KR20180099263A

KR20180099263A - 피세틴을 포함하는 피부건강용 조성물

Info

Publication number: KR20180099263A
Application number: KR1020170026471A
Authority: KR
Inventors: 김교남; 황용일; 손명수
Original assignee: 경남대학교 산학협력단
Priority date: 2017-02-28
Filing date: 2017-02-28
Publication date: 2018-09-05

Abstract

본 발명은 피세틴을 유효성분으로 포함하는 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물을 제공하는 것으로, 멜라노시스(melanosis) 및 지방생성(adipogenesis)의 하향 조절과 피부 섬유 관련 유전자(skin fibril-related genes)의 상향 조절을 통한 피부 건강에서의 피세틴의 신규한 효과를 제공한다.

Description

피세틴을 포함하는 피부건강용 조성물{Composition for skin health Comprising Fisetin}

본 발명은 피세틴을 유효성분으로 포함하는 피부건강용 조성물에 관한 것이다.

노화 과정이란 시간에 따라 세포의 기능이 저하되는 과정으로 세포내 항상성은 노화 과정과 밀접한 관련을 가지고 있다(이선영 등, 2011). 또한 노화는 생물체 내외의 여러 요인으로부터 초래되는 산화적 스트레스를 억제하는 능력을 상실하게 한다. 생체 내에서 에너지 생산을 위한 산화 과정 중에 상당량의 활성산소들이 생성된다. 이들 활성산소는 정상적인 상태에서 생체 내 제거 기작에 의해 대부분 소거되지만, 순간적으로 활성산소가 다량으로 발생되거나 만성적으로 활성산소가 발생되어 항산화 방어 시스템의 균형이 깨지면 피부질환을 비롯한 각종 질병의 원인이 된다고 알려져 있다(Lim et al.,2009; 정은영 등, 2010; 윤미영 등, 2009). 여러 연구자들에 의해 산화적 스트레스는 지질 과산화, 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 멜라닌 생성을 촉진시킴으로써 피부의 탄력을 감소시키고 주름 및 기미·주근깨 등의 각종 피부질환을 유발하여 피부 노화를 가속화시키는 것으로 보고되었다. 따라서 피부 노화를 지연시키고 억제하기 위해서는 생체 내 뿐만 아니라 피부에서 과잉의 활성산소를 억제하고 효율적으로 제거할 수 있는 항산화 방어 시스템이 필요하다(이선영 등, 2011; 김형우 등, 2009).

최근 피부의 건강과 아름다움을 위한 소비자들의 다양한 제품의 수요가 급증하였다. 특히 피부는 영양과 밀접한 관련이 있다는 인식 변화에 따라 이제는 바르는 화장품에서 벗어나 특정 영양소 성분을 이용한 먹는 화장품, 즉 피부미용식품 (nutri-cosmetics, beauty foods)의 개발이 가속화 되고있다. 대표적인 항산화 피부미용식품 소재로는 L-ascorbic acid와 tocopherol이 있다. 이들 비타민의 항산화 활성은 이미 잘 알려져 있으며 피부의 콜라겐 합성 및 탄력 유지에도 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(조윤희, 2005). 최근 웰빙과 더불어 천연 피부미용식품 및 유기농 피부미용식품에 대한 관심이 높아지고 있다. 그러므로 식물 및 식품유래 추출물이나 이들의 생리활성 물질에 대한 과학적인 검증과 안정성 연구가 요구된다.

Benz-γ-pyrone의 구조를 갖는 페놀 화합물 플라보노이드 (flavonoids)는 식물계에 널리 분포하며 플라보놀 (flavonols), 플라본 (flavones), 안토시아니딘 (anthocyanidins), 이소플라본 (isoflavones), 그리고 네오플라보노이드 (neoflavonoids) 등의 하위 그룹을 포함하는 색소성분이다. 녹차의 카테친 (catechins), 양파의 쿼세틴 (quercetin), 두류의 제니스테인 (genistein)은 비교적 잘 알려진 천연물 유래 플라보노이드이며 화장품 소재로의 개발로도 광범위하게 이어지고있다. 자연계에 존재하는 다양한 플라보노이드는 생물체내 세포신호전달, 유전자 및 단백질의 발현, 세포분화 등에 관여하여 노화, 암, 그리고 심혈관계 질환을 예방할 수 있다는 연구결과들이 다수 보고 되었다(Robert J et al., 2001: Kelly EH et al., 2002; Yao K et al., 2008). 이러한 플라보노이드 중 플라보놀 그룹에 속하는 3,3’,4’,7-tetrahydroxy flavone (fisetin)은(Figure 1) 딸기, 사과, 감, 양파, 포도, 그리고 오이 등과 같은 과일이나 채소에 많이 함유된 성분이다(Arai Y et al., 2000).

최근에는 옻나무 추출물로부터 얻은 피세틴(fisetin)이 항산화, 항염, 및 항암 효과를 포함하는 다양한 생리활성이 보고되었다(Maher P, 2006: Higa S et al., 2003). 그럼에도 불구하고 fisetin을 피부 및 미용분야에 적용한 연구는 아직 미흡한 실정이다. 이에, 본 발명자들은 피세틴이 피부미용 및 피부건강에 효과가 있을 수 있다는 점에 착안하여, 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명의 피세틴을 유효성분으로 포함하는 조성물이 피부건강에 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

공개특허공보 제10-2016-0058739호

본 발명자들은, 피부색소침착을 억제하고, CCN2/TGF-β(connective tissue growth factor/transforming growth factor-β)의 신호 전달 경로를 활성화시키며, 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 피세틴(fisetin)이 상기의 활성을 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 피세틴(fisetin)을 유효성분으로 하는 피부건강용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 피세틴(fisetin)을 유효성분으로 포함하여 피부색소침착을 억제하고, CCN2/TGF-β(connective tissue growth factor/transforming growth factor-β)의 신호 전달 경로를 활성화시키며, 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물 제공한다.

