰蛋白酶肽，即ALV(ALVLIAFAQYLQQSPFEDHVK)、ASL(ASLEDLGWADWVLSPR)、及TDT(TDTGVSLQTYDDLLAK)，係分別位在FP1內接近HSA區之N端處、GDF15之N端、及GDF15之C端。該等胜肽係作為FP1之代表性胜肽而受到監測。所有代表性胜肽的濃度係彼此相近，且相近於由免疫檢定測量的濃度，其證實了體內FP1中的GDF15序列保持完整且連接至全HSA序列。
表31：石蟹獼猴經過單次SC投予之後，依免疫親和性捕捉胰蛋白酶分解LC-MS/MS分析所測定，代表FP1各區之代表性胜肽隨時間的血清濃度
此研究目的是要分析人體血漿中FP1的離體穩定性。將取自二名對象(一名男性與一名女性)的肝素抗凝血液，藉由離心方式產生新鮮的非冷凍人類血漿。在37℃下將FP1培養於此基質中，同時輕輕混合，如此持續0、4、24、及48小時。使用免疫檢定方法，測定FP1濃度。與開始濃度(0小時)的平均相差幅度百分比係自-4.1至-12.9之範圍，且並未隨時間增加，其證實了FP1在人類血漿中持續長達48小時具有離體穩定性(表32與圖15)。
在人類血漿中培養之後，利用免疫親和性捕捉LCMS定量完整二聚體的濃度。此方法所測定的濃度隨時間(0、4、24、及48小時)經過仍具穩定性，其展示出FP1在離體人類血漿中長達48小時保持完整二聚體(表33及圖16)。
將為動物及臨床樣本的抗藥物抗體(ADA)檢測，開發出免疫反應(IR)分析法。IR分析將會識別ADA陽性樣本，以將ADA狀態與藥物動力學/毒物動力學(PK/TK)結果作比較，且能夠評估FP1暴露量與藥物動力學。臨床IR分析法將用來篩選血清樣本，確認ADA陽性樣本的特異性，且測定ADA效價以確認陽性樣本。隨後的中和抗體(NAb)分析法開發將用於對第1期程序中來自ADA陽性對象的陽性樣本進行確認。另外，隨後判定ADA與內源性GDF15的交叉反應，以用於第二期程序。在首次應用於人體(first in human,FIH)的研究之前，將進行免疫原性風險評估，額外的免疫反應表徵分析可在彼等有正當理由時實施。
由於尚未發現關於GDF15的內源性標靶受體，因而缺乏關於FP1的活體外結合與功能性資料。然而，在大鼠、小鼠、及石蟹獼猴中的單次或多重劑量藥理與療效的研究已證實FP1在此等物種中的活性，顯示其減少攝食量、減輕體重、及調節口服葡萄糖耐受性的效果。根據療效結果，大鼠與猴子將分別屬於嚙齒與非嚙齒動物毒物學測試物種，且應了解的是，FP1在此等物種中對於其受體的內在效力(相較於在人類中的內在效力)尚未經過完全表徵。
實例15至19涉及本發明之另一種例示性融合蛋白的表徵，該融合蛋白描述於實例5，其具有SEQ ID NO：92(由核苷酸序列SEQ ID NO：92(密碼子最佳化1)及110(密碼子最佳化2)編碼)之胺基酸序列。此融合蛋白係完全重組蛋白，其存在的是HSA(C34S)與成熟人類GDF15之缺失變體(201-308；SEQ ID NO：8)經由42個胺基酸連接子所融合的同二聚體，該連接子由甘胺酸與絲胺酸殘基GS-(GGGGS)8所組成。在HSA的位置34處之單個自然游離半胱胺酸已突變為絲胺酸。具體HSA-GDF15融合蛋白將以「FP2」表示於下文實例中，以求簡化。
雄性C57Bl/6小鼠經過單次給藥後，評估FP2對於降低攝食量的能力。本研究使用了獲自Taconic Biosciences(Hudson,NY)的雄性C57Bl/6N小鼠(10至12週齡)。將小鼠單獨飼養在溫控空間內，提供12小時光暗循環(6 am/6 pm)，允許小鼠任意採食水及飼料。雄性C57Bl/6小鼠持續最短72小時在BioDAQ籠中適應；然後，將小鼠基於最後24小時的攝食量分為六組，每組八隻。在4：00至5：00 pm之間，將動物稱重，並經由皮下注射給予媒劑或化合物。在
化合物投予後48小時期間，利用BioDAQ系統連續記錄各籠的食物重量變化。6xHis-FP1係於本研究中作為對照組使用。
FP2對於所有測試劑量水平經過投予後12、24、及48小時的減少攝食量具有顯著效果(表34)。相對於PBS，小鼠在所有時間點以及在所有劑量水平下(表35)皆有以百分比變化表示的攝食量減少。
雄性SD大鼠經過單次給藥後，評估FP2對於降低攝食量與體重增加的能力。該等動物是在體重200-225g時獲自Charles River Labs(Wilmington,MA)，且在到達一週內使用。彼等係以每籠一隻飼養於溫控空間內，且提供12小時光暗循環，籠內鋪上ALPHA-dri墊草，且設有馴養用塑膠管。允許彼等任意採食水與實驗室嚙齒動物飼料，該飼料即照射過的Certified PicoLab® Rodent Diet 20,5K75*(由Purina Mills,St.Louis,MO.經由ASAP Quakertown,PA供應)。給藥前，為各別大鼠測量體重並加以記錄。
動物持續最短72小時在BioDAQ籠中適應；然後，將大鼠基於最後24小時的攝食量分為六組，每組八隻。在4：00至5：00 pm之間，將動物稱重，並經由皮下注射給予媒劑或化合物。在化合物投予後48小時期間，利用BioDAQ系統連續記錄各籠的食物重量變化。6XHis-FP1係於本研究中作為對照組使用。
經過FP2的單次給藥後，已測得攝食量的劑量依賴性減少。在0.3nmol/kg的劑量下，未觀察到攝食量的顯著差異。在1nmol/kg下，已觀察到12小時(但未在24或48小時)的攝食量減少
有顯著效果。在3及10nmol/kg劑量水平下，已觀察到所有時間點的攝食量皆有顯著減少(表36、圖19)。相對於PBS，在所有時間點以及在所有劑量水平下(表37)皆有以百分比變化表示的攝食量減少。
雄性DIO之C57Bl/6小鼠在8天期間經過重複給藥，評估FP2對於減少攝食量與體重且改善葡萄糖恆定的能力。本研究使用了獲自Taconic Biosciences(Hudson,NY)的雄性DIO之C57Bl/6小鼠(21週齡，高脂採食15週)。將小鼠單獨飼養在溫控空間內，提供12小時光暗循環(6 am/6 pm)，允許小鼠任意採食水及Research Diet D12492(Research Diets,New Brunswick,NJ)。實驗進行前，讓小鼠在小鼠空間中適應>1週。研究終點係攝食量、體重、體組成、及血糖終點(OGTT、血糖)的測量值。給藥前一天，將動物稱重，並按體重(BW)分組。藉由皮下注射對小鼠給藥。經過FP2給藥的動物是在第0天、第3天、第6天、第9天、及第12天接受此化合物。媒劑組及羅格列酮組也在這幾天接受無菌PBS(採SC)。Rosliglitazone係以0.015% w/w提供於膳食中任食。在十五天期間，每日記錄BW及攝食量。在第0、7、及13天，測量血糖。在第14天，進行口服葡萄糖耐受性試驗(OGTT)。在OGTT期間，在所選時間點上測量胰島素水平。在第15天，使用CO2將小鼠安樂死，且經由心臟穿刺收集最終血液樣本以分析暴露量。運行另外的PK小組，其中每個劑量組為三隻小鼠，總共15隻小鼠。
在獲得藥物動力學(PK)樣本時的最後一個研究日，藥效學(PD)(療效)小組中的大多數動物不具可檢測出的藥物濃度，這可能歸因於免疫原性。因此，採用PK小組的平均PK曲線(而不是PD小組的個別PK)來實施在對應劑量水平下，PD小組自基線之重量變化%的暴露反應(各別自第3、6、及9天起)。此方法假定，PK小組在藥物暴露方面的表現與PD小組類似。
使用Emax模型(GraphPad Prism 6，對數(促效劑)相對於反應)來建立暴露與反應數據的相關性(對數轉換藥物濃度)。Hill Slope(最大斜度)設定為1。應注意的是，在第3、6、及9天之中模型擬合的EC10至EC50值係在二倍之內，儘管Emax估計值有所不同(各別Emax=-4.26%、-8.18%、及-9.85%)。在第9天，有些動物亦顯示出藥物暴露喪失，其歸因於潛在ADA形成，因此根據第9天數據的E-R參數估計值應謹慎判讀。
在膳食誘發肥胖的雄性C57Bl/6小鼠中，已評估二週FP2暴露對於攝食量、體重、葡萄糖恆定、及肝臟脂肪含量的效果。在研究的PK小組(n=2或3)中，在第9天前的谷值暴露量在0.3nmol/kg治療組中維持於1.7與3.3nM FP2之間，在1.0nmol/kg治療組中維持於7.1與14nM之間，在3.0nmol/kg治療組中維持於20.8與41.6nM之間，且在10nmol/kg治療組中維持於28.5與112.9nM FP2之間(表49)。在第9天後，大部分動物即使持續接受q3d給藥，仍觀察到循環水平降低(表49)。與此種加快清除現象一致的是，研究中PD小組的大部分動物在第15天時未達到可檢測出的FP2循環水平(表50)。
相較於媒劑處理，DIO小鼠用FP2 q3d治療會減少攝食量(表38)、體重(表39、40，以及圖20)、及餐後血糖(表43及圖23)。在0.3nmol/kg組的第2天、第5天、及第8天，1.0nmol/kg組的第1天至第7天，3.0nmol/kg組的第1天、第2天、第4天至第6天、及第8
天，及10.0nmol/kg組的第1天、第3天至第6天、第8天、及第9天，出現攝食量顯著減少情形。0.3nmol/kg組的第5天至第13天、1.0nmol/kg與10.0nmol/kg組的第3天至第13天、及3.0nmol/kg組的第4天至第13天，具顯著的體重變化百分比。0.3nmol/kg組自第8天起，1.0nmol/kg自第6天起，3.0nmol/kg自第7天起，及10.0nmol/kg組自第5天起，具有顯著的體重克數變化。3.0nmol/kg劑量水平下的動物在第7天，以及3.0與10.0nmol/kg劑量水平下的動物在第13天，其餐後血糖水平顯著降低。
