EA042423B1

EA042423B1 - Гибридные белки gdf15 и их применение

Info

Publication number: EA042423B1
Application number: EA201892561
Authority: EA
Inventors: Энтони Армстронг; Джудит Энн КОННОР; Дженнифер Фурман; Чичи Хуан; Майкл Дж. ХАНТЕР; Сефань Линь-Шмидт; Серена Нельсон; Шамина Рангвала; Шэннон Малликан; Хосе Антонио Чавес
Original assignee: Янссен Байотек, Инк.
Priority date: 2016-05-10
Filing date: 2017-05-05
Publication date: 2023-02-13

Description

Область применения изобретения

Настоящее изобретение относится к гибридным белкам GDF15. В частности, настоящее изобретение относится к гибридному белку, содержащему белок, продлевающий период полужизни, линкер и белок GDF15, нуклеиновым кислотам и экспрессионным векторам, кодирующим гибридные белки, рекомбинантным клеткам с ними, а также фармацевтическим композициям, содержащим эти гибридные белки. Также предложены способы продуцирования гибридных белков и применения гибридных белков для лечения метаболических расстройств.

Предпосылки создания изобретения

Белок GDF15, член семейства TGFe, - это секретируемый белок, который циркулирует в плазме в виде гомодимера с молекулярной массой 25 кДа. У большинства субъектов уровни белка GDF15 в плазме варьируют в интервале 150-1150 пг/мл (Tsai et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle. 2012, 3: 239-243). Уровни белка GDF15 в плазме возрастают в состоянии травмы, при сердечно-сосудистых и определенных типах онкологических заболеваний. Полагают, что данное возрастание обусловлено цитопротекторным механизмом. Высокие уровни белка GDF15 в плазме связаны с потерей массы тела вследствие анорексии и кахексии при онкологических заболеваниях, а также при почечной и сердечной недостаточности. В одном клиническом исследовании уровни белка GDF15 служили в качестве независимого прогностического фактора резистентности к инсулину у субъектов, страдающих ожирением, но не больных диабетом (Kempf et al., Eur. J. Endo. 2012, 167: 671-678). Исследование на близнецах показало, что различия в уровнях белка GDF15 в парах близнецов коррелировали с различиями в индексах массы тела (ИМТ) в соответственных парах, подтверждая, что GDF15 служит долгосрочным регулятором энергетического гомеостаза (Tsai et al., PLoS One. 2015, 10 (7):e0133362).

Белок GDF15 был подробно изучен как биомаркер нескольких сердечно-сосудистых и других видов заболеваний; кроме того, была описана защитная роль GDF15 при гипертрофии миокарда и ишемическом поражении (Collinson, Curr. Opin. Cardiol. 2014, 29: 366-371; Kempf et al., Nat. Med. 2011, 17: 581589; Xu et al., Circ Res. 2006, 98: 342-50). Было показано, что белок GDF15 играет важную роль в защите от повреждений почечных канальцев и интерстициальных тканей в моделях диабета 1 и 2-го типов у мышей (Mazagova et al., Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2013; 305: F1249-F1264). Предполагается, что белок GDF15 обеспечивает защитное действие против гибели сенсорных и моторных нейронов в процессе старения и улучшает восстановление после повреждения периферических нервов (Strelau et al., J. Neurosci. 2009, 29: 13640-13648; Mensching et al., Cell Tissue Res. 2012, 350: 225-238). Фактически было показано, что трансгенные мыши с белком GDF15 имеют большую продолжительность жизни, чем контрольные из одного помета с ними, и это может указывать на то, что эта молекула служит фактором долговременного выживания (Wang et al., Aging. 2014, 6: 690-700).

В многочисленных работах продемонстрировано улучшение переносимости глюкозы и чувствительности к инсулину в моделях мышей после введения белка GDF15. Две независимых линии трансгенных мышей со сверхэкспрессией GDF15 имели пониженную массу тела и массу жировой ткани, а также улучшенную переносимость глюкозы (Johnen et al., Nat. Med. 2007, 13: 1333-1340; Macia et al., PLoS One. 2012, 7: e34868; Chrysovergis et al., Int. J. Obesity. 2014, 38: 1555-1564). Сообщалось об увеличении полного расхода энергии и окислительного метаболизма у трансгенных мышей с белком GDF15 (Chrysovergis et al., 2014, Id.). Это сопровождалось возрастанием экспрессии термогенных генов в бурой жировой ткани и возрастанием экспрессии липолитических генов в белой жировой ткани. Мыши, у которых не хватало гена GDF15, имели увеличенную массу тела и массу жировой ткани (Tsai et al., PLoS One. 2013, 8 (2): e55174). Было показано, что содержащий Fc гибридный белок с GDF15 вызывает уменьшение массы тела, а также улучшение переносимости глюкозы и чувствительности к инсулину на модели яванских макаков, страдающих ожирением, после еженедельного введения в период шести недель (WO 2013/113008).

Предполагается, что влияние белка GDF15 на массу тела достигается за счет сокращения потребления пищи и увеличения расхода энергии. GDF15 может улучшать регуляцию гликемии посредством зависимых и не зависимых от массы тела механизмов.

На основании этих вместе взятых наблюдений можно предполагать, что увеличение уровней GDF15 может оказаться полезным при терапии метаболических заболеваний. Таким образом, в данной области существует потребность в композициях на основе GDF15, которые можно применять для лечения или профилактики метаболических заболеваний, расстройств или состояний.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение удовлетворяет данную потребность, предлагая гибридные белки GDF15, которые демонстрируют повышенную растворимость/стабильность и проявляют признаки, указывающие на возможность их применения для лечения или профилактики метаболических заболеваний, расстройств или состояний. Такие признаки включают, например, уменьшение массы тела, улучшение переносимости глюкозы, улучшение чувствительности к инсулину у субъекта, которому вводят гибридный белок в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

В одном общем аспекте настоящее изобретение относится к гибридному белку, содержащему: (а) белок, продлевающий период полужизни, (b) линкер и (с) белок GDF15, причем гибридный белок со

- 1 042423 ставлен от N-конца до С-конца в порядке (а)-(Ь)-(с).

В одном варианте осуществления настоящего изобретения белок GDF15 представляет собой человеческий белок GDF15 или его функциональный вариант. В конкретных вариантах осуществления белок GDF15 содержит зрелый белок GDF15 или его функциональный вариант. В более конкретных вариантах осуществления белок GDF15 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательностям SEQ ID NO: 6-11. В других конкретных вариантах осуществления белок GDF15 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, такую как аминокислотная последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-11.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения белок, продлевающий период полужизни, представляет собой человеческий сывороточный альбумин (HSA) или его функциональный вариант. В конкретных вариантах осуществления белок, продлевающий период полужизни, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1. В других конкретных вариантах осуществления белок, продлевающий период полужизни, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения линкер представляет собой гибкий линкер. В конкретных вариантах осуществления гибкий линкер содержит последовательность (GGGGS)n, где n составляет от 2 до 20, предпочтительно от 4 до 10. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения линкер гибридного белка представляет собой структурированный линкер. В конкретных вариантах осуществления структурированный линкер содержит последовательность (АР)п или (ЕАААК)п, где n составляет от 2 до 20, предпочтительно от 4 до 10.

В вариантах осуществления настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательностям SEQ ID NO: 5, 25-30, 36-37, 40, 48, 55-60 или 64-75. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 25-30, 40, 55-60 и 70. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60.

В еще одном общем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок настоящего изобретения.

В еще одном общем аспекте настоящее изобретение относится к экспрессионному вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гибридный белок настоящего изобретения.

В еще одном общем аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гибридный белок настоящего изобретения.

В еще одном общем аспекте настоящее изобретение относится к способу продуцирования гибридного белка настоящего изобретения. При этом способ включает в себя этапы, на которых: (1) культивируют клетку-хозяина, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гибридный белок, в условиях, при которых продуцируется гибридный белок, и (2) выделяют гибридный белок, продуцированный клеткой-хозяином.

В еще одном общем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей гибридный белок настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

В еще одном общем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гибридный белок настоящего изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель.

В еще одном общем аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему фармацевтическую композицию настоящего изобретения.

В еще одном общем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики метаболического заболевания, расстройства или состояния, причем способ включает введение нуждающемуся в лечении субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества фармацевтической композиции настоящего изобретения. В конкретном варианте осуществления фармацевтическую композицию вводят субъекту подкожно или внутривенно.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ лечения метаболического расстройства, выбранного из группы, состоящей из диабета 2-го типа, повышенных уровней глюкозы, повышенных уровней инсулина, ожирения, дислипидемии, диабетической нефропатии, ишемического поражения миокарда, застойной сердечной недостаточности или ревматоидного артрита, у субъекта, нуждающегося в таком лечении, содержит введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 25-30, 40, 55-60 и 70, и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте осуществления способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и фармацевтически приемлемый носитель.

Другие аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из представленного ниже описания, включающего подробное описание изобретения и его предпочтительных вари- 2 042423 антов осуществления, и прилагаемой формулы изобретения.

Краткое описание графических материалов

Предшествующее краткое изложение, а также последующее подробное описание изобретения, будут более понятными при рассмотрении вместе с прилагаемыми чертежами. Необходимо понимать, что изобретение не ограничено точными вариантами осуществления, показанными на чертежах.

На чертежах показано следующее.

На фиг. 1А и 1В показана кристаллическая структура GDF15, в которой дисульфидные мостики между первым и вторым остатками цистеина (С1-С2) образуют петлю на N-конце этого белка.

На фиг. 2 показано влияние подкожного введения гибридных белков в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, например, гибридных белков FP1 (SEQ ID NO: 60) и 6xHis-FP1 (SEQ ID NO: 26 с гексагистидиновой меткой (6xHis), присоединенной на N-конце), на потребление пищи мышами линии C57BL/6; показано суммарное потребление пищи за 24 ч после введения. Цифры, показанные внутри столбцов, означают проценты снижения по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель (фосфатно-солевой буферный раствор (PBS)), ±SEM (стандартная погрешность средней величины); N = по 8 животных в группе во всех группах, за исключением группы с N=9, получавшей FP1, 16 нмоль/кг. * р<0,05, по сравнению с носителем в контроле; значения р рассчитывали с помощью дисперсионного анализа и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 3 показано влияние подкожного введения FP1 и 6xHis-FP1 (SEQ ID NO: 26 с гексагистидиновой меткой (6xHis), присоединенной на N-конце), на потребление пищи крысами линии Спрег-Доули; показано суммарное потребление пищи за 48 ч после введения. Цифры, показанные внутри столбцов, означают проценты снижения по сравнению с контрольной группой, получавшей носитель (PBS) ±SEM; N = по 8 животных в группе. * р<0,05, по сравнению с носителем в контроле; значения р рассчитывали с помощью дисперсионного анализа и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 4 показано изменение массы тела у мышей с алиментарным ожирением (DIO) во время введения FP1. Стрелки указывают время (дни) подкожного введения после введения начальной дозы (день 0); N = по 8 животных в группе. * р<0,05 для группы с дозой FP1 1 нмоль/кг, по сравнению с носителем в контроле; # р<0,05 для группы с дозой FP1 10 нмоль/кг, по сравнению с носителем в контроле; значения р рассчитывали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 5А и 5В показаны уровни глюкозы в крови мышей DIO, измеренные в пероральном тесте на переносимость глюкозы (OGTT), проведенном через 14 дней, в которые дозу FP1 вводили каждые 3 дня (q3d), причем уровни выражены в виде площади под кривой (AUC). N = по 8 животных в группе. * р<0,05 для группы с дозой FP1 1 нмоль/кг, по сравнению с носителем в контроле; значения р рассчитывали с помощью дисперсионного анализа и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 6 показаны уровни глюкозы в крови мышей DI0, измеренные после еды, во время введения FP1. N = по 8 животных в группе. * р<0,05, по сравнению с носителем в контроле; значения р рассчитывали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 7 показана оценка резистентности к инсулину на основе гомеостатической модели (HOMAIR) у мышей DIO после 4 часов голодания, проведенная через 14 дней, в которые вводили FP1. N = по 8 животных в группе. * р<0,05, по сравнению с носителем в контроле; значения р рассчитывали с помощью дисперсионного анализа и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 8 показано изменение массы тела у мышей ob/ob во время введения FP1 каждые 3 дня (q3d). Стрелки указывают время (дни) подкожного введения после введения начальной дозы (день 0); N = по 9 животных в группе. * р<0,05 для группы с дозой FP1 10 нмоль/кг, по сравнению с носителем в контроле; # р<0,05 для группы с дозой FP1 1 нмоль/кг, по сравнению с носителем в контроле; значения р рассчитывали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 9 показаны уровни глюкозы в крови мышей ob/ob во время введения FP1. Стрелки указывают время (дни) подкожного введения после введения начальной дозы (день 0); N = по 9 животных в группе. * р<0,05 для группы с дозой FP1 10 нмоль/кг, по сравнению с носителем в контроле; # р<0,05 для группы с дозой FP1 1 нмоль/кг, по сравнению с носителем в контроле; значения р рассчитывали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 10 показана зависимость от времени средней (± стандартное отклонение, СО) концентрации лекарственного средства FP1 в сыворотке после внутривенного (в/в) и подкожного (п/к) введения 2 мг/кг мышам линии C57BI/6.

На фиг. 11 показана зависимость от времени средней (±СО) концентрации лекарственного средства FP1 в сыворотке после в/в и п/к введения 2 мг/кг крысам линии Спрег-Доули.

На фиг. 12 показана зависимость от времени средней (±СО) концентрации лекарственного средства FP1 в сыворотке после в/в и п/к введения 1 мг/кг яванским макакам, в соответствии с определениями

- 3 042423 иммунологическим методом.

На фиг. 13 показана зависимость от времени концентрации FP1 (нг/мл) в виде интактного димера в сыворотке после однократного в/в введения яванским макакам, в соответствии с определениями методом иммуноафинного захвата (1А)/жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХМС).

На фиг. 14 показана зависимость от времени концентрации FP1 (нг/мл) в виде интактного димера в сыворотке после однократного п/к введения яванским макакам, в соответствии с определениями методом иммуноафинного захвата/ЖХМС.

На фиг. 15 показана концентрация FP1, представленная в процентах (%) от исходной концентрации, через 0, 4, 24 и 48 ч после инкубации ex vivo в плазме, полученной от двух человеческих субъектов (Sub), в соответствии с определениями иммунологическим методом.

На фиг. 16 показана средняя концентрация FP1 в виде интактного димера, представленная в процентах (%) от концентрации в момент времени 0, через 0, 4, 24 и 48 ч после инкубации ex vivo в плазме, полученной от двух человеческих субъектов (Sub), в соответствии с определениями интактного вещества методом иммуноафинного захвата/ЖХМС.

На фиг. 17 показано быстрое потребление пищи перед и после однократного введения тощим мышам-самцам линии C57BL6N белка GDF15 с различными вариантами N-концевой делеции (SEQ ID NO: 92, 111 и 112), по сравнению с диким типом гибрида без делеции (SEQ ID 26 с меткой бх His, присоединенной на N-конце). N = по 8 животных в группе; * р<0,05, по сравнению с носителем в контроле; значения р рассчитывали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 18 показано влияние однократной дозы FP2 на потребление пищи мышами линии C57BL/6; в частности, показано суммарное потребление пищи за 24 ч после введения. Цифры, показанные внутри виде столбцов, означают проценты снижения по сравнению с контрольной группой, получавшей PBS (среднее ±SEM); N = по 8 животных в группе во всех группах, за исключением группы с N=6, получавшей 6xHis-FPl. ** р<0,01, *** р<0,001, **** р<0,0001; значения р рассчитывали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и критерия Даннетта для множественных сравнений.

На фиг. 19 показано суммарное потребление пищи, измеренное у крыс линии Спрег-Доули за 24 ч после введения однократной дозы FP2. Цифры, показанные внутри виде столбцов, означают проценты снижения по сравнению с контрольной группой, получавшей PBS (среднее ±SEM); N = по 8 животных в группе. ** р<0,01; значения р рассчитывали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 20 показано процентное изменение массы тела мышей DIO во время введения FP2 по схеме q3d. Стрелки указывают время подкожных инъекций FP2; N = по 6 животных в группе; * р<0,05, по сравнению с носителем в контроле, с помощью двухфакторного дисперсионного анализа и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 21А и 21В показана площадь под кривой (AUC) для уровней концентрации глюкозы в крови, измеренных в тесте OGTT через 14 дней, в которые мышам DIO вводили FP2 по схеме q3d. * р<0,05, с помощью однофакторного дисперсионного анализа и критерия Тьюки для множественных сравнений, N = по 8 животных в группе.

На фиг. 22А показаны уровни инсулина в плазме, измеренные в тесте OGTT через 8 дней, в которые мышам DIO вводили FP2 по схеме q3d. * р<0,05, носитель в контроле, по сравнению с группами, получавшими FP2 (0,3 нмоль/кг); FP2 (10 нмоль/кг); и розиглитазон. # р<0,05, по сравнению с группой, получавшей розиглитазон (10 мг/кг), с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и критерия Тьюки для множественных сравнений.

На фиг. 22В показана AUC для уровней инсулина в плазме, измеренных в тесте OGTT через 8 дней, в которые мышам DIO вводили FP2 по схеме q3d. * р<0,05, по сравнению с носителем в контроле; # р<0,05, по сравнению с группой, получавшей розиглитазон.

На фиг. 23 показаны уровни глюкозы в крови, измеренные после еды, через 8 дней, в которые мышам DIO вводили FP2 по схеме q3d. * р<0,05, по сравнению с носителем в контроле, с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и критерия Тьюки для множественных сравнений, N = по 8 животных в группе.

На фиг. 24 показана оценка HOMA-IR у мышей DIO после 5 ч голодания, проведенная через 14 дней, в которые вводили FP2 по схеме q3d. * р<0,05, по сравнению с носителем в контроле, с помощью однофакторного дисперсионного анализа и критерия Тьюки для множественных сравнений, для N = по 8 животных в группе.

На фиг. 25 показаны концентрации FP2 в сыворотке после внутривенного (в/в) введения 2 мг/кг и подкожного (п/к) введения 2 мг/кг мышам линии C57BI/6. Значения представляют собой среднее +СО (N=5 проб на каждый момент времени).

На фиг. 26 показаны концентрации FP2 в сыворотке после внутривенного (в/в) введения 2 мг/кг и подкожного (п/к) введения 2 мг/кг крысам линии Спрег-Доули. N=5 проб на каждый момент времени.

На фиг. 27 показана концентрация FP2 в плазме у яванских макак, в соответствии с определениями

- 4 042423 иммунологическим методом. Значения представляют собой среднее ±СО при N=3, за исключением N=2 при в/в введении, на день 22 (через 528 ч).

в/в - внутривенно, п/к - подкожно.

На фиг. 28 показана концентрация FP2 в виде интактного димера в плазме у яванских макак, в соответствии с определениями методом ЖХМС. Значения представляют собой среднее ±SEM при N=3, за исключением N=2 при подкожном (п/к) введении через 168 ч, N=1 при п/к введении через 120 и 432 ч, и N=1 при внутривенном (в/в) введении через 168 и 432 ч.

На фиг. 29 показана стабильность ex vivo FP2 в человеческой плазме (нормализованное извлечение в процентах) в течение 48 ч, в соответствии с определениями иммунологическим методом.

На фиг. 30 показана стабильность ex vivo FP2 в человеческой плазме (нормализованное извлечение в процентах) в течение 48 ч, в соответствии с определениями методом ЖХМС.

На фиг. 31 показаны кривые зависимости от концентрации для FP2 и гетеродимера HSAGDF15:GDF15, полученные с помощью анализа рАКТ в клетках SK-N-AS, экспрессирующих рекомбинантный человеческий рецептор GFRAL (N=3).

На фиг. 32 показано суточное потребление пищи (г) яванскими макаками перед и после введения однократной дозы FP1.

* р<0,05, для группы с дозой FP1 10 мг/кг, по сравнению с носителем в контроле.

На фиг. 33 показано изменение массы тела яванских макак в процентах перед и после введения однократной дозы FP1. * р<0,05, для группы с дозой FP1 10 мг/кг, по сравнению с носителем в контроле; # р<0,05, для дозы 3 мг/кг, по сравнению с носителем в контроле, с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и критерия Тьюки для множественных сравнений, для N = по 8 животных в группе.

На фиг. 34 показано суточное потребление пищи (г) яванскими макаками перед и после введения однократной дозы FP2.

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле, с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и критерия Тьюки для множественных сравнений, для N = по 8 животных в группе.

На фиг. 35 показано изменение массы тела яванских макак в процентах перед и после введения однократной дозы FP2. * р<0,05, для группы с дозой FP2 10 нмоль/кг, по сравнению с носителем в контроле, # р<0,05, для дозы FP2 3 нмоль/кг, по сравнению с носителем в контроле, & р<0,05, для дозы FP2 1 нмоль/кг, по сравнению с носителем в контроле, с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями и критерия Тьюки для множественных сравнений, для N = по 8 животных в группе.

Подробное описание изобретения

В разделе Предпосылки создания изобретения и в тексте настоящей заявки приведены цитаты или описания различных публикаций, статей и патентов; каждая из этих ссылок полностью включена в настоящее описание путем ссылки. Обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий и т.п., которые были включены в настоящее описание, приведено в качестве контекста для настоящего изобретения. Такое обсуждение не является допущением того, что любой из или все такие источники являются частью предшествующего состояния знаний в отношении каких-либо описываемых или заявленных изобретений.

Все технические и научные термины в настоящем документе, если не указано иное, имеют общепринятое значение, понятное любому специалисту в области, к которой относится данное изобретение. В ином случае, определенные термины в настоящем документе имеют значения, установленные в настоящем описании. Все патенты, опубликованные заявки на патенты и публикации, упомянутые в настоящем документе, включены в него путем ссылки, как если бы они полностью излагались в настоящем документе. Следует отметить, что в настоящем документе и в приложенной формуле изобретения форма единственного числа включает объекты и во множественном числе, если из контекста явно не следует иное.

Настоящее изобретение относится к гибридному белку, содержащему (а) белок, продлевающий период полужизни, (b) линкер и (с) белок GDF15, причем гибридный белок составлен от N-конца до Сконца в порядке (а)-(b)-(с).

Оказалось, что гибридный белок в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, содержащий белок, продлевающий период полужизни, линкер и белок GDF15, продлевает период полужизни белка GDF15, причем гибридные белки настоящего изобретения показывают метаболические эффекты, которые демонстрируют пригодность их применения в качестве терапевтических средств для лечения и профилактики метаболических заболеваний, расстройств или состояний. Подобные эффекты включают, без ограничения, снижение массы тела, улучшение переносимости глюкозы и улучшение чувствительности к инсулину у животных, которым вводили гибридные белки.

Используемый в настоящем документе термин гибридный белок относится к белку, имеющему две или более частей, ковалентно связанных вместе, при этом каждая из частей происходит от разных белков.

- 5 042423

Гибридные белки в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения могут включать любой белок GDF15. Используемый в настоящем документе термин белок GDF15 относится к любому природному белку дикого типа из семейства ростового фактора дифференцировки 15 или любому его функциональному варианту. Белок GDF15 может происходить от любого млекопитающего, такого как человек или другое приемлемое млекопитающее, такое как мышь, кролик, крыса, свинья, собака или примат. В конкретных вариантах осуществления белок GDF15 представляет собой человеческий белок GDF15 или его функциональный вариант. В предпочтительных вариантах осуществления белок GDF15 представляет собой зрелый белок GDF15 или его функциональный вариант.

Используемый в настоящем документе термин зрелый белок GDF15 относится к части пре-пробелка GDF15, которая отделяется от полноразмерного белка после внутриклеточного расщепления по сайту расщепления RXXR, подобному сайту расщепления фурина. Зрелые белки GDF15 секретируются как гомодимеры, связанные через дисульфидные мостики. В одном варианте осуществления настоящего изобретения зрелый белок GDF15, кратко именуемый GDF15 (197-308) (SEQ ID NO: 6), содержит аминокислоты 197-308 из полноразмерного человеческого белка GDF15.

Используемый в настоящем документе термин функциональный вариант относится к варианту родительского белка, имеющему существенную или значительную степень идентичности с родительским белком и сохраняющему по меньшей мере одну из биологических активностей родительского белка. Функциональный вариант родительского белка можно приготавливать способом, известным в данной области, в контексте настоящего описания. Функциональный вариант может включать одну или более модификаций аминокислотной последовательности родительского белка. Модификации могут изменять физико-химические свойства полипептида, например, улучшать термостабильность полипептида, изменять специфичность субстрата, изменять оптимум рН и т.п. Модификации также могут изменять биологические активности родительского белка при условии, что они не уничтожают или не подавляют все биологические активности родительского белка.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения функциональный вариант родительского белка содержит замену, предпочтительно консервативную замену аминокислот родительского белка, которая не оказывает значительного влияния на биологическую активность родительского белка. Консервативные замены включают, без ограничения, замены аминокислот в пределах группы основных аминокислот (аргинин, лизин и гистидин), кислых аминокислот (глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), полярных аминокислот (глутамин и аспарагин), гидрофобных аминокислот (лейцин, изолейцин и валин), ароматических аминокислот (фенилаланин, триптофан и тирозин) и малых аминокислот (глицин, аланин, серин, треонин и метионин). Необычные или искусственные аминокислоты (такие, как 4-гидроксипролин, 6-N-метиллизин, 2-аминоизомасляная кислота, изовалин и альфаметилсерин) также можно применять для замены стандартных аминокислотных остатков в родительском белке.

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения функциональный вариант родительского белка содержит делецию и/или вставку из одной или более аминокислот в родительском белке. Например, функциональный вариант зрелого белка GDF15 может включать делецию и/или вставку из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более аминокислот в зрелом белке GDF15, предпочтительно делецию от 1 до 30 аминокислот на N-конце зрелого белка GDF15.

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения функциональный вариант родительского белка содержит замену, предпочтительно консервативную замену аминокислот, и делецию и/или вставку, предпочтительно малую делецию и/или вставку аминокислот, в родительском белке.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения гибридный белок изобретения содержит белок GDF15, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности зрелого белка GDF15, такой как GDF15 (197-308) (SEQ ID NO: 6); или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности зрелого белка GDF15, усеченной на N-конце, такой как GDF15 (200-308) (SEQ ID NO: 7), GDF15 (201-308) (SEQ ID NO: 8), GDF15 (202-308) (SEQ ID NO: 9), GDF15 (203-308) (SEQ ID NO: 10) или GDF15 (211-308) (SEQ ID NO: 11). Белок GDF15 может иметь по меньшей мере одну из замен, вставок и делеций в SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 или 11, при условии, что он сохраняет по меньшей мере одну из биологических активностей белка GDF15, таких как его влияние на потребление пищи, уровни глюкозы в крови, резистентность к инсулину, массу тела и т.п.

В конкретных вариантах осуществления гибридный белок настоящего изобретения содержит белок GDF15, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, включая, без ограничения, аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10 или 11.

В гибридных белках в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения можно применять любой приемлемый белок, продлевающий период полужизни. Используемый в настоящем документе термин белок, продлевающий период полужизни может обозначать любой белок или его фрагмент, о котором известно, что он продлевает период полужизни белков, с которыми его соединяют.

- 6 042423

Примеры таких белков, продлевающих период полужизни, включают, без ограничения, человеческий сывороточный альбумин (HSA), домен константной области (Fc) иммуноглобулина (Ig) или трансферрин (Tf). В вариантах осуществления настоящего изобретения белок, продлевающий период полужизни, содержит HSA или его функциональный вариант. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения белок, продлевающий период полужизни, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 1. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения белок, продлевающий период полужизни, содержит HSA или его функциональный вариант, в котором остаток цистеина в положении 34 молекулы HSA заменен серином или аланином.

В конкретных вариантах осуществления гибридный белок настоящего изобретения содержит белок, продлевающий период полужизни, который имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3.

В гибридных белках в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения можно применять любой приемлемый линкер. Используемый в настоящем документе термин линкер относится к связывающему компоненту, содержащему пептидный линкер. Предпочтительно, чтобы линкер помогал обеспечивать правильную укладку, минимизировать стерические препятствия и не нарушал существенным образом структуру каждого функционального компонента в пределах гибридного белка. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пептидный линкер содержит 2-120 аминокислот. Например, пептидный линкер содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,

21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50,

51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,

81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107,

108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 или 120 аминокислот.

В вариантах осуществления настоящего изобретения линкер повышает гибкость компонентов гибридного белка. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения линкер может представлять собой гибкий линкер, содержащий последовательность (GGGGS)n, включая, без ограничения, GS-(GGGGS)n или AS-(GGGGS)n-GT, где n составляет от 2 до 20, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения линкер структурирован. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения линкер может представлять собой структурированный линкер, содержащий последовательность (АР)п или (ЕАААК)п, включая, без ограничения, AS(АР)n-GT или AS-(ЕАААК)n-GT, где n составляет от 2 до 20, например 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15. В других вариантах осуществления настоящего изобретения линкер содержит последовательности (GGGGA)n, (PGGGS)n, (AGGGS)n или GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS, где n составляет от 2 до 20.

В вариантах осуществления настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательностям SEQ ID NO: 5, 25-30, 36-37, 40, 48, 55-56, 59-60 или 64-75. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 25-30, 36-37, 40, 48, 55-56, 59-60 и 64-75. В более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 25-30, 40, 55-56, 55-56, 59-60 и 70. В дополнительных более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения гибридный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 60 или SEQ ID NO: 26. Гибридный белок может также включать малое удлинение (удлинения) на аминном или карбоксильном конце белка, такое как метка, упрощающая очистку, например, полигистидиновая метка, антигенный эпитоп или связывающий домен.

Описанный в настоящем документе гибридный белок можно характеризовать или оценивать по биологическим активностям GDF15, включая, без ограничения, влияние на потребление пищи, пероральные тесты на переносимость глюкозы, измерения уровней глюкозы в крови, анализ на резистентность к инсулину, изменения массы тела, фармакокинетический анализ, токсикокинетический анализ, иммунологические методы и масс-спектрометрический анализ уровня и стабильности полноразмерных гибридных белков, а также анализ стабильности ex vivo в плазме человеческой крови.

В настоящем изобретении также предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок настоящего изобретения. В вариантах осуществления настоящего изобретения выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID NO: 5, 25-30, 36-37, 40, 48, 55-56, 5960 или 64-75. В конкретных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 25-31, 36-37, 40, 48, 55-56, 59-60 и 64-75. В более конкретных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 25-30, 40, 55-56, 5960 и 70. В дополнительных более конкретных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 76-91.

- 7 042423

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок, может представлять собой экспрессионный вектор. Экспрессионные векторы включают, без ограничения, векторы для экспрессии рекомбинантных белков и векторы для доставки нуклеиновых кислот в субъекте, для экспрессии в ткани субъекта, например, вирусные векторы. Примеры вирусных векторов, приемлемых для применения в настоящем изобретении, включают, без ограничения, аденовирусные векторы, адено-ассоциированные вирусные векторы, лентивирусные векторы и т.п. Вектор также может представлять собой невирусный вектор. Примеры невирусных векторов включают, без ограничения, плазмиды, искусственные хромосомы бактерий, искусственные хромосомы дрожжей, бактериофаги и т.п. Вектор может включать любые элементы для выполнения обычной функции экспрессионного вектора, например, промотор, связывающий рибосомы элемент, терминатор, усилитель, селективный маркер или точку начала репликации.

В соответствии с другими вариантами осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок, может иметь оптимизированные кодоны с целью улучшения рекомбинантной экспрессии от желаемой клетки-хозяина, такой как человеческая эмбриональная клетка почек (НЕК) или клетка яичника китайского хомячка (СНО), с помощью известных в данной области способов в контексте настоящего описания.

В настоящем изобретении также предложена клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует гибридный белок настоящего изобретения. Клетки-хозяева включают, без ограничения, клетки-хозяева для экспрессии рекомбинантных белков и клетки-хозяева для доставки нуклеиновой кислоты в субъекте для экспрессии в ткани субъекта. Примеры клеток-хозяев, приемлемых для применения в настоящем изобретении, включают, без ограничения, клетки НЕК или СНО.

В еще одном общем аспекте настоящее изобретение относится к способу продуцирования гибридного белка настоящего изобретения. В общем аспекте способ содержит этапы, на которых: (1) культивируют клетку-хозяина, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гибридный белок, в условиях, при которых продуцируется гибридный белок, и (2) выделяют гибридный белок, продуцированный клеткой-хозяином. Гибридный белок можно дополнительно очистить с помощью способов, известных в данной области.

В некоторых вариантах осуществления гибридный белок экспрессируют в клетках-хозяевах и выделяют из них с помощью сочетания из одного или более стандартных методов очистки, включая, без ограничения, аффинную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, ультрафильтрацию и диализ. Предпочтительно, чтобы гибридный белок был полностью очищен от любых протеаз.

В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая гибридный белок настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.