[화학식 1]

상기 피세틴은 폴리페놀의 플라보노이드 그룹에 속하는 독특한 구조를 가지는 플라보놀에 속한다. 피세틴은 아카시아, 대두, 옻 등에 포함된 성분이다. 피세틴은 옻나무의 추출물에서 분리될 수 있다. 예를 들어, 옻나무의 수피 및/또는 목질 부분 의 추출물을 크로마토그래피를 이용하여 분리함으로써 수득할 수 있다.

본 발명은 피세틴(fisetin)을 유효성분으로 포함하는 피부색소침착 억제용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 피부 세포내 멜라닌 합성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 조성물은 멜라노사이트(melanocyte)의 활성을 억제하여 기미(melasma), 흑색극세포증(acanthosis nigricans) 및 주근깨(freckles)중 적어도 하나를 완화시킬 수 있다.

상기 조성물은 B16F10 멜라노마(melanoma) 세포에서 멜라닌 합성을 억제할 수 있다.

본 발명은 피세틴(fisetin)을 유효성분으로 포함하고, CCN2/TGF-β(connective tissue growth factor/transforming growth factor-β)의 신호 전달 경로를 활성화시키는 피부건강용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 피부 섬유 관련 유전자(skin fibril-related genes)의 발현 수준 조절을 통해 세포 성장을 향상시킬 수 있다.

상기 조성물은 ECM(extracellular matrix) 단백질 프로콜라겐(procollagen), 콜라겐(collagen) 및 피브로넥틴(fibronectin)중 적어도 하나를 활성화시킬 수 있다.

상기 조성물은 피세틴의 함량에 따라 pro-collagen 1α2, collagen 1α2 및 피브로넥틴(fibronectin)의 mRNA 발현 수준을 조절할 수 있다.

본 발명은 피세틴(fisetin)을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 지방생성(adipogenesis)을 억제하여 피부에 지방이 축적되는 것을 방지할 수 있다.

상기 조성물은 전지방세포가 지방세포로의 분화를 억제할 수 있다.

상기 조성물은 상기 지방생성(adipogenesis)의 전사인자로 작동하는 PPARγ의 mRNA발현 수준 또는 C/EBP의 활성을 억제시킬 수 있다.

본 발명은 피세틴(fisetin)을 유효성분으로 포함하는 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 약학 조성물은 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위 안에서 약학적으로 허용 가능한 희석제, 결합제, 붕해제, 윤활제, pH 조절제, 산화방지제, 용해보조제 등의 첨가제를 포함할 수 있다.

희석제는 슈가, 전분, 미결정셀룰로오스, 유당(유당수화물), 포도당, 디-만니톨, 알기네이트, 알칼리토금속류염, 클레이, 폴리에틸렌글리콜, 무수인산수소칼슘, 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있으며, 결합제는 전분, 미결정셀룰로오스, 고분산성 실리카, 만니톨, 디-만니톨, 자당, 유당수화물, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈(포비돈), 폴리비닐피롤리돈 공중합체(코포비돈), 히프로멜로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 천연검, 합성검, 코포비돈, 젤라틴, 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.

붕해제는 전분글리콘산나트륨, 옥수수전분, 감자전분 또는 전호화전분 등의 전분 또는 변성전분; 벤토나이트, 몬모릴로나이트, 또는 비검(veegum) 등의 클레이; 미결정셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류; 알긴산나트륨 또는 알긴산 등의 알긴류; 크로스카멜로스(croscarmellose)나트륨 등의 가교 셀룰로오스류; 구아검, 잔탄검 등의 검류; 가교 폴리비닐피롤리돈(crospovidone) 등의 가교 중합체; 중탄산나트륨, 시트르산 등의 비등성 제제, 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.

윤활제는 탈크, 스테아린산, 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 라우릴설페이트나트륨, 수소화식물성오일, 나트륨벤조에이트, 나트륨스테아릴푸마레이트, 글리세릴 베헤네이트, 글리세릴 모노레이트, 글리세릴모노스테아레이트, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 콜로이드성 이산화규소 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.

pH조절제는 초산, 아디프산, 아스코르빈산, 아스코르빈산 나트륨, 에테르산 나트륨, 사과산, 숙신산, 주석산, 푸마르산, 구연산(시트르산)과 같은 산성화제와 침강 탄산 칼슘, 암모니아수, 메글루민, 탄산 나트륨, 산화 마그네슘, 탄산 마그네슘, 구연산 나트륨, 삼염기칼슘인산염과 같은 염기성화제 등을 사용할 수 있다.

산화방지제는 디부틸 히드록시 톨루엔, 부틸레이티드 히드록시아니솔, 초산 토코페롤, 토코페롤, 프로필 갈레이트, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 선방출성 구획에서, 용해보조제는 라우릴황산나트륨, 폴리소르베이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테류, 도큐세이트 나트륨, 폴록사머(poloxamer) 등을 사용할 수 있다.

또한, 지연방출성 제제를 만들기 위해 장용성 고분자, 수불용성 중합체, 소수성 화합물, 및 친수성 고분자를 포함할 수 있다.