相較於媒劑處理，在口服葡萄糖挑激期間，用FP2 q3d治療的DIO小鼠在第14天具有改善的葡萄糖耐受性(表41；圖21A及21B)。0.3nmol/kg組在30分鐘時，1.0nmol/kg組在60分鐘及120分鐘時，3.0nmol/kg組在120分鐘時，及10.0nmol/kg組在30、90、及120分鐘時，具有顯著較低的葡萄糖。所有劑量組皆有顯著的總曲線下面積。0.3及10.0nmol/kg組的葡萄糖挑激期間胰島素水平在30分鐘時顯著較低(表42；圖22A及22B)。此外，相較於媒劑處理動物，DIO小鼠在經過10.0nmol/kg劑量下FP2 q3d治療14天後的所計算空腹HOMA-IR有顯著減少，此表示胰島素敏感性有所改善(表44及圖24)。
在研究開始前的第-1天，以及第13天，利用MRI測量體組成(表47及表48)。在1.0nmol/kg下與在10.0nmol/kg下經過FP2治療的DIO小鼠，其等在第13天時的脂肪質量顯著降低；而並未有任何治療組發生瘦肉質量變化。在第13天，10.0nmol/kg治療組在相較於媒劑處理組下，其瘦肉質量百分比顯著增加，且其脂肪質量百分比顯著減少。在第-1天至第13天，0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、及10.0nmol/kg治療組具有顯著的瘦肉質量變化，且1.0、3.0、及10.0nmol/kg治療組具有顯著的瘦肉質量百分比變化。所有治療組在相較於媒劑下，皆在第-1天至第13天有顯著的脂肪質量變化與瘦肉質量百分比變化。
媒劑處理動物與15天FP2 q3d治療小鼠之間，沒有顯著的內源性小鼠GDF15血清水平差異(表46)。
結論：結果意味著，在第3、6、及9天，跨及所研究劑量組的群體水平，愈高的藥物暴露量，通常與愈大的自基線的重量變化%有關聯。
DIO小鼠於二周期間暴露於FP2，導致攝食量減少、體重減輕、血糖降低、葡萄糖耐受性改善、及胰島素敏感性。在1.0、3.0、及10.0nmol/kg q3d下，經過多天的攝食量可達到顯著減少。研究開始之後三至五天，體重開始顯著減輕。FP2在3.0與10.0nmol/kg下進行q3d投予後，第13天的餐後血糖顯著降低。經過10.0nmol/kg下FP2 q3d投予後14天，達到顯著降低的空腹HOMA-IR所表示的胰島素敏感性。在第13天，經過10.0nmol/kg下FP2 q3d治療的DIO小鼠中，已觀察到瘦肉質量百分比顯著增加且脂肪質量顯著減少。
表40：FP2對於13天治療期間體重變化(g)之效果
表44：DIO小鼠在經過FP2 q3d治療14天後的空腹HOMA-IR
表46：DIO小鼠經過FP2 q3d治療15天後的血清小鼠GDF15(pg/mL)水平
FP2在經皮下投予至雌性C57Bl/6小鼠時，評估其藥物動力學特性。在於PBS(pH 7.3至7.5)中2.0mg/kg的劑量水平下，將FP2
分別以皮下(n=每個時間點5個樣本)與靜脈內(n=每個時間點5個樣本)投予至雌性C57Bl/6小鼠(Sage Laboratories,St Louis,MO)。在最後時間點的樣本收集是經由最終出血程序。收集血液樣本，將血清加以處理，並長達168小時測量藥物濃度。使用免疫檢定方法，測量FP2水平。血漿中的藥物濃度曲線數據總結於表51及52，且描繪於圖25。
在C57Bl/6小鼠中的FP2之藥物動力學分析展示，經過IV與SC給藥後的終末半衰期各別係~1.51及~1.76天，且在經過SC投予之後的平均生物利用率係~61%。
表53：C57Bl/6小鼠經過2mg/kg IV與2mg/kg SC投予之後的FP2藥物動
在於PBS(pH 7.3至7.5)中的2.0mg/kg劑量水平下，將FP2分別以皮下(n=每個時間點5個樣本)與靜脈內(n=每個時間點5個樣本)投予至雌性SD大鼠(Sage Laboratories,St.Louis,MO)。在最後時間點的樣本收集是經由最終出血程序。收集血液樣本，將血清加以處理，並長達168小時測量藥物濃度。使用免疫檢定方法，測量FP2水平。血漿中的藥物濃度曲線數據總結於表54及55，且描繪於圖26。自此等數據計算的藥物動力學參數總結於表56。
在SD大鼠中的FP2之藥物動力學分析展示，經過IV與SC給藥後的終末半衰期各別係~1.46及~1.37天，且在經過SC投予之後的平均生物利用率係~28%。
各組三隻雄性石蟹獼猴，係各別在1mg/kg下經皮下投予與在1mg/kg下經靜脈內投予於PBS(pH 7.0至7.6)中的FP2。收集血液樣本，將血漿加以處理，並長達21天測量藥物濃度。
石蟹獼猴經過單次劑量的IV(1.0mg/kg)與SC(1.0mg/kg)投予後，將FP2的藥物動力學(PK)加以表徵。血漿藥物濃度-時間曲線，其在SC投予後的免疫檢定及LCMS分析之數據各別總結於表57及58，而
其在IV投予後的免疫檢定及LCMS分析數據總結於表59及60。免疫檢定數據以圖形表示於圖27中，且LCMS數據表示於圖28中。
使用自免疫檢定得到的結果時，FP2經過IV與SC給藥後平均的根據NCA之終末半衰期(t1/2)各別係~7.05與~8.51天。IV與SC投予後的平均PK參數總結於表61。使用免疫檢定的生物分析結果時，FP2經過IV與SC給藥後平均的非房室模型估計之終末半衰期(t1/2)各別係7.05與8.51天。石蟹獼猴經過SC投予後，FP2之平均生物利用率(F%)在根據AUC0-最後時的估計值係~98.5%，且在根據AUC0-無限時的估計值係~109.2%。
在37℃下，持續長達48小時，檢查FP2在新鮮肝素抗凝血漿中的離體穩定性。將取自二名對象(一名男性與一名女性)的肝素抗凝血液，藉由離心方式產生新鮮的非冷凍人類血漿。在37℃下將FP2培養於此基質中，同時輕輕混合，如此持續0、4、24、及48小時。使用免疫檢定方法，測定FP2濃度。採用獨立的免疫親和性捕捉法，以及隨後的LCMS方法，在分析條件下定量此基質中存在的完整二聚體之濃度。
採用免疫檢定方法時，佔開始濃度的回復百分比係自104.8至94.1之範圍，且並未隨時間降低，其證實了FP2在人類血漿中持續長達
48小時具有離體穩定性(圖29與表62)。LCMS方法顯示，濃度隨時間經過呈穩定狀態，其證實了JNJ-64739090在離體人類血漿中長達48小時保持完整二聚體(圖30與表63)。
在原態石蟹獼猴中，評估單次給藥後FP1與FP2對其攝食量及體重的效果。
以三種劑量水平，將FP1皮下投予至原態石蟹獼猴分群(cohort)：1、3、及10nmol/kg。亦納入媒劑處理組。該等動物是在盲化條件下接受治療。持續總共6週的研究：2週的基線攝食量測量與數據收
集、4週的化合物單次給藥後數據收集。給藥後，接著在第1、7、14、21、及28天測量血漿藥物暴露量。
相較於媒劑處理，石蟹獼猴經過FP1單次給藥治療，已減少攝食量及體重(圖32至33)。在10nmol/kg劑量水平下，在第4、5、6、及8至12天，每日攝食量出現顯著減少(圖32)。在10nmol/kg劑量水平下的投予後第2週期間，每日攝食量的一週平均值係顯著降低。在3nmol/kg劑量水平下的投予後第2週，其較給藥前的平均每週攝食量具有顯著的減少幅度百分比；且在10nmol/kg劑量水平下的投予後第1及2週中，其較給藥前的平均每週攝食量具有顯著的減少幅度百分比。在3nmol/kg劑量水平下的第28天，且在10nmol/kg劑量水平下的第14、21、及28天，出現自第0天改變的顯著體重減少幅度百分比(圖33)。
以三種劑量水平，將FP2皮下投予至原態石蟹獼猴分群：1、3、及10nmol/kg。亦納入媒劑處理組。該等動物是在盲化條件下接受治療。持續總共11週的研究：5週的基線攝食量測量與數據收集、1週的治療及5週的清洗期數據收集。給藥後，接著在第1、7、14、21、28、35、及42天測量血漿藥物暴露量。
相較於媒劑處理，石蟹獼猴經過FP2單次給藥治療，已減少攝食量及體重(圖34至35)。在3nmol/kg劑量水平下的第3、5至8、10及12天，且在10nmol/kg劑量水平下的第3至38及40天，出現顯著的每日攝食量減少(圖34)。就每日攝食量之每週平均值來說，其在3nmol/kg劑量水平下投予後第1週內顯著降低，且在10nmol/kg劑量水平下第1至6週顯著降低。在3nmol/kg劑量水平下的投予後第2週，其較給藥前該週的每週平均每日攝食量具有顯著的減少幅度百分比；且在10nmol/kg劑量水平下的投予後第1及6週中，其較給藥前該週的每週平均每日攝食量具有顯著的減少幅度百分比。在1nmol/kg劑量水平下的第21至42天，在3nmol/kg劑量水平下的第14至42天，在10nmol/kg劑量水
平下的第7至42天，出現自第0天改變的顯著體重減少幅度百分比(圖34)。
已探討HSA-GDF15：GDF15異二聚體的生物活性。
為了產生HSA-GDF15：GDF15異二聚體，已設計二種建構體。第一建構體所含有的HSA經由甘胺酸-絲胺酸連接子(SEQ ID NO：93)融合至成熟GDF15(AA 203-308)之N端。第二建構體所含有的6x組胺酸標記HSA經由甘胺酸-絲胺酸連接子與HRV3C蛋白酶裂解位置(SEQ ID NO：94)融合至成熟GDF15(AA 197-308)之N端。根據製造商的規程使用Expi293TM Expression System(Thermo Fisher Scientific)，使質體以1：1之比例進行共轉導。胜肽經過分泌而成為HSA-GDF15蛋白，該蛋白包括異二聚體及同二聚體形式，其中單體係由雙硫鍵連接。