В настоящем изобретении дополнительно предложена композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гибридный белок настоящего изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель. Композиции, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гибридный белок настоящего изобретения, могут содержать носитель для доставки, для введения молекулы нуклеиновой кислоты в клетку с целью экспрессии гибридного белка. Примеры носителей для доставки нуклеиновых кислот включают липосомы, биосовместимые полимеры, включая природные полимеры и синтетические полимеры, липопротеины, полипептиды, полисахариды, липополисахариды, искусственные вирусные оболочки, металлические частицы, бактерии, вирусы, такие как бакуловирусы, аденовирусы и ретровирусы, бактериофаги, космиды, плазмиды, грибковые векторы и другие рекомбинантные носители, обычно используемые в данной области и описанные ранее для экспрессии в разных эукариотических хозяевах.

Фармацевтически приемлемый носитель может включать один или более из фармацевтически приемлемого эксципиента, буферного раствора, стабилизатора, а также других материалов, известных специалистам в данной области. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают, без ограничения, один или более из воды, солевого раствора, буферного раствора, изотонических агентов, таких как сахара, многоатомных спиртов, вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консервантов, а также их сочетания. Такие материалы должны быть нетоксичными и должны не влиять на эффективность активного ингредиента в применяемых дозах и концентрациях. Определенные свойства носителя или другого материала могут зависеть от пути введения, например, внутримышечным, подкожным, пероральным, внутривенным, кожным, интрамукозальным (например, в слизистую кишечника), интраназальным или внутрибрюшинным путем. Например, жидкие фармацевтические композиции по существу включают жидкий носитель, такой как вода, углеводороды, животные или растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. Также можно включать физиологический солевой раствор, раствор глюкозы или другого сахарида, или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Композиции для парентерального введения можно хранить в лиофилизированной форме или в виде раствора, при этом их, как правило, помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, такой как пакет для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, выполненную с возможностью прокалывания иглой для подкожных инъекций.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения фармацевтическая компози- 8 042423 ция может содержать один или более дополнительных компонентов, таких как другой активный ингредиент.

Настоящее изобретение также относится к наборам, содержащим фармацевтическую композицию настоящего изобретения. Наборы могут содержать первый контейнер, в котором имеется высушенный гибридный белок настоящего изобретения, и второй контейнер, в котором имеется водный раствор, предназначенный для смешивания с высушенным гибридным белком перед введением субъекту, либо только один контейнер, содержащий жидкую фармацевтическую композицию настоящего изобретения. Набор может содержать блок введения на одну дозу фармацевтической композиции настоящего изобретения или блок введения на множество доз. Набор может также включать один или более предварительно заполненных шприцев (например, шприцев с жидкостью и шприцев с лиофилизатом). Набор может также содержать инструкцию по его применению. Такая инструкция может описывать применение и свойства материалов, предоставленных в наборе, и ее можно составлять в соответствии с конкретным метаболическим расстройством, подлежащим лечению.

Настоящее изобретение также относится к применению описанных в настоящем документе фармацевтических композиций для лечения или профилактики метаболического заболевания, расстройства или состояния, такого как диабет 2-го типа, повышенные уровни глюкозы, повышенные уровни инсулина, ожирение, дислипидемия, диабетическая нефропатия, ишемическое поражение миокарда, застойная сердечная недостаточность или ревматоидный артрит. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения способ лечения или профилактики метаболического заболевания, расстройства или состояния содержит введение нуждающемуся в лечении субъекту терапевтически или профилактически эффективного количества фармацевтической композиции настоящего изобретения. Любые из описанных в настоящем документе фармацевтических композиций можно применять в способе настоящего изобретения, включая фармацевтические композиции, содержащие гибридный белок настоящего изобретения, или фармацевтические композиции, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок.

Используемый в настоящем документе термин субъект означает любое животное, конкретно млекопитающее, наиболее конкретно человека, которое будет или было подвергнуто лечению способом в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Используемый в настоящем документе термин млекопитающее охватывает любое млекопитающее. Примеры млекопитающих включают, без ограничения, коров, лошадей, овец, свиней, кошек, собак, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, приматов, кроме человека (NHP), таких как низшие и высшие обезьяны, и т.п., и более конкретно, человека.

Метаболическое заболевание, расстройство или состояние означают любое расстройство, связанное с аномальным метаболизмом. Примеры метаболических заболеваний, расстройств или состояний, которые можно лечить в соответствии со способом настоящего изобретения, включают, без ограничения, диабет 2-го типа, повышенные уровни глюкозы, повышенные уровни инсулина, ожирение, дислипидемию, диабетическую нефропатию, ишемическое поражение миокарда, застойную сердечную недостаточность или ревматоидный артрит.

Используемые в настоящем документе термины лечить, лечение относятся к введению композиции субъекту для достижения желаемого терапевтического или клинического исхода у субъекта. В одном варианте осуществления термины лечить, лечение относятся к введению фармацевтической композиции настоящего изобретения для снижения, ослабления или замедления прогрессии или развития метаболического расстройства, такого как диабет 2-го типа, повышенные уровни глюкозы, повышенные уровни инсулина, ожирение, дислипидемия, диабетическая нефропатия, ишемическое поражение миокарда, застойная сердечная недостаточность или ревматоидный артрит.

Термин терапевтически эффективное количество означает количество терапевтически активного соединения, необходимого для получения желаемого биологического или клинического эффекта. В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения термин терапевтически эффективное количество означает количество, достаточное для обеспечения положительных или желаемых результатов, включая клинические результаты. Терапевтически эффективное количество можно вводить за одну или более процедур введения. Применительно к болезненному состоянию, эффективное количество представляет собой количество, достаточное для облегчения, стабилизации или задержки развития заболевания. В соответствии с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество представляет собой количество гибридного белка, необходимое для лечения или профилактики метаболического заболевания, расстройства или состояния, такого как диабет 2-го типа, повышенные уровни глюкозы, повышенные уровни инсулина, ожирение, дислипидемия, диабетическая нефропатия, ишемическое поражение миокарда, застойная сердечная недостаточность или ревматоидный артрит.

В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию настоящего изобретения можно вводить субъекту любым способом, известным специалистам в данной области в контексте настоящего описания, например, с применением внутримышечного, подкожного, перорального, внутривенного, кожного, интрамукозального (например, в слизистую кишечника), интраназального или внутрибрюшинного пути введения.

- 9 042423

В конкретных вариантах осуществления фармацевтическую композицию настоящего изобретения вводят субъекту путем внутривенной инъекции или подкожной инъекции.

Такие параметры, как величина дозы, частота введения и продолжительность введения фармацевтической композиции субъекту в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, не ограничены каким-либо конкретным образом. Оптимальные значения таких параметров могут зависеть от различных факторов, таких как особенности субъекта, подлежащего лечению, конкретное метаболическое заболевание, подлежащее лечению, степень тяжести заболевания, путь введения и т.п., при этом специалист в данной области сможет определить оптимальные значения для таких параметров с целью достижения желаемого терапевтического или клинического исхода. Например, фармацевтическую композицию можно вводить один раз в день или более одного раза в день, например, два раза, три раза, четыре раза и т. п. Обычная доза гибридного белка может варьировать в интервале от около 0,1 мкг/кг до около 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, таких как перечислены выше.

Варианты осуществления

Вариант осуществления 1 представляет собой гибридный белок, содержащий: (а) белок, продлевающий период полужизни, (b) линкер и (с) белок GDF15; причем гибридный белок составлен от Nконца до С-конца в порядке (а)-(b)-(с).

Вариант осуществления 2 представляет собой гибридный белок варианта осуществления 1, в котором белок GDF15 представляет собой человеческий белок GDF15 или его функциональный вариант.

Вариант осуществления 3 представляет собой гибридный белок варианта осуществления 1, в котором белок GDF15 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-11.

Вариант осуществления 4 представляет собой гибридный белок варианта осуществления 1, в котором белок GDF15 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.

Вариант осуществления 5 представляет собой гибридный белок варианта осуществления 4, в котором белок GDF15 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-11.

Вариант осуществления 6 представляет собой гибридный белок любого из вариантов осуществления 1-5, в котором белок, продлевающий период полужизни, содержит человеческий сывороточный альбумин (HSA) или его функциональный вариант.

Вариант осуществления 7 представляет собой гибридный белок варианта осуществления 6, в котором белок, продлевающий период полужизни, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1.

Вариант осуществления 8 представляет собой гибридный белок варианта осуществления 7, в котором белок, продлевающий период полужизни, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3.

Вариант осуществления 9 представляет собой гибридный белок любого из вариантов осуществления 1-8, в котором линкер представляет собой гибкий линкер.

Вариант осуществления 10 представляет собой гибридный белок варианта осуществления 9, в котором линкер содержит последовательность (GGGGS)n, где n составляет от 2 до 20, например GS(GGGGS)x8 или AS-(GGGGS)x8-GT.

Вариант осуществления 11 представляет собой гибридный белок любого из вариантов осуществления 1-9, в котором линкер представляет собой структурированный линкер.

Вариант осуществления 12 представляет собой гибридный белок варианта осуществления 11, в котором линкер содержит последовательность (АР)п или (ЕАААК)п, где n составляет от 2 до 20, например AS-(AP)n-GT или AS-(ЕАААК)n-GT.

Вариант осуществления 13 представляет собой гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 5, 25-31, 36-37, 40, 48, 55-60 или 64-75.

Вариант осуществления 14 представляет собой гибридный белок варианта осуществления 13, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 2531, 36-37, 40, 48, 55-60 и 64-75.

Вариант осуществления 15 представляет собой гибридный белок варианта осуществления 14, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 2530, 40, 55-60 и 70.

Вариант осуществления 16 представляет собой выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гибридный белок любого одного из вариантов осуществления 1-15.

Вариант осуществления 17 представляет собой выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 76-91.

Вариант осуществления 18 представляет собой экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты варианта осуществления 16 или 17.

Вариант осуществления 19 представляет собой клетку-хозяина, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты варианта осуществления 16 или 17.

- 10 042423

Вариант осуществления 20 представляет собой способ продуцирования гибридного белка любого одного из вариантов осуществления 1-15, содержащий этапы, на которых: (1) культивируют клеткухозяина, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гибридный белок, в условиях, при которых продуцируется гибридный белок; и (2) выделяют гибридный белок, продуцированный клеткойхозяином.

Вариант осуществления 21 представляет собой способ варианта осуществления 20, в котором стадия выделения содержит очистку гибридного белка с удалением протеаз.

Вариант осуществления 22 представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество гибридного белка любого одного из вариантов осуществления 1-15 и фармацевтически приемлемый носитель.

Вариант осуществления 23 представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих гибридный белок любого одного из вариантов осуществления 1-15 и фармацевтически приемлемый носитель.

Вариант осуществления 24 представляет собой набор, содержащий фармацевтическую композицию варианта осуществления 22 или 23.

Вариант осуществления 25 представляет собой способ лечения или профилактики метаболического расстройства, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества фармацевтической композиции любого из вариантов осуществления 22 и 23.

Вариант осуществления 26 представляет собой способ варианта осуществления 25, в котором метаболическое расстройство выбрано из группы, состоящей из диабета 2-го типа, повышенных уровней глюкозы, повышенных уровней инсулина, ожирения, дислипидемии, диабетической нефропатии, ишемического поражения миокарда, застойной сердечной недостаточности или ревматоидного артрита.

Вариант осуществления 27 представляет собой способ варианта осуществления 25 или 26, в котором фармацевтическую композицию вводят субъекту подкожно или внутривенно.

Вариант осуществления 28 представляет собой способ лечения метаболического расстройства, выбранного из группы, состоящей из диабета 2-го типа, повышенных уровней глюкозы, повышенных уровней инсулина, ожирения, дислипидемии, диабетической нефропатии, ишемического поражения миокарда, застойной сердечной недостаточности или ревматоидного артрита, у субъекта, нуждающегося в таком лечении, при этом способ включает подкожное или внутривенное введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5, 25-30, 40, 5560 и 70, и фармацевтически приемлемый носитель.

Вариант осуществления 29 представляет собой способ лечения метаболического расстройства, выбранного из группы, состоящей из диабета 2-го типа, повышенных уровней глюкозы, повышенных уровней инсулина, ожирения, дислипидемии, диабетической нефропатии, ишемического поражения миокарда, застойной сердечной недостаточности или ревматоидного артрита, у субъекта, нуждающегося в таком лечении, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и фармацевтически приемлемый носитель.

Вариант осуществления 30 представляет собой способ любого одного из вариантов осуществления 25-29, в котором фармацевтическую композицию вводят субъекту внутривенно или подкожно.

Вариант осуществления 31 представляет собой гибридный белок любого одного из вариантов осуществления 1-15 для применения при лечении или профилактике метаболического расстройства, выбранного из группы, состоящей из диабета 2-го типа, повышенных уровней глюкозы, повышенных уровней инсулина, ожирения, дислипидемии, диабетической нефропатии, ишемического поражения миокарда, застойной сердечной недостаточности или ревматоидного артрита.

Примеры

Для дополнительной иллюстрации характера настоящего изобретения предложены следующие примеры изобретения. Следует понимать, что следующие ниже примеры не ограничивают изобретение, и что объем изобретения определен прилагаемыми пунктами формулы изобретения.

Пример 1. Конфигурация гибридных молекул, содержащих GDF15 - влияние усечений GDF15.

Подобно другим членам семейства TGFe, белок GDF15 синтезируется как пре-про-белок, который образует димер в эндоплазматическом ретикулуме и подвергается фуриновому расщеплению с продуцированием секретируемого зрелого GDF15 (аминокислоты 197-308). Секретируемый зрелый гомодимер GDF15 имеет массу около 25 кДа, и каждый мономер способен образовывать до 4 внутримолекулярных дисульфидных связей с одним межмолекулярным дисульфидом, связывающим компоненты гомодимера.

Кристаллическая структура GDF15 определена в настоящем изобретении и показана на фиг. 1А и 1В. Из кристаллической структуры видно, что С-конец зрелого GDF15 скрыт на границе раздела димеров, в то время как N-конец остается открытым. Этот открытый конец позволяет связывать гибридные белки, такие как белки, продлевающие период полужизни, с N-концом GDF15.

В кристаллической структуре также виден новый узор дисульфидных мостиков между цистеино- 11 042423 выми остатками GDF15. В то время как TGFpi имеет мостики С1-С3 и C2-C7 (т.е. мостики между его первым и третьим цистеиновыми остатками, а также между его вторым и седьмым цистеиновыми остатками), GDF15 имеет мостики С1-С2 и С3-С7 (см. фиг. 1А и 1В). Эти уникальные дисульфидные мостики приводят к замыканию петли, образованной мостиком С1-С2, который расположен на N-конце белка и на удалении от цистеинового узла, который содержит другие дисульфидные связи. Исходя из структуры, можно предположить, что N-конец GDF15 может не быть критическим для образования димера или общего складывания белка, и что GDF15 и присоединенные молекулы на его N-конце могут быть толерантны к делециям на N-конце, которые удаляют остатки С1 и С2, остатки внутри петли С1-С2 и даже остатки на С-конце, связанные с С2.

Пример 2. Конфигурация гибридных молекул, содержащих GDF15 - влияние линкера.

Были оценены различные линкеры между молекулой HSA и молекулой GDF15. Оценке подвергались как гибкие линкеры, содержащие последовательность (GGGGS)n, так и структурированные линкеры, содержащие последовательность (АР)п или (ЕАААК)п, где n составляет 2-20.

Гибридные белки, содержащие различные линкеры, сравнивали по их биофизическим свойствам, их влиянию на эффективность потребления пищи тощими мышами, их фармакокинетическим (ФК) параметрам у мышей, и их стабильности ex vivo в человеческой крови. Результаты испытаний вариантов линкеров показаны в табл. 1. Молекула, содержащая SEQ ID NO: 31, которая содержала линкер (ЕАААК)₈, по данным ВЭЖХ образовывала агрегаты. Оставшиеся семь вариантов линкеров по табл. 1 не образовывали агрегатов.

Таблица 1

Обобщенные данные анализа вариантов линкеров

SEQ ID NO*	Линкер	Агрегация	Хорошие фармакокинетические (ФК) параметры у мышей (WT)	Стабильность ex vivo в человеческой крови
25	AS (GGGGS) ₂GT	Нет	Да	Да
5	GS(GGGGS)4	Нет	Да	Да
26	AS(GGGGS)₈GT	Нет	Да	Да
27	AS (AP) ₅GT	Нет	Да	Да
28	AS (AP) ₁₀GT	Нет	Да	Да
29	AS (AP) ₂₀GT	Нет	Да	Да
30	AS (EAAAK) ₄GT	Нет	Да	Да
31	AS (EAAAK) ₈GT	ДА	Не исследован	Не исследован

* На N-конец была присоединена метка 6xHis для целей очистки.

Для этих вариантов также оценивалась стабильность линкеров по исследованиям in vivo у мышей, а также по исследованиям стабильности ex vivo в пробах человеческой цельной крови и плазмы. В анализе результатов, полученных в этих исследованиях, применяли две формы обнаружения. Оценку интактности линкера проводили методом иммуноанализа с парами антител, анти-GDF15 для захвата и анти-HSA для обнаружения, причем определяли наличие обеих молекул с какой-либо из сторон линкера. Более широкую картину целостности всей молекулы анализировали методом жидкостной хроматографии/массспектрометрии (ЖХМС) с использованием различных суррогатных пептидных последовательностей из HSA и GDF15. Иммуноанализ показал стабильный ФК профиль для всех вариантов линкеров и отсутствие потери концентрации в пробах плазмы с добавками для любого из вариантов линкеров по результатам наблюдения в течение 48 ч. Результаты ЖХМС согласовывались с результатами иммуноанализа, подтверждая, что суррогатные пептиды из различных участков молекул HSA и GDF15 были интактными. ФК профиль вариантов линкеров, подвергнутых анализу методом ЖХМС с использованием суррогатных пептидов, показал аналогичные тенденции для различных вариантов линкеров, причем все они на 7-й день имели обнаруживаемые уровни. Все варианты, приведенные в табл. 1, за исключением SEQ ID 31, имели желаемые биофизические свойства и ФК параметры.

Варианты линкеров оценивали по их активности in vivo путем проведения исследований потребле- 12 042423 ния пищи тощими мышами. В табл. 2 показано влияние вариантов линкеров на эффективность гибридного белка в отношении снижения потребления пищи. Показано явное влияние линкера на указанную эффективность. Что касается гибких линкеров (GGGGS)n, увеличение длины линкера от 2 до 4-8 привело к существенному увеличению эффективности гибридного белка. Для более ригидных линкеров (АР)п эта тенденция была менее очевидной, подтверждая, что решающую роль в эффективности гибридного белка играет степень свободы молекулы GDF15.

Таблица 2

Влияние линкера на эффективность in vivo гибридных белков HSA-GDF15 у тощих мышей

SEQ ID NO*	Линкер	Снижение потребления пищи, % (среднее)
25	AS(GGGGS)₂GT	28,8
5	GS(GGGGS)4	40,5
26	AS(GGGGS)₈GT	60,7
27	AS (AP) ₅GT	48,2
28	AS (AP) ₁₀GT	66,2
29	AS (AP) ₂₀GT	55, 1
30	AS(EAAAK) ₄GT	51,9

* Ha N-конец была присоединена метка 6xHis для целей очистки.

Пример 3. Конфигурация гибридных молекул, содержащих GDF15 - влияние мутаций HAS.

Были составлены рекомбинантные белки, состоящие из белка, продлевающего период полужизни, человеческого сывороточного альбумина, присоединенного к N-концу GDF15 посредством линкер. Такая конфигурация будет обеспечивать целостность интерфейса димеризации GDF15 и допускать соединение через нативные межцепочечные дисульфидные мостики, приводя к образованию гомодимера GDF15, в котором из каждого плеча GDF15 выдвинут слитый с ним HSA. При таком подходе для создания гомодимера HSA-GDF15 требуется только один ген.

Нативный человеческий сывороточный альбумин содержит 35 цистеиновых (Cys, С) остатков, которые образуют 17 дисульфидных мостиков, при этом остаток Cys-34 является единственным свободным цистеином в молекуле. Было показано, что этот свободный остаток Cys-34 функционирует как акцептор свободных радикалов, улавливая множество активных форм кислорода (ROS) и активных форм азота (RNS). Поэтому свободный остаток Cys заменили так, чтобы минимизировать риск гетерогенности в результате окисления.

Свободный цистеин в положении 34 HSA заменили на серин либо аланин, и анализировали гибридные молекулы GDF15 с мутацией HSA (C34S) или HSA (C34A). Обе молекулы очищали с применением трехэтапного способа очистки: (i) ионообменная хроматография, (ii) гидрофобная хроматография и (iii) эксклюзионная хроматография. Сразу же после создания этих молекул анализ ВЭЖХ показал, что обе молекулы были чистыми и не содержали агрегатов (табл. 3).

Однако через две недели после создания гибридного белка с мутацией HSA (C34A) (содержащего SEQ ID NO: 48), анализ ВЭЖХ показал наличие в нем агрегатов, тогда как гибридный белок с мутацией HSA (C34S) (содержащий SEQ ID NO: 40) и через четыре недели не содержал агрегатов.

Таблица 3

Влияние мутации HSA C34 на агрегацию гибридного белка

SEQ ID NO	Мутация HSA	% агрегации сразу после очистки	% агрегации через 2 недели после очистки
40	C34S	0	0
48	C34A	0	33,29

Пример 4. Предрасположение к расщеплению протеазами в GDF15.

Авторы изобретения наблюдали, что остаток аргинина в положении аминокислоты 198 GDF15 (R198) предрасположен к расщеплению протеазами в гибридных молекулах HSA-GDF15. Такое расщепление приводит к образованию гетерогенной популяции и нежелательно для терапевтических композиций. Это расщепление можно предотвратить с помощью смеси ингибиторов протеаз. Были проведены исследования способов очистки для удаления протеазы. В табл. 4 перечислены два типа колонок для проведения аффинной хроматографии HSA, которые испытывались для очистки гибридных белков HSAGDF15, с определением методом ВЭЖХ. Сразу после очистки гибридные белки HSA-GDF15, очищенные обоими способами, были на 100% чистыми и интактными. При низких концентрациях (2-5 мг/мл) белки, очищенные обоими способами, оставались интактными в течение всего периода испытания 4 недели. Однако при высоких концентрациях (40-50 мг/мл) только смола с антителами к HSA (CaptureSelect) очищала от протеазы белки, которые затем оставались интактными в течение всего периода испытания 4

- 13 042423 недели. Смола с лигандами HSA (Albupure) очищала белки, которые вначале были интактными, но затем во время хранения в высоких концентрациях подвергались расщеплению. Добавление смеси ингибиторов протеаз (PI) и ЭДТА полностью подавляло расщепление партии гибридного белка HSA-GDF15 в высокой концентрации, очищенной с помощью смолы Albupure. Таким образом, способ очистки играет решающую роль в создании стабильной терапевтической композиции. Соответствующая деградация не наблюдалась in vivo или ex vivo, подтверждая, что после очистки терапевтической композиции от протеазы расщепление гибридных белков не является проблемой in vivo. Таким образом, способы очистки, позволяющие эффективно удалять возможные молекулы протеазы во время приготовления, например применение смолы CaptureSelect, играют ключевую роль в успешном производстве терапевтических препаратов GDF15, которые являются гомогенными, интактными и стабильными.

Таблица 4

Расщепление гибридных белков HSA-GDF15 протеазами можно предотвратить с помощью способов очистки проб

Условия	% расщепления в популяции HSA-GDF15 (SEQ ID 60)
Концентрация	Смола	+ PI/ ЭДТА	НЕДЕЛЯ 0	НЕДЕЛЯ 1	НЕДЕЛЯ 2	НЕДЕЛЯ 3	НЕДЕЛЯ 4
Низкая	Capture Select	Нет	0	0	0	0	0
Низкая	Albupure	Нет	0	0	0	0	0
Высокая	Capture Select	Нет	0	0	0	0	0
Высокая	Albupure	Нет	0	3, 04	9, 47	11,57	13, 89
Высокая	Capture Select	Да	0	0	0	0	0
Высокая	Albupure	Да	0	0	0	0	0

Пример 5. Варианты GDF15 с N-концевыми делециями.

Кристаллическая структура GDF15, показанная На фиг. 1А и 1В, позволяет предположить, что Nконец GDF15, затронутый в вариантах делеции, не является критическим для образования димера или общего складывания белка. Это также позволяет предположить, что такие N-концевые делеции не повлияют на взаимодействие с возможными рецепторами. Гибридные белки HSA-GDF15, содержащие различные делеции N-конца GDF15, были испытаны на активность in vivo.

Были запланированы варианты N-концевых делеций GDF15, которые удаляли сайт расщепления протеазами в GDF15 (R198). Непосредственно за остатком R198, у остатков N199-G200 имеется потенциальный сайт дезамидирования, а дезамидирование субстрата тоже нежелательно в терапевтических композициях. N-концевые делеции GDF15 могут одновременно удалить и сайт протеолитического расщепления, и сайты дезамидирования. Полученные в результате варианты делеций GDF15, которые были встроены в гибридные белки с HSA, включали GDF15 (201-308; SEQ ID NO: 8), GDF15 (202-308; SEQ ID NO: 9) и GDF15 (211-308; SEQ ID NO: 11). Исследования in vivo у мышей показали, что варианты GDF15 с N-концевыми делециями по-прежнему активно влияют на снижение потребления пищи (фиг. 17). Экспериментальные данные подтвердили, что такие варианты GDF15 с N-концевыми делециями правильно экспрессируются, образуют надлежащие димеры и активны in vivo.

Пример 6. Неактивные мутанты GDF15.

В табл. 5 перечислены двенадцать мутантов GDF15, которые были созданы для подавления активности GDF15 in vivo и определения функционального эпитопа GDF15. Эти мутанты включают пять точечных мутантов, два двойных мутанта и пять тройных мутантов. Гибридные белки HSA-GDF15, содержащие эти мутации, были характеризованы по их биофизическим свойствам и активности (табл. 5). Из 12 мутантов один не экспрессировался, а четыре со временем образовывали агрегаты, указывая на то, что эти мутации нарушают складывание белков и их биофизические свойства. Четыре из оставшихся семи мутантов содержали точечную мутацию GDF15, и эти мутанты испытывали на мышах на предмет снижения потребления пищи по сравнению с диким типом. Три из этих точечных мутантов (I89R, I89W и W32A) утратили активность in vivo, а один мутант (Q60W) остался таким же активным, как дикий тип. Эти результаты показывают, что мутация I89R, I89W или W32A прерывает взаимодействие рецептора/корецептора с GDF15, подтверждая, что функциональные эпитопы GDF15 находятся возле остатков I89 и W32. Мутации пронумерованы на основе зрелого GDF15, вставленного в гибридный белок, т.е. 1 относится к 1-й аминокислоте зрелого GDF15 (SEQ ID NO: 6), а 89 относится к 89-й аминокислоте зрелого белка GDF15.

- 14 042423

Таблица 5

Обобщенные данные биофизических свойств и активности гибридных белков, содержащих мутанты

GDF15

SEQ ID NO	Мутации в GDF15	Биофизические свойства	Активность
5	Дикий тип	Хорошо экспрессируется, стабильный	Активность дикого типа
64	I8 9R	Хорошо экспрессируется, стабильный	Полная потеря активности
65	I8 9W	Хорошо экспрессируется, стабильный	Полная потеря активности
66	L34A, S35A, R37A	Хорошо экспрессируется, стабильный
67	V87A, I89A, L98A	Хорошо экспрессируется, нестабильный
68	L34A, S35A, I89A	Хорошо экспрессируется, стабильный
69	V87A, I89A	Хорошо экспрессируется, стабильный
70	Q60W	Хорошо экспрессируется, стабильный	Такой же активный, как дикий тип
71	W32A	Хорошо экспрессируется, стабильный	Полная потеря активности
72	W2 9A	Хорошо экспрессируется, нестабильный
73	Q60A, S64A, R67A	Хорошо экспрессируется, нестабильный
74	W29A, Q60A, I61A	Не экспрессируется
75	W29A, W32A	Хорошо экспрессируется, нестабильный

* На N-конец была присоединена метка 6х His для целей очистки.

Пример 7. Экспрессия и способы очистки.

Экспрессия.

Для экспрессии 20 мл и больше, экспрессию проводили в клетках НЕК Expi293™, выращенных в среде экспрессии Expi293™. Клетки выращивали при температуре 37°С, при встряхивании со скоростью 125 об/мин, в среде с 8% СО2. Клетки трансфицировали с плотностью 2,5x106 клеток/мл, с использованием набора экспрессии Expi293™. На каждый литр трансфицированных клеток, 1 мг тотальной ДНК разводили в 25 мл Opti-MEM, и 2,6 мл реагента Expi293™ разводили в 25 мл Opti-MEM, и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Разведенную ДНК и разведенный реагент Expi293 объединяли и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем комплекс ДНК добавляли к клеткам. Клетки помещали на ночь во встряхиватель-инкубатор. На следующий день после трансфекции, 5 мл реагента Enhancer 1 из набора разводили в 50 мл реагента Enhancer 2 из набора, и весь объем из двух реагентов Enhancer добавляли к клеткам. Трансфицированные клетки помещали обратно в инкубатор на 4 дня до их отбора. Клетки концентрировали центрифугированием при 6000 g в течение 30 мин, а затем фильтровали через фильтр с ячейкой 0,2 мкм перед этапом очистки.

Экспрессию также проводили в клетках СНО. Плазмиду подвергали очистке и анализу. Перед трансфекцией 1 аликвоту в 200 мкг плазмидной ДНК, содержащей кодирующую область HSA-GDF15, линеаризовали путем расщепления рестрикционным ферментом Acl I. Расщепление данной рестрикционной эндонуклеазой обеспечивает удаление гена резистентности к ампициллину. Две линеаризованные аликвоты по 15 мкг ДНК трансфицировали в двух порциях по 1 x 10⁷ клеток СНО (обозначены как пулы трансфекции А и В) с помощью электроманипулятора клеток ВТХ ЕСМ 830 Electro Cell Manipulator (Harvard Apparatus, г. Холлистон, штат Массачусетс, США). Клетки подвергали 3-кратной электропорации под напряжением 250 вольт с длительностью импульсов 15 миллисекунд и интервалами между импульсами 5 секунд, в кювете с шириной зазора 4 мм. Трансфицированные клетки переносили во встряхи- 15 042423 ваемую колбу, содержащую MACH-l+L-глутамин, и инкубировали в течение 1 суток. Пул трансфекции

А и пул трансфекции В центрифугировали, ресуспендировали в среде MACH-1+MSX и переносили во встряхиваемые колбы для инкубации в течение 6 суток. Трансфицированные клетки, продуцирующие

HSA-гибридный белок, из пула трансфекции А и пула трансфекции В объединяли и высевали в метилцеллюлозу на 8-й день после электропорации.

Очистка.

Проводили двухэтапную очистку с применением смолы CaptureSelect и эксклюзионной хроматографии. Супернатанты над клетками от временно трансфицированных клеток Expi293™ загружали в предварительно уравновешенную (PBS, рН 7,2) колонку со смолой CaptureSelect для связывания HSA (Матрица аффинности к человеческому альбумину CaptureSelect от компании ThermoFisher Scientific) при приблизительной емкости 10 мг белка на 1 мл смолы. После загрузки несвязанные белки удаляли путем промывания колонки PBS с рН 7,2 в количестве 10 объемов колонки (CV). HSA-GDF15, который был связан в колонке, элюировали 10 объемами CV раствора 2 М MgCl₂ в 20 мМ трис, рН 7,0. Соответствующие пикам фракции отбирали, фильтровали (0,2 мкм) и диализировали против PBS с рН 7,2 при температуре 4°С. После диализа белок повторно фильтровали (0,2 мкм) и концентрировали до подходящего объема перед загрузкой на колонку 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare). Фракции белка, элюированные из колонки эксклюзионной хроматографии (SEC) с высокой степенью чистоты (по определению методом SDS-PAGE), объединяли. Концентрацию белка определяли по поглощению света 280 нм на спектрофотометре BioTek Synergy HTTM. Качество очищенных белков оценивали методом SDS-PAGE и аналитической эксклюзионной ВЭЖХ (SE-HPLC, система Dionex HPLC). Уровни эндотоксина измеряли методом LAL-теста (Pyrotell®-T, Associates of Cape Cod).

Также проводили двухэтапную очистку с применением смолы Albupure и эксклюзионной хроматографии. Гибридные белки HSA-GDF15 очищали при комнатной температуре с применением смолы AlbuPure (ProMetic BioSciences Ltd), в которой использован иммобилизованный синтетический триазиновый лиганд для селективного связывания HSA. К смоле AlbuPure добавляли супернатанты с экспрессией. Затем смолу промывали, сначала 4 объемами CV PBS с рН 7,2, а затем 4 объемами CV буферного раствора 50 мМ трис с рН 8,0, 150 мМ NaCl. HSA-GDF15, который был связан в колонке, элюировали 4 объемами CV PBS с рН 7,2, содержащего 100 мМ октаноата натрия. Фракции, содержащие белок, концентрировали до объема 10 мл с помощью концентратора-центрифуги с отсечением по молекулярной массе 30 000 кДа (Amicon), а затем пропускали через колонку 26/60 Superdex S200pg (GE), уравновешенную PBS с рН 7,2. Фракции после эксклюзионной хроматографии, содержащие гомодимер HSA-GDF15, идентифицировали методом SDS-PAGE и объединяли для анализа. Степень чистоты белка оценивали методом SDS-PAGE и SE-HPLC.