상기 장용성 고분자는 pH5 미만의 산성 조건하에서 불용성이거나 또는 안정한 것으로, pH5 이상인 특정 pH조건하에서 용해되거나 또는 분해되는 고분자를 말하며, 예를 들어, 히프로멜로오스아세테이트숙시네이트, 히프로멜로오스프탈레이트(히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트), 히드록시메틸에틸셀룰로오스프탈레이트, 셀룰로오스아세테이트프탈레이트, 셀룰로오스아세테이트숙시네이트, 셀룰로오스아세테이트말레이트, 셀룰로오스벤조에이트프탈레이트, 셀룰로오스프로피오네이트프탈레이트, 메틸셀룰로오스프탈레이트, 카르복시메틸에틸셀룰로오스 및 에틸히드록시에틸셀룰로오스프탈레이트, 메틸히드록시에틸셀룰로오스과 같은 장용성 셀룰로오스 유도체; 스티렌-아크릴산 공중합체, 아크릴산메틸-아크릴산 공중합체, 아크릴산메틸메타크릴산 공중합체(예컨대, 아크릴-이즈), 아크릴산부틸-스티렌-아크릴산 공중합체, 및 아크릴산메틸-메타크릴산-아크릴산옥틸공중합체과 같은 상기 장용성 아크릴산계 공중합체; 폴리(메타크릴산 메틸 메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓 L, 유드라짓 S, 에보닉, 독일), 폴리 (메타크릴산 에틸아크릴레이트) 공중합체 (예컨대, 유드라짓 L100-55)와 같은 장용성 폴리메타크릴레이트 공중합체; 아세트산비닐-말레인산 무수물 공중합체, 스티렌-말레인산 무수물 공중합체, 스티렌-말레인산모노에스테를 공중합체, 비닐메틸에테르-말레인산 무수물 공중합체, 에틸렌-말레인산 무수물 공중합체, 비닐부틸에테르-말레인산 무수물 공중합체, 아크릴로니트릴-크릴산메틸ㆍ말레인산 무수물 공중합체, 및 아크릴산부틸-스티렌-말레인산 무수물 공중합체와 같은 장용성 말레인산계 공중합체; 및 폴리비닐알콜프탈레이트, 폴리비닐아세탈프탈레이트, 폴리비닐부틸레이트프탈레이트 및 폴리비닐아세트아세탈프탈레이트와 같은 장용성 폴리비닐 유도체가 있다.

상기 수불용성 중합체는 약물의 방출을 제어하는 약제학적으로 허용가능한 물에 용해되지 않는 고분자를 말한다. 예를 들어, 수불용성 중합체는 폴리비닐아세테이트(예컨대, 콜리코트 SR30D), 수불용성 폴리메타크릴레이트 공중합체[예컨대, 폴리(에틸아크릴레이트-메틸 메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓 NE30D, 폴리(에틸아크릴레이트-메틸메타크릴레이트-트리메틸아미노에틸메타크릴레이트)공중합체(예컨대, 유드라짓RSPO)등], 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 에스테르, 셀룰로오스 에테르, 셀룰로오스 아실레이트, 셀룰로오스 디아실레이트, 셀룰로오스 트리아실레이트, 셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 디아세테이트 및 셀룰로오스 트리아세테이트 등이 있다.

상기 소수성 화합물은 약물의 방출을 제어하는 약제학적으로 허용가능한 물에 용해되지 않는 물질을 말한다. 예를 들어, 글리세릴 팔미토스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 글리세릴 비헤네이트, 세틸 팔미테이트, 글리세릴 모노 올레이트 및 스레아린산과 같은 지방산 및 지방산 에스테르류; 세토스테아릴 알코올, 세틸알코올 및 스테아릴알코올과 같은 지방산 알코올류; 카르나우바왁스, 밀납, 및 미결정왁스와 같은 왁스류; 탈크, 침강탄산칼슘, 인산일수소칼슘, 산화아연, 산화티탄, 카올린, 벤토나이트, 몬모릴로나이트 및 비검과 같은 무기질 물질 등이 있다.

상기 친수성 고분자는 약물의 방출을 제어하는 약제학적으로 허용가능한 물에 용해되는 고분자 물질을 말한다. 예를 들어, 덱스트린, 폴리덱스트린, 덱스트란, 펙틴 및 펙틴 유도체, 알긴산염, 폴리갈락투론산, 자일란, 아라비노자일란, 아라비노갈락탄, 전분, 히드록시프로필스타치, 아밀로오스, 및 아밀로펙틴와 같은 당류; 히프로멜로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스 및 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨과 같은 셀룰로오스 유도체; 구아검, 로커스트 콩 검, 트라가칸타, 카라기난, 아카시아검, 아라비아검, 젤란검, 및 잔탄검과 같은 검류; 젤라틴, 카제인, 및 제인과 같은 단백질; 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 및 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트과 같은 폴리비닐유도체; 폴리(부틸 메타크릴레이트-(2-디메틸아미노에틸)메타크릴레이트-메틸메타크릴레이트) 공중합체(예컨대, 유드라짓E100, 에보닉, 독일), 폴리(에틸 아크릴레이트-메틸 메타크릴레이드-트리에틸아미노에틸- 메타크릴레이트 클로라이드) 공중합체 (예컨대, 유드라짓 RL, RS, 에보닉, 독일)과 같은 친수성 폴리메타크릴레이트 공중합체; 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 폴리에틸렌 유도체; 카보머 등이 있다.

이외에도 착색제, 향료 중에서 선택된 다양한 첨가제로서 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 선택 사용하여 본 발명의 제제를 제제화할 수 있다.

본 발명에서 첨가제의 범위가 상기 첨가제를 사용하는 것으로 한정되는 것은 아니며, 상기한 첨가제를 선택에 의하여 통상 범위의 용량을 함유하여 제제화할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명은 피세틴을 유효성분으로 포함하는 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 피세틴을 유효성분 포함하는 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물은, 피세틴뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다.

예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분으로서 작두콩 추출물 이외에 향미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 향미제로서 천연 향미제(예컨대, 타우마린, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명은 피세틴을 유효성분으로 포함하는 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 피세틴(fisetin) 이외에 화장fy 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

본 발명은 피세틴을 유효성분으로 포함하는 피부색소침착을 억제하고, CCN2/TGF-β(connective tissue growth factor/transforming growth factor-β)의 신호 전달 경로를 활성화시키며, 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명은 피세틴을 유효성분으로 포함하는 피부색소침착을 억제하고, CCN2/TGF-β(connective tissue growth factor/transforming growth factor-β)의 신호 전달 경로를 활성화시키며, 피부 주름 예방 또는 개선용 약학 조성물, 기능성 식품 조성물 및 화장료 조성물을 제공한다.