自經短時間轉導之Expi293TM細胞而來的細胞上清液，其係在轉導後5天經過收穫，經由離心加以澄清，且經過無菌過濾。將澄清的上清液裝載於Histrap HP管柱(GE Healthcare)，該管柱係於具有20mM磷酸鈉、500mM NaCl、pH 7.4之條件下平衡。經過裝載之後，用平衡緩衝液清洗管柱，藉以去除未結合的蛋白質。結合於管柱的HSA-GDF15蛋白，包括異二聚體及同二聚體兩者，係於具有20mM磷酸鈉、150mM咪唑、pH 7.4之條件下洗提。儲集洗出液流份，並將其在4℃下於6x組胺酸標記HRV3C酶(Janssen)存在時培養整夜，以產生HSA-GDF15：GDF15異二聚體。經過培養之後，使蛋白質溶液透析進入平衡緩衝液，以去除咪唑，之後才能將蛋白質溶液再一次施加於HisTrap HP管柱。在利用20mM磷酸鈉、50mM咪唑、pH 7.4的清洗步驟中，洗提HSA-GDF15：GDF15異二聚體，同時保留組胺酸標記蛋白。藉由尺寸篩除層析(SEC)，在利用HiLoad 26/60 Superdex 200 pg管柱(GE Healthcare)且以1x
DPBS(pH 7.2)平衡的條件下，進一步精製異二聚體。儲集來自SEC之具有高純度(由SDS-PAGE判定)HSA-GDF15：GDF15異二聚體的洗出液流份，並將其加以過濾。利用BioTek SynergyHTTM分光光度計於280nm之吸光度來測定蛋白質的濃度。利用SDS-PAGE與分析性尺寸篩除HPLC(Ultimate3000 HPLC system)，評估經純化之蛋白質品質。利用LAL分析法(Pyrotell®-T,Associates of Cape Cod)，測量內毒素水平。在4℃下儲存純化蛋白質。
將穩定表現GDF15受體(GFRAL)的SK-N-AS細胞(ATCC)播種於96孔盤內的生長培養基(10% FBS)中，於24小時後進行分析。24hrs後，將培養基更換為200μl的DMEM培養基(補充1% HI馬血清)以在37℃培養箱中使細胞飢餓3小時。接著，將1% HI馬血清補充培養基更換為200μl的AB1，然後在37℃培養箱中再培養額外2小時。為了進行分析，抽吸掉所有小孔內的AB1，並將測試化合物於AB2中的溶液以不同濃度加入100μl，然後將盤板在37℃培養箱中培養15min。15分鐘過後，移除測試溶液，並加入30μl的裂解液(提供於檢測套組)，然後在室溫下用盤板振盪機使盤板振盪30min。為進行檢測，將16μl的裂解樣本轉移至384孔分析盤，並添加4μl的HTRF pAKT檢測抗體。在室溫下整夜培養盤板，然後在Envision(Perkin Elmer)上讀取HTRF信號。
利用GraphPad Prism®非線性迴歸(曲線擬合)，來計算EC50值。數據是以取自三項獨立實驗的平均±標準誤差(SE)表示，其中每個數據點採三重複。藉由質譜術來確認HSA-GDF15：GDF15異二聚體的分子同一性。異二聚體曲線向左偏移的現象，意味著HSA-GDF15：GDF15異二聚體誘導pAKT的效力強於具有額外白蛋白的相關同二聚體分子。
已探討連接HSA與GDF15之各種連接子的熱穩定性。為評估形成片段與聚集的可能性，將具有各種連接子的HSA-GDF15融合蛋白稀釋成10mg/ml。添加EDTA與甲硫胺酸之後，將樣本在40℃下培養14天。然後，將樣本稀釋成1mg/ml之濃度，且在尺寸篩除高效液相層析(SE-HPLC)下經過評估。對這些蛋白質定量完整蛋白的百分比，以及片段與聚集的百分比。表64顯示，當具有連接子的HSA-GDF15蛋白由AP重複序列組成時，在熱應力下阻止片段形成的穩定性最高。
為了評估此等連接子是否影響GDF15與其受體的交互作用，使用針對GDF15(Janssen)與HSA(Kerafast,Inc.,Boston,MA)的單株抗體，在GFRAL-Fc融合蛋白塗覆於盤板上且利用抗GDF15或抗HSA檢測的條件下進行免疫檢定。此分析法顯示表66中的所有此等連接子變體皆對受體具有類似結合情形。
本發明已參照其特定實施例詳加說明，而在未悖離本發明之精神與範疇下可於其中進行各種變更與修改，此對於所屬技術領域中具有通常知識者而言將係顯而易見。
本申請案所提序列係提供於下表：WT-野生型
<110> 健生生技公司(Janssen Biotech,Inc.) 安東尼．阿姆斯特朗(Anthony Armstrong) 朱迪思．安．康諾(Judith Ann Connor) 珍妮弗．弗曼(Jennifer Furman) 黃吉吉(Chichi Huang) 邁克爾．J．亨特(Michael J.Hunter) 欣方．林-施密特(Xiefan Lin-Schmidt) 塞雷娜．尼爾森(Serena Nelson) 夏彌那．蘭格瓦拉(Shamina Rangwala) 雪儂．繆利肯(Shannon Mullican) 荷西．安東尼奧．查韋斯(Jose Antonio Chavez)
<120> GDF15融合蛋白及其用途
<130> JBI5086WOPCT
<140> 未知
<141> 隨此
<150> 62/333,886
<151> 05/10/2016
<160> 128
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSA變體
<400> 1
<210> 2
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSA變體
<400> 2
<210> 3
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSA變體
<400> 3
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 4
<210> 5
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 5
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 6
<210> 7
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 7
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 8
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 9
<210> 10
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 10
<210> 11
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 11
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 12
<210> 13
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 13
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 14
<210> 15
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 15
<210> 16
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 16
<210> 17
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 17
<210> 18
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 18
<210> 19
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 19
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 20
<210> 21
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 21
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 22
<210> 23
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 23
<210> 24
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 24
<210> 25
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 25
<210> 26
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 26
<210> 27
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 27
<210> 28
<211> 721
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 28
<210> 29
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 29
<210> 30
<211> 721
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 30
<210> 31
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 31
<210> 32
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 32
<210> 33
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 33
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 34
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 35
