KR20180069058A - 부동 단백질을 포함하는 구강 케어 제품 및 방법 - Google Patents

Abstract

본원에 제공되는 것은 치아 부식 회복 또는 저해, 치아 재미네랄화 촉진, 및/또는 플루오라이드의 충치예방 효과 향상 방법에 유용한 부동 단백질 (AFP) 을 포함하는 구강 케어 조성물이다.

Description

부동 단백질을 포함하는 구강 케어 제품 및 방법

치아 에나멜은 치아의 크라운을 덮는 석회화된 물질의 얇고, 단단한 층이다. 치아 에나멜의 주요 미네랄 성분은 칼슘 포스페이트의 결정질 형태인 하이드록시아파타이트이다. 치아 에나멜의 화학적 부식은 위산 역류로부터 발생하는 위산 또는 산성 음식 및 음료에 대한 치아 노출로부터 발생할 수 있다. 치아 에나멜의 부식은 보다 황색 외관 치아를 야기하는 증가된 상아질 가시성 및 증가된 상아질 세관 노출로 인해 치아 민감성을 증가시킬 수 있다. 타액성 피막(salivary pellicle) (치아 상에 침착된 타액성 당단백질의 얇은 막) 은 부식성 문제에 대해 치아를 보호하는데 필수적이다. 그 결과, 구강건조증을 겪는 사람은 산 부식 손상에 보다 민감하다.

에나멜 부식을 예방하는 것을 보조하기 위해 개발된 기존 방법은 유리 플루오라이드의 공급원을 구강 케어 조성물 내에 도입하는 것을 포함한다. 플루오라이드는 하이드록시아파타이트보다 낮은 pH 에서 용해되기 때문에 산 손상에 대해 보다 내성이 있는 플루오르아파타이트의 형성을 통해 에나멜에 대한 손상을 감소시킨다. 또한, 주석함유 염은 보다 내산성인 미네랄 층을 형성함으로써 세치제(dentifrice) 제형에 도입되어 유사하게 에나멜 표면을 보호하였다. 에나멜 표면을 보호하고 코팅하는 중합체가 또한 기재되었다.

또한, 충치유발성 박테리아를 함유하는 플라크가 탄수화물로 대사되는 경우, 구강에서 산이 발생된다. 플라크가 에나멜을 통해 양성자 및 미네랄 확산의 속도를 제어하는 배리어를 형성하기 때문에, 플라크 산은 부식성 병변(carious lesion)을 야기한다. 세치제 제형에 플루오라이드 이온을 도입하는 것은 플라크 산의 영향을 완화시키는 가장 일반적인 방법이다. 플루오라이드는 탈미네랄화(demineralization) 속도를 감소시키고, 재미네랄화(remineralization)를 향상시킨다. 또한, 재미네랄화를 향상시키기 위해 플라크 pH 를 제어하거나, 칼슘 포스페이트 염을 안정화시키는 여러 접근법이 개발되었다.

치아 상의 비-박테리아 및 박테리아 발생 산의 영향을 완화시키기 위한 방법들이 개발되었지만, 산 부식 및 박테리아 산 영향으로부터 에나멜을 효과적으로 회복하는 개선된 구강 케어 조성물을 제공하는 것에 대한 요구가 여전히 존재한다.

간단한 개요

본 발명자들은 예상치 못하게도 부동 단백질 (Anti Freeze Protein: AFP) 이 치아 부식의 영향을 회복 또는 완화시키고, 치아 재미네랄화를 촉진하고, 플루오라이드의 충치예방 효과를 향상시키는데 효과적이라는 것을 발견하였다.

예를 들어, 한 구현예에서, AFP 는 대략 중성 또는 약염기성 pH, 예를 들어 pH 7-8, 예를 들어 약 pH 7.5 의 완충 용액을 제공하기 위해, 완충액, 예를 들어 Na₂HPO₄ 완충액 (1.5 mM) 및 CaCl₂ (2.5 mM) 과 같은 포스페이트 완충액에 희석하고, 용액을 여과하고 원심분리하여 AFP 를 포함하는 여과물을 수득함으로써, 적합한 구강에 허용되는 담체의 성분을 갖는 제형으로 제조된다. 살생물제 (예를 들어, 0.1% 세틸피리디늄 클로라이드) 및 플루오라이드가 여과물에 첨가될 수 있다. 이후, AFP 는 구강에 허용되는 담체의 성분, 예를 들어 치약 또는 구강청결제 베이스와 조합되어, 치아 부식의 영향의 회복 또는 완화, 치아 재미네랄화 촉진, 및 플루오라이드의 충치예방 효과 향상을 위한 구강 케어 조성물을 제공할 수 있다.