도 1a 내지 도 1d는 B16F10 흑색 종 세포에서 멜라닌 합성에 대한 피세틴(fisetin) 처리의 효과를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2d는 피세틴 처리가 섬유(fibril) 관련 유전자의 발현 수준과 HSFs(Human Skin Fibroblasts)의 세포 성장에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3d는 3T3-L1 지방생성(adipogenesis)에 피세틴(fisetin) 처리의 효과를 나타낸 것이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 아래 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 상세히 설명한다. 도면에 관계없이 동일한 부재번호는 동일한 구성요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실험예 및 실험 방법

실험예1: 실험물질

본 실험에 사용된 피세틴(fisetin), Oil Red O (ORO), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone (Dex), insulin, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), sodium deoxycholate, nonidet P-40 (NP-40), phosphatase inhibitor cocktail 및 phenylmethane sulfonyl fluoride (PMSF)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), penicillin-streptomycin (PS) 및 bovine calf serum (BCS)는 Welgene Inc. (Daegu, Korea)에서 구입하였다. Fetal bovine serum (FBS)는 GE Healthcare Bio-Sciences Co. (Piscataway, NJ, USA)에서 구입하였다. TRIzol 시약은 Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)에서, PCR PreMix (i-Taq)는 Intron (Seongnam, Korea)에서 구입하였다. 항체(anti-bodies)는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)에서 구입하였다.

실험예2: 세포배양

B16F10 멜라노마(melanoma) 및 3T3-L1 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 인간 피부 섬유아세포(human skin fibroblasts, 이하 ‘HSFs’라 한다.)은 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 분양받았다. B16F10 멜라노마(melanoma) 세포와 HSFs을 100unit/mL의 PS와 10%의 FBS를 포함하는 DMEM 배지에 배양시켰다. 3T3-L1 세포를 100unit/mL의 PS와 10%의 BCS를 포함하는 DMEM 배지에 배양시켰다. 상기 세포들은 37℃의 온도, 5%의 CO2 환경(TC115; Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, USA)에서 배양되었고, 2일 간격으로 배지가 교체되었다.

실험예3: 세포 생존율

MTT assay를 통하여 B16F10 멜라노마(melanoma) 세포와 HSFs에 대한 피세틴의 세포독성을 분석하였다. 배양된 B16F10 멜라노마(melanoma) 세포와 HSFs에 24시간 동안 10, 25, 50, 75, 100, 200 및 400μM 농도의 피세틴을 처리한 후 DMEM배지를 제거하였다. 계속해서, 1 mL의 MTT용액(0.2 mg/mL의 MTT를 포함하는 DMEM)을 1시간동안 가하였다. MTT용액을 제거하고, 수용액에 용해되지 않는 포르마잔(formazan)을 디메틸 설프옥사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 용해시켰다. 3T3-L1 세포의 생존력은 EZ-Cytox assay kit를 사용하여 평가되었다. 배양된 3T3-L1 세포에 24시간 동안 10, 20, 40, 60, 80, 100 및 200μM 농도의 피세틴을 처리하였다. DMEM 배지를 제거하고 24시간 동안 피세틴 처리를 한 후, EZ-Cytox 용액을 가하였다. 1시간 배양후, microplate reader(VersaMax; Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 570nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존력은 피세틴을 처리하지 않은 세포를 대조군으로 하여 세포생존율로 계산되었다.

실험예4: 멜라닌(melanin) 함유량

멜라노시스(melanosis)에 대항하는 피세틴의 억제 활성을 측정하기 위해 72시간 동안 10, 50, 75 및 100 μM 농도의 피세틴으로 처리된 1 μM의 α-MSH 및 100 μM의 IBMX를 사용하여 B16F10 멜라노마(melanoma) 세포에서 멜라닌 축적을 유도하였다. phosphate buffered saline (PBS)로 세척한 후, 상기 세포들을 200μL의 trypsin-EDTA를 사용하여 세포 배양 접시에서 분리하였다. 세포내의 멜라닌 함유량을 측정하기 위하여 10분 동안 18,472xg에서 채집된 세포를 원심분리하였다. 100℃에서 10분 동안 1N NaOH의 200 μL와 10% (v/v) 디메틸 설프옥사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO)에 펠렛을 용해시킨 후, 세포외의 멜라닌 총량을 측정하기 위해 상기 용액을 채집하였다. microplate reader를 이용하여 405nm에서 세포 내외의 멜라닌 총량을 측정하였고 피세틴을 처리하지 않은 세포를 대조군으로 하여 멜라닌 함유량(%)을 계산하였다.

실험예5: 세포 성장 및 증식 측정

세포 성장과 증식에서 피세틴 처리 효과를 검사하기 위하여 플라스틱 니들(needle)로 배양된 세포를 스크레이프(scrape)하였다. 계속해서, 0 및 50 μM 농도의 피세틴에 상기 세포를 노출시켰다. 세포간의 거리를 측정하기 위하여 200배율의 도립현미경 inverted microscope) (KI2000; Korea Lab Tech, Seongnam, Korea)을 이용하여 세포 성장 및 증식 활성을 측정하였다.

실험예6: 3T3-L1의 지방세포(adipocyte) 분화

3Ts-L1의 전지방 세포를 5%의 CO2와 37℃의 분위기에서 100unit/mL의 PS와 10%의 BCS로 보충된 DMEM에서 배양하였고, 2일마다 배지를 교체하였다. 3T3-L1 세포를 2 일째부터 6 일째까지 fisetin으로 처리하였다. 세포성장 후 2일째에, 500μM의 IBMX, 5.2μM의 덱사메타손(dexamethasone) 및 167nM의 인슐린(insulin)을 포함하는 100unit/mL의 PS (FBS-medium)와 10%의 FBS로 보충된 DMEM 배지에서 day0으로 지정된 3T3-L1 전지방세포(preadipocytes)를 배양하였다. 2일후, 167nM의 인슐린(추가 2일 동안)을 첨가한 FBS배지로 배지를 교체하였다. 그후. 별도의 첨가 없이 FBS배지에서 3T3-L1 지방세포를 배양하였다.