<210> 36
<211> 706
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 36
<210> 37
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 37
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 38
<210> 39
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 39
<210> 40
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 40
<210> 41
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 41
<210> 42
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 42
<210> 43
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 43
<210> 44
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 44
<210> 45
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 45
<210> 46
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 46
<210> 47
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 47
<210> 48
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 48
<210> 49
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 49
<210> 50
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 50
<210> 51
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 51
<210> 52
<211> 80
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 52
<210> 53
<211> 85
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 53
<210> 54
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 54
<210> 55
<211> 739
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 55
<210> 56
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 56
<210> 57
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 57
<210> 58
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 58
<210> 59
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 59
<210> 60
<211> 739
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 60
<210> 61
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 61
<210> 62
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 62
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 63
<210> 64
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 64
<210> 65
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 65
<210> 66
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 66
<210> 67
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 67
<210> 68
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 68
<210> 69
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 69
<210> 70
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 70
<210> 71
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 71
<210> 72
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 72
<210> 73
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 73
<210> 74
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 74
<210> 75
<211> 719
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 75
<210> 76
<211> 2157
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 76
<210> 77
<211> 2133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 77
<210> 78
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 78
<210> 79
<211> 2133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 79
<210> 80
<211> 2163
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 80
<210> 81
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 81
<210> 82
<211> 2163
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 82
<210> 83
<211> 2157
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 83
<210> 84
<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 84
<210> 85
<211> 2151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 85
<210> 86
<211> 2157
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 86
<210> 87
<211> 2157
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 87
<210> 88
<211> 2157
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 88
<210> 89
<211> 2151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 89
<210> 90
<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 90
<210> 91
<211> 2157
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 91
<210> 92
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 92
<210> 93
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 93
<210> 94
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 94
<210> 95
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 95
<210> 96
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 96