Примеры 8-14 и 19 включают характеризацию примера гибридного белка настоящего изобретения, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60. Этот гибридный белок представляет собой полностью рекомбинантный белок, который существует в виде гомодимерного гибрида HSA и зрелого человеческого GDF15, соединенных линкером, содержащим 42 аминокислоты и состоящим из глициновых и сериновых остатков, GS-(GGGGS)8. Расчетная молекулярная масса этого гибридного белка составляет 162 696 дальтон, а единственный нативный свободный цистеин в положении 34 HSA был заменен серином. Далее в примерах этот конкретный гибридный белок HSA-GDF15 для простоты будет именоваться просто FP1. Вариант FP1 с меткой 6х His (6xHis-FP1, SEQ ID NO: 26), содержащий линкер AS-(GGGGS)x8-GT, использовали для сравнения в некоторых из приведенных ниже примеров.

Пример 8. Влияние FP1 на потребление пищи мышами линии C57BL/6.

Цель данного эксперимента заключалась в том, чтобы продемонстрировать зависимое от дозы воздействие FP1 на ингибирование потребления пищи мышами линии C57BL/6.

Самцы мышей линии C57BL/6 в течение минимум 72 ч проходили акклиматизацию в клетках BioDAQ. Затем мышей на основании потребления пищи в предыдущие 24 ч разделяли на шесть групп по восемь животных. В период с 16:00 до 17:00 животных взвешивали и вводили им носитель или композицию, содержащую FP1, путем подкожной инъекции. Изменение массы корма для каждой клетки непрерывно регистрировалось системой BioDAQ в течение 48 ч после инъекций. Для сравнения в настоящем исследовании использовали 6xHis-FP1.

Результаты (фиг. 2 и табл. 6) представлены как среднее значение суммарного потребления пищи для заданного промежутка времени. Результаты показали, что подкожное введение FP1 мышам линии C57BL/6 существенно ингибировало потребление пищи по сравнению с животными, получавшими носитель, при всех дозах и во все моменты времени в ходе испытания. Введение 6xHis-FP1 вызывало снижение потребления пищи при дозе 8 нмоль/кг.

- 16 042423

Таблица 6

Влияние подкожного введения FP1 на потребление пищи мышами линии C57BL/6; показано суммарное потребление пищи за 12, 24 и 48 часов после введения

Суммарное потребление пищи (г)
Введение	12 часов	24 часа	48 часов
PBS	3,7 + 0,2	4,3 + 0,1	8,4 + 0,3
FBI, 1 нмоль/кг	2,9 + 0, 1*	3,4 + 0,2**	7,0 + 0,3**
FBI, 4 нмоль/кг	2,3 + 0,2****	3,1 + 0, 1****	6,6 + 0,3***
FBI, 8 нмоль/кг	2,1 + 0,2****	3,2 + 0, 1***	6,4 + 0,2****
FBI, 16 нмоль/кг	1,7 + 0,2****	2,7 + 0,2****	6,2 + 0,3****
6xHis-FPl, 8 нмоль/кг	1,8 + 0,2****	2,6 + 0,2****	6,0 + 0,2****

Данные представлены как среднее ±SEM.

* р<0,05, по сравнению с PBS; ** р<0,01, по сравнению с PBS; *** р<0,001, по сравнению с PBS; **** р<0,0001, по сравнению с PBS.

Однофакторный дисперсионный анализ и критерий Тьюки для множественных сравнений; n=8 на группу.

Пример 9. Влияние FP1 на потребление пищи крысами линии Спрег-Доули.

Цель данного эксперимента заключалась в том, чтобы продемонстрировать зависимое от дозы воздействие FP1 на ингибирование потребления пищи у крыс линии Спрег-Доули.

Самцы крыс линии Спрег-Доули в течение минимум 72 ч проходили акклиматизацию в клетках BioDAQ. Затем крыс на основании потребления пищи в предыдущие 24 ч разделяли на шесть групп по восемь животных. В период с 16:00 до 17:00 животных взвешивали и вводили им носитель или композицию, содержащую гибридный белок, путем подкожной инъекции. Изменение массы корма для каждой клетки непрерывно регистрировалось системой BioDAQ в течение 48 ч после инъекций. Для сравнения в настоящем исследовании использовали 6xHis-FP 1.

Результаты представлены на фиг. 3 и в табл. 7. Подкожное введение FP1 в дозах 2,5 нмоль/кг и 10 нмоль/кг ингибировало потребление пищи по сравнению с животными, получавшими носитель. Ингибирование достигало статистической значимости только при самой высокой испытанной дозе (10 нмоль/кг) через 24 и 48 ч после введения. Введение FP1 вызывало снижение потребления пищи при дозе 8 нмоль/кг, и этот эффект был значимым через 24 и 48 ч.

Таблица 7

Влияние подкожного введения FP1 на потребление пищи крысами линии Спрег-Доули; показано суммарное потребление пищи за 12, 24 и 48 ч после введения

Суммарное потребление пищи (г)
Введение	12 часов	24 часа	48 часов
PBS	20, 6 + 1,3	25,3 + 1,3	49, 1 + 2,1
FP1, 0,1 нмоль/кг	23,3 + 1,4	26, 9 + 0,8	52,8 + 1,3
FP1, 0,5 нмоль/кг	22,6+1,7	25, 1 + 1,0	48,3 + 1,8
FP1, 2,5 нмоль/кг	20, 0 + 1,4	22,0 +1,0	44,6+1,4
FP1, 10 нмоль/кг	18,7 + 0,9	19, 9 + 1,0*	39,9 ± 2,3*
6xHis-FPl, 8 нмоль/кг	17,0 ±1,5	18,8 + 1,4**	38,4 + 2,5**

Данные представлены как среднее ±SEM.

* р<0,05, по сравнению с PBS; ** р<0,01, по сравнению с PBS.

Пример 10. Влияние FP1 на гомеостаз глюкозы и массу тела у мышей с алиментарным ожирением (DIO).

Цель настоящего эксперимента состояла в оценке влияния FP1 на потребление пищи, массу тела и гомеостаз глюкозы в течение двух недель введения у мышей DIO линии C57BL/6.

Самцов мышей DIO взвешивали и подкожно вводили им дозы FP1 2 мл/кг каждые три дня (q3d) в

- 17 042423 день 0, 3, 6, 9 и 12. Группам, получавшим носитель и розиглитазон, вводили PBS по аналогичной схеме. Животным контрольной группы розиглитазон добавляли в корм в количестве 0,015%, доступ к корму не ограничивали. Массы тела мышей и пищи регистрировали ежедневно. Уровни глюкозы измеряли с помощью глюкометра (One Touch® Ultra®, Lifescan, г. Милпитас, штат Калифорния, США). Массу жировой и нежировой ткани у мышей, находящихся в сознании, количественно измеряли методом ЯМР с разрешением по времени (TD-NMR), с помощью прибора Bruker Mini-Spec LF110. Пероральный тест на переносимость глюкозы (OGTT) у мышей проводили после 4 ч голодания. Глюкозу в крови измеряли через надрез на хвосте через 0, 30, 60, 90 и 120 мин после введения через желудочный зонд 2 г/кг глюкозы, 10 мл/кг. Инсулин измеряли через 0, 30 и 90 мин после введения глюкозы.

В конце исследования мышей умерщвляли посредством ингаляции СО2 и отбирали посмертную пробу крови. Сыворотку помещали в планшет на 96 лунок на влажный лед, а затем хранили при температуре -80°С. Извлекали печень и оценивали содержание жира по отношению к общей массе на срезах печени методом TD-NMR на приборе Bruker MiniSpec mq60, в соответствии с инструкцией производителя.

Рассчитывали оценку резистентности к инсулину натощак по гомеостатической модели (HOMA-IR) на основании произведения глюкозы натощак (в мг/дл) и инсулина (в мЕд/л), деленного на коэффициент 405.

Введение мышам DIO FP1 по схеме q3d в дозах 1 нмоль/кг и 10 нмоль/кг приводило к снижению массы тела (табл. 8) и потребления пищи (табл. 9). Указанные снижения достигали статистической значимости только в определенные моменты времени, как описано ниже.

FP1 вызывал снижение массы тела при дозах 1 (со 2-го до 14-го дня) и 10 нмоль/кг (с 1-го до 14-го дня) у мышей DIO (табл. 8 и фиг. 4). Значительное снижение потребления пищи наблюдали в 1-й и 2-й дни исследования при дозе 1 нмоль/кг и в 1, 8 и 9-й дни при дозе 10 нмоль/кг (табл. 9).

Таблица 8

Изменение массы тела (% от начальной) во время введения FP1 у мышей DIO

Введение День	Носитель Н/П	FP1 (нмоль/кг) 0,1 1 10	Розиглитазон 10 мг/кг в день
-2	0,1 ± 0,2	-0, 1 ± 0,4	0,6 ± 0,4	0,2 ± 0,3	0,1 ± 0,2
-1	-0, 8 ± 0,3	-0,2 ± 0,3	0,4 ± 0,3	-0,3 ± 0,4	-0,9 ± 0,2
0	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0
1	0,1 ± 0,2	-0,1 ± 0,4	-1,5 ± 0,5	-2,8 ± 0, 4*	1,9 ± 0,2
2	0,0 ± 0,3	-0, 8 ± 0,5	-3,2 ± 0, 4*	-3, 1 ± 0,5*	2,2 ± 0,5
3	-0,2 ± 0,4	-0,4 ± 0,4	-3,2 ± 0, 6*	-4,0 ± 0,7*	2,6 ± 0,5
4	-0,4 ± 0,5	-0,7 ± 0,5	-3,8 ± 0, 6*	-4,4 ± 0, 8*	3,0 ± 0,5*
5	-0,5 ± 0,4	-1, 0 ± 0,3	-4,0 ± 0,5*	-4, 6 ± 0, 9*	3, 8 ± 0,6*
6	-0,4 + 0,6	-0,5 + 0,5	-3,8 + 0, 4*	-5,6 + 0, 9*	4,0 ± 0,7*
7	-0,3 ± 0,5	-0,5 ± 0,5	-4,3 ± 0, 6*	-6, 1 ± 0, 9*	5,5 ± 0,8*
8	-0, 6 ± 0,5	-0,5 ± 0,5	-4,2 ± 0, 6*	-6, 7 ± 1, 1*	6, 1 ± 0, 9*
9	-0, 4 ± 0,5	-0,2 ± 0,5	-4,5 ± 0, 6*	-7,2 ± 1,2*	7,0 ± 1,0*

- 18 042423

10	-0,3 ± 0,5	0,3 ± 0,5	-4,4 ± 0, 8*	-7,8 ± 1,2*	7,8 ± 1,1*
11	-0,5 ± 0,5	0,5 ± 0,4	-4,4 ± 0, 8*	-7,9 ± 1, 4*	8,2 ± 1,2*
12	-0, 8 ± 0,6	0,8 ± 0,5	-4,3 ± 1, 0*	-7, 9 ± 1,5*	8,5 ± 1,2*
13	-0,8 ± 0,6	0,5 ± 0,5	-3, 9 ± 0, 9*	-8,7 ± 1, 6*	8,6 ± 1,3*
14	-1,7 ± 0,6	-0, 4 ± 0,5	-4,6 ± 1, 0*	-9,0 ± 1,7*	7,6 ± 1,3*

Данные представлены как среднее ±SEM. n=8 на группу.

* р<0,05 по сравнению с таковыми в группе, получавшей носитель.

Таблица 9

Суточное потребление пищи (г) во время введения FP1 у мышей DIO

Введение День	Носитель Н/П	FP1 (нмоль/кг) 0,1 1 10	Ровиглитавон 10 мг/кг в день
-2	2,9 + 0,1	3,0 + 0,2	2,9 + 0,1	2,8 + 0,1	2,8 + 0,1
0	3,0 ± 0,1	3,0 ± 0,1	2,8 ± 0,1	2,8 ± 0,1	3,0 ± 0,1
1	2,9 ± 0,1	3,1 ± 0,1	2,1 ± 0,2*	1,5 ± 0,1*	3,6 ± 0,1*
2	3,0 ± 0,1	3,0 ± 0,1	2,3 ± 0,1*	2,6 ± 0,2	3,9 ± 0,2*
3	2,8 ± 0,1	3,0 ± 0,1	2,6 ± 0,1	2,4 ± 0,2	3,5 ± 0,1*
4	2,3 ± 0,1	2,6 ± 0,1	2,2 ± 0,1	2,3 ± 0,1	3,3 ± 0,1*
5	2,8 ± 0,1	3,0 ± 0,1	2,8 ± 0,1	2,6 ± 0,1	3,7 ± 0,2*
6	2,8 ± 0,1	3,1 ± 0,1	2,9 ± 0,1	2,4 ± 0,2	3,7 ± 0,2*
7	2,7 ± 0,1	2,9 ± 0,1	2,6 ± 0,1	2,4 ± 0,1	3,8 ± 0,2*
8	2,7 ± 0,1	2,9 ± 0,1	2,6 ± 0,1	2,1 ± 0,1*	3,5 ± 0,2*
9	3,0 ± 0,1	3,3 ± 0,1	2,8 ± 0,1	2,5 ± 0,2*	4,3 ± 0,2*
10	2,6 ± 0,1	3,0 ± 0,1	2,6 ± 0,1	2,2 ± 0,1	3,6 ± 0,1*
11	2,9 ± 0,1	3,1 ± 0,1	2,7 ± 0,2	2,6 ± 0,2	3,4 ± 0,1*
12	2,7 ± 0,1	3,1 ± 0,1	3,0 ± 0,1	3,0 ± 0,2	3,6 ± 0,2*
13	2,6 ± 0,1	2,8 ± 0,1	2,8 ± 0,1	2,2 ± 0,2	3,2 ± 0,1*

По данным теста OGTT, выполненного на 14-й день исследования, FP1 существенно снижал уровни глюкозы по сравнению с животными, получавшими носитель, во все моменты времени после времени 0 и при всех трех дозах, применявшихся в испытании (табл. 10). Этот показатель дополнительно количественно определяли как полную площадь под кривой (AUC) и дельта AUC, которые были значительно меньше, по сравнению с животными, получавшими носитель, при всех трех дозах, применявшихся в испытании (табл. 10 и фиг. 5А и 5В).

- 19 042423

Таблица 10

Уровни глюкозы в крови (мг/дл) по данным теста OGTT, проведенного через четырнадцать дней, в которые мышам DIO вводили FP1 по схеме q3d

Введение	Дова (нмоль/ кг)	Время после стимуляции глюкозой (мин) 0 30 60 90 120	Полная AUC (мг/дл/ 120 мин)	Дельта AUC (мг/дл/ 120 мин)
Носитель	Н/П	209, 6 ± 16, 5	399,4 ± 46,4	338,5 ± 46,3	297,5 ± 38,0	269,3 ± 36, 6	38 244,4 ± 4308,2	13 089,4 ± 3573,0
FP1	о, 1	196, 6 ±7,6	319,0 + 21,5*	241,6 + 14,4*	196,0 + 12,8*	184,0 ± 6, 3*	28 408,1 ± 1236,1*	4885,5 ± 955,1*
1	164,0 ± 7,2	251,4 + 13, 0*	227,6 + 12, 6*	191,9 + 9, 4*	180,6 + 13, 1*	25 295,6 + 1026,7*	5615,6 ± 647,6*
10	146, 6 ± 5,9	195,6 ± 14,5*	197,1 ± 6, 9*	172,1 ± 6, 3*	174,9 ± 13, 8*	21 768,8 ± 603,0*	4211,4 ± 425,8*
Ровиглита Вон	10 мг/кг в день	130,8 + 6,0	199,1 ± 12, 9*	204,4 ± 8,5*	184,1 ± 10, 9*	169,1 ± 5,7*	22 115,6 + 671,9*	6425,6 ± 599, 6

Уровни глюкозы после еды измеряли в начале (0-й день), на 7-й день и на 13-й день исследования (табл. 11 и фиг. 6). FP1 вызывал снижение уровня глюкозы в крови статистически значимым образом при дозах 1 нмоль/кг и 10 нмоль/кг на 13-й день исследования.

Таблица 11

Уровни глюкозы в крови после еды во время введения FP1 у мышей DIO по схеме q3d

		Время после начала введения (дней)
Введение	Доза (нмоль/кг)	0	7	13
Носитель	Н/П	177,6±10,9	173,6±10,6	225,3±23,0
FP1	0, 1	174,1+8,5	171,8+16,3	196,4+8,1
1	167,5+7,8	135,1+11,2	165,3+10,3*
10	165,3+13,7	145,3+4,9	153,8+7,5*
Розиглитазон	10 мг/кг в день	189,6+17,3	122,6+8,1*	154,8+6,5*

Уровни инсулина в плазме, измеренные в тесте OGTT, были значительно выше в группе, получавшей FP1, чем в соответственной группе, получавшей носитель, для дозы 0,1 нмоль/кг через 30 мин, и ниже при дозах 1 и 10 нмоль/кг в тот же момент времени (табл. 12). Амплитуда уровня инсулина в тесте OGTT, измеренная по полной площади под кривой, была выше, чем у группы, получавшей носитель, для дозы 0,1 нмоль/кг FP1 (табл. 12), и ниже при дозах 1 и 10 нмоль/кг. В обоих случаях статистическая значимость была достигнута только при самой низкой дозе. В момент времени через 90 мин у мышей, получавших 1 и 10 нмоль/кг FP1, уровень инсулина был ниже; однако этот эффект не достиг статистической значимости. Измерения на основании модели HOMA-IR, как показателя чувствительности к инсулину, были проведены на 14-й день исследования. В этот момент времени введение FP1 привело к снижению HOMA-IR или к улучшенной чувствительности к инсулину при дозе 10 нмоль/кг (табл. 13 и фиг. 7).

- 20 042423

Таблица 12

Уровни инсулина в плазме (пг/мл), измеренные в тесте OGTT, проведенном через четырнадцать дней, в которые мышам DIO вводили FP1 по схеме q3d

Введение	Дова (нмоль/ кг)	Время после стимуляции глюкозой (мин) 0 30 90	Полная AUC (пг/мл/90 мин)
Носитель	Н/П	6096,0 ± 774,3	14660,0 ± 3031,2	5034,4 ± 405,1	902 151,9 ± 143123,2
FP1	о, 1	7861,0 ± 779,5	33825,8 ± 7902,0*	6494,4 ± 797,0	1834808,8 + 381276,1*
1	4808,1 ± 795,8	13061,8 ± 2226,3	3443,5 ± 342,5	763218,1 ± 119 766,8
10	3478,3 ± 634,6	7147,0 ± 823,8	2958,0 ± 414,0	462528,8 ± 44 653,1
Ровиглитав он	10 мг/кг в день	2965,6 ± 524,2	2203,1 ± 193,5*	1180,0 ± 57,1	179025,0 ± 9970,7

Таблица 13

Модель HOMA-IR после голодания у мышей DIO через четырнадцать дней, в которые им вводили FP1 по схеме q3d

Введение	Доза (нмоль/кг)	HOMA-IR
Носитель	Н/П	93,5 ± 15,3
FP1	0, 1	112,4 ± 14,6
1	56,7 ± 9,7
10	37,7 ± 8,2*
Розиглитазон	10 мг/кг в день	27,3 ± 4,7*

Величина снижения веса, достигнутая к 13 дню, не привела к измеримым изменениям абсолютной массы жировой ткани или относительной (%) массы жировой ткани при любой дозе (табл. 14). При дозе 10 нмоль/кг наблюдали значительное снижение абсолютной массы нежировой ткани. Этого снижения не наблюдали при выражении в виде относительной (%) массы нежировой ткани. Массу печени мышей измеряли при посмертной аутопсии на 15-й день исследования (табл. 15). Введение FP1 приводило к снижению абсолютной массы печени и массы печени, выраженной в процентах от массы тела, при дозе 10 нмоль/кг. Снижение наблюдали при дозе 1 нмоль/кг, но оно не достигало статистической значимости ни по одному из параметров. Содержание жира в печени измеряли по биопсийному материалу методом ЯМР (табл. 16). Гибридный белок FP1 снижал содержание печеночного жира, измеряемого в процентах от массы биопсийного материала, при дозах 1 и 10 нмоль/кг. Это снижение было значительным при более высокой дозе.

- 21 042423

Таблица 14

Состав тела через тринадцать дней введения FP1 по схеме q3d у мышей DIO

Введение	Дова (нмоль/кг)	Масса жировой ткани (г)	Масса нежировой ткани (г)	Масса жировой ткани (% от массы тела)	Масса нежировой ткани (% от массы тела)
Носитель	Н/П	11,6 ± 0,5	29,6 ± 0,4	23,4 ± 0,8	59,6 ± 0, 9
FP1	о, 1	12,2 ± 0,4	29,7 ± 0,4	24,1 ± 0,6	58,5 ±0,6
1	12,1 ± 0,3	28,0 ± 0,4	25,1 ± 0,3	58,3 ±0,6
10	10,6 ± 0,3	27,7 ± 0,4*	23,1 ± 0,3	60,6 ±0,6
Розиглитаз он	10 мг/кг в день	14,9 ± 0,6*	30,0 ± 0,5	27,2 ± 0, 4*	55,0 ± 0, 6*

Таблица 15

Масса печени через пятнадцать дней введения FP1 по схеме q3d у мышей DIO

Введение	Доза (нмоль/кг)	Масса печени (г)	Масса печени (% от массы тела)
Носитель	Н/П	2,6 ± 0,1	5,4 ± 0,2
FP1	0, 1	2,9 ± 0,2	5,8 ± 0,2
1	2,2 ± 0,1	4,6 ± 0,2
10	1,9 ± 0,1*	4,2 ± 0,1*
Розиглитазон	10 мг/кг в день	2,5 ± 0,2	4,6 ± 0,2

Таблица 16

Содержание жира в печени, измеренное через пятнадцать дней введения FP1 по схеме q3d, у мышей DIO

Введение	Доза (нмоль/кг)	Жир (%)
Носитель	Н/П	27,3 ±2,1
FP1	о, 1	26, 0 + 1,4
1	22,5 ± 1,4
10	17,8 ± 1,6*
Розиглитазон	10 мг/кг в день	25,9 ± 0,8

Пример 11. Влияние FP1 на уровни глюкозы в крови и массу тела у мышей ob/ob.

Цель этого эксперимента состояла в оценке влияния FP1 на массу тела и уровни глюкозы в крови через восемь дней введения мышей ob/ob с ожирением, гипергликемией и дефицитом лептина.

Самцов мышей ob/ob взвешивали и подкожно вводили им дозы FP1 2 мл/кг через каждые три дня (q3d) на 0, 3 и 6-й день. Массы тела мышей и пищи регистрировали ежедневно. Уровни глюкозы измеряли ежедневно с помощью глюкометра. В конце исследования мышей умерщвляли и отбирали посмертную пробу крови.

FP1 в дозе 1 нмоль/кг значительно снижал массу тела (выраженную в процентах от начальной массы тела) у мышей ob/ob, начиная со 2-го дня и по 8-й день, по сравнению с мышами, получавшими носитель. FP1 в дозе 10 нмоль/кг снижал массу тела (выраженную в процентах от начальной массы тела) у мышей ob/ob, начиная с 1-го дня и по 8-й день, по сравнению с мышами, получавшими носитель (табл. 17 и фиг. 8).

- 22 042423

Таблица 17

Изменение массы тела (% от начальной) во время введения FP1 по схеме q3d у мышей ob/ob

Введение	Носитель	FP1
День	Н/П	1 нмоль/кг	10 нмоль/кг
-6	-2,5 ± 0,3	-2,8 + 0,4	-3, 6 + 0,5
-5	-2,4 ± 0,3	-3, 0 + 0,5	-3,5 + 0,5
-4	-1,9 ±0,2	-2,5 + 0,4	-2,8 + 0,3
-1	-0,3 + 0,3	0,1 + 0,2	-0,3 + 0,2
0	0,0 + 0,0	0,0 + 0,0	0,0 + 0,0
1	0,5 + 0,2	-1, 6 + 0,2	-2,3 + 0,5*
2	1,1 + 0,2	-1,8+0,4*	-2, 0 + 0,9*
3	1,3 + 0,3	-2,5 + 0,4*	-3,1 + 1,1*
4	1,8 + 0,3	-3,3 + 0,5*	-4,2 + 1,3*
5	1,8 + 0,4	-3,5 + 0,5*	-4,7 + 1,5*
6	2,0 + 0,5	-4,0+0,7*	-5, 7 + 1,6*
7	2,8 + 0,6	-4, 8 + 0,8*	-6, 3 + 1,7*
8	3,5 + 0,8	-4,5 + 1,0*	-6, 1 + 1,9*

FP1 в дозе 10 нмоль/кг снижал уровни глюкозы после еды у мышей ob/ob в 1-й и 2-й дни исследования, а также с 4-го дня по 8-й день, по сравнению с мышами, получавшими носитель. Снижение уровня глюкозы в крови наблюдали при дозе 1 нмоль/кг; однако этот эффект не достиг статистической значимости (табл. 18 и фиг. 9).

Таблица 18

Уровни глюкозы после еды у мышей ob/ob во время введения FP1 по схеме q3d

Введение День	Носитель Н/П	FP1 1 нмоль/кг 10 нмоль/кг
-6	463,6 + 31,2	395,7+52,0	463, 6 + 41,0
-5	554,9 + 57,5	609,6 + 53,6	552,9 + 53,0
-4	502,9 + 41,6	517,9 + 71,6	490,3 + 54,4
-1	552,1 + 45,1	567,2 + 51,2	586, 0+42,6
0	468, 8 + 57,3	479, 7 ± 61,8	437,0 ± 42,7
1	537,0 + 42,8	439, 0 + 80,4	336,2 + 51,0*
2	511,7 + 43,5	440,0+74,3	293,7 + 37, 6*
3	447,8 + 54,2	369, 6 + 75,9	279,4+38,8
4	516, 3 + 47,0	384,6+84,0	261,2 + 43,7*
5	531,0 + 47,1	410,9 + 92,2	286,9 + 55,8*
6	596, 1 + 45,1	451,1 + 82, 6	301,9 + 49,3*
7	566, 7 + 44,3	425, 3 + 86,9	246, 7 + 43,5*
8	509, 9 + 37,6	337,8 ± 75,1	223,4 ± 34,1*

Пример 12. Фармакокинетика у различных видов животных.

Фармакокинетика у мышей.

FP1 внутривенно и подкожно вводили самкам мышей линии C57BL/6 в дозе 2 мг/кг в PBS с рН 7. В течение 7 дней после введения обоими путями отбирали пробы крови, обрабатывали сыворотку и измеряли концентрации лекарственного средства. Концентрацию FP1 определяли методом иммуноанализа. Зависимость концентрации лекарственного средства в сыворотке от времени сведена в табл. 19 и 20, и показана на фиг. 10.

- 23 042423

Таблица 19

Зависимость концентрации FP1 в сыворотке (нМ) от времени после однократного введения подкожно самкам мышей линии C57BL/6

	FP1, доза, подкожно
Момент времени	Результат животного 56 (нМ)	Результат животного 57 (нМ)	Результат животного 58 (нМ)	Результат животного 60 (нМ)	Результат животного 63 (нМ)	Средний результат (нМ)	Станд. откл.
4 ч.	32,299	50,735	42,766	32,407	23,018	36,245	10,698
24 ч.	88,822	106,418	88,648	103,841	80,346	93,615	11,093
72 ч.	33,563	38,473	32,473	33,625	32,769	34,181	2,451
96 ч.	20,639	24,988	21,247	19,356	20,771	21,400	2,124
День 7	5,399	6, 919	7,234	5,994	5,637	6,237	0,803

Таблица 20

Зависимость концентрации FP1 в сыворотке (нМ) от времени после однократного введения внутривенно самкам мышей линии C57BL/6

	FP1, доза, внутривенно
Момент времени	Результат животного 52 (нМ)	Результат животного 53 (нМ)	Результат животного 65 (нМ)	Результат животного 66 (нМ)	Результат животного 70 (нМ)	Средний результат (нМ)	Станд. откл.
1 ч.	240,419	233,318	232,484	276,913	272,727	251,172	21,857
24 ч.	86,823	95,774	80,201	93,153	88,853	88,961	6, 027
72 ч.	33,634	37,447	33,108	41,680	34,034	35,981	3,612
96 ч.	22,666	20,588	19,458	33,718	20,361	23,358	5,909
День 7	7,401	5,606	4,896	8,556	4,205	6, 133	1,803

Фармакокинетическии анализ показал, что период терминальный полужизни FP1 у мышей линии C57BL/6 после подкожного и внутривенного введения составлял 1,67 и 1,57 дня, соответственно (табл. 21). Средняя биодоступность FP1 после подкожного введения составила ~ 71%.

Таблица 21

Среднее (±СО) значение фармакокинетических параметров FP1 после внутривенного и подкожного введения в дозе 2 мг/кг самкам мышей линии C57BL/6

Путь введения		tl/2 (дни)	CL или CL/F (мл/день/ кг)	Vss (мл/ кг)	Стах (нг/ мл)	Тщах* (ДНИ)	АиС₀-_посл. (день* нг/мл)	AUC₀-_inf (день* нг/мл)
Подкожно	Среднее	1,67	49,48		14 994	1	38 315	40 734
	(СО)	(0,14)	(4,791)		(1776)		(3851)	(4072)
Внутривенно	Среднее	1,57	35,00	69,03	40 231	0,04	55 263	57 531
	(СО)	(0,19)	(3,13)	(5,8)	(3500)		(4853)	(5416)

Примечание. *Tmax (медиан.).

Фармакокинетика у крыс.

FP1 внутривенно и подкожно вводили самкам крыс линии Спрег-Доули в дозе 2 мг/кг в PBS с рН 7. В течение 7 дней после введения обоими путями отбирали пробы крови, обрабатывали сыворотку и измеряли концентрации лекарственного средства. Концентрацию FP1 определяли методом иммуноанализа. Зависимость концентрации лекарственного средства в сыворотке от времени сведена в табл. 22 и 23, и показана на фиг. 11.

Таблица 22

Зависимость концентрации FP1 в сыворотке (нМ) от времени после однократного введения подкожно самкам крыс линии Спрег-Доули

	FP1, группа 3 (доза, подкожно)
Момент времени	Результат животного 53 (нМ)	Результат животного 55 (нМ)	Результат животного 67 (нМ)	Результат животного 68 (нМ)	Результат животного 69 (нМ)	Средний результат (нМ)	Станд. откл.
4 ч.	4,766	3,500	3,932	3,546	3,250	3,799	0,593
24 ч.	45,118	53,192	39,196	39,823	40,804	43,627	5,826
72 ч.	18,900	24,102	23,124	23,718	18,933	21,755	2,615
96 ч.	12,193	14,333	14,185	14,669	11,256	13,327	1,511
День 7	2,805	2,821	2,447	3,438	2,358	2,774	0,426

- 24 042423

Зависимость концентрации FP1 в сыворотке (нМ) от времени после однократного введения внутривенно

Таблица 23 самкам крыс линии Спрег-Доули

Момент	Результат	Результат	Результат	Результат	Результат	Средний	Станд.
	ЖИВОТНОГО	ЖИВОТНОГО	ЖИВОТНОГО	ЖИВОТНОГО	ЖИВОТНОГО	результат
времени	51 (нМ)	52 (нМ)	57 (нМ)	64 (нМ)	66 (нМ)	(нМ)	откл.
1 ч.	43,620*	382,676	403,255	443,080	510,105	356,547	181,560
24 ч.	102,665*	142,661	139,066	124,528	126,425	127,069	15,728
72 ч.	46,720	60,105	67,090	59,257	70,423	60,719	9,127
96 ч.	29,409	39,897	41,225	42,258	48,074	40,173	6, 779
День 7	6, 976	11,251	8,913	9,540	13,006	9,937	2,298

*Повторный анализ подтвердил результаты.

Фармакокинетический анализ показал, что терминальный период полужизни FP1 у крыс линии Спрег-Доули после подкожного и внутривенного введения составлял 1,34 и 1,51 дня, соответственно (табл. 24). Средняя биодоступность FP1 после подкожного введения составила ~ 23%.

Таблица 24

Среднее (±СО) значение фармакокинетических параметров FP1 после внутривенного и подкожного введения в дозе 2 мг/кг самкам крыс линии Спрег-Доули

Путь введен		tl/2 (дни)	CL или CL/F (мл/день/кг)	Vss (мл/кг)	Стах (нг/мл)	Тщах* (ДНИ)	AUCo-посл. (день*нг/	AUC₀-_inf (день*нг/
ИЯ							мл)	мл)
Подкож но	Средн ее	1,34	100,09		6987	1	19 250	20 112
	(СО)	(0,04)	(3,97)		(417)		(794)	(820)
Внутри венно	Средн ее	1,51	24,75	53,41	59 000	0,04	83 028	86 525
	(СО)	(0,12)	(8,53)	(17,15)	(25 031)		(20 126)	(20 881)

Примечание. *Tmax (медиан.).

Фармакокинетика у обезьян.

FP1 внутривенно и подкожно вводили новым самцам яванского макака (Масаса fascicularis) в дозе 1 мг/кг в PBS с рН 7. В течение 21 дня после введения обоими путями отбирали пробы крови, обрабатыва ли сыворотку и измеряли концентрации лекарственного средства иммунологическим методом анализа. Зависимость концентрации лекарственного средства в сыворотке от времени сведена в табл. 25 и 26, и показана на фиг. 12.