따라서, 본 개시는:

a) AFP;

b) 구강에 허용되는 담체

(여기서, AFP 는 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 3 중량% 의 양으로 조성물에 존재함) 를 포함하는 구강 케어 조성물 (조성물 1 또는 2 또는 3), 예를 들어 세치제에 관한 것이다. 예를 들어, 본 개시는 하기를 제공한다:

1.1. AFP 가 곤충 AFP 인 조성물 1.

1.2. AFP 가 폴리펩티드 서열 SEQ ID NO:2 를 갖는 조성물 1.

1.3. AFP 가 식물 AFP 인 조성물 2.

1.4. AFP 가 폴리펩티드 서열 SEQ ID NO:3...을 갖는 조성물 2.

1.5. AFP 가 어류 AFP 인 조성물 3.

1.6. AFP 가 폴리펩티드 서열 SEQ ID NO:1...을 갖는 조성물 3.

1.7. 플루오라이드를 포함하는 임의의 상기 조성물.

1.8. AFP 가 예를 들어 포스페이트 완충액을 사용하여 대략 중성 또는 약염기성 pH, 예를 들어 pH 7-8 로 중화된 임의의 상기 조성물.

1.9. AFP 가 살생물제, 예를 들어 세틸피리디늄 클로라이드 (CPC) 를 유효 농도, 예를 들어 여과물의 0.1 중량% 으로 포함하는 임의의 상기 조성물.

1.10. AFP 가 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 3 중량%, 예를 들어 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 2 중량%, 예를 들어 약 0.02 중량%, 약 0.1 중량%, 약 0.5 중량% 또는 약 2 중량% 의 양으로 조성물에 존재하는 임의의 상기 조성물.

1.11. 조성물이 유효량의 플루오라이드를 포함하는 임의의 상기 조성물.

1.12. 100 ppm 내지 2500 ppm 의 플루오라이드의 양, 예를 들어, 250 ppm 내지 750 ppm, 예를 들어 약 500 ppm 의 플루오라이드를 포함하는 임의의 상기 조성물.

1.13. 예를 들어 아연 옥사이드, 아연 시트레이트, 아연 락테이트, 아연 포스페이트, 아연 아세테이트, 아연 클로라이드, 아미노산과의 아연 착물, 및 상기 중 임의의 것의 혼합물로부터 선택되고, 아연의 양이 아연 이온의 중량에 의해 산출시 0.1 중량% 내지 3 중량%, 예를 들어 약 1 내지 약 2 중량% 인 구강에 허용되는 아연 염 또는 옥사이드를 포함하는 임의의 상기 조성물.

1.14. 구강에 허용되는 주석함유 염, 예를 들어 SnF₂ 또는 SnCl₂ 를 포함하는 임의의 상기 조성물.

1.15. 조성물이 구강세정제, 치약, 치아 젤, 치아 분말, 마손-방지(non-abrasive) 젤, 무스, 발포체, 구강 스프레이, 및 타블렛, 예를 들어 세치제, 예를 들어 치약 또는 구강세정제로부터 선택되는 형태인 임의의 상기 조성물.

1.16. 조성물이 하기로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 추가로 포함하는 임의의 상기 조성물: 연마제, pH 조정제, 계면활성제, 발포체 조절제, 증점제, 점도 조절제, 보습제, 항치석제(anti-calculus) 또는 타르타르 조절제(tartar control agent), 감미제, 향미제 및 착색제.

1.17. 조성물이 치약인 임의의 상기 조성물.