<210> 97
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 97
<210> 98
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 98
<210> 99
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 99
<210> 100
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 100
<210> 101
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 101
<210> 102
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 102
<210> 103
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 103
<210> 104
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 104
<210> 105
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 105
<210> 106
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 106
<210> 107
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 107
<210> 108
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GDF15變體
<400> 108
<210> 109
<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 109
<210> 110
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 110
<210> 111
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 111
<210> 112
<211> 725
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 112
<210> 113
<211> 733
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 113
<210> 114
<211> 2199
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 114
<210> 115
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 115
<210> 116
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 116
<210> 117
<211> 713
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 117
<210> 118
<211> 2139
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 118
<210> 119
<211> 717
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 119
<210> 120
<211> 2151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 120
<210> 121
<211> 741
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 121
<210> 122
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 122
<210> 123
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 123
<210> 124
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 124
<210> 125
<211> 735
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 125
<210> 126
<211> 2205
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 126
<210> 127
<211> 727
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 融合蛋白
<400> 127
<210> 128
<211> 2181
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼融合蛋白的序列
<400> 128
Claims (45)
- 一種融合蛋白，其包含：a. 半衰期延長蛋白，b. 連接子，及c. GDF15蛋白；其中該融合蛋白係以(a)-(b)-(c)之順序自N端至C端配置。
- 如請求項1所述之融合蛋白，其中該GDF15蛋白係成熟GDF15蛋白或其功能性變體。
- 如請求項1所述之融合蛋白，其中該GDF15蛋白包含與SEQ ID NO：6、7、8、9、10、或11具有至少90%同一性的胺基酸序列。
- 如請求項3所述之融合蛋白，其中該GDF15蛋白包含選自由SEQ ID NO：6、7、8、9、10、及11所組成之群組的胺基酸序列。
- 如請求項1至4中任一項所述之融合蛋白，其中該半衰期延長蛋白係人類血清白蛋白(HSA)或其功能性變體。
- 如請求項5所述之融合蛋白，其中該半衰期延長蛋白包含與SEQ ID NO：1具有至少90%同一性的胺基酸序列。
- 如請求項6所述之融合蛋白，其中該半衰期延長蛋白包含選自由SEQ ID NO：1、2、及3所組成之群組的胺基酸序列。
- 如請求項1至7中任一項所述之融合蛋白，其中該連接子係柔性連接子(flexible linker)。
- 如請求項8所述之融合蛋白，其中該連接子包含序列(GGGGS)n，其中n係2至20。
- 如請求項1至7中任一項所述之融合蛋白，其中該連接子係結構化連接子(structured linker)。
- 如請求項10所述之融合蛋白，其中該連接子包含序列(AP)n或(EAAAK)n，其中n係2至20。
- 如請求項1至7中任一項所述之融合蛋白，其中該連接子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：(GGGGA)n、(PGGGS)n、(AGGGS)n、或GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS，其中n係2至20。
- 一種融合蛋白，其包含與SEQ ID NO：5、25至30、36至37、40、48、55至56、59至60、64至75、92、113、115、117、119、121、123、125、或127具有至少90%序列同一性的胺基酸序列。
- 如請求項13所述之融合蛋白，其包含選自由SEQ ID NO：5、25至30、40、55至56、59至60、70、92、113、115、117、119、121、123、125、及127所組成之群組的胺基酸序列。
- 一種單離之核酸分子，其包含編碼如請求項1至14中任一項所述之融合蛋白的核苷酸序列。
- 如請求項15所述之單離之核酸分子，其與SEQ ID NO：76至91、95、109、110、114、116、118、120、122、124、126、及128具有至少90%序列同一性。
- 如請求項16所述之單離之核酸分子，其包含選自由SEQ ID NO：76至91、95、109、110、114、116、118、120、122、124、126、及128所組成之群組的核苷酸序列。
- 一種載體，其包含編碼如請求項1至14中任一項所述之融合蛋白的核酸分子。
- 如請求項18所述之載體，其包含選自由SEQ ID NO：76至91、95、109、110、114、116、118、120、122、124、126、及128所組成之群組的核苷酸序列。
- 一種宿主細胞，其包含編碼如請求項1至14中任一項所述之融合蛋白的核酸分子。
- 一種產生如請求項1至14中任一項所述之融合蛋白的方法，其包含：(1)在產生該融合蛋白的條件下培養宿主細胞，該宿主細胞包含編碼該融合蛋白的核酸分子；及(2)回收由該宿主細胞產生的該融合蛋白。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至14中任一項所述之融合蛋白及醫藥上可接受之載劑。
- 一種醫藥組成物，其包含編碼如請求項1至14中任一項所述之融合蛋白的核酸分子及醫藥上可接受之載劑。
- 一種治療或預防代謝病症之方法，其包含向有需要之對象投予有效量的如請求項22或23所述之醫藥組成物。
- 一種治療有需要之對象的病症之方法，該病症係選自由代謝病症所組成之群組，該代謝病症係選自由第2型糖尿病、升高葡萄糖水平、升高胰島素水平、肥胖、異常血脂症、糖尿病性腎病變、心肌缺血性損傷、充血性心臟衰竭、及類風濕性關節炎所組成之群組，該方法包含向該對象投予治療有效量的醫藥組成物，該醫藥組成物包含：融合蛋白，其包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列；及醫藥上可接受之載劑。