Таблица 25

Зависимость концентрации FP1 в сыворотке (нМ) от времени после однократного введения подкожно яванским макакам, в соответствии с определениями иммунологическим методом

	FP1 (доза, подкожно)
Момент времени	Животное 110 (нМ)	Животное 111 (нМ)	Животное 112 (нМ)	Средний результат	Станд. откл.
Предварительная	< LLOQ	< LLOQ	< LLOQ	< LLOQ	Н/П
6 ч.	49,304	43,784	72,110	55,066	15,017
24 ч.	93,368	71,958	96,863	87,396	13,483
48 ч.	107,689	97,509	115,144	106,781	8,853
72 ч.	113,601	104,190	104,449	107,414	5,360
120 ч.	101,490	95,049	91,717	96,085	4,968
168 ч.	82,167	75,435	81,569	79,724	3,726
240 ч.	71,033	56,732	59,266	62,344	7,631
336 ч.	44,380	42,758	42,571	43,236	0,995
432 ч.	30,911	29,445	32,839	31,065	1,702
528 ч.	21,277	20,404	26, 427	22,703	3,255

- 25 042423

Таблица 26

Зависимость концентрации FP1 в сыворотке (нМ) от времени после однократного введения внутривенно яванским макакам, в соответствии с определениями иммунологическим методом

FP1 (доза, внутривенно)

Момент времени	Животное 104 (нМ)	Животное 105 (нМ)	Животное 106 (нМ)	Средний результат	Станд. откл.
Предварительная	< LLOQ	< LLOQ	< LLOQ	< LLOQ	н/п
1 ч.	212,661	235,168	189,000	212,276	23,087
6 ч.	190,315	185,331	183,575	186,407	3,497
24 ч.	141,743	155,943	146,487	148,058	7,229
48 ч.	111,765	126,105	120,744	119,538	7,246
72 ч.	105,076	106,955	106,441	106,157	0,971
120 ч.	92,591	103,882	103,757	100,077	6,483
168 ч.	71,368	93,055	87,706	84,043	11,298
240 ч.	71,554	65,093	65,685	67,444	3,572
336 ч.	46,184	38,961	41,696	42,280	3,647
432 ч.	34,589	31,266	19,492	28,449	7,933
528 ч.	26,885	24,154	22,422	24,487	2,250

Фармакокинетический анализ показал, что терминальный период полужизни FP1 у яванских макак после подкожного и внутривенного введения составил 8,5 и 9,2 дня, соответственно, а средняя биодоступность после подкожного введения составила ~ 88% (табл. 27).

Таблица 27

Среднее (±СО) значение фармакокинетических параметров FP1 после внутривенного и подкожного введения в дозе 1 мг/кг яванским макакам

Путь введения		tl/2 (Дни)	CL или CL/F (мл/ день/ кг)	Vss (мл/ кг)	Стах (нг/ мл)	Тщах* (ДНИ)	АиС₀__посл. (день* нг/мл)	AUCo-i_nf (день* нг/мл)
Подкожно	Среднее	8,5	3,9		17 776	3	211 030	256 202
	(СО)	(1,5)	(0,3)		(950)		(11 332)	(20 192)
Внутривенно	Среднее	9,2	3,4	45,6	34 001	0,04	239 758	292 206
	(СО)	(0,5)	(0,1)	(1,6)	(3698)		(6095)	(11 516)

Примечание. *Tmax (медиан.)

Количественное определение концентрации интактного димера в сыворотке яванских макак после внутривенного и подкожного введения проводили методом иммуноафинного захвата/ЖХМС (табл. 28 и 29 и фиг. 13 и 14). Концентрации, определяемые данным методом, были близки к концентрациям, определяемы методом иммуноанализа (IA), доказывая, что в организме яванских макак FP1 циркулирует в виде интактного димера без заметной подверженности метаболическим изменениям.

- 26 042423

Таблица 28

Зависимость концентрации FP1 в виде интактного димера в сыворотке (нг/мл) от времени после однократного внутривенного введения яванским макакам в соответствии с определениями методом иммуноафинного захвата/ЖХМС

День	Интактный димер по данным масс-спектрометрии (объединенные пробы)	Данные иммуноанализа (средн.)
0, 00	0	0
0, 04	33 347	34 537
0,25	29 686	30 328
1, 00	28 787	24 089
2,00	17 249	19 449
3, 00	16 827	17 272
5, 00	16 159	16 282
7,00	11 124	13 674
10,00	8746	10 973
14,00	5328	6879
18,00	3857	4629
22,00	2252	3984

Таблица 29

Зависимость концентрации FP1 в виде интактного димера в сыворотке (нг/мл) от времени после однократного подкожного введения яванским макакам в соответствии с определениями методом иммуноафинного захвата/ЖХМС

День	Интактный димер по данным масс-спектрометрии (объединенные пробы)	Данные иммуноанализа (средн.)
0, 00	0	0
0,25	9625	8959
1, 00	15 799	14 219
2, 00	17 671	17 373
3, 00	19 130	17 476
5, 00	12 284	15 633
7,00	10 808	12 971
10, 00	8910	10 143
14,00	5814	7034
18,00	4074	5054
22,00	2967	3694

Концентрацию аналитов в сыворотке яванских макак после внутривенного и подкожного введения также измеряли методом иммуноафинного захвата/расщепления трипсином/жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХМС/МС) (табл. 30 и 31). Выбранные триптические пептиды, а именно: ALV (ALVLIAFAQYLQQSPFEDHVK), ASL (ASLEDLGWADWVLSPR) и TDT (TDTGVSLQTYDDLLAK), расположены внутри FP1 вблизи от N-конца области HSA, N-конца GDF15 и С-конца GDF15, соответственно. Пептиды отслеживали как суррогатные пептиды FP1. Концентрации всех суррогатных пептидов были близки друг другу и концентрациям, измеренным методом иммуноанализа, доказывая, что последовательность GDF15 в FP1 остается интактной и связана с полной последовательностью HSA in vivo.

- 27 042423

Таблица 30

Зависимость концентрации в сыворотке (нг/мл) суррогатных пептидов, представляющих различные области FP1, от времени после однократного внутривенного введения яванским макакам в соответствии с определениями методом иммуноафинного захвата/расщепления трипсином /жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХМС/МС)

Момент времени	FP1 в среднем (нг/мл)	Станд. откл.	Данные иммуно анализа (нг/мл)
День	Часы	ALV	TDT	ASL	ALV	TDT	ASL
0,00	0	< LLOQ	< LLOQ	< LLOQ	Н/П	Н/П	Н/П	0,0
0,04	1	32400,0	39766,7	33333,3	2623,0	3162,8	2722,7	34536,9
0,25	6	29100,0	27166,7	30600,0	3439,5	1006,6	2095,2	30328,1
1,00	24	24366,7	23300,0	23800,0	4215,8	3996,2	4100,0	24088,7
2,00	48	19433,3	17733,3	18700,0	1457,2	1193,0	854,4	19448,6
3,00	72	18100,0	17200,0	17166,7	360,6	871,8	1001,7	17271,6
5,00	120	15966,7	14033,3	14233,3	1001,7	642,9	1011,6	16282,3
7,00	168	13733,3	11800,0	12100,0	1115,0	600,0	300, 0	13673,6
10,00	240	9303,3	8570,0	8570,0	2290,1	1682,2	1685,9	10973,0
14,00	336	5860,0	5890,0	6056, 7	415,8	312,2	388,0	6878,9
18,00	432	4143,3	4400,0	4226,7	374,3	52, 9	571,2	4628,6
22,00	528	2830,0	3256,7	2753,3	355,4	420,0	319, 0	3984,0

Таблица 31

Зависимость концентрации в сыворотке (нг/мл) суррогатных пептидов, представляющих различные области FP1, от времени после однократного подкожного введения яванским макакам в соответствии с определениями методом иммуноафинного захвата/расщепления трипсином/жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ЖХМС/МС)

Момент времени	FP1 в среднем (нг/мл)	Станд. откл.	Данные иммуноа нализа (нг/мл)
День	Часы	ALV	TDT	ASL	ALV	TDT	ASL
0, 00	0	< LLOQ	< LLOQ	< LLOQ	Н/П	Н/П	Н/П	0,0
0,25	6	9323,3	7430,0	8123,3	1900,3	2471,6	1954,1	8959,1
1, 00	24	15233,3	13390,0	14533,3	2926, 3	3222,0	2683,9	14219,2
2,00	48	15366,7	14000,0	14166,7	2579, 4	1646,2	2311,6	17373,0
3, 00	72	17300,0	16033,3	15333,3	1571,6	1001,7	986, 6	17476,0
5,00	120	15333,3	13366,7	13666,7	1222,0	1692,1	1501,1	15632,9
7,00	168	13333,3	11633,3	11700,0	709,5	472, 6	781,0	12970,9
10,00	240	8496,7	7376, 7	8343,3	1475,5	189, 0	1039,1	10143,2
14,00	336	6046,7	6116,7	6253,3	90,2	118,5	110,6	7034,5
18,00	432	4593,3	5250,0	4636,7	802,6	1157,5	621,7	5054,2
22,00	528	3056, 7	3490,0	3116,7	424,5	687,7	220,5	3693,7

Анализ стабильности в человеческой плазме Целью данного исследования был анализ стабильности FP1 в человеческой плазме ex vivo. Свежую незамороженную человеческую плазму получали из гепаринизированной крови двух субъектов (одного мужчины и одной женщины) путем центрифугирования. FP1 инкубировали в этой матрице при температуре 37°С с осторожным перемешиванием в течение 0, 4, 24 и 48 ч. Концентрацию FP1 определяли методом иммуноанализа. Среднее отличие в процентах от начальной концентрации (0 ч) варьировало в интервале от -4,1 до -12,9 и не увеличивалось со временем, что свидетельствует о стабильности FP1 в человеческой плазме в течение до 48 ч ex vivo (табл. 32 и фиг. 15).

- 28 042423

Таблица 32

Концентрация FP1 (мкг/мл) через 0, 4, 24 и 48 ч инкубации ex vivo в плазме, полученной от двух человеческих субъектов (Sub), в соответствии с определениями иммунологическим методом

Проба ex vivo	Конц. в плазме мужчины Sub 1 (мкг/мл)	% отличия ТО	Конц. в плазме женщины Sub 2 (мкг/мл)	% отличия ТО	Средняя КОНЦ. (мкг/мл)	% отличия ТО
Плазма, Т 0 ч. FP1	11,503	Н/П	12,649	Н/П	12,076	Н/П
Плазма, Т 4 ч. FP1	10,524	-8,5	10,521	-16,8	10,523	-12,9
Плазма, Т 24 ч. FP1	9, 934	-13,6	12,402	-2,0	11,168	-7,5
Плазма, Т 48 ч. FP1	10,582	-8,0	12,575	-0, 6	11,578	-4,1

Количественное определение концентрации интактного димера после инкубации в человеческой плазме проводили методом иммуноафинного захвата/ЖХМС. Концентрации, определенные данным методом, оставались стабильными с течением времени (0, 4, 24 и 48 ч), доказывая, что FP1 сохраняется в человеческой плазме ex vivo в виде интактного димера в течение до 48 ч (табл. 33 и фиг. 16).

Таблица 33

Средняя концентрация FP1 (мкг/мл) в виде интактного димера и отличие (%) от начальной концентрации через 0, 4, 24, 48 ч инкубации ex vivo в плазме, полученной от двух человеческих субъектов, в соответствии с определениями методом иммуноафинного захвата/ЖХМС

	Конц, димера (мкг/мл)	Отличие (%)
0 ч.	15, 8	100, 0
4 ч.	15, 8	100, 1
24 ч.	15, 9	100, 9
48 ч.	15, 2	96, 0

Пример 13. Стратегия иммунного ответа.

Для обнаружения антилекарственного антитела (ADA) у животных и в клинических пробах будут разработаны методы анализа иммунного ответа (IR). Анализ иммунного ответа (IR) будет определять ADA-положительные пробы для сравнения статуса по ADA с результатами фармакокинетического/токсикокинетического (РК/ТК) анализа, что позволит оценивать воздействие и фармакокинетические параметры FP1. Клинический анализ иммунного ответа будет применяться для просмотра проб сыворотки, подтверждения специфичности ADA-положительных проб и определения титра ADA для подтвержденных положительных проб. Затем будет разработан метод анализа нейтрализующих антител (NAb), применимый к положительным пробам от ADA-положительных субъектов, подтвержденным на стадии 1 программы. Далее будет выполнено определение перекрестной реактивности ADA в отношении эндогенного GDF15 для применения на стадии 2 программы. Перед выполнением первого исследования у человека (FIH) будет проведена оценка риска иммуногенности, а при надлежащем обосновании возможно проведение дополнительных анализов для характеристики иммунного ответа.

Пример 14. Токсикологический план.

Поскольку эндогенный рецептор-мишень для GDF15 не выявлен, отсутствуют функциональные данные в отношении FP1, как и данные о связывании in vitro. Тем не менее, исследования фармакологических показателей и эффективности однократных и множественных доз, проведенные на крысах, мышах и яванских макаках, продемонстрировали активность FP1 у этих видов, что свидетельствует о его влиянии на снижение потребления пищи, снижение массы тела и модуляцию переносимости глюкозы в пероральном тесте. В качестве грызунов и не-грызунов в токсикологическом исследовании, на основании результатов по эффективности, приняты крыса и обезьяна, соответственно, учитывая однако тот факт, что собственное воздействие FP1 на рецептор у этих видов (в отличие от человека) охарактеризовано не полностью.

Примеры 15-19 включают характеристику другого примера гибридного белка настоящего изобретения, описанного в примере 5, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 92 (кодируемую последовательностями нуклеотидов SEQ ID NO: 92 (оптимизация кодонов 1) и 110 (оптимизация кодонов 2)). Этот гибридный белок представляет собой полностью рекомбинантный белок, который существует в виде гомодимера гибрида HSA (C34S) и варианта делеции зрелого человеческого GDF15 (201-308; SEQ ID NO: 8), соединенных содержащим 42 аминокислоты линкером, состоящим из глицино- 29 042423 вых и сериновых остатков GS-(GGGGS)₈. Единственный нативный свободный цистеин в положении 34

HSA был заменен на серин. Далее в примерах этот конкретный гибридный белок HSA-GDF15 для простоты будет именоваться FP2.

Пример 15. Влияние FP2 на потребление пищи мышами линии C57BL/6.

Выполняли оценку способности FP2 снижать потребление пищи самцами мышей линии C57BL/6 после введения однократной дозы. В данном исследовании использовали самцов мышей линии C57BL/6 (в возрасте 10-12 недель), полученных от компании Taconic Biosciences (г. Хадсон, штат Нью-Йорк, США). Мышей размещали в клетках по отдельности, в помещении с регулируемой температурой и 12часовым циклом чередования освещения и темноты (6:00/18:00), и предоставляли им неограниченный доступ к воде и корму. Самцы мышей линии C57BL/6 в течение минимум 72 ч проходили акклиматизацию в клетках BioDAQ; затем мышей на основании потребления пищи за последние 24 ч разделяли на шесть групп, по восемь животных. В период с 16:00 до 17:00 животных взвешивали и вводили им носитель или композиции путем подкожной инъекции. Изменение массы корма для каждой клетки непрерывно регистрировалось системой BioDAQ в течение 48 ч после введения композиции. Для сравнения в настоящем исследовании использовали препарат 6xHis-FP 1.

FP2 оказывал значительное влияние на снижение потребления пищи через 12, 24 и 48 ч после введения при всех уровнях дозы, применявшихся в испытании (табл. 34). У мышей наблюдали снижение в процентном изменении потребления пищи по сравнению с PBS во все моменты времени и при всех уровнях дозы (табл. 35).

Таблица 34

Влияние однократной дозы FP2 на потребление пищи в течение 48 часов мышами линии C57BL/6 ________________Суммарное потребление пищи (г)________________

Введение	12 часов	24 часа	48 часов
BBS	3,7 ± 0,2	4,4 + 0,2	8,8 + 0,4
FP2, 1 нмоль/кг	2,8 + 0,4*	3,0 + 0,4**	6,9 + 0,7*
FP2, 4 нмоль/кг	2,4 + 0,2***	3,1+ 0,2**	7,0 + 0,3*
FP2, 8 нмоль/кг	1,9 + 0,2****	2,4 + 0,1****	6,2 + 0,2***
FP2, 16 нмоль/кг	1,8+0,1****	2,7 + 0,1***	6,3 + 0,4**
6xHis-FPl, 8 нмоль/кг	2,3 + 0,3***	2,8 + 0,4**	6,6 + 0,7**

Данные представлены как среднее ±SEM.

* р<0,05, по сравнению с PBS.

** р<0,01, по сравнению с PBS.

*** р<0,001, по сравнению с PBS.

**** р<0,0001, по сравнению с PBS, соответственно.

Статистические анализы: метод дисперсионного анализа и критерий Даннетта для множественных сравнений.

n=8 на группу, за исключением 6xHis-FP1, 8 нмоль/кг (n=6).

Таблица 35

Влияние однократной дозы FP2 на процентное снижение потребления пищи (по сравнению с носителем в контроле) в течение 48 ч у мышей линии C57BL/6

Процент ингибирования по сравнению с PBS
Введение	12 часов	24 часа	48 часов
PBS	0,0 + 7,9	0,0 + 7,7	0,0 + 5,9
FP2, 1 нмоль/кг	22,4 + 12,5*	31,8 + 10,5**	21,8 + 8,1*
FP2, 4 нмоль/кг	36,6 + 7,2***	30,4 + 5, 8**	20,2 + 4,7*
FP2, 8 нмоль/кг	47,0 + 6,2****	45,7 + 3,8****	29,7 + 3,9***
FP2, 16 нмоль/кг	49,2 + 4,1****	38,1 + 4,1***	27,8 + 5,1**
6xHis-FPl, 8 нмоль/кг	36,9 + 9,9***	36, 5 + 8,8**	24,6 + 8,2**

Анорексигенныи эффект FP2 выражен как относительное снижение потребления пищи по сравнению с PBS в контроле, соответственно.

Данные представлены как среднее ±SEM.

* р<0,05, по сравнению с PBS.

** р<0,01, по сравнению с PBS.

*** р<0,001, по сравнению с PBS.

- 30 042423 **** р<0,0001, по сравнению с PBS, соответственно.

Пример 16. Влияние FP2 на потребление пищи крысами линии Спрег-Доули.

Выполняли оценку способности FP2 снижать потребление пищи и прирост массы тела у самцов крыс линии Спрег-Доули после введения однократной дозы. Животных получили от компании Charles Rivers Labs (г. Уилмингтон, штат Массачусетс, США), они имели массу тела 200-225 г и были использованы в течение одной недели после доставки. Животных размещали в клетках по отдельности на подстилках Alpha Dry, и с пластиковой трубкой для подачи, в помещении с регулируемой температурой и 12-часовым циклом чередования освещения и темноты. Им предоставляли неограниченный доступ к воде и кормили кормом для лабораторных грызунов; Корм для грызунов Irradiated Certified PicoLab® Rodent Diet 20, 5K75* (поставщик: Purina Mills, г. Сент-Луис, штат Миссури, через ASAP, г. Квакертаун, штат Пенсильвания, США). Перед введением дозы каждую крысу взвешивали и регистрировали массу тела.

Животные в течение минимум 72 ч проходили акклиматизацию в клетках BioDAQ; затем крыс на основании потребления пищи за последние 24 ч разделяли на шесть групп по восемь животных. В период с 16:00 до 17:00 животных взвешивали и вводили им носитель или композиции путем подкожной инъекции. Изменение массы корма для каждой клетки непрерывно регистрировалось системой BioDAQ в течение 48 ч после введения композиции. Для сравнения в настоящем исследовании использовали препарат 6xHis-FP1.

После введения однократной дозы FP2 измеряли зависимое от дозы снижение потребления пищи. При дозе 0,3 нмоль/кг не наблюдали существенных отличий в потреблении пищи. При дозе 1 нмоль/кг наблюдали значительное влияние на снижение потребления пищи через 12 ч, но не через 24 или 48 ч. При уровнях дозы 3 и 10 нмоль/кг наблюдали значительное снижение потребления пищи во все моменты времени (табл. 36, фиг. 19). Снижение в процентном изменении потребления пищи по сравнению с PBS наблюдали во все моменты времени и при всех уровнях дозы (табл. 37).

Таблица 36

Влияние однократной дозы FP2 на потребление пищи в течение 48 ч крысами линии Спрег-Доули

Суммарное потребление пищи (г)
Введение	12 часов	24 часа	48 часов
BBS	21,7 ±0,6	25, 0 + 0,8	53, 1 + 1,6
FP2, 0,3 нмоль/кг	19, 5 + 0,9	22,9 + 0,7	48,4 + 1,5
FP2, 1 нмоль/кг	17,5 + 0,9*	19, 8 + 0,8	47,0 + 2,6
FP2, 3 нмоль/кг	16, 1 + 1,2**	17,0 + 1,0**	39,2 ± 3,2**
FP2, 10 нмоль/кг	15,8 + 0,9***	16,5+0,9**	36,5 + 3,2**
6xHis-FPl, 8 нмоль/кг	15,0 + 1,4***	15,7 + 1,2**	37,2 + 4,5**

Данные представлены как среднее ±SEM.

* р<0,05, по сравнению с PBS.

** р<0,01, по сравнению с PBS.

*** р<0,001, по сравнению с PBS, соответственно.

n=8 на группу.

Таблица 37

Влияние однократной дозы FP2 на процентное снижение потребления пищи (по сравнению с носителем в контроле) в течение 48 ч крысами линии Спрег-Доули

Процент ингибирования по	сравнению с PBS
Введение	12 часов	24 часа	48 часов
PBS	0,0 + 4,0	0,0 + 4,6	0,0 + 4,3
FP2, 0,3 нмоль/кг	10, 0 + 4,7	8,5 + 4,1	8,8 + 3,9
FP2, 1 нмоль/кг	19,3 + 4,7*	20, 8 + 4,1	11,5 + 5,5
FP2, 3 нмоль/кг	25, 9 + 6, 1**	32,0 + 4,7**	26,2 + 6,5**
FP2, 10 нмоль/кг	27,4 + 4,8***	33,8 + 4,1**	31,2 + 6,4**
6xHis-FPl, 8 нмоль/кг	30,8 + 6,6***	37,0 + 5, 4**	29, 9 + 8,8**

Анорексигенный эффект FP2 выражен как относительное снижение потребления пищи по сравне- 31 042423 нию с PBS в контроле, соответственно.

Данные представлены как среднее ±SEM.

* р<0,05, по сравнению с PBS.

* * р<0,01, по сравнению с PBS.

* ** р<0,001, по сравнению с PBS, соответственно.

n=8 на группу.

Пример 17. Влияние FP2 на потребление пищи, массу тела и гомеостаз глюкозы у мышей с алиментарным ожирением (DIO) линии C57BL/6.

Выполняли оценку способности FP2 снижать потребление пищи и массу тела, а также улучшать гомеостаз глюкозы при многократной дозе у самцов мышей DIO линии C57BL/6 в течение 8 дней. В данном исследовании использовали самцов мышей DIO линии C57BL/6 (в возрасте 21 недели, откормленные жиросодержащим кормом в течение 15 недель), полученные от компании Taconic Biosciences (г. Хадсон, штат Нью-Йорк, США). Мышей размещали в клетках по отдельности, в помещении с регулируемой температурой и 12-часовым циклом чередования освещения и темноты (6:00/18:00), им предоставляли неограниченный доступ к воде и давали корм Research Diet D12492 (Research Diets, г. НьюБрансуик, штат Нью-Джерси, США). Перед экспериментом мыши больше 1 недели проходили акклиматизацию в виварии для мышей. Конечными результатами исследования являлись измерения потребления пищи, массы тела, состава тела и гликемических показателей (тест OGTT, уровень глюкозы в крови). За один день перед введением дозы животных взвешивали и разделяли на группы по массе тела (BW).

Дозу мышам вводили путем подкожной инъекции. Животные, которым вводили FP2, получали данную композицию на 0-й день, 3-й день, 6-й день, 9-й день и 12-й день. Группа, получавшая носитель, и группа, получавшая розиглитазон, в эти дни получали стерильный PBS подкожно. Розиглитазон добавляли в корм в количестве 0,015%, доступ к корму не ограничивали. Массу тела и потребление пищи регистрировали ежедневно в течение пятнадцати дней. Уровень глюкозы в крови измеряли на 0, 7 и 13-й дни. Пероральный тест на переносимость глюкозы (OGTT) проводили на 14-й день. Уровни инсулина измеряли в выбранные моменты времени в ходе проведения теста OGTT. На 15-й день мышей умерщвляли посредством ингаляции СО₂ и отбирали посмертные пробы крови через пункцию сердца для анализа воздействия. Отдельную ветвь ФК проводили в группах, состоящих из трех мышей на каждую дозу, всего 15 мышей.

Анализ зависимости воздействие-ответ (E-R) для FP2 у мышей DIO.

Большинство животных в фармакодинамических (ФД) ветвях (эффективность) в последний день исследования, когда отбирали фармакокинетические (ФК) пробы, имели необнаружимые концентрации лекарственного средства, возможно из-за иммуногенности. Таким образом, при проведении анализа зависимости воздействие-ответ (на 3, 6 и 9-й дни, соответственно) средние профили ФК из ветвей ФК, вместо отдельных ФК из ветвей ФД, использовали для изменения массы тела (%) относительно исходного уровня в ветвях ФД при соответственном уровне дозы. Этот метод предполагает, что с точки зрения воздействия лекарственного средства ветви ФК ведут себя аналогично ветвям ФД.

Для корреляции между воздействием и данными ответа (логарифмически преобразованные концентрации лекарственных препаратов) использовали модель E_max ( (GraphPad Prism 6, log (агонист) против ответа)). Угловой коэффициент Хилла был принят равным 1. Следует отметить, что подобранные моделью значения ЕС₁₀-ЕС₅₀ для 3, 6 и 9 дней отличались не более чем вдвое, несмотря на то, что оценки E_maxбыли различными (E_max=-4,26, 8,18 и -9,85%, соответственно). У некоторых животных на 9-й день также наблюдали снижение воздействия лекарственного средства ввиду возможного образования ADA, и поэтому оценки параметра E-R на основании данных на 9-й день следует интерпретировать с осторожностью.

Влияние двухнедельного воздействия FP2 на потребление пищи, массу тела, гомеостаз глюкозы и содержание жира в печени оценивали у самцов у мышей с алиментарным ожирением (DIO) линии C57BL/6. В ветви ФК исследования до 9-го дня исследования, воздействие в группе введения, получавшей дозу 0,3 нмоль/кг, составило 1,7-3,3 нМ FP2, в группе введения, получавшей дозу 1,0 нмоль/кг - 7,114 нМ, в группе введения, получавшей дозу 3,0 нмоль/кг - 20,8-41,6 нМ, в группе введения, получавшей дозу 10 нмоль/кг - 28,5-112,9 нМ FP2 (n=2 или 3, табл. 49). После 9-го дня наблюдалось снижение уровней циркуляции у большинства животных, несмотря на постоянное введение препарата по схеме q3d (табл. 49). В согласии с этим ускоренным выведением, большинство животных в ветви ФД исследования на 15-й день имело необнаружимые уровни циркулирующего FP2 (табл. 50).

Введение FP2 мышам DIO по схеме q3d привело к снижению потребления пищи (табл. 38), массы тела (табл. 39, 40 и фиг. 20) и уровня глюкозы в крови после еды, по сравнению с носителем в контроле (табл. 43 и фиг. 23). Значительное снижение потребления пищи наблюдали на 2-й день, 5-й день, 8-й день при дозе 0,3 нмоль/кг, с 1-го дня по 7-й день при дозе 1,0 нмоль/кг, на 1-й день, 2-й день, с 4-го дня по 6й день, и на 8-й день при дозе 3,0 нмоль/кг, а также на 1-й день, с 3-го дня по 6-й день, на 8-й день и на 9й день при дозе 10,0 нмоль/кг. Процентное изменение массы тела было значительным с 5-го дня по 13-й

- 32 042423 день при дозе 0,3 нмоль/кг, с 3-го дня по 13-й день при дозах 1,0 нмоль/кг и 10,0 нмоль/кг, и с 4-го дня по 13-й день при дозе 3,0 нмоль/кг. Изменение массы тела в граммах было значительным с 8-го дня при дозе 0,3 нмоль/кг, с 6-го дня при дозе 1,0 нмоль/кг, с 7-го дня при дозе 3,0 нмоль/кг и с 5-го дня при дозе 10,0 нмоль/кг. Снижение уровней глюкозы в крови после еды было значительным на 7-й день у животных с уровнем дозы 3,0 нмоль/кг, и было значительным на 13-й день у животных с уровнями дозы 3,0 и 10,0 нмоль/кг.

Мыши DIO, получавшие FP2 по схеме q3d, на 14-й день имели улучшенную переносимость глюкозы по сравнению с носителем в контроле, по данным теста с пероральным введением глюкозы (табл. 41; фиг. 21А и 21В). Уровень глюкозы значительно снижался через 30 мин в группе, получавшей дозу 0,3 нмоль/кг, через 60 и 120 мин в группе, получавшей дозу 1,0 нмоль/кг, через 120 мин в группе, получавшей дозу 3,0 нмоль/кг, и через 30, 90 и 120 мин в группе, получавшей дозу 10,0 нмоль/кг. Полная площадь под кривой была значительной для всех групп по дозам. Уровни инсулина по данным теста переносимости глюкозы значительно снижались через 30 мин в группах, получавших дозы 0,3 и 10,0 нмоль/кг (табл. 42; фиг. 22А и 22В). Кроме того, по сравнению с животными, получавшими носитель, наблюдали значительное снижение вычисленного значения HOMA-IR после голодания у мышей DIO через 14 дней, в которые им вводили FP2 по схеме q3d в дозе 10,0 нмоль/кг, что указывает на улучшенную чувствительность к инсулину (табл. 44 и фиг. 24).

Состав тела измеряли методом МРТ в -1-й день перед началом исследования и на 13-й день (табл. 47 и табл. 48). Введение FP2 в дозах 1,0 нмоль/кг и 10,0 нмоль/кг мышам DIO приводило к значительному снижению массы жировой ткани на 13-й день; при этом не наблюдалось изменений массы нежировой ткани во всех подопытных группах. На 13-й день подопытная группа, получавшая 10,0 нмоль/кг, имела значительное увеличение относительной (%) массы нежировой ткани и значительное относительное (%) снижение массы жировой ткани по сравнению с группой, получавшей носитель. С -1-го по 13-й день были значительными изменения массы нежировой ткани в подопытных группах, получавших 0,3 нмоль/кг, 1,0 нмоль/кг и 10,0 нмоль/кг, и были значительными относительные изменения (%) массы нежировой ткани в подопытных группах, получавших 1,0, 3,0 и 10,0 нмоль/кг. С -1-го по 13-й день были значительными изменения массы жировой ткани и относительные изменения (%) массы нежировой ткани во всех подопытных группах по сравнению с носителем в контроле.

Не наблюдали существенных отличий в уровнях эндогенного мышиного GDF15 в сыворотке между животными, получавшими носитель и получавшими FP2 по схеме q3d в течение 15 дней (табл. 46).

Заключение: результаты показывают, что повышение воздействия лекарственного средства по существу связано с большим (%) изменением массы тела относительно исходной на уровне популяции по всем подопытным группам в исследовании, в 3, 6 и 9-й дни.

Воздействие FP2 в течение двух недель приводило к снижению потребления пищи, снижению массы тела, снижению уровня глюкозы в крови, улучшению переносимости глюкозы и чувствительности к инсулину у мышей DIO. Значительное снижение потребления пищи за множество дней было достигнуто введением доз 1,0, 3,0 и 10,0 нмоль/кг по схеме q3d. Масса тела существенно снижалась, начиная с третьего - пятого дня после начала исследования. Уровень глюкозы в крови после еды значительно снизился на 13-й день после введения FP2 в дозах 3,0 и 10,0 нмоль/кг по схеме q3d. Чувствительность к инсулину, которую оценивали по значительному снижению значения HOMA-IR после голодания, была достигнута через 14 дней, в которые животным вводили FP2 в дозе 10,0 нмоль/кг по схеме q3d. На 13-й день наблюдали значительное повышение процентной массы нежировой ткани и значительное снижение процентной массы жировой ткани у мышей DIO, получавших FP2 в дозе 10,0 нмоль/кг по схеме q3d.