1.18. 하나 이상의 가용성 포스페이트 염을 포함하는 임의의 상기 조성물로서, 예를 들어 여기서 "가용성 포스페이트 염" 은 25℃ 에서 적어도 1 g/100 ml 수용해도를 갖는 구강에 허용되는 포스페이트 염을 의미하고; 예를 들어 하나 이상의 가용성 포스페이트 염은 피로포스페이트 및/또는 폴리포스페이트, 예를 들어 트리폴리포스페이트의 소듐 및/또는 포타슘 염이고; 예를 들어 하나 이상의 가용성 포스페이트 염은 테트라소듐 피로포스페이트 (TSPP), 소듐 트리폴리포스페이트 (STPP) 또는 TSPP 및 STPP 의 조합을 포함하고; 예를 들어 하나 이상의 가용성 포스페이트 염은 조성물의 1-20 중량%, 예를 들어 2-8 중량%, 예를 들어 약 5 중량% 의 양으로 존재하는 임의의 상기 조성물.

1.19. 플루오라이드가 주석함유 플루오라이드, 소듐 플루오라이드, 포타슘 플루오라이드, 소듐 모노플루오로포스페이트, 소듐 플루오로실리케이트, 암모늄 플루오로실리케이트, 아민 플루오라이드 (예를 들어, N'-옥타데실트리메틸렌디아민-N,N,N'-트리스(2-에탄올)-디하이드로플루오라이드), 암모늄 플루오라이드, 티타늄 플루오라이드, 헥사플루오로설페이트, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 염에 의해 제공되는 임의의 상기 조성물.

1.20. 예를 들어 글리세린, 소르비톨, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 자일리톨, 및 이의 혼합물로부터 선택되는 보습제를 포함하는 세치제, 예를 들어 조성물의 적어도 30 중량%, 예를 들어 40-50 중량% 의 글리세린을 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물.

1.21. 예를 들어 음이온성, 양이온성, 쯔비터이온성, 및 비이온성 계면활성제, 및 이의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 세치제이고, 예를 들어 여기서 세치제 베이스가 음이온성 계면활성제, 예를 들어 소듐 라우릴 설페이트, 소듐 에테르 라우릴 설페이트, 및 이의 혼합물 (예를 들어, 조성물의 약 0.3 중량% 내지 약 4.5 중량% 의 양의, 예를 들어 1-2 중량% 의 소듐 라우릴 설페이트 (SLS)) 로부터 선택되는 계면활성제를 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물.

1.22. 쯔비터이온성 계면활성제, 예를 들어 베타인 계면활성제, 예를 들어 코카미도프로필베타인 (예를 들어, 조성물의 약 0.1 중량% 내지 약 4.5 중량% 의 양의, 예를 들어 0.5-2 중량% 의 코카미도프로필베타인) 을 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물.

1.23. 하나 이상의 다당류 검, 예를 들어 잔탄 검 또는 카라기난, 실리카 증점제, 및 이들의 조합의 점도 조절량을 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물.

1.24. 검 스트립 또는 단편을 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물.

1.25. 향미제, 방향제 및/또는 착색제를 포함하는 임의의 상기 조성물.

1.26. 유효량의 하나 이상의 항균제를 포함하는 세치제, 예를 들어 할로겐화 디페닐 에테르 (예를 들어, 트리클로산), 허브 추출물 및 에센셜 오일 (예를 들어, 로즈마리 추출물, 차 추출물, 매그놀리아 추출물, 티몰, 멘톨, 유칼립톨, 제라니올, 카르바크롤, 시트랄, 히노키톨, 카테콜, 메틸 살리실레이트, 에피갈로카테킨 갈레이트, 에피갈로카테킨, 갈산, 미스왁 추출물, 산자나무 추출물), 비스구아니드 소독제 (예를 들어, 클로르헥시딘, 알렉시딘 또는 옥테니딘), 4차 암모늄 화합물 (예를 들어, 세틸피리디늄 클로라이드 (CPC), 벤잘코늄 클로라이드, 테트라데실피리디늄 클로라이드 (TPC), N-테트라데실-4-에틸피리디늄 클로라이드 (TDEPC)), 페놀성 소독제, 헥세티딘, 옥테니딘, 산구이나린, 포비돈 요오드, 델모피놀, 살리플루오르, 금속 이온 (예를 들어, 아연 염, 예를 들어 아연 시트레이트, 주석함유 염, 구리 염, 철 염), 산구이나린, 프로폴리스 및 산소화제(oxygenating agent) (예를 들어, 과산화수소, 완충된 소듐 퍼옥시보레이트 또는 퍼옥시카보네이트), 프탈산 및 이들의 염, 모노퍼탈산 및 이들의 염 및 에스테르, 아스코르빌 스테아레이트, 올레오일 사르코신, 알킬 설페이트, 디옥틸 술포숙시네이트, 살리실라닐리드, 도미펜 브로마이드, 델모피놀, 옥타피놀 및 기타 피페리디노 유도체, 니신 제제, 클로라이트 염; 및 상기 중 임의의 것의 혼합물로부터 선택되는 항균제; 예를 들어, 트리클로산 또는 세틸피리디늄 클로라이드를 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물.