- 一種治療有需要之對象的病症之方法，該病症係選自由代謝病症所組成之群組，該代謝病症係選自由第2型糖尿病、升高葡萄糖水平、升高胰島素水平、肥胖、異常血脂症、糖尿病性腎病變、心肌缺血性損傷、充血性心臟衰竭、及類風濕性關節炎所組成之群組，該方法包含向該對象投予治療有效量的醫藥組成物，該醫藥組成物包含：融合蛋白，其包含SEQ ID NO：92之胺基酸序列；及醫藥上可接受之載劑。
- 一種二聚體，其包含兩條多肽鏈，其中各鏈自N端至C端包含HSA區、連接子及GDF15區；其中該HSA區包含與SEQ ID NO：1、2、或3具有至少90%同一性的胺基酸序列，且其中該GDF15區包含與SEQ ID NO：6、7、8、9、10、或11具有至少90%同一性的胺基酸序列。
- 如請求項27所述之二聚體，其中該HSA區包含選自由SEQ ID NO：1、2、及3所組成之群組的胺基酸序列。
- 如請求項27所述之二聚體，其中該GDF15區包含選自由SEQ ID NO：6、7、8、9、10、及11所組成之群組的胺基酸序列。
- 如請求項27所述之二聚體，其中該兩條多肽鏈係藉由雙硫鍵連接。
- 如請求項27所述之二聚體，其中該HSA區與該GDF15區係藉由多肽連接子接合。
- 如請求項31所述之二聚體，其中該HSA區與該GDF15區係藉由柔性連接子接合。
- 如請求項32所述之二聚體，其中該多肽連接子包含序列(GGGGS)n，其中n係2至20。
- 如請求項31所述之二聚體，其中該HSA區與該GDF15區係藉由結構化連接子接合。
- 如請求項34所述之二聚體，其中該多肽連接子包含序列(AP)n或(EAAAK)n，其中n係2至20。
- 如請求項31所述之二聚體，其中該連接子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：(GGGGA)n、(PGGGS)n、(AGGGS)n、或GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS，其中n係2至20。
- 一種二聚體，其包含(i)第一多肽鏈，其包含在N端的第一HSA區、連接子及在C端的第一GDF15區；及(ii)第二多肽鏈，其包含第二GDF15區；其中該HSA區包含與SEQ ID NO：1、2、或3具有至少90%同一性的胺基酸序列，且其中該第一GDF15區包含與SEQ ID NO：6、7、8、9、10、或11具有至少90%同一性的胺基酸序列，且該第二GDF15區包含與SEQ ID NO：6、7、8、9、10、或11具有至少90%同一性的胺基酸序列。
- 如請求項37所述之二聚體，其中該HSA區包含選自由SEQ ID NO：1、2、及3所組成之群組的胺基酸序列。
- 如請求項37所述之二聚體，其中該GDF15區包含選自由SEQ ID NO：6、7、8、9、10、及11所組成之群組的胺基酸序列。
- 如請求項37所述之二聚體，其中該連接子包含選自由下列所組成之群組的胺基酸序列：(GGGGS)n、(AP)n、(EAAAK)n、(GGGGA)n、(PGGGS)n、(AGGGS)n、及GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS，其中n係2至20。
- 如請求項37所述之二聚體，其中該兩條多肽鏈係藉由雙硫鍵連接。
- 一種多肽，其包含選自由SEQ ID NO：7、8、9、10及11所組成之群組的胺基酸序列。
- 一種單離之核酸分子，其包含選自由SEQ ID NO：96至108所組成之群組的核苷酸序列。
- 一種載體，其包含核酸分子，該核酸分子包含選自由SEQ ID NO：96至108所組成之群組的核苷酸序列。
- 一種宿主細胞，其包含核酸分子，該核酸分子包含選自由SEQ ID NO：96至108所組成之群組的核苷酸序列。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662333886P | 2016-05-10 | 2016-05-10 | |
| US62/333,886 | 2016-05-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201803892A true TW201803892A (zh) | 2018-02-01 |
| TWI760333B TWI760333B (zh) | 2022-04-11 |
Family
ID=60266761
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW106115164A TWI760333B (zh) | 2016-05-10 | 2017-05-08 | Ｇｄｆ１５融合蛋白及其用途 |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10336812B2 (zh) |
| EP (1) | EP3454832A4 (zh) |
| JP (3) | JP7022879B2 (zh) |
| KR (2) | KR20230169417A (zh) |
| CN (1) | CN109451726A (zh) |
| AR (1) | AR108442A1 (zh) |
| AU (3) | AU2017263237B2 (zh) |
| BR (1) | BR112018072946A2 (zh) |
| CA (1) | CA3022865A1 (zh) |
| CL (1) | CL2018003148A1 (zh) |
| CO (1) | CO2018012096A2 (zh) |
| CR (2) | CR20180532A (zh) |
| DO (1) | DOP2018000245A (zh) |
| EA (1) | EA201892561A1 (zh) |
| EC (1) | ECSP18083561A (zh) |
| IL (2) | IL262652B2 (zh) |
| MA (1) | MA44986A (zh) |
| MX (2) | MX2018013784A (zh) |
| MY (1) | MY191030A (zh) |
| NI (1) | NI201800121A (zh) |
| PE (2) | PE20190352A1 (zh) |
| PH (1) | PH12018502361A1 (zh) |
| SG (2) | SG10201912739XA (zh) |
| SV (1) | SV2018005781A (zh) |
| TW (1) | TWI760333B (zh) |
| WO (1) | WO2017196647A1 (zh) |
| ZA (1) | ZA201808284B (zh) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2832581C (en) | 2011-04-08 | 2022-08-23 | Yumei Xiong | Method of treating or ameliorating metabolic disorders using growth differentiation factor 15 (gdf-15) |
| EP3763734A1 (en) | 2013-07-31 | 2021-01-13 | Amgen Inc. | Growth differentiation factor 15 (gdf-15) constructs |
| EP3184106A1 (en) * | 2015-12-23 | 2017-06-28 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Growth differentiation factor 15 as biomarker for metformin |
| US10336812B2 (en) * | 2016-05-10 | 2019-07-02 | Janssen Biotech, Inc. | GDF15 fusion proteins and uses thereof |
| CN109414471A (zh) | 2016-05-24 | 2019-03-01 | 诺和诺德股份有限公司 | Mic-1化合物及其用途 |
| GB201710229D0 (en) * | 2017-06-27 | 2017-08-09 | Tdeltas Ltd | Compounds for new use |
| US20190224278A1 (en) * | 2018-01-22 | 2019-07-25 | Intelligent Synthetic Biology Center | Producing method of antimicrobial peptide with enhanced adhesion and uses thereof |
| TWI724392B (zh) | 2018-04-06 | 2021-04-11 | 美商美國禮來大藥廠 | 生長分化因子15促效劑化合物及其使用方法 |
| CN111954537A (zh) | 2018-04-09 | 2020-11-17 | 美国安进公司 | 生长分化因子15融合蛋白 |
| PE20211078A1 (es) | 2018-10-22 | 2021-06-09 | Janssen Pharmaceutica Nv | Proteinas de fusion de peptido similar al glucagon 1 (glp1)-factor de diferenciacion de crecimiento 15 (gdf15) y usos de estas |