Таблица 38

Влияние FP2 на суточное потребление пищи (г) после 13 дней введения

Введение День	Носитель Н/П	FP2 (нмоль/кг)	Ровиглитавон 10 мг/кг в День
0,3	1,0	3,0	10,0
0	2,0±0,1	1,9±0,1	2,2±0,2	1,9±0,2	1,9±0,2	2,2±0,1
1	2,4±0,2	2,1±0,1	1,6±0,1*	1,5±0,1*	1,3±0,1*	2,7±0,1
2	2,5±0,1	1,8±0,1*	1,7±0,2*	1,9±0,1*	2,0±0,1	3,0±0,2
3	2,5±0,1	2,1±0,1	1,7±0,1*	1,9±0,1	1,8±0,1*	2,8±0,2
4	2,6±0,1	2,0±0,1	1,80,1*	1,9±0,1*	1,9±0,1*	2,9±0,2

- 33 042423

5	2,8± 0,1	2,1±0,2*	2,2+0,1*	2,2±0,0*	1,9±0,1*	2,7+0,2
6	2,8± 0,1	2,3+0,2	2,1±0,1*	2,2±0,1*	2,0±0,1*	2,8+0,2
7	2,6+ 0,2	2,+0,1	2,0+0,1*	2,0+0,2	2,1+0,1	2,9+0,2
8	2,7± 0,2	2,1±0,1*	2,2±0,1	2,0±0,1*	2,0±0,1*	3,1+0,2
9	2,8± 0,1	2,3±0,1	2,3+0,2	2,3±0,2^Л	2,1±0,2*	3,2±0,1
10	2,6± 0,1	2,5+0,1	2,4+0,2	2,3±0,2^Л	2,1± 0,2	3,0+0,2
11	2,9± 0,1	2,5±0,1	2,8+0,2	2,6+0,4	2,6± 0,1	3,3 ± 0,1
12	2,8± 0,1	2,7+0,2	2,8±0,1	2,8+0,2	2,9± 0,1	3,1 ± 0,2
13	2,7± 0,1	2,5+0,2	2,6+0,1	2,6+0,1	2,2± 0,1	3,1 ± 0,2

Значения представляют среднее ±SEM по данным от 8 животных в каждый момент времени и в каждой группе, за исключением данных для n=7, которые отмечены значком^Л.

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле.

Статистические анализы: двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями, критерий Тьюки для множественных сравнений.

Таблица 39

Влияние FP2 на процентное изменение массы тела после 13 дней введения

Введение День	Носитель Н/П	FP2 (нмоль/кг)	Ровиглитавон 10 мг/кг в День
0,3	1,0	3,0	10,0
-1	-0,1 ± о, 4	0,5 ± 0,2	-0,1 ± 0,1	-0,4 ± 0,2	0,0 ± 0,6	0,1 ± 0,2
0	0, 0 ± 0, 0	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0	0,0 ± 0,0
1	-0,4 ± 0,5	-1,0 ± 0,3	-2,2 ± 0,4	-1,8 ± 0, 6	-2,4 ± 0,5	1,3 ± 0,4
2	-0,4 ± 0,3	-2,2 ± 0,4	-3,4 ± 0,6	-3,0 ± 0, 6	-3, 1 ± 0,4	1,3 ± 0,5
3	-0,3 ± 0, 4	-2,3 ± 0,4	-4,2 ± 0,6*	-3,5 ± 0, 6	-4,3 ± 0,5*	1,9 ± 0,5
4	-0,3 ± 0,5	-2, 9 ± 0,5	-5,3 ± 0,6*	-4,9 ± 0,7*	-5,8 ± 0,7*	1,8 ± 0,7
5	-0,2 ± 0, 4	-4,2 ± 0,7*	-6,2 ± 0,6*	-5,6 ± 0,7*	-6, 8 ± 0,7*	1,7 ± 0,8
6	-0,4 ± 0, 6	-5,1 ± 0,7*	-7,4 ± 0,8*	-6,9 ± 0,7*	-8,5 ± 0, 9*	1,1 + 0,9
7	0,2 ± 0, 8	-5,1 ± 0,7*	-7,7 ± 0,9*	-7,4 ± 0,7*	-8,7 ± 0, 9*	2,0 ± 1,0
8	0,2 ± 1, 0	-6,1 ± 0,8*	-7,9 ± 0,9*	-8,0 ± 0, 8*	-9,7 ± 0, 8*	2,4 ± 1,1
9	0,5 ± 1, 1	-6,0 ± 0,9*	-8,4 ± 0,9*	-8,8 ± 0, 9*	-10,1 ± 1, 0*	3,1 ± 1,0
10	1, 1 ± 1,2	-5,7 ± 0,8*	-8,1 ± 0,9*	-8,9 ± 0, 9*	-10,7 ± 1,2*	3,5 ± 1,2
11	1,2 ± 1,3	-6,1 ± 0,9*	-8,2 ± 0,8*	-8,6 ± 1,3*	-11,1 ± 1, 4*	3,7 ± 1,2
12	1,4 ± 1,3	-6,3 ± 1,2*	-7,7 ± 0,8*	-8,2 ± 1, 4*	-10,9 ± 1, 4*	4,1 + 1,3
13	1,7 ± 0, 9	-5,8 ± 1,4*	-7,1 ± 1,0*	-7,2 ± 1, 4*	-10,9 ± 1, 4*	4,7 ± 1,3

Значения представляют среднее ±SEM по данным от 8 животных в каждый момент времени и в каждой группе.

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле.

Статистические анализы: двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями, кри

- 34 042423 терий Тьюки для множественных сравнений.

Таблица 40

Влияние FP2 на изменение массы тела (г) после 13 дней введения

Введение	Носитель	FP2 (нмоль/кг)	Ровиглитавон
День	н/п	0,3	1,0	3,0	10,0	10 мг/кг в День
-1	44, 6 ± 0, 6	44,5 ± 0, 6	44,5 ± 0,6	44,5 ± 0,6	44,5 ± 0,6	44,5 ± 0,6
0	44, 6 ± 0, 6	44,3 ± 0, 6	44, 6 ± 0,6	44,7 ± 0,6	44, 6 ± 0,7	44,4 ± 0,6
1	44,5 ± 0,7	43,8 ± 0, 6	43, 6 ± 0,6	43, 9 ± 0,7	43,5 ± 0,7	45,0 ± 0,7
2	44,5 ± 0,7	43,3 ± 0,7	43, 1 ± 0,6	43,3 ± 0,7	43,2 ± 0,7	45,0 ± 0,7
3	44,5 ± 0,7	43,2 ± 0,7	42,7 ± 0,6	43, 1 ± 0,7	42, 6 ± 0,6	45,3 ± 0,7
4	44,5 ± 0,7	43,0 ± 0,7	42,2 ± 0,6	42,5 ± 0,7	42,0 ± 0,7	45,2 ± 0,7
5	44,5 ± 0,7	42,4 ± 0,7	41, 8 ± 0,5	42,2 ± 0,7	41,5 ± 0, 6*	45,2 ± 0,7
6	44,5 ± 0,7	42,0 ± 0,7	41,3 ± 0, 6*	41, 6 ± 0,7	40,7 ± 0,5*	44,9 ± 0,8
7	44,7 + 0,7	42,0 + 0,7	41,1 + 0, 6*	41,4 + 0,7*	40, 6 + 0,5*	45,3 ± 0,8
8	44,7 ± 0,7	41,6 ± 0,7*	41, 1 ± 0,7*	41, 1 ± 0,7*	40,2 ± 0, 6*	45,5 + 0,8
9	44,8 ± 0,7	41,6 ± 0, 8*	40,8 ± 0,7*	40,8 ± 0, 8*	40,0 ± 0, 8*	45,8 ± 0,7
10	45,1 ± 0,7	41,8 ± 0, 8*	41, 0 ± 0, 8*	40, 8 ± 0, 8*	39, 8 ± 0, 8*	46,0 ± 0,8
11	45,2 ± 0, 8	41,6 ± 0, 8*	40, 9 ± 0,7*	40,8 ± 0, 9*	39, 6 ± 0, 9*	46,1 ± 0,8
12	45,3 + 0,7	41,5 + 0, 9*	41,2 + 0,7*	41,0 + 0, 9*	39,7 + 0, 9*	46,3 ± 0,9
13	45,4 ± 0,7	41,7 ± 0, 9*	41,4 ± 0, 8*	41,5 ± 0, 9*	39,7 ± 0, 9*	46,5 ± 0,9

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле.

- 35 042423

Таблица 41

Влияние FP2 на уровни глюкозы в крови (мг/дл) в тесте OGTT, проведенном через 14 дней введения

Введение	Доза (нмоль/ кг)	Время после стимуляции глюкозой (мин)	Полная AUC (мг/дл/ 120 мин)	Δ AUC (мг/дл/ 120 мин)
0	30	60	90	120
Носитель	Н/П	161 + 10	225 + 17	228 + 14	208 + 18	213 + 19	25 429 + 1228	6094 + 1430
FP2	0,3	144 ± 4	163 + 14*	209 + 11	180 + 12	171 + 7	21 270 + 399*	3985 + 521
1, 0	151 ± 9	179 + 18	188 + 7	179 + 13	163 + 8*	21 096 + 754*	2972 + 907
3, 0	149 ± 8	180 + 18	179 + 11*	164 ± 6	163 + ₉*	20 338 + 876*	2426 + 1058
10,0	134 ± 6	163 ± 7*	190 ± 13	152 ± 7*	163 ± 8*	19 599 ± 614*	3539 ± 1198
РоЗигл итазон	10 мг/кг в день	132 ± 9	152 ± 10*	162 ± 13*	138 ± 9*	159 ± 9*	17 904 ± 632*	2139 ± 1179

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле.

Статистические анализы: двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями, критерий Тьюки для множественных сравнений для значений уровней глюкозы;

однофакторный дисперсионный анализ, критерий множественных сравнений Тьюки для AUC.

Таблица 42

Влияние FP2 на уровни инсулина (нг/мл) в тесте OGTT, проведенном через 14 дней введения

Введение	Доза (нмоль/кг)	Время после стимуляции глюкозой (мин)	Полная AUC (нг/мл/90 мин)
0	30	90
Носитель	Н/П	4,2 ± 0,7	12,2 ± 2,3	3,6 ± 0,5	716,1 ± 122,0
FP2	0, 3	2,9 ± 0,6	5,8 ± 1,8*	2,4 ± 0,4	377,1 ± 97,3
1, 0	2,9 ± 0,4	8,2 ± 2,6	2,6 ± 0,4	491,8 ± 118,2
	3,0	3,0 ± 0,3	8,4 ± 1,5	2,5 ± 0,3	498,6 ± 77,0
10,0	2,4 ± 0,4	4,3 ± 0,5*	2,1 ± 0,4	295,5 ± 32,0
Розиглитазон	10 мг/кг в день	0,9 ± 0,1	1, 8 ± 0,2*	0,8 ± 0,1	118,5 ± 9,6*

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле.

Статистические анализы: двухфакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями, критерий Тьюки для множественных сравнений для значений уровней инсулина;

- 36 042423

Таблица 43

Влияние FP2 на уровни глюкозы в крови (мг/дл) после еды

Введение	Доза (нмоль/кг)	Время после начала введения (дней) 0 7 13
Носитель	Н/П	162 + 5	159 + 6	180 ± 9
FP2	0,3	143 ± 5	150 ± 9	168 ± 9
1,0	153 + 12	135 ± 7	159 ± 7
3, 0	148 ± 3	127 + 6*	151 ± 8*
10, 0	146 ± 6	136 ± 4	148 ± 3*
Розиглитазон	10 мг/кг в день	137 + 7	117 + 4*	134 + 6*

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле.

Таблица 44

Значение HOMA-IR после голодания у мышей DIO через 14 дней, в которые им вводили FP2 по схеме

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле.

Статистические анализы: однофакторный дисперсионный анализ, критерий Тьюки для множественных сравнений.

Таблица 45

Масса печени у мышей DIO через 15 дней введения FP2 по схеме q3d

Введение	Доза (нмоль/кг)	Масса печени (г)	Масса печени (% от массы тела)
Носитель	Н/П	1,9 + 0,1	4,3 ± 0,3
FP2	о, 1	1,7 + 0,1	4,0 ± 0,1
1, 0	1,7 ± 0,0	4,2 ± 0,1
3, 0	1,8 + 0,1	4,2 ± 0,1
10, 0	1,7 + 0,1	4,2 ± 0,1
Розиглитазон	10 мг/кг в день	1,9 + 0,1	4,1 ± 0,2

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле.

Статистические анализы: однофакторный дисперсионный анализ, критерий Тьюки для множест

- 37 042423 венных сравнений.

Таблица 46

Уровни мышиного GDF15 (пг/мл) в сыворотке мышей DIO через 15 дней введения FP2 по схеме q3d

Введение	Доза (нмоль/кг)	mGDF15
Носитель	Н/П	258,3 ± 21,4
FP2	0, 1	214, 1 + 10,3
1, 0	191,6+12,7
3, 0	254,5 ± 28, 6
10, 0	202, 0 + 10,0
Розиглитазон	10 мг/кг в день	509, 6 + 26, 2*

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле.

Таблица 47

Влияние JNJ-64739090, вводимого мышам DIO по схеме q3d, на состав тела (г), по данным МРТ

Введение	Доза (нмоль/ кг)	Жировая ткань (г) , день -1	Жировая ткань (г) , день 13	Δ Жир (г)	Нежировая ткань (г) , день -1	Нежирова я ткань (г) , день 13	Δ Нежировая ткань (г)
Носитель	Н/П	17,4 ± 0,6	18,2 ± 0,6	0,9 ± 0,3	25,4 ± 0,3	25,1 ± 0,3	-0,4 ± 0,2
FP2	0,3	17,0 ± 0,6	15,2 ± 0,8	-1,9 ± 0,6*	25,8 ± 0,7	24,5 ± 0,5	-1,2 ± 0,2*
1,0	17,0 ± 0,6	14,9 ± 0,6*	-2,1 ± 0,4*	25,8 ± 0,5	24, 6 ± 0,4	-1,2 ± 0,2*
3,0	17,4 ± 0,7	15,1 ± 1,1	-2,3 ± 0,5*	25,3 ± 0,4	24,2 ± 0,4	-1,1 ± 0,1
10,0	16,7 ± 0,6	13,2 ± 0,8*	-3,6 ± 0,5*	26, 1 ± 0, 6	24,5 ± 0,6	-1,7 ± 0,2*
Розиглита Вон	10 мг/кг День	17,2 ± 0,6	19,1 ± 0,5	1,9 ± 0,6	25,5 ± 0,7	25,1 ± 0,6	-0,4 ± 0,2

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле.

- 38 042423

Таблица 48

Влияние FP2, вводимого мышам DIO по схеме q3d, на состав тела (%), по данным МРТ

Введение	Доза (нмоль/ кг)	Жировая ткань (%), день -1	Жировая ткань (%), день 13	Δ Жир (%)	Нежировая ткань (%) , день -1	Нежировая ткань (%) , день 13	Δ Нежировая ткань (%)
Носитель	Н/П	38,1 ± 1,0	40,1 ± 1,0	2,1 ± 0,3	55,9 ± 0,9	55,3 ± 0,9	-0,6 ± 0,3
FP2	0,3	37,6 ± 1,2	36,3 ± 1,3	-1,3 ± 0,9*	56,8 ± 1,3	59,0 ± 1,4	2,2 ± 0,8
1,0	37,2 ± 1,1	35,8 ± 0,9	-1,4 ± 0,5*	56,7 ± 1,1	59,5 ± 1,0	2,8 ± 0,6*
3,0	38,3 ± 1,4	36,1 ± 2,0	-2,3 ± 0,7*	55,9 ± 1,2	58,7 ± 2,0	2,8 ± 0,8*
10,0	36,9 ± 1,1	33,1 ± 1,5*	-3,8 ± 0,8*	57,5 ± 1,0	61,7 ± 1,4*	4,2 ± 0,7*
РоЗиглита Зон	10 мг/ кг День	38,0 ± 1,2	41,1 ± 0,9	3,1 ± 0,9	56,2 ± 1,2	53,9 ± 0,8	-2,3 ± 0,8

Значения представляют среднее ± SEM по данным от 8 животных в каждый момент времени и в каждой группе.

* р<0,05, по сравнению с носителем в контроле.

Таблица 49

Воздействия FP2 в сыворотке (нМ) в ветви ФК исследования у мышей DIO, получавших введение по схеме q3d

		Время после введения начальной дозы (время после введения последней дозы)
Группа введения	Идентификатор субъекта	День 3	День 6	День 9	День 12	День 14 (48 ч.)	День 15 (72 ч.)	День 17 (120 ч.)
о,1 нмоль/ КГ	9	1,930	2,993	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
10	1,853	3,369	2,817	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
11	1,715	2,637	2,568	2,709	3,441	1,313	< LOQ
1,0	9	8,198	9,660	9,645	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
нмоль/ кг	10	7,073	10,595	8,966	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
11	6, 689	13,967	10,802	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
3,0 нмоль/ кг	9	20,802	26,329	27,863	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
10	23,563	32,020	41,576	1,168	< LOQ	< LOQ	< LOQ
11	21,704	30,101	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
10,0 нмоль/ кг	9	28,495	33,050	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
10	70,779	112,898	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ
11	70,404	111,767	55,117	< LOQ	< LOQ	< LOQ	< LOQ

Данные выражены в виде концентрации у каждого животного.

< LOQ=ниже предела количественного определения; LOQ=0,494 нМ.

** Значения в 3, 6, 9 и 12-й дни непосредственно перед введением следующей дозы.

- 39 042423

Таблица 50

Терминальные воздействия FP2 в сыворотке (нМ) у мышей DIO через 15 дней введения по схеме q3d

Группа введения (нмоль/кг)
Идентификатор животного	0,1	1,0	3,0	10,0
1	2,567 <	LOQ <	ΐ LOQ	< LOQ
2	< LOQ <	LOQ <	ΐ LOQ	44,149
3	< LOQ <	LOQ <	i LOQ	< LOQ
4	1,144 0	, 678 <	ΐ LOQ	< LOQ
5	< LOQ <	LOQ <	ΐ LOQ	< LOQ
6	3,440 <	LOQ <	ΐ LOQ	< LOQ
7	2,727 <	LOQ <	ΐ LOQ	< LOQ
8	< LOQ <	LOQ <	ΐ LOQ	< LOQ

Пример 18. Фармакокинетика FP2 у различных видов животных и иммунный ответ.

Фармакокинетика у мышей.

Фармакокинетические свойства FP2 оценивали путем подкожного введения самкам мышей линии C57BL/6. FP2 вводили подкожно (n=5 проб на каждый момент времени) и внутривенно (n=5 проб на каждый момент времени) самкам мышей линии C57BL/6 (Sage Laboratories, г. Сент-Луис, штат Миссури, США) при уровне дозы 2,0 мг/кг в PBS (pH 7,3-7,5). В последний момент времени отбирали пробы терминальной крови. В течение 168 ч отбирали пробы крови, обрабатывали сыворотку и измеряли концентрации лекарственного средства. Уровни FP2 измеряли методом иммуноанализа. Профили концентрации лекарственного средства в плазме сведены в табл. 51 и 52, и показаны на фиг. 25.

Фармакокинетический анализ показал, что терминальный период полужизни FP2 у мышей линии

C57BL/6 после внутривенного и	подкожного введения составил ~ 1,51 и 1,76 дня, соответственно, а
средняя биодоступность после подкожного введения составила ~ 61%. Таблица 51 Концентрация FP2 в сыворотке (нг/мл) после однократного введения подкожно (п/к) мышам линии
Результат Момент животного времени 31 (нг/мл) 4 ч. 11310,11	___________C57BL/6__________________________ FP2, доза, подкожно Результат Результат Результат Результат Средний Станд. животного животного животного животного результат откл. 32 33 35 36 (нг/мл) (нг/мл) (нг/мл) (нг/мл) (нг/мл) (нг/мл) 6323,44 23489,21 4357,74 4835,54 10063,21 7995,0
24 ч. 12378,58	10 896,80 17 769,03 15928,14 15404,08 14 475,33 2785,0
72 ч. 5127,95	5569,27 6727,37 7909,66 7550,32 6576,91 1210,5
96 ч. 3059,83	3350,25 4042,04 4095,15 4431,94 3795,84 569,0
168 ч. 784,61	1202,66 1364,68 1557,60 1678,02 1317,51 348,9
Таблица 52 Концентрация FP2 в сыворотке (нг/мл) после однократного введения внутривенно (в/в) мышам линии

C57BL/6

FP2, доза, внутривенно

Момент времени	Результат животного 37 (нг/мл)	Результат животного 40 (нг/мл)	Результат животного 41 (нг/мл)	Результат животного 45 (нг/мл)	Результат животного 48 (нг/мл)	Средний результат (нг/мл)	Станд. откл. (нг/мл)
1 ч.	49573,59	42382,59	40001,18	43085,75	46443,59	44297,34	3742,9
24 ч.	22173,85	19120,39	19393,78	19798,29	17459,96	19589,25	1696,7
72 ч.	8334,33	7989,10	8573,44	9086,37	8186,68	8433,98	422,5
96 ч.	4478,83	4699,80	4749,93	5331,39	4579,08	4767,81	332,3
168 ч.	1044,24	1419,64	1393,44	1835,63	979,49	1334,49	343,6

- 40 042423

Фармакокинетические параметры FP2 после введения внутривенно в дозе 2 мг/кг и подкожно в дозе 2 мг/кг мышам линии C57BL/6

Таблица 53

Путь введения		tl/2 (дни)	CL или CL/F (мл/день /кг)	Vz или Vz/F (мл/кг)	Стах (нг/мл)	Тщах* (ДНИ)	AUCo-посл. (дни* нг/мл)	AUC₀._inf (дни* нг/мл)
Подкожно	Среднее	1,76	43	108	15619	1	44972	48379
	СО	0,16	8	20	4870		8563	9147
Внутривенно	Среднее	1,51	25	55	44297	0,042	76 269	79253
	СО	0,18	1	6	3743		3788	4051

Фармакокинетика у крыс.

FP2 вводили подкожно (n=5 проб на каждый момент времени) и внутривенно (n=5 проб на каждый момент времени) самкам крыс линии Спрег-Доули (Sage Laboratories, г. Сент-Луис, штат Миссури, США) при уровне дозы 2,0 мг/кг в PBS (рН 7,3-7,5). В последний момент времени отбирали пробы терминальной крови. В течение 168 ч отбирали пробы крови, обрабатывали сыворотку и измеряли концентрации лекарственного средства. Уровни FP2 измеряли методом иммуноанализа. Профили концентрации лекарственного средства в плазме сведены в табл. 54 и 55, и показаны на фиг. 26. Фармакокинетические параметры, рассчитанные на основании этих данных, сведены в табл. 56.

Фармакокинетический анализ FP2 у крыс линии Спрег-Доули показал, что терминальный период полужизни после внутривенного и подкожного введения составил ~ 1,46 и 1,37 дня, соответственно, а средняя биодоступность после подкожного введения составила ~ 28%.

Таблица 54

Концентрация FP2 в сыворотке (нг/мл) после однократного введения подкожно (п/к) крысам линии

Спрег-Доули

Момент времени	Результат Результат Результат Результат Результат животного животного животного животного животного	Средний результат (нг/мл)	Станд. откл. (нг/мл)
01 (нг/мл)	02 (нг/мл)	03 (нг/мл)	04 (нг/мл)	05 (нг/мл)
4 ч.	730,95	257,94	469,95	496,34	400,65	471,16	172,2
24 ч.	9236,27	6658,79	7728,92	7449,56	6502,60	7515,23	1092,1
72 ч.	4559,04	4464,72	5619,82	4287,25	3844,15	4555,00	655,6
96 ч.	2791,97	2452,35	3387,55	2316,06	2176,00	2624,79	483,8
168 ч.	622,32	606,36	< 80,00	514,19	476,49	554,84	70,7

Таблица 55

Концентрация FP2 в сыворотке (нг/мл) после однократного введения внутривенно (в/в) крысам линии Спрег-Доули FP2, доза, внутривенно

Момент времени	Результат Результат Результат Результат Результат животного животного животного животного животного 06 07 08 09 10 (нг/мл) (нг/мл) (нг/мл) (нг/мл) (нг/мл)	Средний Станд. результат откл. (нг/мл) (нг/мл)
1 ч. 24 ч. 72 ч. 96 ч. 168 ч.	60 785,80 47 392,80 43 046,54 46 014,25 44 547,65 25 470,36 24 729,88 21 157,29 20 497,32 21 459,71 8208,46 9262,13 8866,76 8635,93 8843,83 4433,18 4833,22 4995,63 4630,60 4604,13 1083,14 1469,35 1614,61 1394,17 1053,89	48 357,41 7134,5 22 662,91 2267,1 8763,42 384,1 4699,35 218,1 1323,03 245,7

Таблица 56

Фармакокинетические параметры FP2 после введения внутривенно в дозе 2 мг/кг и подкожно в дозе 2 мг/кг крысам линии Спрег-Доули

Путь введения		tl/2 (дни)	CL или CL/F (мл/день/ кг)	Vz или Vz/F (мл/ кг)	Стах (нг/ мл)	Ттах* (ДНИ)	AUCo-посл. (дни* нг/мл)	AUCo-inf (дни* нг/мл)
Подкожно	Среднее	1,37	84	165	7515	1	22 614	24 036
	СО	0,04	10	17	1092		2509	2893
Внутривенно	Среднее	1,46	23	49	48 357	0,042	83 271	86 089
	СО	0,12	2	6	7135		6081	5820

Фармакокинетика у обезьян.

FP2 вводили подкожно в дозе 1 мг/кг и внутривенно в дозе 1 мг/кг трем самцам яванского макака

- 41 042423 каждому, в PBS (рН 7,0-7,6). В течение 21 дня отбирали пробы крови, обрабатывали сыворотку и измеряли концентрации лекарственного средства.

Фармакокинетические (ФК) параметры FP2 характеризовали после введения яванским макакам однократной дозы внутривенно (1,0 мг/кг) и подкожно (1,0 мг/кг). Зависимость концентрации лекарственного средства в плазме от времени после введения подкожно, по данным иммуноанализа и ЖХМС, сведена в табл. 57 и 58, соответственно, а после введения внутривенно, по данным иммуноанализа и ЖХМС, сведена в табл. 59 и 60, соответственно. Данные иммуноанализа представлены в виде графика на фиг. 27, а данные ЖХМС представлены на фиг. 28.

Исходя из результатов иммуноанализа, среднее значение терминального периода полужизни (t1/2) FP2 после внутривенного и подкожного введения на основании NCA составило ~ 7,05 и ~ 8,51 дня, соответственно. Средние ФК параметры после внутривенного и подкожного введения сведены в табл. 61. Исходя из результатов иммунологического биоанализа, среднее расчетное значение терминального периода полужизни (t1/2) FP2 после внутривенного и подкожного введения на основании модели без компартментов составило 7,05 и 8,51 дня, соответственно. Средняя биодоступность (F%) FP2 у яванских макак после подкожного введения согласно расчетам на основании AUC_0-last составила 98,5%, а согласно расчетам на основании AUC_0-inf составила 109,2%.

Таблица 57

Концентрация FP2 в плазме (нг/мл) у яванских макак после однократного введения подкожно, по данным иммуноанализа

Иммуноанализ

Время (ч.)	Животное 704	Животное 705	Животное 706	Сред., подкожное введение	Станд. откл.
0	< 80, 0	< 80, 0	< 80, 0	< 80, 0	Н/П
6	7365,3	6128,5	6056,9	6516,9	735, 6
24	19 716,8	10 903,8	10 554,7	13 725,1	5191,9
48	18 191,7	14 353,7	14 464,7	15 670,0	2184,5
72	17 813,9	14 207,5	12 684,0	14 901,8	2634,5
120	13 823,9	11 445,8	10 590,8	11 953,5	1675,3
168	12 359,6	10 103,8	9467,8	10 643,8	1519,7
240	9457,9	7642,6	8109,1	8403,2	942,7
336	6796,8	5679,8	5235,7	5904,1	804,3
432	5581,3	3830,6	3746, 5	4386,1	1035,9
528	4126, 2	2613,4	2879,3	3206,3	807,7

Н/П - не применимо.

Таблица 58

Концентрация FP2 в плазме (нг/мл) у яванских макак после однократного введения подкожно, по данным

ЖХМС

ЖХМС
Время (ч.)	Животное 704	Животное 705	Животное 706	Сред., подкожное	SEM
	введение
0	< 1000	< 1000	< 1000	< 1000	Н/П
6	6110,0	5910	6200,0	6073,3	85, 7
24	#	10 420,0	11 300,0	10 860,0	359, 3
48	16 560,0	13 510,0	14 960,0	15 010,0	880, 8
72	13 690,0	13 450,0	13 380,0	13 506,7	93, 9
120	11 040,0	#	#	11 040,0	Н/П
168	#	8680,0	9400,0	9040,0	293, 9
240	6940,0	7070,0	7140,0	7050,0	58, 6
336	4400,0	4580,0	4430,0	4470,0	55, 7
432	-	2910,0	-	2910,0	Н/П
528	< 1000	< 1000	< 1000	< 1000	Н/П

- =не удалось выполнить анализ в первый раз, пробы недостаточно для повторного анализа. # =неправильно маркированная пробирка, проба исключена из анализа.

- 42 042423

Н/П - не применимо.

Таблица 59

Концентрация FP2 в плазме (нг/мл) у яванских макак после однократного введения внутривенно, по данным иммуноанализа

Иммуноанализ

Время	Сред., внутривенно е введение	Станд. откл.
(ч.)	Животное 701	Животное 702	Животное 703
0	< 80, 0	< 80, 0	< 80, 0	< 80, 0	Н/П
1	29 938,3	31 139,0	23 545,3	28 207,6	4082,0
6	24 711,9	21 173,0	20 434,4	22 106,4	2286,5
24	19 648,4	21 420,9	8662,7	16 577,3	6911,3
48	17 790,1	17 107,0	12 983,1	15 960,0	2600,7
72	17 889,4	13 871,1	13 692,4	15 151,0	2373,3
120	15 298,6	11 982,5	11 361,5	12 880,9	2116,7
168	11 752,0	10 982,8	9933,8	10 889,5	912,7
240	8921,1	7465,0	6733,4	7706,5	1113,6
336	6572,8	5750,5	4687,6	5670,3	945, 1
432	1099,6	3425,0	3458,0	2660,9	1352,2
528	< 80,0	2069,0	2416,2	2242,6	Н/П

Н/П - не применимо.

Таблица 60

Концентрация FP2 в плазме (нг/мл) у яванских макак после однократного введения внутривенно, по данным ЖХМС

Время (ч.)	Животное 701	ЖХМС	SEM
Животное 702	Животное 703	Сред., внутривенное введение
0	< 1000	< 1000	< 1000	< 1000	Н/П
1	25 340,0	28 820	26 220,0	26 793,3	1044,7
6	24 610,0	26 340,0	23 810,0	24 920,0	746, 6
24	18 410,0	18 680,0	9810,0	15 633,3	2912,7
48	16 290,0	17 370,0	13 840,0	15 833,3	1044,3
72	15 430,0	14 920,0	14 280,0	14 876,7	332,7
120	11 180,0	11 480,0	11 440,0	11 366,7	94,0
168	9170,0	#	#	9170,0	Н/П
240	6800,0	7380,0	7600,0	7260,0	238, 6
336	2870,0	3860,0	3480,0	3403,3	288,3
432	-	-	3030,0	3030,0	Н/П
528	1150,0	1680,0	1400,0	1410,0	153, 1

-=не удалось выполнить анализ в первый раз, пробы недостаточно для повторного анализа.

Н/П - не применимо.

#=неправильно маркированная пробирка, проба исключена из анализа.

Таблица 61

Среднее значение (±СО) фармакокинетических параметров FP2 после внутривенного и подкожного введения яванским макакам в дозе 1 мг/кг

Путь введения		tl/2 (дни)	CL или CL/F (мл/день/кг )	Vz или Vz/F (мл/кг)	Стах (нг/м л)	гр * --max (дни)	АиС₀__посл. (день*нг/ мл)	AUC₀__inf (день*нг/ мл)
Подкожно	Среднее	8,51	4,6	56	16178	1,67	180792	221032
СО	1,28	0,8	7	3065		29990	44931
Внутривен НО	Среднее	7,05	4,9	51	28208	0,042	183468	202380
СО	1,45	0,2	12	4082		18268	9617

ФК параметры представляют собой средние значения ФК по данным иммуноанализа, на основании

- 43 042423

NCA.

*Tmax (медиана).

Анализ стабильности в человеческой плазме.

Стабильность FP2 исследовали в свежей гепаринизированной плазме ex vivo при 37°С в течение до 48 ч. Свежую незамороженную человеческую плазму получали из гепаринизированной крови двух субъектов (одного мужчины и одной женщины) путем центрифугирования. FP2 инкубировали в этой матрице при температуре 37°С с осторожным перемешиванием в течение 0, 4, 24 и 48 ч. Концентрацию FP2 определяли методом иммуноанализа. Количественное определение концентрации интактного димера в этой матрице при условиях анализа проводили методом независимого иммуноафинного захвата/ЖХМС.

По данным иммуноанализа коэффициент извлечения в процентах от исходной концентрации варьировал в интервале 104,8-94,1 и не уменьшался с течением времени, доказывая, что FP2 стабилен в человеческой плазме ex vivo в течение до 48 ч (фиг. 29 и табл. 62). По данным ЖХМС, концентрация оставалась стабильной во времени, доказывая, что JNJ-64739090 остается в человеческой плазме ex vivo в виде интактного димера в течение до 48 ч (фиг. 30 и табл. 63).