1.27. 미백제, 예를 들어 퍼옥사이드, 금속 클로라이트, 퍼보레이트, 퍼카보네이트, 퍼옥시산, 하이포클로라이트, 및 이들의 조합; 예를 들어 과산화수소 또는 과산화수소 공급원, 예를 들어 우레아 퍼옥사이드 또는 퍼옥사이드 염 또는 착물 (예를 들어, 퍼옥시포스페이트, 퍼옥시카보네이트, 퍼보레이트, 퍼옥시실리케이트, 또는 퍼설페이트 염; 예를 들어, 칼슘 퍼옥시포스페이트, 소듐 퍼보레이트, 소듐 카보네이트 퍼옥사이드, 소듐 퍼옥시포스페이트, 및 포타슘 퍼설페이트) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 미백제를 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물.

1.28. 박테리아 부착을 방해하거나 방지하는 작용제, 예를 들어 솔브롤 또는 키토산을 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물.

1.29. 예를 들어, 칼슘 설페이트, 칼슘 클로라이드, 칼슘 니트레이트, 칼슘 아세테이트, 칼슘 락테이트, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 가용성 칼슘 염을 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물.

1.30. 상아질 민감성을 감소시키기에 유효한 양으로 생리학적으로 또는 구강에 허용되는 포타슘 염, 예를 들어 포타슘 니트레이트 또는 포타슘 클로라이드를 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물.

1.31. 음이온성 중합체, 예를 들어 합성 음이온성 중합체성 폴리카르복실레이트를 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물로서, 예를 들어, 여기서 음이온성 중합체가 말레산 무수물 또는 산과 또 다른 중합성 에틸렌성 불포화 단량체의 1:4 내지 4:1 공중합체로부터 선택되고; 예를 들어, 음이온성 중합체가 약 30,000 내지 약 1,000,000, 예를 들어 약 300,000 내지 약 800,000 의 평균 분자량 (M.W.) 을 갖는 메틸 비닐 에테르/말레산 무수물 (PVM/MA) 공중합체이고, 예를 들어, 음이온성 중합체가 조성물의 약 1-5 중량%, 예를 들어 약 2 중량% 인 임의의 상기 조성물.

1.32. 브레스 프레시너(breath freshener), 향미제 또는 방향제를 포함하는 세치제인 임의의 상기 조성물.

1.33. 조성물의 pH 가 대략 중성, 예를 들어 약 pH 7 인 임의의 상기 조성물.

1.34. 산 부식을 감소 및 저해하고, 치아를 세정하고, 박테리아에 의해-생성된 바이오필름 및 플라크를 감소시키고, 치은염을 감소시키고, 치아 우식 및 충치의 형성을 저해하고, 상아질 과민감성을 감소시키는데 사용되는 임의의 상기 조성물.

1.35. 치아 에나멜 부식을 감소, 저해 또는 회복하는데 사용되는 임의의 상기 조성물.

1.36. 치아 에나멜의 재미네랄화를 촉진하는데 사용되는 임의의 상기 조성물.

1.37. 플루오라이드의 충치예방 효과를 향상시키는데 사용되는 임의의 상기 조성물.