| WO2020084161A1 (en) * | 2018-10-26 | 2020-04-30 | Vrije Universiteit Brussel | New tools for improving gene therapy and use thereof |
| WO2020104948A1 (en) * | 2018-11-20 | 2020-05-28 | Janssen Pharmaceutica Nv | Gdf15 analogs and methods for use in decreasing body weight and/or reducing food intake |
| KR102406899B1 (ko) * | 2019-02-27 | 2022-06-10 | 주식회사 대웅제약 | 알부민이 결합된, Slit3 단백질의 LRRD2를 포함하는 근육 질환 예방 또는 치료용 조성물 |
| EP3932430A4 (en) * | 2019-02-27 | 2023-02-01 | Daewoong Pharmaceutical Co., Ltd. | ALBUMIN-RELATED COMPOSITION COMPRISING LRRD2 OF THE SLIT3 PROTEIN FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF BONE DISEASES |
| AU2020260931B2 (en) * | 2019-04-23 | 2023-08-24 | Lg Chem, Ltd. | Fusion polypeptide comprising Fc region of immunoglobulin and GDF15 |
| US20230210950A1 (en) | 2019-10-04 | 2023-07-06 | Amgen Inc. | Use of gdf15 for treating cardiometabolic syndrome and other conditions |
| CN112618698B (zh) * | 2019-10-08 | 2021-10-08 | 北京东方百泰生物科技股份有限公司 | 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的注射制剂 |
| KR20210065057A (ko) * | 2019-11-26 | 2021-06-03 | 주식회사유한양행 | 지속형 gdf15 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학 조성물 |
| MX2022006634A (es) * | 2019-12-11 | 2022-07-04 | Lg Chemical Ltd | Polipeptido de fusion que comprende gdf15 y region de polipeptido capaz de experimentar o-glicosilacion. |
| EP4085077A4 (en) | 2019-12-31 | 2024-01-17 | Beijing QL Biopharmaceutical Co., Ltd. | FUSION PROTEINS FROM GLP-1 AND GDF15 AND CONJUGATES THEREOF |
| CN111393526B (zh) * | 2020-03-30 | 2022-04-12 | 中国人民解放军第四军医大学 | 抗gdf15中和性单克隆抗体及其应用 |
| CN115244076B (zh) * | 2020-10-27 | 2023-08-04 | 北京质肽生物医药科技有限公司 | Gdf15融合蛋白及其用途 |
| WO2023025129A1 (zh) * | 2021-08-24 | 2023-03-02 | 广东东阳光药业有限公司 | Gdf15融合蛋白及其用途 |
| WO2023154953A1 (en) | 2022-02-14 | 2023-08-17 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Gdf15 polypeptides for treating and preventing autoimmune diseases |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU8591198A (en) | 1997-07-31 | 1999-02-22 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Growth differentiation factor-15 |
| US7919084B2 (en) * | 2002-06-17 | 2011-04-05 | St. Vincent's Hospital Sydney Limited | Methods of diagnosis, prognosis and treatment of cardiovascular disease |
| PT1641823E (pt) * | 2003-06-12 | 2011-11-08 | Lilly Co Eli | Proteínas de fusão de análogos de glp-1 |
| US20090099031A1 (en) * | 2005-09-27 | 2009-04-16 | Stemmer Willem P | Genetic package and uses thereof |
| US20120107420A1 (en) * | 2008-10-31 | 2012-05-03 | St Vincent's Hospital Sydney Limited | Methods of prognosis in chronic kidney disease |
| TW201101990A (en) | 2009-07-08 | 2011-01-16 | zhen-zheng Huang | Plant media |
| NZ597580A (en) * | 2009-07-20 | 2013-11-29 | Univ Nat Taiwan | Polypeptides selective for alpha.v.beta.3 integrin conjugated with a variant of human serum albumin (hsa) and pharmaceutical uses thereof |
| WO2013113008A1 (en) | 2012-01-26 | 2013-08-01 | Amgen Inc. | Growth differentiation factor 15 (gdf-15) polypeptides |
| EP2830646B1 (en) | 2012-03-27 | 2018-03-07 | NGM Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
| US9695228B2 (en) * | 2012-11-21 | 2017-07-04 | Janssen Biotech, Inc. | EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules |
| EP2934584B1 (en) * | 2012-12-21 | 2020-02-19 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Anti-gdf15 antibodies |
| HUE039465T2 (hu) * | 2013-01-25 | 2019-01-28 | Janssen Biotech Inc | KV1.3 antagonisták és alkalmazási eljárások |
| JP6272907B2 (ja) | 2013-01-30 | 2018-01-31 | エヌジーエム バイオファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 代謝障害の処置における組成物及び使用方法 |
| US9161966B2 (en) * | 2013-01-30 | 2015-10-20 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | GDF15 mutein polypeptides |
| EP3763734A1 (en) * | 2013-07-31 | 2021-01-13 | Amgen Inc. | Growth differentiation factor 15 (gdf-15) constructs |
| WO2015198199A1 (en) * | 2014-06-23 | 2015-12-30 | Novartis Ag | Hsa-gdf-15 fusion polypeptide and use thereof. |
| US9272019B2 (en) | 2014-06-24 | 2016-03-01 | Novo Nordisk A/S | MIC-1 fusion proteins and uses thereof |