Таблица 62

Стабильность FP2 в человеческой плазме ex vivo (нг/мл) (нормализованное извлечение в процентах) в течение 48 ч, по данным иммунологического анализа

Композиция	Пол	Время (ч.)	Концентрация (нг/мл)	Нормализование е извлечение в процентах
FP2	женщина	0	9104	100, 0 99, 5 102,5 103, 0
4	9056
24	9332
48	9374
мужчина	0	9473	100, 0 104,8 95, 9 94,1
4	9929
24	9081
48	8912

Таблица 63

Стабильность FP2 в человеческой плазме ex vivo (нг/мл) (нормализованное извлечение в процентах) в течение 48 ч, по данным интактной ЖХМС

Композиция	Пол	Время (ч. )	Концентрация (нг/мл)	Нормализованно е извлечение в процентах
FP2	Жен.	0	11 090	100, 0
4	10 830	97,7
24	10 500	94,7
48	10 030	90,4
Муж.	0	10 760	100, 0
4	9640	89, 6
24	10 190	94,7
48	8500	79, 0

Пример 19. Эффективность FP1 и FP2 у яванских макак.

Были оценены влияния FP1 и FP2 на потребление пищи и массу тела после введения однократной дозы у новых яванских макак.

FP1 подкожно вводили группе новых яванских макак в трех разных уровнях доз: 1, 3 и 10 нмоль/кг. Также в исследование включили группу, получавшую носитель. Животным вводили препарат по слепому методу. Исследование продолжалось в целом 6 недель: в течение 2 недель измеряли исходные уровни потребления пищи и собирали данные, и в течение 4 недель собирали данные после одноразового введения композиции. Воздействия лекарственного препарата в плазме измеряли на 1, 7, 14, 21 и 28-й день после введения.

Введение яванским макакам однократной дозы FP1 приводило к снижению потребления пищи и массы тела, по сравнению с носителем в контроле (фиг. 32-33). Значительное снижение суточного потребления пищи наблюдали на 4, 5, 6 и 8-12-й дни при уровне дозы 10 нмоль/кг (фиг. 32). Среднее суточное потребление пищи за неделю значительно снизилось на 2-й неделе после введения уровня дозы 10 нмоль/кг. При уровне дозы 3 нмоль/кг наблюдали ось значительное процентное снижение среднего

- 44 042423 потребления пищи за неделю на 2-й неделе после введения дозы, по сравнению с потреблением до введения дозы, а при уровне дозы 10 нмоль/кг наблюдали значительное процентное снижение среднего потребления пищи за неделю на 1-й и 2-й неделях после введения дозы, по сравнению с потреблением до введения дозы. Значительное процентное снижение массы тела по сравнению с 0-м днем наблюдали на

28-й день при уровне дозы 3 нмоль/кг, и на 14, 21 и 28-й дни при уровне дозы 10 нмоль/кг (фиг. 33).

FP2 подкожно вводили группе новых яванских макак в трех разных уровнях доз: 1, 3 и 10 нмоль/кг. Также в исследование включили группу, получавшую носитель. Животным вводили препарат по слепому методу. Исследование продолжалось в целом 11 недель: в течение 5 недель измеряли исходные уровни потребления пищи и собирали данные, в течение 1 недели вводили препарат, и в течение 5 недель собирали данные о стадии выведения. Воздействия лекарственного препарата в плазме измеряли на 1, 7, 14, 21, 28, 35 и 42-й дни после введения.

Введение яванским макакам однократной дозы FP2 приводило к снижению потребления пищи и массы тела, по сравнению с носителем в контроле (фиг. 34-35). Значительное снижение суточного потребления пищи наблюдали на 3, 5-8, 10 и 12-й дни при уровне дозы 3 нмоль/кг, и на 3-38 и 40-й дни при уровне дозы 10 нмоль/кг (фиг. 34). Среднее суточное потребление пищи за неделю значительно снизилось на 1-й неделе после введения дозы 3 нмоль/кг, и значительно снизилось на 1-6-й неделях после введения дозы 10 нмоль/кг. При уровне дозы 3 нмоль/кг наблюдали значительное процентное снижение среднего суточного потребления пищи за неделю на 2-й неделе после введения дозы, по сравнению с потреблением до введения дозы, а при уровне дозы 10 нмоль/кг наблюдали значительное процентное снижение среднего суточного потребления пищи за неделю на 1-6-й неделях после введения дозы, по сравнению с потреблением до введения дозы. Значительное процентное изменение массы тела по сравнению с 0 днем наблюдали на 21-42-й дни при уровне дозы 1 нмоль/кг, на 14-42-й дни при уровне дозы 3 нмоль/кг, и на 7-42-й дни при уровне дозы 10 нмоль/кг (фиг. 34).

Пример 20. Гетеродимер HSA-GDF15:GDF15.

Было проведено исследование биоактивности гетеродимера HSA-GDF15:GDF15.

Для создания гетеродимера HSA-GDF15:GDF15 были разработаны два конструкта. Первый конструкт содержал HSA, соединенный с N-концом зрелого GDF15 (АА 203-308) посредством глицинсеринового линкера (SEQ ID NO: 93). Второй конструкт содержал меченный бх гистидином HSA, соединенный с N-концом зрелого GDF15 (АА 197-308) посредством глицин-серинового линкера и сайта расщепления протеазы HRV3C (SEQ ID NO: 94). Эти плазмиды котрансфицировали в соотношении 1:1 в системе Expi293™ Expression (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с протоколом производителя. Пептиды секретировались как белки HSA-GDF15, включая гетеродимерную и гомодимерную формы, в которых мономеры связывались посредством дисульфидных мостиков.

Супернатанты с клеточных культур временно трансфицированных клеток Expi293™ собирали через 5 дней после трансфекции, осветляли центрифугированием и стерилизовали фильтрованием (0,2 мкм, мембрана PES, Corning). Осветленные супернатанты загружали в колонку HisTrap HP (GE Healthcare), уравновешенную раствором 20 мМ фосфата натрия, 500 мМ NaCl с рН 7,4. После загрузки несвязанный белок удаляли путем промывания колонки уравновешивающим буферным раствором. Белки HSAGDF15, включая гетеродимерную и гомодимерную формы, связывались в колонке и элюировались раствором 20 мМ фосфата натрия, 150 мМ имидазола с рН 7,4. Фракции элюата объединяли и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С в присутствии меченного бх гистидином фермента HRV3C (компания Janssen) для получения гетеродимера HSA-GDF15:GDF15. После инкубации раствор белка диализовали в уравновешивающем буферном растворе для удаления имидазола, а затем еще раз пропускали через колонку HisTrap HP. Гетеродимер HSA-GDF15:GDF15, элюировали раствором 20 мМ фосфата натрия, 50 мМ имидазола с рН 7,4 на этапе промывания, при этом меченные гистидином белки удерживались. Гетеродимер дополнительно подвергали очистке методом эксклюзионной хроматографии (SEC) на колонке HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (GE Healthcare) уравновешенной в 1x DPBS, pH 7,2. Фракции элюата из колонки SEC, содержащие HSA-GDF15:GDF15 высокой чистоты (по данным SDS-PAGE) объединяли и фильтровали. Концентрации белка определяли по поглощению при 280 нм на спектрофотометре BioTek SynergyHTTM. Качество очищенных белков оценивали методами SDS-PAGE и аналитической эксклюзионной ВЭЖХ (система ВЭЖХ Ultimate 3000). Уровни эндотоксина измеряли методом LAL-теста (Pyrotell®-Т, Associates of Cape Cod). Очищенный белок хранили при 4°С.

Клетки SK-N-AS (АТСС), стабильно экспрессирующие рецептор GDF15 (GFRAL), за 24 ч перед анализом высевали в среду для выращивания (10% FBS) в планшете на 96 лунок. Через 24 ч клетки истощали в течение 3 ч в инкубаторе при температуре 37°С, для чего среду культивирования заменяли на 200 мкл эссенциальной среды Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), с добавлением 1% лошадиной сыворотки HI. Затем среду с добавлением 1% лошадиной сыворотки HI заменяли на 200 мкл АВ1 и дополнительно инкубировали в течение 2 ч в инкубаторе при температуре 37°С. При проведении анализа изо всех лунок аспирировали АВ1, добавляли 100 мкл исследуемой композиции в разных концентрациях в АВ2, после чего планшет инкубировали в течение 15 мин в инкубаторе при температуре 37°С. Через 15 мин исследуемый раствор извлекали и добавляли 30 мкл лизирующего буфера (содержит- 45 042423 ся в наборе для обнаружения), планшет встряхивали на планшетном шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Для обнаружения, 16 мкл лизированной пробы переносили в планшет для анализа на 384 лунки и добавляли 4 мкл детекторных антител HTRF рАКТ. Планшет инкубировали в течение ночи при комнатной температуре, а затем считывали сигнал HTRF на приборе Envision (Perkin Elmer).

Значения ЕС5₀ рассчитывали методом нелинейной регрессии (подгонки кривой) с помощью программного приложения GraphPad Prism®. Данные представляли как среднее±стандартная ошибка (СО) по трем отдельным экспериментам, с тремя повторностями на каждую точку данных. Молекулярную идентичность гетеродимера HSA-GDF15:GDF15 подтверждали методом масс-спектрометрии. Сдвиг кривой гетеродимера влево указывает на то, что гетеродимер HSA-GDF15:GDF15 обладает большей мощностью в индуцировании рАКТ по сравнению с соответственной молекулой гомодимера с дополнительным альбумином.

Пример 21. Термостабильность линкера.

Исследовали термостабильность для различных линкеров, соединяющих HSA и GDF15. Для оценки способности к фрагментированию и образованию агрегатов гибридные белки HSA-GDF15 с разными линкерами разводили до концентрации 10 мг/мл. После добавления ЭДТА и метионина пробы инкубировали при температуре 40°С в течение 14 дней. Затем пробы разводили до концентрации 1 мг/мл и оценивали методом эксклюзионной/высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-ВЭЖХ). В этих белках количественно определяли процентное содержание интактного белка, а также фрагментов и агрегатов. В табл. 64 показано, что белки HSA-GDF15 с линкерами, состоящими из повторов АР, наиболее устойчивы к фрагментированию в условиях тепловой нагрузки.

Чтобы оценить, влияют ли эти линкеры на взаимодействие GDF15 с его рецептором, проводили иммунный анализ, при котором на планшет наносили гибридный белок GFRAL-Fc и определяли антиGDF15 или анти-HSA с использованием моноклональных антител к GDF15 (Janssen) и к HSA (Kerafast, Inc., г. Бостон, штат Массачусетс, США). Анализ показал, что все эти варианты линкеров, представленные в табл. бб, связываются с рецептором схожим образом.

Таблица 64

Результаты эксклюзионной/высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-ВЭЖХ) после тепловой нагрузки в течение 14 дней

SEQ ID NO	Линкер	Агрегаты (%)	Интактные (%)	Фрагменты (%)
113	GS(GGGGS)₈	3,33	84,44	12,22
115	GA(GGGGA)₈	3,51	87,98	8,5
117	(АР) ₁₀	1, 64	98,36	0
119	(АР) ₁₂	2,36	97, 64	0
121	GGS-(EGKSSGSGSESKST) ₃- GGS	1, 67	85, 24	13, 09
123	GS(PGGGS)₈	2,96	88,12	8,91
125	GS(AGGGS)8	3,44	86, 22	10,34
127	GGS-(EGKSSGSGSESKST)₂- GGS	1,71	91,17	7,12

Хотя изобретение включает подробное описание со ссылкой на конкретные варианты его осуществления, специалисту в данной области будет очевидно, что в него могут быть внесены различные изменения и модификации, без отступления от существа и объема настоящего изобретения.

Последовательности, на которые в настоящей заявке приводятся ссылки, представлены ниже в таблице:

WT - дикий тип

- 46 042423

SEQ ID NO	Описание	Последовательность
1	Человеческий сывороточный альбумин, WT (HSA)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GL
2	Вариант HSA, C34S	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV

- 47 042423

		ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GL
3	Вариант HSA, С34А	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GL
5	HSA (C34S)- GS(GGGGS) ₄GDF15 (WT) гибрид	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVL S Р REVQVTMCIGAG Р S Q FRAANMHAQIКТ S LHRLКР DTVPАР ССVPAS YNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
6	Зрелый GDF15 (197-308)	ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFR AANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLA KDCHCI
7	Усеченный зрелый GDF15 (200-308)	GDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAAN MHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDC HCI
8	Усеченный зрелый GDF15 (201-308)	DHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANM HAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCH CI
9	Усеченный зрелый GDF15 (202-308)	HCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMH AQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHC I
10	Усеченный зрелый GDF15 (203-308)	CPLGPGRCC RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHA QIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

- 48 042423

11	Усеченный зрелый GDF15 (211-308)	C RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHR LKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
25	HSA (C34S)- AS(GGGGS)₂GT- -GDF15 гибрид	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLASGGGGSGGGGSGTARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR EVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN PMVLIQ KTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
26	HSA (C34S)- AS(GGGGS)₈GT - GDF15 (WT)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLASGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGTARNGDHC PLGPGRCC RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQ IKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
27	HSA (C34S)- AS(AP)₅GT- GDF15 гибрид	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLASAPAPAPAPAPGTARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPR

- 49 042423

		EVQVTMCIGAG P S Q FRAANMHAQIKT S LHRLКP DTVPAP СCVPAS YNPMVLIQ KTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
28	HSA (C34S) AS (AP) ₁₀GT - GDF15 гибрид	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLASAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPGTARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDL GWADWVL S P REVQVTMCIGAG P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVP ASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
29	HSA (C34S) - AS (AP) ₂₀GT- GDF15 гибрид	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLASAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPGTARNGDHC PLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQ IKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
30	HSA (C34S) - AS (EAAAK) ₄GT - GDF15 гибрид	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLASEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKGTARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDL

- 50 042423

		GWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVP ASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
31	HSA (C34S)- AS (EAAAK) ₈GT- GDF15 гибрид	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLASEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKGTARNGDHC PLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQ IKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
36	HSA (C34S)- GS(GGGGS) ₄GDF15 гибрид (мутант, делеция 13)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSCSRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVT MCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLКPDTVPАРСCVPASYNPMVLIQKTDTG VSLQTYDDLLAKDCHCI
37	HSA (C34S) - GS(GGGGS) ₄- GDF15 гибрид (мутант, делеция 14)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTM

- 51 042423

		CIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGV SLQTYDDLLAKDCHCI
40	HSA (C34S) - GS(GGGGS) ₄- GDF15 гибрид	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
48	HSA (C34A)- GS(GGGGS)4-GDF15 гибрид	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
55	HSA (C34A)- GS(GGGGS)₈- GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPL

- 52 042423

		G P GRC C RLHTVRASLEDLGWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIК TSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
56	HSA (C34A)- (AP) ₁₀- GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQAPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWAD WVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHRLКP DTVPАР СCVPAS YN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
59	HSA (C34S)- (AP) ₁₀- GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWAD WVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
60	HSA (C34S)- GS-(GGGGS) g ^— GDF15 (WT)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPL

- 53 042423

		G P GRC C RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIК TSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
64	HSA (C34S) - GS(GGGGS) ₄- GDF15 (I89R)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLRQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
65	HSA (C34S) GS(GGGGS)4-GDF15 (I89W)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLWQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
66	HSA (C34S) - GS(GGGGS)4— GDF15 (L34A, S35A, R37A)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW

- 54 042423

		ADWVAAPAEVQVTMCIGAG P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
67	HSA (C34S) - GS(GGGGS) 4 — GDF15 (V87A, I89A, L98A)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVL S P REVQVTMCIGAG P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMALAQKTDTGVSAQTYDDLLAKDCHCI
68	HSA (C34S) - GS(GGGGS) 4 — GDF15 (L34A, S35A, I89A)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVAAP REVQVTMCIGAG P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLAQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
69	HSA (C34S) - GS(GGGGS) ₄GDF15 (V87A, I8 9A)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW

- 55 042423

		ADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMALAQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
70	HSA (C34S) - GS(GGGGS) ₄- GDF15 (Q60W)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAWIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
71	HSA (C34S) - GS(GGGGS) ₄- GDF15 (W32A)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADAVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
72	HSA (C34S) - GS(GGGGS) ₄- GDF15 (W29A)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGA

- 56 042423

		ADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
73	HSA (C34S) - GS(GGGGS) 4 — GDF15 (Q60A, S64A, R67A)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGW ADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAAIKTALHALКP DTVPАР СCVPAS YNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
74	HSA (C34S) - GS(GGGGS) 4 — GDF15 (W29A, Q60A, I61A)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGA ADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAAAKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
75	HSA (C34S) - GS(GGGGS) ₄GDF15 (W29A, W32A)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGA

- 57 042423

		ADAVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPAS YNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
76	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 5	gacgcccacaagagcgaggtggcccaccggttcaaggacctgggcgaggagaa cttcaaggccctggtgctgatcgccttcgcccagtacctgcagcagtccccct tcgaggaccacgtgaagctggtgaacgaggtgaccgagttcgccaagacctgc gtggccgacgagagcgccgagaactgcgacaagagcctgcacaccctgttcgg cgacaagctgtgcaccgtggccaccctgcgggagacctacggcgagatggccg actgctgcgccaagcaggagcccgagcggaacgagtgcttcctgcagcacaag gacgacaaccccaacctgccccggctggtgcggcccgaggtggacgtgatgtg caccgccttccacgacaacgaggagaccttcctgaagaagtacctgtacgaga tcgcccggcggcacccctacttctacgcccccgagctgctgttcttcgccaag cggtacaaggccgccttcaccgagtgctgccaggccgccgacaaggccgcctg cctgctgcccaagctggacgagctgcgggacgagggcaaggccagcagcgcca agcagcggctgaagtgcgccagcctgcagaagttcggcgagcgggccttcaag gcctgggccgtggcccggctgagccagcggttccccaaggccgagttcgccga ggtgagcaagctggtgaccgacctgaccaaggtgcacaccgagtgctgccacg gcgacctgctggagtgcgccgacgaccgggccgacctggccaagtacatctgc gagaaccaggacagcatcagcagcaagctgaaggagtgctgcgagaagcccct gctggagaagagccactgcatcgccgaggtggagaacgacgagatgcccgccg acctgcccagcctggccgccgacttcgtggagagcaaggacgtgtgcaagaac tacgccgaggccaaggacgtgttcctgggcatgttcctgtacgagtacgcccg gcggcaccccgactacagcgtggtgctgctgctgcggctggccaagacctacg agaccaccctggagaagtgctgcgccgccgccgacccccacgagtgctacgcc aaggtgttcgacgagttcaagcccctggtggaggagccccagaacctgatcaa gcagaactgcgagctgttcgagcagctgggcgagtacaagttccagaacgccc tgctggtgcggtacaccaagaaggtgccccaggtgagcacccccaccctggtg gaggtgagccggaacctgggcaaggtgggcagcaagtgctgcaagcaccccga ggccaagcggatgccctgcgccgaggactacctgagcgtggtgctgaaccagc tgtgcgtgctgcacgagaagacccccgtgagcgaccgggtgaccaagtgctgc accgagagcctggtgaaccggcggccctgcttcagcgccctggaggtggacga gacctacgtgcccaaggagttcaacgccgagaccttcaccttccacgccgaca tctgcaccctgagcgagaaggagcggcagatcaagaagcagaccgccctggtg gagctggtgaagcacaagcccaaggccaccaaggagcagctgaaggccgtgat ggacgacttcgccgccttcgtggagaagtgctgcaaggccgacgacaaggaga cctgcttcgccgaggagggcaagaagctggtggccgccagccaggccgccctg ggcctgggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggatctggtggaggtgg cagtggaggagggggatccgctcgcaacggtgaccactgccctctgggtcctg gtcgctgctgccgcctgcacaccgttcgcgcttctctggaagacctgggttgg gctgactgggttctgtctcctcgcgaagttcaggttaccatgtgcatcggtgc ttgcccttctcagttccgcgctgctaacatgcacgctсадаtcaaaacctetc tgcaccgcctgaaacctgacaccgttcctgctccttgctgcgttcctgcttct tacaaccctatggttctgatccagaaaaccgacaccggtgtttctctgcagac

- 58 042423

		ctacgacgacctgctggctaaagactgccactgcatc
77	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 25	gatgetcataagtccgaagtcgcccaсадаttcaaggacctcggagaagaaaa ttttaaggccctcgtgcttatcgccttcgcccaatacctccagcagtccccgt tcgaggaccacgtgaagctcgtgaacgaagtgaccgagtttgccaagacttgt gtggcggatgaatccgccgagaactдедаcaagagcctccacaegetgttegg cgacaagctgtgcaccgtcgccacgctgagagaaacttacggagagatggccg actgctgcgcaaagcaggagccggaacggaacgaatgcttcctgcaacataag gacgataaccctaacttgcctcgcctggtccgccctgaggtcgacgtgatgtg caccgcgttccacgacaacgaggaaacctttcttaagaagtacctgtacgaga ttgcgcggaggcacccttatttctacgcccccgaactgttgttcttcgccaag cggtacaaggctgcctttaccgaatgctgccaggccgccgataaggcggcttg cctgctgccgaagctcgacgagttgcgcgatgaggggaaggcgtcctccgcta agcagcggctgaaatgtgcgagcctccagaagttcggggagcgcgccttcaag gcctgggccgtggcgcgcctgtctcaacggttcccgaaggccgagttcgccga agtgtcgaagctggtcaccgacctgacgaaagtgcacaccgaatgttgtcacg gcgatctgctggaatgcgccgatgacagagccgatttggccaagtacatctgc gaaaaccaggacagcatttcgtcaaagctgaaggaatgctgcgaaaagccctt getggaaaagtcecactgcatcgcggaagtggagaaegaegagatgcccgccg acctcccgtccctggccgccgatttcgtggagtcgaaggatgtgtgcaagaac tacgcagaagccaaggacgtgttcctgggaatgtttctgtatgagtacgcccg ccgccacccggactactcggtcgtgctcctgctgcgactggcaaagacctacg aaaccactctggagaagtgctgcgccgccgcggacccgcacgagtgctacgca aaggtgttcgacgagttcaagccacttgtcgaggagcctcagaacctgatcaa gcagaactgcgaactgttcgagcagctgggagagtacaaattccagaacgcgc ttctcgtgcgctacaccaagaaggtcccccaggtgtccactccgaccctggtg gaagtgtccaggaacctgggaaaggtcggctccaagtgttgcaagcatcccga ggctaagcgcatgccctgcgccgaggactacttgtccgtggtgctgaatcagc tgtgcgtgctccatgaaaagaccccagtgtccgacagagtgaccaagtgctgt accgaatcgctcgtgaaccggcggccgtgcttttccgcactggaggtggacga aacctacgtgccgaaggagttcaacgcagaaaccttcactttccacgccgaca tctgcactctgtccgagaaggagcggcagattaagaagcagactgccctggtg gagcttgtgaaacacaagcctaaggccaccaaagagcagctgaaggccgtcat ggatgatttcgcggccttcgtggaaaagtgttgtaaagcggacgacaaggaga cttgcttcgccgaagaaggaaagaagctcgtggcagcgtcacaggccgctctg ggcctcgctagcggtggagggggcagcggtggtggaggatccggtaccgcgcg caacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacgg tccgcgcgtegetggaagacctgggctgggccgattgggtgetgtcgccaegg gaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggc aaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacgg tgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaa aagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaaga ctgccactgcata

- 59 042423

78

Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 26

gatgetcataagtccgaagtcgcccaсадаttcaaggacctcggagaagaaaa ttttaaggccctcgtgcttatcgccttcgcccaatacctccagcagtccccgt tcgaggaccacgtgaagctcgtgaacgaagtgaccgagtttgccaagacttgt gtggeggatgaatccgccgagaactдедаcaagagcctccacaegetgttegg cgacaagctgtgcaccgtcgccacgctgagagaaacttacggagagatggccg actgctgcgcaaagcaggagccggaacggaacgaatgcttcctgcaacataag gacgataaccctaacttgcctcgcctggtccgccctgaggtcgacgtgatgtg caccgcgttccacgacaacgaggaaacctttcttaagaagtacctgtacgaga ttgcgcggaggcacccttatttctacgcccccgaactgttgttcttcgccaag cggtacaaggctgcctttaccgaatgctgccaggccgccgataaggcggcttg cctgctgccgaagctcgacgagttgcgcgatgaggggaaggcgtcctccgcta agcagcggctgaaatgtgcgagcctccagaagttcggggagcgcgccttcaag gcctgggccgtggcgcgcctgtctcaacggttcccgaaggccgagttcgccga agtgtcgaagctggtcaccgacctgacgaaagtgcacaccgaatgttgtcacg gcgatctgctggaatgcgccgatgacagagccgatttggccaagtacatctgc gaaaaccaggacagcatttcgtcaaagctgaaggaatgctgcgaaaagccctt getggaaaagtcecactgcatcgcggaagtggagaacgaegagatgcccgccg acctcccgtccctggccgccgatttcgtggagtcgaaggatgtgtgcaagaac tacgcagaagccaaggacgtgttcctgggaatgtttctgtatgagtacgcccg ccgccacccggactactcggtcgtgctcctgctgcgactggcaaagacctacg aaaccactctggagaagtgctgcgccgccgcggacccgcacgagtgctacgca aaggtgttcgacgagttcaagccacttgtcgaggagcctcagaacctgatcaa gcagaactgcgaactgttcgagcagctgggagagtacaaattccagaacgcgc ttctcgtgcgctacaccaagaaggtcccccaggtgtccactccgaccctggtg gaagtgtccaggaacctgggaaaggtcggctccaagtgttgcaagcatcccga ggctaagcgcatgccctgcgccgaggactacttgtccgtggtgctgaatcagc tgtgcgtgctccatgaaaagaccccagtgtccgacagagtgaccaagtgctgt accgaatcgctcgtgaaccggcggccgtgcttttccgcactggaggtggacga aacctacgtgccgaaggagttcaacgcagaaaccttcactttccacgccgaca tctgcactctgtccgagaaggagcggcagattaagaagcagactgccctggtg gagcttgtgaaacacaagcctaaggccaccaaagagcagctgaaggccgtcat ggatgatttcgcggccttcgtggaaaagtgttgtaaagcggacgacaaggaga cttgcttcgccgaagaaggaaagaagctcgtggcagcgtcacaggccgctctg ggcctegetageggaggtggeggatcaggtggcggaggtagcggtggaggcgg ctctggcggaggtggatcaggcggaggaggttccggtggaggaggctcaggag gaggaggaagtggaggagggggatccggtaccgcgcgcaacggggaccactgt ccgctcgggcccgggcgttgetgccgtctgcacacggtccgcgcgtegetgga agacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgacca tgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcag atcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctg cgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccgggg tgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata

- 60 042423

79	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 27	gatgetcataagtccgaagtcgcccaсадаttcaaggacctcggagaagaaaa ttttaaggccctcgtgcttatcgccttcgcccaatacctccagcagtccccgt tcgaggaccacgtgaagctcgtgaacgaagtgaccgagtttgccaagacttgt gtggcggatgaatccgccgagaactgcgacaagagcctccacacgctgttcgg cgacaagctgtgcaccgtcgccacgctgagagaaacttacggagagatggccg actgctgcgcaaagcaggagccggaacggaacgaatgcttcctgcaacataag gacgataaccctaacttgcctcgcctggtccgccctgaggtcgacgtgatgtg caccgcgttccacgacaacgaggaaacctttcttaagaagtacctgtacgaga ttgcgcggaggcacccttatttctacgcccccgaactgttgttcttcgccaag cggtacaaggctgcctttaccgaatgctgccaggccgccgataaggcggcttg cctgctgccgaagctcgacgagttgcgcgatgaggggaaggcgtcctccgcta agcagcggctgaaatgtgcgagcctccagaagttcggggagcgcgccttcaag gcctgggccgtggcgcgcctgtctcaacggttcccgaaggccgagttcgccga agtgtcgaagctggtcaccgacctgacgaaagtgcacaccgaatgttgtcacg gcgatctgctggaatgcgccgatgacagagccgatttggccaagtacatctgc gaaaaccaggacagcatttcgtcaaagctgaaggaatgctgcgaaaagccctt getggaaaagtcccactgcatcgcggaagtggagaacgaegagatgcccgccg acctcccgtccctggccgccgatttcgtggagtcgaaggatgtgtgcaagaac tacgcagaagccaaggacgtgttcctgggaatgtttctgtatgagtacgcccg ccgccacccggactactcggtcgtgctcctgctgcgactggcaaagacctacg aaaccactctggagaagtgctgcgccgccgcggacccgcacgagtgctacgca aaggtgttcgacgagttcaagccacttgtcgaggagcctcagaacctgatcaa gcagaactgcgaactgttcgagcagctgggagagtacaaattccagaacgcgc ttctcgtgcgctacaccaagaaggtcccccaggtgtccactccgaccctggtg gaagtgtccaggaacctgggaaaggtcggctccaagtgttgcaagcatcccga ggctaagcgcatgccctgcgccgaggactacttgtccgtggtgctgaatcagc tgtgcgtgctccatgaaaagaccccagtgtccgacagagtgaccaagtgctgt accgaatcgctcgtgaaccggcggccgtgcttttccgcactggaggtggacga aacctacgtgccgaaggagttcaacgcagaaaccttcactttccacgccgaca tctgcactctgtccgagaaggagcggcagattaagaagcagactgccctggtg gagcttgtgaaacacaagcctaaggccaccaaagagcagctgaaggccgtcat ggatgatttcgcggccttcgtggaaaagtgttgtaaagcggacgacaaggaga cttgcttcgccgaagaaggaaagaagctcgtggcagcgtcacaggccgctctg ggcctcgctagcgcacctgcccccgctccagctcctgcaccaggtaccgcgcg caacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacgg tccgcgcgtegetggaagacctgggctgggccgattgggtgetgtcgccaegg gaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggc aaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacgg tgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaa aagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaaga ctgccactgcata
80	Нуклеиновая	gatgetcataagtccgaagtcgcccaсадаttcaaggacctcggagaagaaaa

- 61 042423

	кислота, кодирующая SEQ ID NO: 28	ttttaaggccctcgtgcttatcgccttcgcccaatacctccagcagtccccgt tcgaggaccacgtgaagctcgtgaacgaagtgaccgagtttgccaagacttgt gtggcggatgaatccgccgagaactgcgacaagagcctccacacgctgttcgg cgacaagctgtgcaccgtcgccacgctgagagaaacttacggagagatggccg actgctgcgcaaagcaggagccggaacggaacgaatgcttcctgcaacataag gacgataaccctaacttgcctcgcctggtccgccctgaggtcgacgtgatgtg caccgcgttccacgacaacgaggaaacctttcttaagaagtacctgtacgaga ttgcgcggaggcacccttatttctacgcccccgaactgttgttcttcgccaag cggtacaaggctgcctttaccgaatgctgccaggccgccgataaggcggcttg cctgctgccgaagctcgacgagttgcgcgatgaggggaaggcgtcctccgcta agcagcggctgaaatgtgcgagcctccagaagttcggggagcgcgccttcaag gcctgggccgtggcgcgcctgtctcaacggttcccgaaggccgagttcgccga agtgtcgaagctggtcaccgacctgacgaaagtgcacaccgaatgttgtcacg gcgatctgctggaatgcgccgatgacagagccgatttggccaagtacatctgc gaaaaccaggacagcatttcgtcaaagctgaaggaatgctgcgaaaagccctt gctggaaaagtcccactgcatcgcggaagtggagaacgacgagatgcccgccg acctcccgtccctggccgccgatttcgtggagtcgaaggatgtgtgcaagaac tacgcagaagccaaggacgtgttcctgggaatgtttctgtatgagtacgcccg ccgccacccggactactcggtcgtgctcctgctgcgactggcaaagacctacg aaaccactctggagaagtgctgcgccgccgcggacccgcacgagtgctacgca aaggtgttcgacgagttcaagccacttgtcgaggagcctcagaacctgatcaa gcagaactgcgaactgttcgagcagctgggagagtacaaattccagaacgcgc ttctcgtgcgctacaccaagaaggtcccccaggtgtccactccgaccctggtg gaagtgtccaggaacctgggaaaggtcggctccaagtgttgcaagcatcccga ggctaagcgcatgccctgcgccgaggactacttgtccgtggtgctgaatcagc tgtgcgtgctccatgaaaagaccccagtgtccgacagagtgaccaagtgctgt accgaatcgctcgtgaaccggcggccgtgcttttccgcactggaggtggacga aacctacgtgccgaaggagttcaacgcagaaaccttcactttccacgccgaca tctgcactctgtccgagaaggagcggcagattaagaagcagactgccctggtg gagcttgtgaaacacaagcctaaggccaccaaagagcagctgaaggccgtcat ggatgatttcgcggccttcgtggaaaagtgttgtaaagcggacgacaaggaga cttgcttcgccgaagaaggaaagaagctcgtggcagcgtcacaggccgctctg ggcctcgctagcgcacctgcccccgctccagcacccgccccagcccctgctcc cgcaccagctcctgcaccaggtaccgctcgcaacggtgaccactgccctctgg gtcctggtcgctgctgccgcctgcacaccgttcgcgcttctctggaagacctg ggttgggctgactgggttctgtctcctcgcgaagttcaggttaccatgtgcat cggtgettgcccttctcagttccgcgctgetaacatgcacgctсадаtcaaaa cctctctgcaccgcctgaaacctgacaccgttcctgctccttgctgcgttcct gcttcttacaaccctatggttctgatccagaaaaccgacaccggtgtttctct gcagacctacgacgacctgctggctaaagactgccactgcatc
81	Нуклеиновая кислота,	gatgetcataagtccgaagtcgcccaсадаttcaaggacctcggagaagaaaa ttttaaggccctcgtgcttatcgccttcgcccaatacctccagcagtccccgt