실험예7: Oil Red O(ORO) 염색

DMEM 배지를 제거하고 3T3-L1의 지방생성(adipogenesis)에 피세틴의 항 지방 효과를 측정하기 위하여 PBS로 세척한 후, 세포를 30 분 동안 25 ℃에서 3.7 % (v/v) 포름 알데히드로 고정시켰다. 6일째 ORO 염색을 이용하여 분화된 지방세포에서 세포내 지방 축적을 평가하였다. 그후, 포름알데히드로 고정된 지방세포를 물로 3회 세척하였다. 이소프로판올(isopropanol)에서 3mg/mL의 ORO로 15분 동안 지방구(droplets)를 염색하였다(CR300; FINEPCR, Gunpo, Korea). 염색된 세포를 증류수로 3회 세척한 후, 세포를 촬영하였다. ORO 염색된 지방구를 DMSO에서 분해하였고, 100 μg/well씩 96 well plate로 옮겼다. microplate reader를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험예8: total RNA의 단리(isolation)와 RT-PCR의 분석

전사 인자의 mRNA 발현수준을 RT-PCR로 측정하였다. 트리졸(TRIzol) 시약을 이용하여 HSFs와 피세틴(fisetin)으로 처리된 3T3-L1 세포로에서 total RNA를 추출하였다. RNase가 없는 40 μL의 물에 total RNA를 용해시켰다. 48℃에서 12사이클 반응을 통해 cDNA를 합성하는 CycleScript RT PreMix을 이용한 역전사로 cDNA 2 μg을 얻었다. 아가로즈젤(agarose gel)과 β-액틴(β-actin)에 전기영동(electrophoresis)하여 mRNA 발현수준을 분석하였다. C/EBPα, PPARγ, CCN2, FAS, LPL, procollagen 1α2, collagen 1α2, fibronectin, Smad2 및 β-actin에 대한 RT-PCR 프라이머(RT-PCR primers)를 표 1에 나타내었다.

[표 1] RT-PCR분석을 위한 primer sequences

실험예9: 웨스턴 블로팅(western blotting)

1 mM의 PMSF, pH 8.0인 50 mM의 Tris-HCl, 1%(w/v) NP-40, 0.5% 소듐 데옥시클로레이트(sodium deoxycholate), 150 mM NaCl과 포스파타아제(phosphatase) inhibitor cocktail을 포함하는 RIPA 버퍼(buffer)에 HSFs 및 3T3-L1 cells을 용해시켰다. 4℃의 18,472xg에서 20분동안 원심분리 후, 상청액(supernatant) 내의 총단백질(total protein)을 Bradford assay로 정량화하였다. 계속해서, 정량된 상등액을 SDS-PAGE로 전기 영동하였고 분리된 단백질을 TBST로 희석된 5%(w/v) 탈지유로 차단된 폴리비닐리덴 플로라이드(polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 이동시켜, 1차 항체(primary antibodies )와 4 ℃에서 12 시간 반응시켰다. 적절한 양고추냉이 과산화 효소가 접합된 2차 항체와 함께 실온에서 1 시간 동안 멤브레인을 배양하였다. 표적 단백질을 화학 발광 검출 키트로 검출하고 ChemiDoc Molecular Imager(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 시각화하였다.

실험예10: 통계분석

데이터는 평균±표준편차로 표현하였으며, 데이터의 통계처리는 Statistical Package for Social Science (SPSS, Chicago, IL, USA)를 이용하여 분석하였다. Student’s t-test 방법에 의하여 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다.

실험결과

실험결과1: 피세틴은 B16F10 멜라노마(melanoma) 세포에서 말라닌 합성을 억제한다.

B16F10 멜라노마(melanoma)에서의 세포 생존력에 대한 피세틴(fisetin)의 효과를 MTT assays를 이용하여 확인하였다. B16F10 멜라노마 세포를 10, 25, 50, 100, 200 및 400μM의 피세틴으로 24 시간 동안 처리 하였다. 24 시간 동안 100 μM의 농도까지 피세틴에 대한 노출은 B16F10 멜라노마 세포의 생존 능력에 독성 영향을 미치지 않았다(도 1a). 그러나, 100, 200, and 400 μM의 피세틴 처리시 B16F10 멜라노마(melanoma)의 생존력은 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(p<0.05). 이에, 이후의 실험에서는 10 내지 50 μM 농도의 피세틴이 사용되었다.

B16F10 멜라노시스(melanosis)에 대한 피세틴(fisetin)의 효과를 검사하기 위해 72 시간 동안 10, 50, 75 및 100 μM 피세틴의 존재 또는 부재 하에서 1 μM α-MSH 및 100 μM IBMX로 처리함으로써 멜라닌 축적을 개시하였다. 진피 조직의 멜라닌은 표피의 특이적 세포 소포인 성숙한 멜라노좀에서 유래한다. 따라서, 세포 내외의 멜라닌 농도를 포함한 전체 멜라닌 함량의 평가가 중요하다.

B16F10 세포에서 멜라닌 축적에 대한 피세틴 처리의 억제 효과를 B16F10 세포에서 세포 내외의 멜라닌 수준을 측정하여 평가 하였다. 72 시간 동안 투여량에 따라 피세틴을 처리한 경우 α-MSH와 IBMX에 의해 유도된 B16F10 멜라노시스(melanosis)를 억제하는 결과를 나타냈다(도 1b). 10, 50, 75, 100μM의 피세틴 처리는 세포 내외의 멜라닌 축적을 각각 0, 22.27, 68.92, 64.33 % (도 1c), 13.05, 61.97, 80.53, 72.17 % 억제 하였다(도 1d).

멜라닌은 표피에서 합성된 천연 색소이다. 그러나 기미(melasma), 흑색극세포증(acanthosis nigricans) 및 주근깨(freckles)의 과다색소침착은 멜라노사이트(melanocytes)에서 멜라닌의 과도한 생산으로 인해 발생한다. Reynoutria elliptica의 추출물은 SK-MEL-2세포에서 α-MSH 매개 티로시나제 활성 및 멜라닌 생성(melanogenesis)을 통해 억제를 보인다고 전해진다. 또한, Taraxacum platycarpum의 에틸 아세테이트 분획물은 B16F10 멜라노마(melanoma) 세포에서 티로시나제 활성 및 멜라닌 합성을 억제 하였다. 따라서, 피부 미백 물질의 연구는 멜라노사이트(melanocytes)에 의해 과도한 색소 축적으로 인한 피부 손상 및 노화 방지에 중요하다. 따라서, 피세틴은 분명히 B16F10 멜라노마(melanoma) 세포에서 멜라닌 합성의 억제를 통해 중요한 역할을 한다.