조성물 1 또는 2 또는 3 의 특정 신규한 구현예는:

a) AFP;

b) 임의로 유효량의 플루오라이드;

b) 구강에 허용되는 담체

를 포함하고,

예를 들어, AFP 의 양이 0.01 중량% 내지 2 중량% 이고,

예를 들어, 플루오라이드가 100 ppm 내지 1000 ppm, 예를 들어 약 500 ppm 의 양으로 존재하는, 세치제이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 구강 케어 조성물은 검 베이스, 향미제, 감미제 및 AFP 를 포함하는 츄잉 검이다. 검 베이스는 약 4.8% 내지 약 90%, 향미제는 약 0.1% 내지 약 10%, 감미제는 약 0.1% 내지 약 95%, 및 AFP 는 약 0.01% 내지 약 0.5% 로 존재한다.

한 양태에서, 본 개시는 치아 부식의 회복 또는 저해 또는 보호 또는 예방, 재미네랄화 촉진, 및/또는 플루오라이드의 충치예방 효과 향상에 사용하기 위한; 예를 들어 방법 1 (및 그 이하 참조) 에 따른 하기 방법 중 어느 하나에서 사용하기 위한 조성물 1 또는 2 또는 3 (및 그 이하 참조) 중 어느 하나를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 조성물, 예를 들어 조성물 1 또는 2 또는 3 (및 그 이하 참조) 중 어느 하나, 예를 들어 하기를 포함하는 구강 케어 조성물을 치아에 적용하는 것을 포함하는, 치아 부식 회복 또는 저해, 치아 재미네랄화 촉진, 및/또는 플루오라이드의 충치예방 효과 향상 방법 (방법 1 또는 2 또는 3) 을 제공한다:

a) AFP

b) 구강에 허용되는 담체,

여기서, AFP 는 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 3 중량% 의 양으로 조성물에 존재한다. 예를 들어, 본 개시는 하기를 제공한다:

1.1. AFP 가 곤충 AFP 인 방법 1.

1.2. AFP 가 폴리펩티드 서열 SEQ ID NO:2...를 갖는 방법 1.

1.3. AFP 가 식물 AFP 인 방법 2.

1.4. AFP 가 폴리펩티드 서열 SEQ ID NO:3...를 갖는 방법 2.

1.5. AFP 가 어류 AFP 인 방법 3.

1.6. AFP 가 폴리펩티드 서열 SEQ ID NO:1...를 갖는 방법 3.

1.7. AFP 가 플루오라이드를 포함하는 임의의 상기 방법.

1.8. 부분적으로 가수분해된 식물 단백질이 예를 들어 포스페이트 완충액을 사용하여 대략 중성 또는 약염기성 pH, 예를 들어 pH 7-8 로 중화된 임의의 상기 방법.

1.9. AFP 가 살생물제, 예를 들어 세틸피리디늄 클로라이드 (CPC) 를 유효 농도, 예를 들어 여과물의 0.1 중량% 로 포함하는 임의의 상기 방법.

1.10. AFP 가 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 3 중량%, 예를 들어 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 2 중량%, 예를 들어 약 0.02 중량%, 약 0.1 중량%, 약 0.5 중량% 또는 약 2 중량% 의 양으로 조성물에 존재하는 임의의 상기 방법.

1.11. 조성물이 유효량의 플루오라이드를 포함하는 임의의 상기 조성물.

1.12. 플루오라이드의 양이 100 ppm 내지 1000 ppm, 예를 들어 약 500 ppm 플루오라이드인 임의의 상기 방법.

1.13. 조성물이 구강세정제, 치약, 치아 젤, 치아 분말, 마손-방지 젤, 무스, 발포체, 구강 스프레이, 및 타블렛으로부터 선택되는 형태인 임의의 상기 방법.

1.14. 조성물이 하기로부터 선택되는 하나 이상 작용제를 추가로 포함하는 임의의 상기 방법: 연마제, pH 조정제, 계면활성제, 발포체 조절제, 증점제, 점도 조절제, 보습제, 항치석제 또는 타르타르 조절제, 감미제, 향미제 및 착색제.

1.15. 조성물이 세치제, 예를 들어 치약인 임의의 상기 방법.

1.16. 조성물이 조성물 1 또는 2 또는 3 (상기 및 이하 참조) 중 어느 하나로부터 선택되는 임의의 상기 방법.

1.17. 예를 들어 조성물이 치아 부식을 갖거나 치아 부식을 가질 위험이 증가된 것으로 확인된 환자의 치아에 적용되는, 치아 부식, 예를 들어 에나멜 부식의 감소, 저해 또는 회복 방법인 임의의 상기 방법.