- 62 042423

	кодирующая SEQ ID NO: 29	tcgaggaccacgtgaagctcgtgaacgaagtgaccgagtttgccaagacttgt gtggcggatgaatccgccgagaactgcgacaagagcctccacacgctgttcgg cgacaagctgtgcaccgtcgccacgctgagagaaacttacggagagatggccg actgctgcgcaaagcaggagccggaacggaacgaatgcttcctgcaacataag gacgataaccctaacttgcctcgcctggtccgccctgaggtcgacgtgatgtg caccgcgttccacgacaacgaggaaacctttcttaagaagtacctgtacgaga ttgcgcggaggcacccttatttctacgcccccgaactgttgttcttcgccaag cggtacaaggctgcctttaccgaatgctgccaggccgccgataaggcggcttg cctgctgccgaagctcgacgagttgcgcgatgaggggaaggcgtcctccgcta agcagcggctgaaatgtgcgagcctccagaagttcggggagcgcgccttcaag gcctgggccgtggcgcgcctgtctcaacggttcccgaaggccgagttcgccga agtgtcgaagctggtcaccgacctgacgaaagtgcacaccgaatgttgtcacg gcgatctgctggaatgcgccgatgacagagccgatttggccaagtacatctgc gaaaaccaggacagcatttcgtcaaagctgaaggaatgctgcgaaaagccctt gctggaaaagtcccactgcatcgcggaagtggagaacgacgagatgcccgccg acctcccgtccctggccgccgatttcgtggagtcgaaggatgtgtgcaagaac tacgcagaagccaaggacgtgttcctgggaatgtttctgtatgagtacgcccg ccgccacccggactactcggtcgtgctcctgctgcgactggcaaagacctacg aaaccactctggagaagtgctgcgccgccgcggacccgcacgagtgctacgca aaggtgttcgacgagttcaagccacttgtcgaggagcctcagaacctgatcaa gcagaactgcgaactgttcgagcagctgggagagtacaaattccagaacgcgc ttctcgtgcgctacaccaagaaggtcccccaggtgtccactccgaccctggtg gaagtgtccaggaacctgggaaaggtcggctccaagtgttgcaagcatcccga ggctaagcgcatgccctgcgccgaggactacttgtccgtggtgctgaatcagc tgtgcgtgctccatgaaaagaccccagtgtccgacagagtgaccaagtgctgt accgaatcgctcgtgaaccggcggccgtgcttttccgcactggaggtggacga aacctacgtgccgaaggagttcaacgcagaaaccttcactttccacgccgaca tctgcactctgtccgagaaggagcggcagattaagaagcagactgccctggtg gagcttgtgaaacacaagcctaaggccaccaaagagcagctgaaggccgtcat ggatgatttcgcggccttcgtggaaaagtgttgtaaagcggacgacaaggaga cttgcttcgccgaagaaggaaagaagctcgtggcagcgtcacaggccgctctg ggcctcgctagcgcacctgcccccgctccagccccagctcctgcacctgctcc agcaccagctcctgcaccagctccagcccctgcacctgcacccgctccagccc cagctcctgcacctgctccagcaccaggtaccgcgcgcaacggggaccactgt ccgctcgggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctgga agacctgggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgacca tgtgcatcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcag atcaagacgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctg cgtgcccgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccgggg tgtcgctccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata
82	Нуклеиновая кислота,	gatgetcataagtccgaagtcgcccaсадаttcaaggacctcggagaagaaaa ttttaaggccctcgtgcttatcgccttcgcccaatacctccagcagtccccgt

- 63 042423

	кодирующая SEQ ID NO: 30	tcgaggaccacgtgaagctcgtgaacgaagtgaccgagtttgccaagacttgt gtggcggatgaatccgccgagaactgcgacaagagcctccacacgctgttcgg cgacaagctgtgcaccgtcgccacgctgagagaaacttacggagagatggccg actgctgcgcaaagcaggagccggaacggaacgaatgcttcctgcaacataag gacgataaccctaacttgcctcgcctggtccgccctgaggtcgacgtgatgtg caccgcgttccacgacaacgaggaaacctttcttaagaagtacctgtacgaga ttgcgcggaggcacccttatttctacgcccccgaactgttgttcttcgccaag cggtacaaggctgcctttaccgaatgctgccaggccgccgataaggcggcttg cctgctgccgaagctcgacgagttgcgcgatgaggggaaggcgtcctccgcta agcagcggctgaaatgtgcgagcctccagaagttcggggagcgcgccttcaag gcctgggccgtggcgcgcctgtctcaacggttcccgaaggccgagttcgccga agtgtcgaagctggtcaccgacctgacgaaagtgcacaccgaatgttgtcacg gcgatctgctggaatgcgccgatgacagagccgatttggccaagtacatctgc gaaaaccaggacagcatttcgtcaaagctgaaggaatgctgcgaaaagccctt gctggaaaagtcccactgcatcgcggaagtggagaacgacgagatgcccgccg acctcccgtccctggccgccgatttcgtggagtcgaaggatgtgtgcaagaac tacgcagaagccaaggacgtgttcctgggaatgtttctgtatgagtacgcccg ccgccacccggactactcggtcgtgctcctgctgcgactggcaaagacctacg aaaccactctggagaagtgctgcgccgccgcggacccgcacgagtgctacgca aaggtgttcgacgagttcaagccacttgtcgaggagcctcagaacctgatcaa gcagaactgcgaactgttcgagcagctgggagagtacaaattccagaacgcgc ttctcgtgcgctacaccaagaaggtcccccaggtgtccactccgaccctggtg gaagtgtccaggaacctgggaaaggtcggctccaagtgttgcaagcatcccga ggctaagcgcatgccctgcgccgaggactacttgtccgtggtgctgaatcagc tgtgcgtgctccatgaaaagaccccagtgtccgacagagtgaccaagtgctgt accgaatcgctcgtgaaccggcggccgtgcttttccgcactggaggtggacga aacctacgtgccgaaggagttcaacgcagaaaccttcactttccacgccgaca tctgcactctgtccgagaaggagcggcagattaagaagcagactgccctggtg gagcttgtgaaacacaagcctaaggccaccaaagagcagctgaaggccgtcat ggatgatttcgcggccttcgtggaaaagtgttgtaaagcggacgacaaggaga cttgcttcgccgaagaaggaaagaagctcgtggcagcgtcacaggccgctctg ggcctcgctagcgaagcagcagccaaagaagcagccgcaaaagaagcagccgc taaggaggccgcagcaaagggtaccgcgcgcaacggggaccactgtccgctcg ggcccgggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctg ggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcat cggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaaga cgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgccc gccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgct ccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata
83	Нуклеиновая кислота, кодирующая	gacgcccacaagagcgaggtggcccaccggttcaaggacctgggcgaggagaa cttcaaggccctggtgctgatcgccttcgcccagtacctgcagcagtccccct tcgaggaccacgtgaagctggtgaacgaggtgaccgagttcgccaagacctgc

- 64 042423

	SEQ ID NO: 40	gtggccgacgagagcgccgagaactgcgacaagagcctgcacaccctgttcgg cgacaagctgtgcaccgtggccaccctgcgggagacctacggcgagatggccg actgctgcgccaagcaggagcccgagcggaacgagtgcttcctgcagcacaag gacgacaaccccaacctgccccggctggtgcggcccgaggtggacgtgatgtg caccgccttccacgacaacgaggagaccttcctgaagaagtacctgtacgaga tcgcccggcggcacccctacttctacgcccccgagctgctgttcttcgccaag cggtacaaggccgccttcaccgagtgctgccaggccgccgacaaggccgcctg cctgctgcccaagctggacgagctgcgggacgagggcaaggccagcagcgcca agcagcggctgaagtgcgccagcctgcagaagttcggcgagcgggccttcaag gcctgggccgtggcccggctgagccagcggttccccaaggccgagttcgccga ggtgagcaagctggtgaccgacctgaccaaggtgcacaccgagtgctgccacg gcgacctgctggagtgcgccgacgaccgggccgacctggccaagtacatctgc gagaaccaggacagcatcagcagcaagctgaaggagtgctgcgagaagcccct gctggagaagagccactgcatcgccgaggtggagaacgacgagatgcccgccg acctgcccagcctggccgccgacttcgtggagagcaaggacgtgtgcaagaac tacgccgaggccaaggacgtgttcctgggcatgttcctgtacgagtacgcccg gcggcaccccgactacagcgtggtgctgctgctgcggctggccaagacctacg agaccaccctggagaagtgctgcgccgccgccgacccccacgagtgctacgcc aaggtgttcgacgagttcaagcccctggtggaggagccccagaacctgatcaa gcagaactgcgagctgttcgagcagctgggcgagtacaagttccagaacgccc tgctggtgcggtacaccaagaaggtgccccaggtgagcacccccaccctggtg gaggtgagccggaacctgggcaaggtgggcagcaagtgctgcaagcaccccga ggccaagcggatgccctgcgccgaggactacctgagcgtggtgctgaaccagc tgtgcgtgctgcacgagaagacccccgtgagcgaccgggtgaccaagtgctgc accgagagcctggtgaaccggcggccctgcttcagcgccctggaggtggacga gacctacgtgcccaaggagttcaacgccgagaccttcaccttccacgccgaca tctgcaccctgagcgagaaggagcggcagatcaagaagcagaccgccctggtg gagctggtgaagcacaagcccaaggccaccaaggagcagctgaaggccgtgat ggacgacttcgccgccttcgtggagaagtgctgcaaggccgacgacaaggaga cctgcttcgccgaggagggcaagaagctggtggccgccagccaggccgccctg ggcctgggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggatctggtggaggtgg cagtggaggagggggatccgcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccg ggcgttgctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgg gccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgc gtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcc tgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagc tacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagac ctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata
84	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 55	gatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaa tttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcaggccccat ttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgt gttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttgg

- 65 042423

		agacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctg actgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaa gatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtg cactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaa ttgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaa aggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctg cctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgcca aacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaa gcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcaga agtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatg gagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgt gaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctct gttggaaaaatcecactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgctg acttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaac tatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaag aaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatg aaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgcc aaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaa acaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgc tattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgta gaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctga agcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatctatccgtggtcctgaaccagt tatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgc acagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatga aacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagata tatgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgtt gagctcgtgaaacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttat ggatgatttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggaga cctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcaagctgcctta ggcttaggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggatctggtggaggtgg cagtggaggagggggatccggcggcggcggcagcggcggcggcggatctggtg gaggtggcagtggaggagggggatccgcgcgcaacggggaccactgtccgctc gggcccgggcgttgetgccgtctgcacacggtccgcgcgtegetggaagacct gggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgca tcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaag acgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcc cgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgc tccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata
85	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 56	gatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaa tttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcaggccccat ttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgt gttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttgg

- 66 042423

		agacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctg actgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaa gatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtg cactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaa ttgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaa aggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctg cctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgcca aacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaa gcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcaga agtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatg gagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgt gaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctct gttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgctg acttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaac tatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaag aaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatg aaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgcc aaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaa acaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgc tattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgta gaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctga agcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatctatccgtggtcctgaaccagt tatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgc acagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatga aacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagata tatgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgtt gagctcgtgaaacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttat ggatgatttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggaga cctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcaagctgcctta ggcttagcacctgcccccgctccagcacccgccccagcccctgctcccgcacc agctcctgcaccagcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgtt gctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgat tgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgccc gagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcacc gcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaat cccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatga tgacttgttagccaaagactgccactgcata
86	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 40 (оптимизация	gatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaa tttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtccccat ttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgt gttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttgg agacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctg

- 67 042423

	кодонов 1)	actgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaa gatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtg cactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaa ttgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaa aggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctg cctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgcca aacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaa gcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcaga agtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatg gagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgt gaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctct gttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgetg acttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaac tatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaag aaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatg aaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgcc aaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaa acaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgc tattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgta gaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctga agcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatctatccgtggtcctgaaccagt tatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgc acagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatga aacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagata tatgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgtt gagctcgtgaaacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttat ggatgatttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggaga cctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcaagctgcctta ggcttaggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggatctggtggaggtgg cagtggaggagggggatccgcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccg ggcgttgetgccgtctgcacacggtccgcgcgtegetggaagacctgggctgg gccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgc gtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcc tgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagc tacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagac etatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata
87	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 40 (оптимизация кодонов 2)	gacgcccacaagagcgaggtggcccacagattcaaggacctgggcgaggaaaa cttcaaggccctggtgctgatcgccttcgcccagtacctgcagcagagcccct tcgaggaccacgtgaagctggtcaacgaagtgaccgagttcgccaagacctgc gtggccgacgagagcgccgagaactgcgacaagagcctgcacaccctgttcgg cgacaagctgtgcaccgtggccaccctgcgggaaacctacggcgagatggccg actgctgcgccaagcaggaacccgagcggaacgagtgcttcctgcagcacaag

- 68 042423

		gacgacaaccccaacctgcccagactcgtgcggcccgaggtggacgtgatgtg caccgccttccacgacaacgaggaaaccttcctgaagaagtacctgtacgaga tcgccagacggcacccctacttctacgcccccgagctgctgttcttcgccaag cggtacaaggccgccttcaccgagtgctgccaggccgccgataaggccgcctg cctgctgcccaagctggacgagctgagagatgagggcaaggccagctccgcca agcagcggctgaagtgcgccagcctgcagaagttcggcgagcgggcctttaag gcttgggctgtggcccggctgagccagagattccccaaggccgagtttgccga ggtgtccaagctggtcaccgacctgaccaaggtgcacaccgagtgttgtcacg gcgacctgctggaatgcgccgacgacagagccgacctggccaagtacatctgc gagaaccaggacagcatcagcagcaagctgaaagagtgctgcgagaagcccct gctggaaaagagccactgtatcgccgaggtggaaaacgacgagatgcccgctg acctgcccagcctggccgccgacttcgtggaaagcaaggacgtgtgcaagaac tacgccgaggccaaggatgtgttcctgggcatgttcctgtatgagtacgcccg cagacaccccgactacagcgtggtgctgctgctgcggctggccaagacctacg agacaaccctggaaaagtgctgcgccgctgccgacccccacgagtgctacgcc aaggtgttcgacgagttcaagcctctggtggaagaaccccagaacctgatcaa gcagaactgcgagctgttcgagcagctgggcgagtacaagttccagaacgccc tgctcgtgcggtacaccaagaaagtgccccaggtgtccacccccaccctggtc gaagtgtcccggaacctgggcaaagtgggcagcaagtgctgcaagcaccctga ggccaagcggatgccctgcgccgaggactacctgtccgtggtgctgaaccagc tgtgcgtgctgcacgagaaaacccccgtgtccgacagagtgaccaagtgctgt accgagagcctggtcaacagacggccctgcttcagcgccctggaagtggacga gacatacgtgcccaaagagttcaacgccgagacattcaccttccacgccgaca tctgcaccctgagcgagaaagagcggcagatcaagaagcagaccgccctggtc gagetggtcaagcacaagcccaaggccaccaaagaacagctgaaggccgtgat ggacgacttcgccgccttcgtcgagaagtgttgcaaggccgacgacaaagaga catgcttcgccgaagagggcaagaaactggtggccgcctctcaggccgccctg ggactgggatctggcggcggaggaagcggaggcggaggatctgggggaggcgg ctctggcggagggggatccgccagaaatggcgaccactgtcccctgggccctg gccggtgttgcagactgcacacagtgcgggccagcctggaagatctgggctgg gccgattgggtgctgagccccagagaagtgcaggtcacaatgtgcatcggcgc ctgccccagccagttcagagccgccaacatgcacgcccagatcaagaccagcc tgcaccggctgaagcccgacaccgtgcctgccccttgttgcgtgcccgccagc tacaaccccatggtgctgattcagaaaaccgacaccggcgtgtccctgcagac ctacgacgatctgctggccaaggactgccactgcatc
88	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 48	gatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaa tttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcaggccccat ttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgt gttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttgg agacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctg actgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaa gatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtg

- 69 042423

		cactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaa ttgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaa aggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctg cctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgcca aacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaa gcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcaga agtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatg gagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgt gaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctct gttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgetg acttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaac tatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaag aaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatg aaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgcc aaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaa acaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgc tattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgta gaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctga agcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatctatccgtggtcctgaaccagt tatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgc acagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatga aacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagata tatgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgtt gagctcgtgaaacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttat ggatgatttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggaga cctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcaagctgcctta ggcttaggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggatctggtggaggtgg cagtggaggagggggatccgcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccg ggcgttgetgccgtctgcacacggtccgcgcgtegetggaagacctgggctgg gccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgc gtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcc tgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagc tacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagac ctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata
89	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 59	gatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaa tttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtccccat ttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgt gttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttgg agacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctg actgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaa gatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtg cactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaa

- 70 042423

		ttgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaa aggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctg cctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgcca aacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaa gcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcaga agtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatg gagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgt gaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctct gttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgctg acttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaac tatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaag aaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatg aaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgcc aaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaa acaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgc tattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgta gaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctga agcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatctatccgtggtcctgaaccagt tatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgc acagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatga aacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagata tatgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgtt gagctcgtgaaacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttat ggatgatttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggaga cctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcaagctgcctta ggcttagcacctgcccccgctccagcacccgccccagcccctgctcccgcacc agctcctgcaccagcgcgcaacggggaccactgtccgctcgggcccgggcgtt gctgccgtctgcacacggtccgcgcgtcgctggaagacctgggctgggccgat tgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgcatcggcgcgtgccc gagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaagacgagcctgcacc gcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcccgccagctacaat cccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgctccagacctatga tgacttgttagccaaagactgccactgcata
90	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 60 (оптимизация кодонов 1)	gatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaa tttcaaagccttggtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtccccat ttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgt gttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttgg agacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctg actgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaa gatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtg cactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaa ttgccagaagacatccttacttttatgccccggaactccttttctttgctaaa

- 71 042423

		aggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaagctgcctg cctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgcca aacagagactcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaa gcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcaga agtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatg gagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgt gaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctct gttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgetg acttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaac tatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaag aaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatatg aaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgcc aaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaa acaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgc tattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgta gaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctga agcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatctatccgtggtcctgaaccagt tatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgc acagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatga aacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagata tatgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgtt gagctcgtgaaacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttat ggatgatttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggaga cctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcaagctgcctta ggcttaggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggatctggtggaggtgg cagtggaggagggggatccggcggcggcggcagcggcggcggcggatctggtg gaggtggcagtggaggagggggatccgcgcgcaacggggaccactgtccgctc gggcccgggcgttgetgccgtctgcacacggtccgcgcgtegetggaagacct gggctgggccgattgggtgctgtcgccacgggaggtgcaagtgaccatgtgca tcggcgcgtgcccgagccagttccgggcggcaaacatgcacgcgcagatcaag acgagcctgcaccgcctgaagcccgacacggtgccagcgccctgctgcgtgcc cgccagctacaatcccatggtgctcattcaaaagaccgacaccggggtgtcgc tccagacctatgatgacttgttagccaaagactgccactgcata
91	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 70	gacgcccacaagagcgaggtggcccaccggttcaaggacctgggcgaggagaa cttcaaggccctggtgctgatcgccttcgcccagtacctgcagcagtccccct tcgaggaccacgtgaagctggtgaacgaggtgaccgagttcgccaagacctgc gtggccgacgagagcgccgagaactgcgacaagagcctgcacaccctgttcgg cgacaagctgtgcaccgtggccaccctgcgggagacctacggcgagatggccg actgctgcgccaagcaggagcccgagcggaacgagtgcttcctgcagcacaag gacgacaaccccaacctgccccggctggtgcggcccgaggtggacgtgatgtg caccgccttccacgacaaegaggagaccttcctgaagaagtacctgtaegaga tcgcccggcggcacccctacttctacgcccccgagctgctgttcttcgccaag

- 72 042423

		cggtacaaggccgccttcaccgagtgctgccaggccgccgacaaggccgcctg cctgctgcccaagctggacgagctgcgggacgagggcaaggccagcagcgcca agcagcggctgaagtgcgccagcctgcagaagttcggcgagcgggccttcaag gcctgggccgtggcccggctgagccagcggttccccaaggccgagttcgccga ggtgagcaagctggtgaccgacctgaccaaggtgcacaccgagtgctgccacg gcgacctgctggagtgcgccgacgaccgggccgacctggccaagtacatctgc gagaaccaggacagcatcagcagcaagctgaaggagtgctgcgagaagcccct gctggagaagagccactgcatcgccgaggtggagaacgacgagatgcccgccg acctgcccagcctggccgccgacttcgtggagagcaaggacgtgtgcaagaac tacgccgaggccaaggacgtgttcctgggcatgttcctgtacgagtacgcccg gcggcaccccgactacagcgtggtgctgctgctgcggctggccaagacctacg agaccaccctggagaagtgctgcgccgccgccgacccccacgagtgctacgcc aaggtgttcgacgagttcaagcccctggtggaggagccccagaacctgatcaa gcagaactgcgagctgttcgagcagctgggcgagtacaagttccagaacgccc tgctggtgcggtacaccaagaaggtgccccaggtgagcacccccaccctggtg gaggtgagccggaacctgggcaaggtgggcagcaagtgctgcaagcaccccga ggccaagcggatgccctgcgccgaggactacctgagcgtggtgctgaaccagc tgtgcgtgctgcacgagaagacccccgtgagcgaccgggtgaccaagtgctgc accgagagcctggtgaaccggcggccctgcttcagcgccctggaggtggacga gacctacgtgcccaaggagttcaacgccgagaccttcaccttccacgccgaca tctgcaccctgagcgagaaggagcggcagatcaagaagcagaccgccctggtg gagctggtgaagcacaagcccaaggccaccaaggagcagctgaaggccgtgat ggacgacttcgccgccttcgtggagaagtgctgcaaggccgacgacaaggaga cctgcttcgccgaggagggcaagaagctggtggccgccagccaggccgccctg ggcctgggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggatctggtggaggtgg cagtggaggagggggatccgctcgcaacggtgaccactgccctctgggtcctg gtcgctgctgccgcctgcacaccgttcgcgcttctctggaagacctgggttgg gctgactgggttctgtctcctcgcgaagttcaggttaccatgtgcatcggtgc ttgcccttctcagttccgcgctgctaacatgcacgcttggatcaaaacctctc tgcaccgcctgaaacctgacaccgttcctgctccttgctgcgttcctgcttct tacaaccctatggttctgatccagaaaaccgacaccggtgtttctctgcagac ctacgacgacctgctggctaaagactgccactgcatc
92	HSA (C34S) - GS-(GGGGS)₈ -GDF15 (делеция 4)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV

- 73 042423

		ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDHCPLGPGR С C RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAO P S Q FRAANMHAQIKT S LH RLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
93	HSA (C34S)- GS-(GGGGS)g — GDF15 (делеция 5)	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHCPLGPGRC C RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAO P S Q FRAANMHAQIKT S LHR LKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
94	6x-гистидиновая метка- HSA (C34S)- GS-(GGGGS) g — Сайт HRV3C белка GDF15	EFHHHHHHDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNE VTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPER NECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYA PELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQ KFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDR ADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFV ESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAA ADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVP QVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPV SDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKL VAASQAALGLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLEVLFQGPARNGDHCPLGPGR С C RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAO P S Q FRAANMHAQIKT S LH RLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
95	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 92 (оптимизация кодонов 1)	GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAA TTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTCCCCAT T T GAAGAT CAT GTAAAAT TAGT GAAT GAAGTAACT GAAT T T GCAAAAACAT GT GTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGG AGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTG ACT GCT GT GCAAAACAAGAACCT GAGAGAAAT GAAT GOTT CTT GCAACACAAA GAT GACAAC С CAAAC CT C COCO GAT T GGT GAGAC CAGAGGT T GAT GT GAT GT G CACTGCTTTT CAT GACAAT GAAGAGACAT T T T T GAAAAAATAC T TATAT GAAA TTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAA AGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTG

- 74 042423

		CCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCA AACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAA GCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGA AGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATG GAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGT GAAAAT CAAGATT CGAT СТ CCAGTAAACT GAAGGAAT GCT GT GAAAAACCT СТ GTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTG ACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAAC TATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAG AAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATG AAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCC AAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAA ACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGC ТАТ ТAGT Т С GT ТАСАС CAAGAAAGTАС С С CAAGT GT СААСТ С СААСТ СТ Т GTА GAGGTСТCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATССТGA AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGT ТАТ GT GT GTT GCAT GAGAAAACGCCAGTAAGT GACAGAGT CACCAAAT GCT GC ACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGA AACATAC GT Т С С СAAAGAGT Т ТAAT G С Т GAAACАТ Т САС С Т Т С CAT G СAGATA ТАТ GCACACTTT СТ GAGAAGGAGAGACAAAT CAAGAAACAAACT GCACTT GTT GAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTAT GGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGA CCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTA GGGCTTGGAAGCGGCGGAGGGGGGAGTGGCGGCGGTGGCTCCGGGGGGGGCGG ATCCGGCGGAGGGGGCAGCGGGGGTGGAGGGAGTGGCGGGGGAGGATCAGGGG GAGGAGGATCAGGAGGGGGCGGAAGTGATCATTGCCCTCTCGGGCCCGGACGG TGTTGCCGCCTCCACACTGTGAGGGCTTCACTTGAAGACCTTGGATGGGCCGA CTGGGTGCTGTCCCCAAGAGAGGTACAAGTCACAATGTGTATTGGCGCCTGCC CCAGCCAGTTTCGCGCCGCTAACATGCACGCCCAGATAAAAACCAGCCTGCAC CGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAA TCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATG ATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATA
96	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 7	GGGGACCACTGTCCGCTCGGGCCCGGGCGTTGCTGCCGTCTGCACACGGTCCG CGCGTCGCTGGAAGACCTGGGCTGGGCCGATTGGGTGCTGTCGCCACGGGAGG TGCAAGTGACCATGTGCATCGGCGCGTGCCCGAGCCAGTTCCGGGCGGCAAAC ATGCACGCGCAGATCAAGACGAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCC AGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGA CCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGC CACTGCATA
97	Нуклеиновая кислота, кодирующая	GACCACTGTCCGCTCGGGCCCGGGCGTTGCTGCCGTCTGCACACGGTCCGCGC GTCGCTGGAAGACCTGGGCTGGGCCGATTGGGTGCTGTCGCCACGGGAGGTGC AAGTGACCATGTGCATCGGCGCGTGCCCGAGCCAGTTCCGGGCGGCAAACATG

- 75 042423

	SEQ ID NO: 8 (оптимизация кодонов 1)	CACGCGCAGATCAAGACGAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGC GCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCG ACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCAC TGCATA
98	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 8 (оптимизация кодонов 2)	GATCATTGCCCTCTCGGGCCCGGACGGTGTTGCCGCCTCCACACTGTGAGGGC TTCACTTGAAGACCTTGGATGGGCCGACTGGGTGCTGTCCCCAAGAGAGGTAC AAGTCACAATGTGTATTGGCGCCTGCCCCAGCCAGTTTCGCGCCGCTAACATG CACGCCCAGATAAAAACCAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGC GCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCG ACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCAC TGCATA
99	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 8 (оптимизация кодонов 3)	GATCATTGTCCCCTTGGACCGGGTAGATGCTGTCGCCTGCACACTGTGCGGGC TTCACTGGAGGACCTCGGCTGGGCTGACTGGGTGCTGTCCCCACGGGAGGTGC AAGTGACCATGTGCATCGGCGCCTGTCCTTCGCAATTCCGGGCCGCGAATATG CACGCCCAGATCAAGACCTCCCTGCATCGCCTCAAGCCCGACACTGTGCCTGC TCCATGCTGTGTGCCGGCCTCCTATAACCCCATGGTGCTGATCCAGAAAACCG ATACCGGCGTCAGCCTGCAGACGTATGATGATCTGCTGGCCAAGGACTGCCAT TGCATC
100	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 9 (оптимизация кодонов 1)	CACTGTCCGCTCGGGCCCGGGCGTTGCTGCCGTCTGCACACGGTCCGCGCGTC GCTGGAAGACCTGGGCTGGGCCGATTGGGTGCTGTCGCCACGGGAGGTGCAAG TGACCATGTGCATCGGCGCGTGCCCGAGCCAGTTCCGGGCGGCAAACATGCAC GCGCAGATCAAGACGAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCC CTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACA CCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGC АТА
101	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 9 (оптимизация кодонов 2)	CATTGCCCTCTCGGGCCCGGACGGTGTTGCCGCCTCCACACTGTGAGGGCTTC ACTTGAAGACCTTGGATGGGCCGACTGGGTGCTGTCCCCAAGAGAGGTACAAG TCACAATGTGTATTGGCGCCTGCCCCAGCCAGTTTCGCGCCGCTAACATGCAC GCCCAGATAAAAACCAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCC CTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACA CCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGC АТА
102	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 9 (оптимизация кодонов 3)	CATTGTCCCCTTGGACCGGGTAGATGCTGTCGCCTGCACACTGTGCGGGCTTC ACTGGAGGACCTCGGCTGGGCTGACTGGGTGCTGTCCCCACGGGAGGTGCAAG TGACCATGTGCATCGGCGCCTGTCCTTCGCAATTCCGGGCCGCGAATATGCAC GCCCAGATCAAGACCTCCCTGCATCGCCTCAAGCCCGACACTGTGCCTGCTCC ATGCTGTGTGCCGGCCTCCTATAACCCCATGGTGCTGATCCAGAAAACCGATA CCGGCGTCAGCCTGCAGACGTATGATGATCTGCTGGCCAAGGACTGCCATTGC АТС
103	Нуклеиновая кислота, кодирующая	TGTCCGCTCGGGCCCGGGCGTTGCTGCCGTCTGCACACGGTCCGCGCGTCGCT GGAAGACCTGGGCTGGGCCGATTGGGTGCTGTCGCCACGGGAGGTGCAAGTGA CCATGTGCATCGGCGCGTGCCCGAGCCAGTTCCGGGCGGCAAACATGCACGCG

- 76 042423

	SEQ ID NO: 10 (оптимизация кодонов 1)	CAGATCAAGACGAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTG CTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCG GGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATA
104	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 10 (оптимизация кодонов 2)	TGCCCTCTCGGGCCCGGACGGTGTTGCCGCCTCCACACTGTGAGGGCTTCACT TGAAGACCTTGGATGGGCCGACTGGGTGCTGTCCCCAAGAGAGGTACAAGTCA CAATGTGTATTGGCGCCTGCCCCAGCCAGTTTCGCGCCGCTAACATGCACGCC CAGATAAAAACCAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTG CTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCG GGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATA
105	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 10 (оптимизация кодонов 3)	TGTCCCCTTGGACCGGGTAGATGCTGTCGCCTGCACACTGTGCGGGCTTCACT GGAGGACCTCGGCTGGGCTGACTGGGTGCTGTCCCCACGGGAGGTGCAAGTGA CCATGTGCATCGGCGCCTGTCCTTCGCAATTCCGGGCCGCGAATATGCACGCC CAGATCAAGACCTCCCTGCATCGCCTCAAGCCCGACACTGTGCCTGCTCCATG CTGTGTGCCGGCCTCCTATAACCCCATGGTGCTGATCCAGAAAACCGATACCG GCGTCAGCCTGCAGACGTATGATGATCTGCTGGCCAAGGACTGCCATTGCATC
106	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 11 (оптимизация кодонов 1)	TGCCGTCTGCACACGGTCCGCGCGTCGCTGGAAGACCTGGGCTGGGCCGATTG GGTGCTGTCGCCACGGGAGGTGCAAGTGACCATGTGCATCGGCGCGTGCCCGA GCCAGTTCCGGGCGGCAAACATGCACGCGCAGATCAAGACGAGCCTGCACCGC CTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCC CATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATG ACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATA
107	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 11 (оптимизация кодонов 2)	TGCCGCCTCCACACTGTGAGGGCTTCACTTGAAGACCTTGGATGGGCCGACTG GGTGCTGTCCCCAAGAGAGGTACAAGTCACAATGTGTATTGGCGCCTGCCCCA GCCAGTTTCGCGCCGCTAACATGCACGCCCAGATAAAAACCAGCCTGCACCGC CTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCC CATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATG ACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATA
108	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 11 (оптимизация кодонов 3)	TGTCGCCTGCACACTGTGCGGGCTTCACTGGAGGACCTCGGCTGGGCTGACTG GGTGCTGTCCCCACGGGAGGTGCAAGTGACCATGTGCATCGGCGCCTGTCCTT CGCAATTCCGGGCCGCGAATATGCACGCCCAGATCAAGACCTCCCTGCATCGC CTCAAGCCCGACACTGTGCCTGCTCCATGCTGTGTGCCGGCCTCCTATAACCC CATGGTGCTGATCCAGAAAACCGATACCGGCGTCAGCCTGCAGACGTATGATG ATCTGCTGGCCAAGGACTGCCATTGCATC
109	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 60 (оптимизация кодонов 2)	GATGCGCACAAGTCGGAAGTGGCCCATCGCTTTAAGGACCTGGGAGAAGAGAA CTTCAAGGCCCTGGTCCTGATCGCGTTCGCCCAGTACCTCCAGCAGTCCCCGT TTGAGGACCACGTCAAGCTTGTGAACGAAGTGACCGAGTTCGCAAAGACTTGT GTGGCCGATGAGTCCGCCGAAAACTGCGACAAGTCCCTGCACACCTTGTTCGG AGACAAGCTGTGCACCGTCGCGACTTTGCGGGAGACTTACGGCGAAATGGCGG ACTGCTGCGCAAAGCAGGAGCCCGAAAGGAACGAGTGCTTCCTGCAACACAAG GACGACAACCCGAACCTTCCGAGACTCGTGCGGCCTGAGGTCGACGTGATGTG САС Т G CAT Т С CAT GATAAC GAAGAAACAT T С С T GAAGAAGTAC С T GTAT GAAA TTGCCAGACGCCACCCGTACTTCTACGCCCCCGAACTGCTGTTCTTCGCCAAG