실험결과2: 피세틴 처리는 CCN2/TGF-β(connective tissue growth factor/transforming growth factor-β) 신호 전달 경로의 활성화를 통해 피부 섬유 관련 유전자(skin fibril-related genes)의 발현 수준과 세포 성장을 향상시킨다.

HSFs(Human Skin Fibroblasts)의 생존력에 대한 피세틴 처리의 영향을 MTT assay로 평가 하였다. HSFs를 10, 25, 50, 100, 200 및 400 μM 피세틴으로 24시간 동안 처리하였다. 그러나, 24시간 동안 10 내지 50μM 농도의 피세틴 처리는 HSFs의 생존력에 영향을 미치지 않았다(도 2a). 피부 섬유 관련 유전자(skin fibril-related genes)의 성장에 피세틴 처리 기여도를 조사하기 위해 HSFs를 10, 25 및 50 μM 피세틴에 노출시켰다. 피세틴 처리는 pro-collagen 1α2, collagen 1α2 및 fibronectin의 mRNA 발현 수준을 용량에 따라 증가시켰다(도 2b). 세포간 매트릭스(interstitial matrix), ECM(extracellular matrix) 및 기저막은 모두 섬유소 콜라겐과 피브로넥틴 세포외 단백질로 구성된다. ECM의 유지와 성장은 건강한 피부 유지에 결정적인 요소이다. 콜라겐은 인간 피부의 ECM에 풍부하다. 프로콜라겐(Procollagen)은 피부 섬유 아세포로부터의 엑소사이토시스(exocytosis)에 의해 분비되는 콜라겐의 전구체이며, 프로콜라겐 프로테아제에 의한 말단 프로 펩티드의 절단을 통해 콜라겐으로 전환된다. 피브로넥틴(fibronectin)은 콜라겐과 피브린의 ECM 성분을 결합하는 ECM의 고분자량의 당단백질이다. 세포 피브로넥틴은 ECM으로 조립되고 피브로넥틴은 상처 치유에 중요한 역할을 한다. 따라서, 피세틴은 ECM 단백질 프로콜라겐(procollagen), 콜라겐(collagen) 및 피브로넥틴(fibronectin)의 활성화를 통해 피부 건강의 결정적인 조절인자로 기능할 가능성이 있다. 피부 섬유의 손상과 붕괴의 회복에 피세틴 처리 기여를 측정하기 위해 HSFs에 0, 1, 12 및 24 시간 피세틴 처리 후에 세포 성장과 증식을 관찰하였다. 바늘로 스크래치한 후 피세틴으로 처리한 HSFs 사이의 거리는 처리를 하지 않은 세포보다 더 가까웠다(도 2c). 또한, 세포 성장과 증식에 있어 피세틴을 처리한 것이 대조군에 비해 시간에 따라 유의하게 (p <0.05) 활성화되었다.

피부에서 상처 치유는 염증 반응, 재생 조직 형성과 ECM 재구성을 포함하는 복잡한 과정이다. 상처로 이동하는 피부 섬유 아세포는 상처 주변의 ECM 회복을 촉진하는 프로테오글리칸 (proteoglycans)과 I형 및 III형 콜라겐의 합성을 증식시킨다. 일부 섬유 아세포는 근섬유아세포(myofibroblasts)로 분화하고 상처 가장자리의 수축을 통한 상처 회복 활성을 위해 근섬유아세포 형성의 표지자로 흔히 사용되는 α-smooth muscle actin을 합성한다. ICR 생쥐의 절개 상처는 인삼 사포닌으로 치료 한 후 회복되었으며 인삼 사포닌으로 처리된 생쥐의 콜라겐 침착은 상처 치유 과정에서 인삼에 의해 활성화되었다. 따라서, 피세틴 처리는 물리적 손상에 대한 반응으로 피부 섬유 관련 유전자(skin fibril-related genes)의 상향 조절을 통한 세포 성장 및 증식에 기여하였다.

피세틴이 CCN2/TGF-β 신호 전달에 미치는 영향을 측정하기 위해 RT-PCR을 사용하여 CCN2 및 Smad2의 mRNA 발현 수준에 미치는 영향을조사 하였다. 피세틴 처리는 용량에 따라 CCN2와 Smad2 (CCN2 downstream mediator)의 mRNA 발현 수준을 증가시켰다(도 2d). CCN2, TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3의 단백질 발현 수준을 CCN2/TGF-β 신호 전달 경로에 대한 피세틴의 효과를 측정하기 위해 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 평가하였다. 피세틴 처리에 의해 6시간 동안 CCN2와 TGF-β2의 단백질 발현이 증가하였다. 대조적으로, 대조군과 비교하여 피세틴 처리는 TGF-β1 및 TGF-β3의 단백질 발현 수준에 유의한 (p> 0.05) 효과를 나타내지 않았다(도 2d).

소장골(cuttlebone) 추출물은 IL-6 및 TNF-α의 전염증성 사이토 카인 수준의 하향 조절을 통해 화상 손상에서 상처 치유를 증가시킨 것으로 보고되었다. 혈청내피 성장인자, 혈소판유도 성장인자 및 뉴로트로핀 3(neurotrophin 3)의 조절을 통해, 곡물 및 미생물로부터 유래 된 β-글루칸은 항주름, 항산화 및 상처치유활성 및 보습 효과의 유익한 효과를 갖는 것으로 보고되었다. 그러나, 피세틴으로 처리된 CCN2/TGF-β 신호 전달 경로의 조절이 일어나는 근본적인 분자 메커니즘은 아직 연구되지 않았다. 본 연구는 피부 섬유 관련 유전자(skin fibril-related genes)의 상향 조절이 CCN2 및 TGF-β2의 활성화를 통해 매개됨을 제안한다.

실험결과3: 피세틴 처리는 지방 생성 전사 인자의 하향 조절을 통해 3T3-L1 지방 생성(adipogenesis)을 억제한다.