1.18. 예를 들어 조성물이 탈미네랄화를 갖는 것으로 확인된 환자의 치아에 적용되는, 치아 재미네랄화, 예를 들어 에나멜의 재미네랄화의 촉진 방법인 임의의 상기 방법.

1.19. 예를 들어 조성물이 치아 우식의 초기 징후, 예를 들어 초기 에나멜 카리에스(caries) 또는 활성 우식(active decay)을 갖거나, 치아 우식의 위험이 증가된 것으로 확인된 환자의 치아에 적용되는, 플루오라이드의 충치예방 효과의 향상 방법인 임의의 상기 방법.

1.20. 조성물이 유효량의 플루오라이드를 포함하고/하거나 방법이 유효량의 플루오라이드를 포함하는 유효량의 플루오라이드 구강세정제 또는 치약을 포함하는 구강 케어 제품의 투여를 추가로 포함하는 방법 1.15.

또 다른 구현예에서, 본 개시는 예를 들어 방법 1 또는 2 또는 3 (및 그 이하 참조) 중 어느 하나에서의 치아 부식 회복 또는 저해, 재미네랄화 촉진, 및/또는 플루오라이드의 충치예방 효과 향상을 위한, 예를 들어 조성물 1 또는 2 또는 3 (및 그 이하 참조) 중 어느 하나에 따른 구강 케어 조성물의 제조에서의 AFP 의 용도를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 예를 들어 치아 부식 회복 또는 저해, 치아 재미네랄화 촉진, 및/또는 플루오라이드의 충치예방 효과 향상에 유용한 구강 케어 제품, 예를 들어 조성물 1 또는 2 또는 3 (및 그 이하 참조) 중 어느 하나에 따른 제품의, 하기를 포함하는 제조 방법 (방법 4) 을 제공한다:

a) AFP 를 수성 완충 용액, 예를 들어, 포스페이트 완충 용액으로 희석함으로써 중화하여, 대략 중성 또는 약염기성 pH, 예를 들어 pH 7-8 를 갖는 용액을 수득하는 단계;

b) a) 의 용액 생성물을 여과 및 원심분리하여 AFP 를 포함하는 여과물을 수득하는 단계;

c) 플루오라이드 (예를 들어 플루오라이드, 예를 들어 소듐 플루오라이드 또는 소듐 모노플루오로포스페이트를 함유하는 구강에 허용되는 염의 형태), 및 임의로 살생물제 (예를 들어, 유효량, 예를 들어, 여과물의 0.01 내지 1 중량%, 예를 들어 약 0.1 중량% 의 세틸피리디늄 클로라이드) 를 b) 의 여과 생성물에 첨가하는 단계;

d) c) 의 생성물을 구강에 허용되는 담체의 성분에 혼화하여 AFP 를 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 3 중량% 의 양으로 포함하는 구강 케어 조성물을 수득하는 단계.

예를 들어, 본 개시는 AFP 를 포함하는 구강 케어 조성물, 예를 들어, 조성물 1 또는 2 또는 3 (및 그 이하 참조) 중 어느 하나에 따른 조성물을 제공하고, 구강 케어 조성물은 방법 4 (및 그 이하 참조) 의 방법에 의해 수득되거나 또는 수득가능하다.

본 발명의 적용가능한 추가 분야는 이하 제공되는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 상세한 설명 및 특정 실시예가 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내는 한편, 이는 본 발명의 범위를 한정하지 않으며 단지 예시하기 위한 것임을 이해해야 한다.

상세한 설명

바람직한 구현예(들)에 대한 다음의 설명은 사실상 단지 예시적인 것이며 본 발명, 그 적용, 또는 용도를 조금도 제한하지 않는다.

전체에서 사용된 바와 같이, 범위는 범위 내에 있는 각각의 모든 값을 설명하기 위한 속기로서 사용된다. 범위 내의 임의의 값은 범위의 말단으로 선택될 수 있다. 또한, 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 본 발명의 개시 및 인용된 참고문헌의 정의에서 상충되는 경우, 본 개시가 우선한다.