- 77 042423

		AGATACAAGGCCGCCTTTACCGAATGTTGTCAAGCCGCCGATAAGGCAGCGTG CCTGCTGCCGAAGTTGGACGAGCTCAGGGACGAAGGAAAGGCCTCGTCCGCCA AGCAGAGGCTGAAGTGCGCGTCGCTCCAGAAGTTTGGAGAGCGGGCTTTTAAG GCCTGGGCAGTGGCTAGGTTGAGCCAGAGGTTCCCCAAGGCGGAGTTTGCCGA AGTGTCCAAGCTCGTGACTGACCTGACTAAAGTCCATACCGAATGCTGCCACG GCGATCTGCTCGAATGCGCAGATGACCGGGCGGATTTGGCCAAGTACATTTGC GAAAACCAAGACTCCATAAGCTCCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAAAAGCCTСТ GCTCGAGAAGTCCCACTGTATCGCCGAGGTGGAGAACGACGAAATGCCGGCAG ACCTCCCTAGCCTGGCAGCCGACTTCGTCGAATCCAAGGACGTGTGCAAGAAC TACGCCGAAGCGAAGGACGTGTTCCTGGGAATGTTCCTGTACGAGTACGCCAG ACGGCATCCAGACTACTCCGTGGTGCTTCTCTTGCGGCTGGCCAAGACTTATG AAACGACCCTGGAGAAATGTTGCGCTGCTGCTGACCCACACGAGTGCTACGCC AAAGTGTTCGACGAGTTTAAGCCTCTCGTGGAGGAACCCCAGAACCTCATCAA GCAGAACTGCGAACTTTTCGAGCAGCTCGGGGAGTACAAGTTCCAAAACGCGC TGCTTGTCCGCTACACCAAGAAAGTGCCGCAAGTGTCCACACCGACCCTCGTG GAAGTGTCCAGGAACCTGGGCAAAGTCGGAAGCAAATGTTGCAAGCACCCCGA AGCCAAGCGCATGCCGTGCGCAGAGGACTACCTTTCGGTGGTGTTGAACCAGC TCTGCGTCCTGCACGAAAAGACCCCGGTGTCAGACCGCGTGACCAAGTGCTGT ACCGAAAGCCTCGTGAATCGGCGCCCCTGCTTCTCGGCCCTGGAGGTGGACGA AACTTACGTGCCGAAAGAGTTCAACGCGGAAACCTTCACCTTTCATGCCGATA TCTGCACCCTGTCCGAGAAGGAGCGGCAGATCAAGAAGCAGACCGCCCTGGTG GAGCTTGTGAAACACAAGCCGAAGGCCACTAAGGAACAGCTGAAGGCCGTCAT GGACGATTTCGCTGCCTTCGTCGAGAAGTGCTGCAAGGCCGACGACAAGGAGA CTTGCTTCGCTGAAGAAGGGAAGAAGCTTGTGGCCGCTAGCCAGGCTGCACTG GGACTGGGTAGCGGTGGAGGGGGATCAGGGGGTGGTGGATCGGGAGGAGGAGG ATCAGGAGGTGGCGGCTCAGGAGGAGGCGGATCAGGCGGTGGAGGATCCGGAG GCGGAGGATCGGGTGGAGGAGGCTCAGCGAGGAACGGGGATCATTGTCCCCTT GGACCGGGTAGATGCTGTCGCCTGCACACTGTGCGGGCTTCACTGGAGGACCT CGGCTGGGCTGACTGGGTGCTGTCCCCACGGGAGGTGCAAGTGACCATGTGCA TCGGCGCCTGTCCTTCGCAATTCCGGGCCGCGAATATGCACGCCCAGATCAAG ACCTCCCTGCATCGCCTCAAGCCCGACACTGTGCCTGCTCCATGCTGTGTGCC GGCCTCCTATAACCCCATGGTGCTGATCCAGAAAACCGATACCGGCGTCAGCC TGCAGACGTATGATGATCTGCTGGCCAAGGACTGCCATTGCATC
110	Нуклеиновая кислота, кодирующая SEQ ID NO: 92 (оптимизация кодонов 2)	GATGCGCACAAGTCGGAAGTGGCCCATCGCTTTAAGGACCTGGGAGAAGAGAA CTTCAAGGCCCTGGTCCTGATCGCGTTCGCCCAGTACCTCCAGCAGTCCCCGT TTGAGGACCACGTCAAGCTTGTGAACGAAGTGACCGAGTTCGCAAAGACTTGT GTGGCCGATGAGTCCGCCGAAAACTGCGACAAGTCCCTGCACACCTTGTTCGG AGACAAGCTGTGCACCGTCGCGACTTTGCGGGAGACTTACGGCGAAATGGCGG ACTGCTGCGCAAAGCAGGAGCCCGAAAGGAACGAGTGCTTCCTGCAACACAAG GACGACAACCCGAACCTTCCGAGACTCGTGCGGCCTGAGGTCGACGTGATGTG САС Т G CAT Т С CAT GATAAC GAAGAAACAT T С С T GAAGAAGTAC С T GTAT GAAA TTGCCAGACGCCACCCGTACTTCTACGCCCCCGAACTGCTGTTCTTCGCCAAG

- 78 042423

		AGATACAAGGCCGCCTTTACCGAATGTTGTCAAGCCGCCGATAAGGCAGCGTG CCTGCTGCCGAAGTTGGACGAGCTCAGGGACGAAGGAAAGGCCTCGTCCGCCA AGCAGAGGCTGAAGTGCGCGTCGCTCCAGAAGTTTGGAGAGCGGGCTTTTAAG GCCTGGGCAGTGGCTAGGTTGAGCCAGAGGTTCCCCAAGGCGGAGTTTGCCGA AGTGTCCAAGCTCGTGACTGACCTGACTAAAGTCCATACCGAATGCTGCCACG GCGATCTGCTCGAATGCGCAGATGACCGGGCGGATTTGGCCAAGTACATTTGC GAAAACCAAGACTCCATAAGCTCCAAGCTGAAGGAGTGCTGTGAAAAGCCTCT GCTCGAGAAGTCCCACTGTATCGCCGAGGTGGAGAACGACGAAATGCCGGCAG ACCTCCCTAGCCTGGCAGCCGACTTCGTCGAATCCAAGGACGTGTGCAAGAAC TACGCCGAAGCGAAGGACGTGTTCCTGGGAATGTTCCTGTACGAGTACGCCAG ACGGCATCCAGACTACTCCGTGGTGCTTCTCTTGCGGCTGGCCAAGACTTATG AAACGACCCTGGAGAAATGTTGCGCTGCTGCTGACCCACACGAGTGCTACGCC AAAGTGTTCGACGAGTTTAAGCCTCTCGTGGAGGAACCCCAGAACCTCATCAA GCAGAACTGCGAACTTTTCGAGCAGCTCGGGGAGTACAAGTTCCAAAACGCGC TGCTTGTCCGCTACACCAAGAAAGTGCCGCAAGTGTCCACACCGACCCTCGTG GAAGTGTCCAGGAACCTGGGCAAAGTCGGAAGCAAATGTTGCAAGCACCCCGA AGCCAAGCGCATGCCGTGCGCAGAGGACTACCTTTCGGTGGTGTTGAACCAGC TCTGCGTCCTGCACGAAAAGACCCCGGTGTCAGACCGCGTGACCAAGTGCTGT ACCGAAAGCCTCGTGAATCGGCGCCCCTGCTTCTCGGCCCTGGAGGTGGACGA AACTTACGTGCCGAAAGAGTTCAACGCGGAAACCTTCACCTTTCATGCCGATA TCTGCACCCTGTCCGAGAAGGAGCGGCAGATCAAGAAGCAGACCGCCCTGGTG GAGCTTGTGAAACACAAGCCGAAGGCCACTAAGGAACAGCTGAAGGCCGTCAT GGACGATTTCGCTGCCTTCGTCGAGAAGTGCTGCAAGGCCGACGACAAGGAGA CTTGCTTCGCTGAAGAAGGGAAGAAGCTTGTGGCCGCTAGCCAGGCTGCACTG GGACTGGGTAGCGGTGGAGGGGGATCAGGGGGTGGTGGATCGGGAGGAGGAGG ATCAGGAGGTGGCGGCTCAGGAGGAGGCGGATCAGGCGGTGGAGGATCCGGAG GCGGAGGATCGGGTGGAGGAGGCTCAGATCATTGTCCCCTTGGACCGGGTAGA TGCTGTCGCCTGCACACTGTGCGGGCTTCACTGGAGGACCTCGGCTGGGCTGA CTGGGTGCTGTCCCCACGGGAGGTGCAAGTGACCATGTGCATCGGCGCCTGTC CTTCGCAATTCCGGGCCGCGAATATGCACGCCCAGATCAAGACCTCCCTGCAT CGCCTCAAGCCCGACACTGTGCCTGCTCCATGCTGTGTGCCGGCCTCCTATAA CCCCATGGTGCTGATCCAGAAAACCGATACCGGCGTCAGCCTGCAGACGTATG ATGATCTGCTGGCCAAGGACTGCCATTGCATC
111	HSA (C34S)-GS(GGGGS)₈-(делеция 5) GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC

- 79 042423

		TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSHCPLGPGRC C RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LHR LKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
112	HSA (C34S)-GS(GGGGS)₈-(делеция 14) GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSCRLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAP CCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
113	(Делеция 2) HSA (C34S)-GS- (GGGGS)₈-(делеция 4) GDF15	HKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVA DESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDD NPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRY KAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAW AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICEN QDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYA EAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKV FDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEV SRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTE SLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVEL VKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDHCPLGPGRCC RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRL KPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
114	ДНК для SEQ ID NO: 113 (делеция 2) HSA (C34S)-GS- (GGGGS)₈-(делеция 4) GDF15	CACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAA AGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTCCCCATTTGAAG AT CAT GTAAAAT TAGT GAAT GAAGTAACT GAAT T T GCAAAAACAT GTGTTGCT GATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAA ATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCT GT GCAAAACAAGAACCT GAGAGAAAT GAAT GCTT CTT GCAACACAAAGAT GAC AACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGC T T T T CAT GACAAT GAAGAGACAT T T T T GAAAAAATAC T TATAT GAAAT T G С CA GAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTAT

- 80 042423

		AAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTT GCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGA GACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGG GCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTC CAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATC TGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAAT CAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGA AAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGC CTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCT GAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCA TCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCA CTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTG TTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAA TTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAG T T C GT TACAC CAAGAAAGTAC С C CAAGT GT CAACT С CAACT CT T GTAGAGGT C TCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATGCTGAAGCAAA AAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTG T GTT GGAT GAGAAAACGCCAGTAAGT GACAGAGT CACCAAAT GCT GCACAGAA TCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATA CGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCA CACTTT CT GAGAAGGAGAGACAAAT CAAGAAACAAACT GCACTT GTT GAGCT C GT GAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACT GAAAGCT GTTAT GGAT GA TTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCT TTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGGCTT GGAAGCGGCGGAGGGGGGAGTGGCGGCGGTGGCTCCGGGGGGGGCGGATCCGG CGGAGGGGGCAGCGGGGGTGGAGGGAGTGGCGGGGGAGGATCAGGGGGAGGAG GATCAGGAGGGGGCGGAAGTGATCATTGCCCTCTCGGGCCCGGACGGTGTTGC CGCCTCCACACTGTGAGGGCTTCACTTGAAGACCTTGGATGGGCCGACTGGGT GCTGTCCCCAAGAGAGGTACAAGTCACAATGTGTATTGGCGCCTGCCCCAGCC AGTTTCGCGCCGCTAACATGCACGCCCAGATAAAAACCAGCCTGCACCGCCTG AAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCAT GGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACT TGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATA
115	HSA (C34S)-GA(GGGGA) ₈-(делеция 4) GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC

- 81 042423

		TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGADHCPLGPGR С C RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAG P S Q FRAANMHAQIKT S LH RLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
116	ДНК для SEQ ID NO: 115 HSA (C34S)-GA(GGGGA) ₈-(делеция 4) GDF15	GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAA TTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTCCCCAT T T GAAGAT CAT GTAAAAT TAGT GAAT GAAGTAACT GAAT T T GCAAAAACAT GT GTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGG AGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTG ACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAA GAT GACAAC С CAAAC СТ С С С С C GAT T GGT GAGAC CAGAGGT T GAT GT GAT GT G CACTGCTTTT CAT GACAAT GAAGAGACAT T T T T GAAAAAATAC T TATAT GAAA TTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAA AGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTG CCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCA AACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAA GCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGA AGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATG GAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGT GAAAAT CAAGATT CGAT CT CCAGTAAACT GAAGGAAT GCT GT GAAAAACCT CT GTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTG ACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAAC TATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAG AAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATG AAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCC AAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAA ACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGC TAT TAGT T C GT TACAC CAAGAAAGTAC С C CAAGT GT CAACT С CAACT CT T GTA GAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGA AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGT TAT GT GT GTT GCAT GAGAAAACGCCAGTAAGT GACAGAGT CACCAAAT GCT GC ACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGA AACATAC GT T С С CAAAGAGT T TAAT GCT GAAACAT T СAC С T T C CAT G CAGATA TAT GCACACTTT CT GAGAAGGAGAGACAAAT CAAGAAACAAACT GCACTT GTT GAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTAT GGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGA CCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTA GGGCTTGGTGCTGGAGGAGGCGGGGCGGGCGGCGGGGGTGCCGGTGGGGGTGG CGCAGGGGGAGGTGGTGCGGGTGGTGGTGGGGCTGGTGGGGGAGGTGCAGGCG GTGGCGGTGCCGGGGGGGGTGGCGCGGATCATTGCCCTCTCGGGCCCGGACGG TGTTGCCGCCTCCACACTGTGAGGGCTTCACTTGAAGACCTTGGATGGGCCGA

- 82 042423

		CTGGGTGCTGTCCCCAAGAGAGGTACAAGTCACAATGTGTATTGGCGCCTGCC CCAGCCAGTTTCGCGCCGCTAACATGCACGCCCAGATAAAAACCAGCCTGCAC CGCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAA TCCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATG ATGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATA
117	HSA (C34S)(AP) ₁₀- (делеция 4) GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLS P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN PMVL IQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
118	ДНК для SEQ ID NO: 117 HSA (C34S)- (AP) ₁₀- (делеция 4) GDF15	GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAA TTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTCCCCAT Τ T GAAGAT CAT GTAAAAT TAGT GAAT GAAGTAACT GAAT Τ T GCAAAAACAT GT GTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGG AGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTG ACT GCT GT GCAAAACAAGAACCT GAGAGAAAT GAAT GCTT CTT GCAACACAAA GAT GACAAC С CAAAC СТ С С С С C GAT T GGT GAGAC CAGAGGT T GAT GT GAT GT G CACTGCTTTT CAT GACAAT GAAGAGACAT Τ Τ Τ T GAAAAAATAC T TATAT GAAA TTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAA AGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTG CCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCA AACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAA GCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGA AGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATG GAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGT GAAAAT CAAGATT CGAT CT CCAGTAAACT GAAGGAAT GCT GT GAAAAACCT CT GTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTG ACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAAC TATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAG AAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATG AAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCC AAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAA ACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGC

- 83 042423

		TAT TAGT T C GT TACAC CAAGAAAGTAC С C CAAGT GT CAACT С CAACT CT T GTA GAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGA AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGT TAT GT GT GTT GCAT GAGAAAACGCCAGTAAGT GACAGAGT CACCAAAT GCT GC ACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGA AACATAC GT T С С CAAAGAGT T TAAT GCT GAAACAT T СAC С T T C CAT G CAGATA TAT GCACACTTT CT GAGAAGGAGAGACAAAT CAAGAAACAAACT GCACTT GTT GAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTAT GGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGA CCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTA GGGCTTGCACCAGCCCCTGCCCCTGCACCTGCACCTGCTCCCGCACCGGCTCC AGCCCCAGCTCCGGATCATTGCCCTCTCGGGCCCGGACGGTGTTGCCGCCTCC ACACTGTGAGGGCTTCACTTGAAGACCTTGGATGGGCCGACTGGGTGCTGTCC CCAAGAGAGGTACAAGTCACAATGTGTATTGGCGCCTGCCCCAGCCAGTTTCG CGCCGCTAACATGCACGCCCAGATAAAAACCAGCCTGCACCGCCTGAAGCCCG ACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAATCCCATGGTGCTC ATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGATGACTTGTTAGC CAAAGACT GCCACT GCATA
119	HSA (C34S)(AP) ₁₂- (делеция 4) GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWAD WVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYN PMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
120	ДНК для SEQ ID NO: 119 HSA (C34S)- (AP) ₁₂- (делеция 4) GDF15	GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAA TTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTCCCCAT T T GAAGAT CAT GTAAAAT TAGT GAAT GAAGTAACT GAAT T T GCAAAAACAT GT GTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGG AGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTG ACT GCT GT GCAAAACAAGAACCT GAGAGAAAT GAAT GCTT CTT GCAACACAAA GAT GACAAC С CAAAC СТ С С С С C GAT T GGT GAGAC CAGAGGT T GAT GT GAT GT G CACTGCTTTT CAT GACAAT GAAGAGACAT T T T T GAAAAAATAC T TATAT GAAA TTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAA AGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTG

- 84 042423

		CCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCA AACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAA GCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGA AGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATG GAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGT GAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCT GTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTG ACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAAC TATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAG AAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATG AAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCC AAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAA ACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGC TAT TAGT T C GT TACAC CAAGAAAGTAC С C CAAGT GT CAACT С CAACT CT T GTA GAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGA AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGT TAT GT GT GT T GCAT GAGAAAAC GC CAGTAAGT GACAGAGT САС CAAAT GC T GC ACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGA AACATAC GT T С С CAAAGAGT T TAAT GCT GAAACAT T СAC С T T C CAT G CAGATA TAT GCACACTTT CT GAGAAGGAGAGACAAAT CAAGAAACAAACT GCACTT GTT GAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTAT GGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGA CCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTA GGGCTTGCACCAGCCCCTGCCCCTGCACCTGCACCTGCTCCCGCACCGGCTCC AGCCCCAGCTCCGGCTCCAGCTCCTGATCATTGCCCTCTCGGGCCCGGACGGT GTTGCCGCCTCCACACTGTGAGGGCTTCACTTGAAGACCTTGGATGGGCCGAC TGGGTGCTGTCCCCAAGAGAGGTACAAGTCACAATGTGTATTGGCGCCTGCCC CAGCCAGTTTCGCGCCGCTAACATGCACGCCCAGATAAAAACCAGCCTGCACC GCCTGAAGCCCGACACGGTGCCAGCGCCCTGCTGCGTGCCCGCCAGCTACAAT CCCATGGTGCTCATTCAAAAGACCGACACCGGGGTGTCGCTCCAGACCTATGA TGACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATA
121	HSA (C34S)- GGS(EGKSSGSGSESKST)₃ -GGS- (делеция 4) GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL

- 85 042423

		GLGGSEGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGSDHC PLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQ IKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
122	ДНК для SEQ ID NO: 121 HSA (C34S)- GGS(EGKSSGSGSESKST) 3-GGS- (делеция 4) GDF15	GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAA TTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTCCCCAT T T GAAGAT CAT GTAAAAT TAGT GAAT GAAGTААСТ GAAT T T GGAAAAAGAT GT GTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCGTTTTTGG AGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTG ACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAA GAT GACAAC С CAAAC СТ С С С С C GAT T GGT GAGAC CAGAGGT T GAT GT GAT GT G CACTGCTTTT CAT GACAAT GAAGAGACAT T T T T GAAAAAATAC T TATAT GAAA TTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAA AGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTG CCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCA AACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAA GCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGA AGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATG GAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGT GAAAAT CAAGATT CGAT CT CCAGTAAACT GAAGGAAT GCT GT GAAAAACCT CT GTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTG ACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAAC TATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAG AAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATG AAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCC AAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAA ACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGC TAT TAGT T C GT TACAC CAAGAAAGTAC С C CAAGT GT GAAGT C GAAGT CT T GTA GAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATGCTGA AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGT TAT GT GT GTT GCAT GAGAAAACGCCAGTAAGT GACAGAGT CACAAAAT GCT GT ACTGAGAGCTTGGTCAACAGGCGGCCGTGCTTCAGCGCCCTCGAGGTGGATGA GACTTATGTCCCAAAGGAGTTTAATGCGGAAACTTTTACTTTCCACGCAGACA TTTGCACCTTGTCTGAAAAGGAAAGACAGATTAAGAAACAGACTGCTCTTGTG GAACTGGTAAAACATAAACCAAAAGCTACGAAGGAGCAGCTTAAGGCTGTTAT GGATGATTTCGCCGCGTTTGTCGAGAAGTGCTGCAAAGCGGACGATAAGGAAA CTTGCTTTGCAGAGGAAGGTAAGAAACTCGTAGCGGCAAGTCAGGCTGCGCTT GGCCTTGGAGGCAGTGAAGGCAAATCCTCTGGGAGTGGCTCTGAAAGTAAATC CACCGAGGGCAAATCCAGTGGATCTGGGTCTGAATCTAAGTCTACCGAGGGGA AGTCTTCTGGCAGTGGGTCAGAATCTAAATCTACAGGCGGCTCTGACCATTGC CCGTTGGGACCAGGACGCTGCTGTCGCCTTCATACAGTGCGAGCGAGTTTGGA AGACCTGGGCTGGGCTGACTGGGTGCTTAGCCCTCGGGAGGTCCAGGTCACAA TGTGCATTGGCGCGTGTCCCAGTCAATTTAGAGCAGCAAATATGCACGCCCAA

- 86 042423

		ATAAAAACCTCCCTGCATAGGCTTAAGCCAGATACTGTCCCCGCACCATGCTG TGTGCCTGCTTCTTACAATCCTATGGTACTCATCCAGAAGACCGACACGGGAG TTAGCCTCCAGACTTATGACGACCTCTTGGCTAAAGATTGCCATTGTATT
123	HSA (C34S)-GS(PGGGS)₈-(делеция 4) GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSPGGGSPGGGSPGGGSPGGGSPGGGSPGGGSPGGGSPGGGSDHCPLGPGR С C RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAO P S Q FRAANMHAQIKT S LH RLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
124	ДНК для SEQ ID NO: 123 HSA (C34S)-GS(PGGGS)₈-(делеция 4) GDF15	GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAA TTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTCCCCAT T T GAAGAT CAT GTAAAAT TAGT GAAT GAAGTAACT GAAT T T GCAAAAACAT GT GTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGG AGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTG ACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAA GAT GACAAC С CAAAC СТ С С С С C GAT T GGT GAGAC CAGAGGT T GAT GT GAT GT G CACTGCTTTT CAT GACAAT GAAGAGACAT T T T T GAAAAAATAC T TATAT GAAA TTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAA AGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTG CCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCA AACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAA GCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGA AGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATG GAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGT GAAAAT CAAGATT CGAT CT CCAGTAAACT GAAGGAAT GCT GT GAAAAACCT CT GTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTG ACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAAC TATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAG AAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATG AAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCC AAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAA ACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGC TAT TAGT T C GT TACAC CAAGAAAGTAC С C CAAGT GT CAACT С CAACT CT T GTA GAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGA

- 87 042423

		AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGT TAT GT GT GT T GCAT GAGAAAAC GC CAGTAAGT GACAGAGT CAC GAAAT GT T GC ACAGAGTCACTGGTCAACAGGAGACCTTGCTTCTCCGCTCTTGAGGTTGACGA AACGTATGTСCCAAAAGAGTTCAACGCCGAAACGTTTACGTTTCATGCGGACA TAT GCACT CT CAGT GAGAAGGAGCGACAAAT CAAAAAACAGACT GCT CTT GTA GAGTT GGTAAAACACAAACCTAAAGCAACAAAAGAGCAATT GAAAGCT GT GAT GGACGATTTTGCAGCTTTCGTAGAAAAGTGCTGCAAGGCCGACGATAAAGAAA CCTGTTTCGCTGAAGAAGGCAAAAAACTTGTTGCGGCATCTCAGGCCGCTCTT GGACTTGGGAGCCCGGGTGGCGGGTCTCCAGGCGGAGGCTCTCCGGGCGGAGG TAGTCCCGGAGGGGGTAGTCCGGGCGGCGGTTCTCCAGGTGGAGGTTCTCCTG GTGGTGGCAGTCCTGGCGGAGGATCTGATCACTGTCCCCTTGGGCCCGGGAGG TGCTGCCGACTTCATACAGTTCGCGCCAGCCTTGAAGATTTGGGGTGGGCCGA CTGGGTGTTGAGCCCGAGAGAGGTCCAAGTCACGATGTGTATTGGAGCCTGTC CCTCTCAATTCCGAGCCGCAAATATGCATGCGCAAATAAAGACGAGTCTCCAT CGGTTGAAGCCTGATACTGTCCCAGCTCCGTGCTGCGTCCCCGCGAGTTATAA TCCCATGGTCCTTATACAGAAAACAGACACTGGTGTCAGCCTTCAGACGTATG ACGATTTGCTTGCTAAAGACTGTCATTGTATT
125	HSA (C34S)-GS(AGGGS)₈-(делеция 4) GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GLGSAGGGSAGGGSAGGGSAGGGSAGGGSAGGGSAGGGSAGGGSDHCPLGPGR С C RLHTVRAS L E D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKT S LH RLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
126	ДНК для SEQ ID NO: 125	GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAA TTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTCCCCAT T T GAAGAT CAT GTAAAAT TAGT GAAT GAAGTAACT GAAT T T GCAAAAACAT GT GTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGG AGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTG ACT GCT GT GCAAAACAAGAACCT GAGAGAAAT GAAT GCTT CTT GCAACACAAA GAT GACAAC С CAAAC СТ С С С С C GAT T GGT GAGAC CAGAGGT T GAT GT GAT GT G CACTGCTTTT CAT GACAAT GAAGAGACAT T T T T GAAAAAATAC T TATAT GAAA TTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAA AGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTG CCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCA

- 88 042423

		AACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAA GCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGA AGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATG GAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGT GAAAAT CAAGATT CGAT CT CCAGTAAACT GAAGGAAT GCT GT GAAAAACCT CT GTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTG ACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAAC TATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAG AAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATG AAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCC AAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAA ACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGC TAT TAGT T C GT TACAC CAAGAAAGTAC С C CAAGT GT CAACT С CAACT CT T GTA GAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATGCTGA AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGT TAT GT GT GT T GCAT GAGAAAAC GC CAGTAAGT GACAGAGT CACTAAAT GT T GT ACCGAGTCTCTTGTTAATAGGCGGCCATGCTTCAGTGCATTGGAAGTCGACGA AACCTATGTACCAAAGGAGTTCAACGCAGAAACATTTACATTCCATGCTGATA TCTGCACATTGAGCGAGAAAGAGAGACAGATTAAGAAACAGACAGCGCTTGTT GAACTGGTTAAACACAAACCAAAAGCTACCAAGGAGCAGCTTAAGGCAGTAAT GGATGACTTCGCGGCCTTTGTCGAGAAATGTTGTAAAGCGGATGATAAAGAGA CATGCTTCGCCGAAGAGGGCAAAAAACTTGTAGCGGCAAGCCAGGCCGCACTG GGTCTCGGTAGTGCGGGCGGTGGTTCAGCGGGGGGAGGATCTGCAGGTGGTGG CTCAGCGGGTGGCGGTAGCGCTGGGGGGGGCTCCGCAGGTGGGGGATCAGCAG GCGGCGGATCAGCCGGCGGTGGATCCGACCACTGTCCTCTCGGGCCTGGTCGG TGTTGCCGCCTCCATACTGTGCGCGCGTCTCTTGAGGATCTGGGGTGGGCTGA TTGGGTTCTCTCTCCCCGCGAAGTGCAGGTGACCATGTGTATTGGTGCTTGCC CAAGTCAATTCCGAGCAGCTAACATGCACGCCCAGATCAAGACTAGCCTGCAT CGGCTTAAGCCCGACACTGTTCCTGCCCCTTGCTGTGTTCCTGCATCTTATAA TCCAATGGTCCTGATCCAGAAAACCGATACGGGTGTATCATTGCAAACATACG ACGACTTGCTTGCCAAAGATTGCCATTGCATT
127	HSA (C34S)- GGS(EGKSSGSGSESKST)2 -GGS- (делеция 4) GDF15	DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTC VADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHK DDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAK RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK AWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYIC ENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKN YAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYA KVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLV EVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSWLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCC TESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALV ELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL

-

Claims

GLGGSEGKSSGSGSESKSTEGKSSGSGSESKSTGGSDHCPLGPGRCCRLHTVR AS L Е D L GWADWVL S P REVQVTMCIGAC P S Q FRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVP APCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI

128 ДНК для SEQ ID NO: 127 GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAA TTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTCCCCAT T T GAAGAT CAT GTAAAAT TAGT GAAT GAAGTAACT GAAT T T GCAAAAACAT GT GTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGG AGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTG ACT GCT GT GCAAAACAAGAACCT GAGAGAAAT GAAT GCTT CTT GCAACACAAA GAT GACAAC С CAAAC CT С С С С C GAT T GGT GAGAC CAGAGGT T GAT GT GAT GT G CACTGCTTTT CAT GACAATGAAGAGACATTTTT GAAAAAATACTTATAT GAAA TTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAA AGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTG CCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCA AACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAA GCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGA AGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATG GAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGT GAAAAT CAAGATT CGAT CT CCAGTAAACT GAAGGAAT GCT GT GAAAAACCT CT GTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTG ACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAAC TATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAG AAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATG AAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCC AAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAA ACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGC TAT TAGT T C GT TAGAC CAAGAAAGTAC С C GAAGT GT GAAGT C GAAGT CT T GTA GAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATGCTGA AGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGT TAT GT GT GT T GCAT GAGAAAAC GC CAGTAAGT GACAGAGT GAG GAAAT GCT GT ACAGAATCCCTCGTGAATAGAAGGCCCTGCTTCTCTGCCCTTGAGGTGGACGA GACTTACGTCCCTAAGGAGTTTAACGCCGAGACCTTTACTTTTCATGCTGATA TTTGCACCCTTTCCGAAAAGGAGCGGCAGATCAAGAAACAAACAGCCTTGGTG GAACTCGTAAAACATAAACCCAAAGCCACCAAGGAACAACTTAAAGCTGTTAT GGATGACTTCGCAGCCTTCGTCGAGAAATGTTGCAAGGCGGATGATAAGGAAA CGTGTTTTGCTGAGGAAGGGAAGAAGTTGGTTGCTGCCTCTCAAGCGGCTCTG GGGCTTGGCGGATCAGAGGGGAAGTCCTCCGGGTCCGGTAGCGAGTCCAAATC TACGGAAGGGAAGTCATCCGGTTCTGGGTCAGAGTCCAAATCCACAGGAGGAT CAGACCATTGCCCATTGGGACCAGGACGATGTTGTCGCCTGCATACGGTAAGA GCGTCTCTGGAGGATCTCGGCTGGGCCGATTGGGTTCTCTCACCACGAGAAGT ACAGGTCACAATGTGCATAGGAGCTTGTCCGAGCCAATTCCGGGCGGCTAATA TGCACGCACAGATCAAGACCTCTTTGCACCGCTTGAAGCCCGATACCGTGCCA

GCACCGTGTTGCGTCCCAGCATCTTACAACCCTATGGTTTTGATACAGAAAAC TGACACAGGTGTGAGCCTCCAGACATATGATGATTTGCTGGCTAAGGATTGCC ACTGTATA

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Гибридный белок, содержащий:

а) белок, продлевающий период полужизни, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2,

b) линкер, имеющий длину 35-48 аминокислот и содержащий аминокислотную последовательность (GGGGS)n, где n равно 7 или 8 (SEQ ID NO: 42 или 43), и

c) белок GDF15, выбранный из группы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 6;

причем гибридный белок составлен от N-конца до С-конца в порядке (а)-(Ь)-(с).
2. Гибридный белок по п.1, в котором линкер имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
3. Гибридный белок, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 60 и 92.
4. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую гибридный белок по п.1.

-