지방 조직은 주로 피부 바로 밑, 내장 기관 및 유방 조직 주위에 위치하고 열과 냉기에 대한 절연 효과, 에너지 균형 유지 및 항상성에 유익한 효과가 있다. 그러나, 지방의 과도 축적은 피부에 주름을 일으키는 피하 셀룰라이트의 원인이 될 수 있다. 천연 물질은 지방 생성을 억제하는 것으로 알려져 있다; 그러나, 피부 건강을 위한 피세틴의 항비만(anti-adipogenic) 활성 및 근본적인 분자 메커니즘은 아직 불분명하다. 24시간 동안 3T3-L1의 전지방세포를 10, 20, 40, 60, 80, 100 및 200 μM의 피세틴으로 처리하였다. 24 시간 동안 1 내지 200μM의 농도의 피세틴 처리는 3T3-L1 전지방 세포에 독성을 갖지 않았다(도 3a). 따라서, 1, 10, 25, 50 및 100 μM fisetin의 농도가 후속 실험을 위해 사용되었다. 3T3-L1 지방생성(adipogenesis)의 피세틴 억제를 알아보기 위해 1, 10, 25, 50 및 100μM 피세틴의 존재 및 부존재하에서 지방생성(adipogenesis)을 개시하기 위해 세포를 지방생성 배지에 노출시켰다. 3T3-L1 지방 생성에 대한 피세틴의 억제 효과를 6 일째 ORO 염색을 기준으로 평가하였다. 피세틴 처리는 대조군에 비해 용량에 따라 3T3-L1 지방 생성을 유의하게 (p <0.05) 억제하였다. 1, 10, 25, 50 및 100μM의 농도에서 피세틴 처리는 3T3-L1 지방 생성을 각각 1.31, 19.04, 62.31, 75.44 및 100.00 % 억제하였다(도 3b). 또한, 세포 내 지방구(lipid droplet)의 수와 크기는 피세틴 처리시 현저하게 감소했다(도 3c). 따라서, 피세틴 처리는 3T3-L1 지방생성(adipogenesis)의 하향 조절(down-regulation)을 통해 세포내 지방 축적을 억제하였다. 지방생성(adipogenesis)은 전지방세포(preadipocytes)의 지방세포(adipocytes)로의 분화로 정의되며 CCAAT/enhancer-binding protein (C/EBP) 계열 및 peroxisome proliferator-activated receptors(PPARs)와 같은 호르몬, 영양소, 아디포킨(adipokines) 및 지방생성 전사 인자의 조절에 의존한다. 이는 지방생성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. C/EBPβ와 C/EBPδ는 분화 후에 즉시 유도되는 반면, C/EBPα와 PPARγ는 훨씬 나중에 발현된다. C/EBPα와 PPARγ는 지방 세포 특이적 유전자 아디포넥틴(adipogenectin), 지방산 합성 효소 (fatty acid synthase; FAS), 리포프로테인 리파제(lipoprotein lipase; LPL)의 발현에 필요하며, 세포 내에서 형태학적 변화와 지방 축적을 일으킨다.

C/EBPα와 PPARγ의 발현 수준을 전사 인자와 지방세포 특이적 유전자의 mRNA 발현에서 피세틴의 지방생성(adipogenesis) 억제 관련성을 RT-PCR로 평가하였다. 3T3-L1 지방 세포를 10, 25, 50 및 100μM 피세틴에 2 내지 6 일 동안 노출시켰다. 지방생성 전사인자 C/EBPα, PPARγ 및 CCN2의 mRNA 발현 수준은 용량 의존적으로 피세틴 처리에 의해 억제되었다 (도 3d). 또한, 피세틴 처리는 FAS 및 LPL을 포함하여 지방세포 특이적 유전자 발현을 저해하였다. 자연 물질 Rumex crispus L. (Polygonaceae 계통의 다년생 초목)과 Aster scaber Thunb (Compositae 계통의 다년생 초본) 추출물의 항지방생성 활성은 전사 인자 C/EBP 및 PPARγ의 mRNA 발현 수준을 억제한다고 알려져 있다. 지방생성 전사 인자 및 지방세포 특이적 유전자의 조절은 지방 축적 저해에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, CCN2/TGF-β 신호 전달 경로의 활성화는 지방세포 분화 동안 C/EBP-β 및 C/EBP-α의 발현 수준의 억제를 통해 중요한 역할을 한다. 따라서, 전사 인자의 mRNA 발현 수준은 아마도 피세틴 처리에 의해 유도된 CCN2/TGF 신호 전달 경로의 활성화와 관련이 있을 것이다.

피세틴 처리는 B16F10 멜라노마(melanoma) 세포에서 멜라닌 합성을 억제했다. 또한, CCN2/TGF-β 신호 전달 경로는 HSF에서 피부 섬유 관련 유전자(skin fibril-related genes)의 발달 및 형성에 있어서 중요하다. 전사 인자 C/EBPα 및 PPARγ의 하향 조절을 통한 3T3-L1 지방생성 동안 지방 축적의 억제도 이 신호 전달 경로에 의해 조절된다.

결론적으로, 멜라노시스(melanosis) 및 지방생성(adipogenesis)의 하향 조절과 피부 섬유 관련 유전자(skin fibril-related genes)의 상향 조절을 통한 피부 건강에서의 피세틴의 신규한 역할이 본원에 제시되었다. 피부 건강을 위해 피세틴을 사용한 영양 화장품(nutri-cosmetics) 및 기능성 식품 개발에 유용한 정보를 제공한다.

제제예1: 피세틴(fisetin)을 유효성분으로 하는 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 약학조성물

1.1 산제의 제조

피세틴 30mg

유당 100mg

탈크 10mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

1.2 정제의 제조

피세틴 30mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다

1.3 캅셀제의 제조

피세틴 30mg

결정성 셀룰로오스 3mg

락토오스 14.8mg

마그네슘 스테아레이트 0.2mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1.4 주사제의 제조

피세틴 30mg

만니톨 180mg

주사용 멸균 증류수 2974mg

Na2HPO4·12H2O 26mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

1.5. 액제의 제조

피세틴 30mg

이성화당 10g

만니톨 5g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예2: 피세틴(fisetin)을 유효성분으로 하는 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물

2.1 정제형 식품의 제조

피세틴 20㎎

옥수수전분 100㎎

유당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제형 식품을 제조한다.