| KR20170065026A (ko) | 2014-07-30 | 2017-06-12 | 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. | 대사 장애 치료용으로 이용되는 조성물 및 방법 |
| JP6663428B2 (ja) * | 2014-10-30 | 2020-03-11 | アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド | Ｇｄｆ１５ポリペプチドを使用する、赤血球を増加させるための方法および組成物 |
| GB201512733D0 (en) * | 2015-07-20 | 2015-08-26 | Genagon Therapeutics Ab | Therapeutic agents for treating conditions associated with elevated GDF15 |
| US10336812B2 (en) * | 2016-05-10 | 2019-07-02 | Janssen Biotech, Inc. | GDF15 fusion proteins and uses thereof |
| MA46523A (fr) * | 2016-10-12 | 2019-08-21 | Janssen Biotech Inc | Procédés de criblage de modulateurs d'une activité biologique de type gdf15 |
| PE20211078A1 (es) * | 2018-10-22 | 2021-06-09 | Janssen Pharmaceutica Nv | Proteinas de fusion de peptido similar al glucagon 1 (glp1)-factor de diferenciacion de crecimiento 15 (gdf15) y usos de estas |
-
2017
- 2017-05-04 US US15/586,463 patent/US10336812B2/en active Active
- 2017-05-05 AU AU2017263237A patent/AU2017263237B2/en active Active
- 2017-05-05 JP JP2018558704A patent/JP7022879B2/ja active Active
- 2017-05-05 MA MA044986A patent/MA44986A/fr unknown
- 2017-05-05 IL IL262652A patent/IL262652B2/en unknown
- 2017-05-05 CR CR20180532A patent/CR20180532A/es unknown
- 2017-05-05 EA EA201892561A patent/EA201892561A1/ru unknown
- 2017-05-05 MY MYPI2018704153A patent/MY191030A/en unknown
- 2017-05-05 BR BR112018072946-9A patent/BR112018072946A2/pt active Search and Examination
- 2017-05-05 CN CN201780042988.XA patent/CN109451726A/zh active Pending
- 2017-05-05 SG SG10201912739XA patent/SG10201912739XA/en unknown
- 2017-05-05 WO PCT/US2017/031197 patent/WO2017196647A1/en active Application Filing
- 2017-05-05 SG SG11201809700YA patent/SG11201809700YA/en unknown
- 2017-05-05 CR CR20230026A patent/CR20230026A/es unknown
- 2017-05-05 MX MX2018013784A patent/MX2018013784A/es unknown
- 2017-05-05 EP EP17796596.9A patent/EP3454832A4/en active Pending
- 2017-05-05 IL IL302720A patent/IL302720A/en unknown
- 2017-05-05 CA CA3022865A patent/CA3022865A1/en active Pending
- 2017-05-05 PE PE2018002341A patent/PE20190352A1/es unknown
- 2017-05-05 KR KR1020237041129A patent/KR20230169417A/ko active Application Filing
- 2017-05-05 KR KR1020187035159A patent/KR20190003746A/ko not_active Application Discontinuation
- 2017-05-05 PE PE2023003061A patent/PE20240015A1/es unknown
- 2017-05-08 TW TW106115164A patent/TWI760333B/zh active
- 2017-05-10 AR ARP170101236A patent/AR108442A1/es unknown
-
2018
- 2018-11-06 CL CL2018003148A patent/CL2018003148A1/es unknown
- 2018-11-08 CO CONC2018/0012096A patent/CO2018012096A2/es unknown
- 2018-11-08 EC ECSENADI201883561A patent/ECSP18083561A/es unknown
- 2018-11-09 SV SV2018005781A patent/SV2018005781A/es unknown
- 2018-11-09 PH PH12018502361A patent/PH12018502361A1/en unknown
- 2018-11-09 NI NI201800121A patent/NI201800121A/es unknown
- 2018-11-09 DO DO2018000245A patent/DOP2018000245A/es unknown
- 2018-11-09 MX MX2024002398A patent/MX2024002398A/es unknown
- 2018-12-07 ZA ZA2018/08284A patent/ZA201808284B/en unknown
-
2019
- 2019-05-15 US US16/412,819 patent/US11208464B2/en active Active
-
2021
- 2021-08-19 AU AU2021218103A patent/AU2021218103B2/en active Active
- 2021-11-18 US US17/455,649 patent/US20230119382A1/en active Pending
- 2021-12-27 JP JP2021212546A patent/JP7481319B2/ja active Active
-
2023
- 2023-11-13 AU AU2023266233A patent/AU2023266233A1/en active Pending
-
2024
- 2024-04-25 JP JP2024071116A patent/JP2024102147A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI760333B (zh) | Ｇｄｆ１５融合蛋白及其用途 | |
| JP6567613B2 (ja) | 代謝障害を処置するための融合タンパク質 | |
| JP6152380B2 (ja) | 代謝障害を処置するためのデュアル機能性タンパク質 | |
| JP6110304B2 (ja) | Ｆｇｆ２１関連障害を処置する方法 | |
| EP2791338B1 (en) | Soluble igf receptor fc fusion proteins and uses thereof | |
| TW201602345A (zh) | 生長分化因子１５（ｇｄｆ－１５）構築體 | |
| TWI853223B (zh) | Gdf15融合蛋白及其用途 | |
| EA042423B1 (ru) | Гибридные белки gdf15 и их применение | |
| NZ787709A (en) | Gdf15 fusion proteins and uses thereof | |
| CN115551529A (zh) | 增强房水流出并降低眼内压的方法 | |
| Boettcher et al. | Patent: Methods of Treating FGF21-Associated Disorders | |
| WO2015057908A1 (en) | Methods of treating diabetes and related disorders |