2.2 캅셀 식품의 제조

피세틴 40㎎

결정성 셀룰로오스 3㎎

락토오스 14.8㎎

마그네슘 스테아레이트 0.2㎎

통상의 캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀 식품을 제조한다.

2.3 액화 식품의 제조

피세틴 50㎎

이성화당 10g

만니톨 5g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적정량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100mL로 조절한 후 병에 충진하여 멸균시켜 액화 식품을 제조한다.

2.4 건강식품의 제조

피세틴 50㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70㎍

비타민 E 1.0㎎

비타민 B1 0.13㎎

비타민 B2 0.15㎎

비타민 B6 0.5㎎

비타민 B12 0.2㎍

비타민 C 10㎎

비오틴 10㎍

니코틴산아미드 1.7㎎

엽산 50㎍

판토텐산 칼슘 0.5㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75㎎

산화아연 0.82㎎

탄산마그네슘 25.3㎎

제1인산칼륨 15㎎

제2인산칼슘 55㎎

구연산칼륨 90㎎

탄산칼슘 100㎎

염화마그네슘 24.8㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2.5 건강음료의 제조

피세틴 100㎎

구연산 1000㎎

올리고당 100g

작두콩농축액 2g

타우린 1g

정제수를 가하여 전체 900mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 제조에 사용한다.

제제예3: 피세틴(fisetin)을 유효성분으로 하는 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물

3.1 피세틴을 함유한 크림

피세틴을 포함하는 크림의 제조예는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다. 수상인 정제수, 트리에탄올아민, 글리콜(1,3-Propanediol)을 70℃로 가열하고 용해시키고, 여기에 유상인 지방산, 유성성분, 유화제 및 방부제를 70℃로 가열하여 용해한 액을 첨가하여 유화시킨다. 유화가 완료된 후 상기 용액을 45℃로 냉각시키고 피세틴과 향을 첨가하고 분산시킨 다음 30℃로 냉각한다.

[표 2]

3.2 피세틴을 함유한 겔

피세틴을 함유한 겔의 제조예는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.

[표 3]

피부는 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하(hypodermis) 등 여러 층으로 구성되어 있다. 피세틴(fisetin)의 몇 가지 생물학적 활성이 보고되었지만, 피부에 유익한 효과와 피세틴(fisetin)의 기능은 아직 명확하지 않았다. B16F10 멜라노마(melanoma) 세포, 인간 피부 섬유아세포(fibroblasts) 및 3T3-L1 세포를 사용하여 피 피세틴(fisetin)의 피부건강에 유익한 효과를 연구하였다. B16F10 멜라노마(melanoma) 세포에서의 α-MSH- 및 IBMX- 유도된 멜라노시스(melanosis)는 피세틴(fisetin) 처리에 의해 억제되었고, 이는 또한 CCN2/TGF-β(connective tissue growth factor/transforming growth factor-β) 신호 전달 경로를 통한 피부 섬유 관련 유전자(skin fibril-related genes)의 mRNA 발현 수준을 향상시켰다. CCN2/TGF-β 신호 전달 경로의 활성화를 통해 전사 인자의 하향 조절을 통한 세포 내 지방 축적의 감소가 관찰되었다. 멜라노시스(melanosis) 및 지방생성(adipogenesis)의 하향 조절 및 피부 섬유 관련 유전자(skin fibril-related genes)의 상향 조절을 통한 피부건강에 있어서 피세틴(fisetin)의 새로운 기능이 관찰되었다.

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

피세틴(fisetin)을 유효성분으로 포함하는 피부색소침착 억제용 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 조성물은 피부 세포내 멜라닌 합성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부색소침착 억제용 조성물.
제2 항에 있어서,
상기 조성물은 멜라노사이트(melanocyte)의 활성을 억제하여 기미(melasma), 흑색극세포증(acanthosis nigricans) 및 주근깨(freckles)중 적어도 하나를 완화시키는 것을 특징으로 하는 피부색소침착 억제용 조성물.
제1 항에 있어서,
상기 조성물은 B16F10 멜라노마(melanoma) 세포에서 멜라닌 합성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부색소침착 억제용 조성물.
피세틴(fisetin)을 유효성분으로 포함하고, CCN2/TGF-β(connective tissue growth factor/transforming growth factor-β)의 신호 전달 경로를 활성화시키는 피부건강용 조성물.
제5 항에 있어서,
상기 조성물은 피부 섬유 관련 유전자(skin fibril-related genes)의 발현 수준 조절을 통해 세포 성장을 향상시키는 것을 특징으로 하는 피부 건강용 조성물.
제6 항에 있어서,
상기 조성물은 ECM(extracellular matrix) 단백질 프로콜라겐(procollagen), 콜라겐(collagen) 및 피브로넥틴(fibronectin)중 적어도 하나를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 피부 건강용 조성물
제5 항에 있어서,
상기 조성물은 피세틴의 함량에 따라 pro-collagen 1α2, collagen 1α2 및 피브로넥틴(fibronectin)의 mRNA 발현 수준을 조절하는 것을 특징으로 하는 피부 건강용 조성물.
피세틴(fisetin)을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물.
제9 항에 있어서,
상기 조성물은 지방생성(adipogenesis)을 억제하여 피부에 지방이 축적되는 것을 방지하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물.
제10 항에 있어서,
상기 조성물은 전지방세포가 지방세포로의 분화를 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물.
제11 항에 있어서,
상기 조성물은 상기 지방생성(adipogenesis)의 전사인자로 작동하는 PPARγ의 mRNA발현 수준 또는 C/EBP의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 피부 주름 예방 또는 개선용 조성물.
피세틴(fisetin)을 유효성분으로 포함하는 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 약학 조성물.
피세틴(fisetin)을 유효성분으로 포함하는 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물.
피세틴(fisetin)을 유효성분으로 포함하는 피부색소침착 억제, 피부건강 및 피부 주름 예방 또는 개선용 화장료 조성물.