달리 명시하지 않는 한, 본원 및 본 명세서의 다른 부분에서 표현된 모든 백분율 및 양은 중량 백분율을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 제시된 양은 물질의 유효 중량(active weight)을 기반으로 한다.

부동 단백질 (AFP)

부동 단백질 (AFP) 은 서브제로(subzero) 환경에서 생존을 허용하는 특정 척추동물, 식물, 균류 및 박테리아와 같은 생물로부터의 단백질이다. AFP 는 얼음 구조화 단백질(Ice structuring protein)로도 지칭된다. AFP 는 작은 얼음 결정에 결합하여 그렇지 않은 경우 생물에게 치명적일 수 있는 얼음의 성장 및 재결정화를 저해한다. AFP 의 일반적인 특징은 융점과 빙점의 차이인 열 히스테리시스(thermal hysteresis)이다. 고체 얼음과 액체 물 사이의 계면에 AFP 를 첨가하면 열역학적으로 유리한 얼음 결정의 성장이 저해된다. 얼음 성장은 얼음의 물-접근 가능한(water-accessible) 표면을 덮고 있는 AFP 에 의해 동력학적으로 저해된다. 열 히스테리시스는 나노리터 오스모미터로 실험실에서 용이하게 측정된다.

여러 생물로부터의 AFP 의 일반적인 공통 서열은 존재하지 않는다 [Crit Rev Biotechnol. 2008; 28: 57-82., Properties, potentials, and prospects of antifreeze proteins, Venketesh S1, Dayananda C.; Journal of Experimental Biology 2015; 218: 1846-1855., Animal ice-binding (antifreeze) proteins and glycolipids: an overview with emphasis on physiological function, John G Duman].

본 발명에서 유용한 것은, 호밀풀(lolium perenne)과 같은 식물 유래 또는 마크로조아르세스 아메리카누스(macrozoarces americanus)와 같은 어류 유래 AFP 이다. 바람직한 AFP 는 곤충 유래이다. 2 가지 공지된 유형의 곤충 AFP, 테네브리오(Tenebrio) 및 덴드로이데스(Dendroides) AFP 가 존재하고, 이들은 모두 상이한 곤충 부류이다. 이들은 서로 유사하며, 대략 8.3 - 12.5 kD 의 가변적인 수의 12 또는 13-머(mer) 반복으로 이루어진다. 특히 바람직한 곤충 유래 AFP 는 코리스토네우라 푸미페라나(choristoneura fumiferana) 유래이다.

특히 바람직한 AFP 는 하기 폴리펩티드 서열을 갖는 것들이다:

BM 82 (SEQ ID NO:1)

BM 80 (SEQ ID NO:2)

BM 83 (SEQ ID NO:3)

본 발명의 특히 바람직한 구현예는 SEQ ID NO: 1, 2, 3 에 나타낸 폴리펩티드 서열을 갖는 단백질이다. 특히 바람직한 구현예는 또한 적어도 1 개, 2 개, 10 개 이하, 바람직하게는 5 개 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실로부터 발생하는 단백질이다. 특히 바람직한 것은 SEQ ID NO: 1, 2, 3 에 나타낸 폴리펩티드 서열로부터 출발하여, 모든 아미노산의 1% 이하, 3% 이하, 5% 이하가 치환되거나 또는 결실된 단백질이고, 출발 단백질의 생물학적 특성을 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 80%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 여전히 갖는다. 여기서 단백질의 생물학적 특성은 열 히스테리시스를 의미한다.

AFP 는 또한 바람직하게는 AFP 의 아미노- 또는 카르복시말단 부분에서 융합 파트너와 연결될 수 있다. 융합 파트너는 예를 들어 AFP의 정제에 유용한 his 태그와 같은 작은 펩티드 서열 - 6 내지 10 개의 his 잔기의 서열일 수 있다. SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 은 예를 들어 이들의 카르복시말단에 his₆ 태그를 갖는다.

융합 파트너는 또한 핵산 수준에서 제한 엔도뉴클레아제의 인식 부위를 새롭게 생성하거나 또는 불활성화시킨 결과인 AFP 의 아미노- 및 또는 카르복시말단의 일부 추가적인 아미노산일 수 있다.

AFP 는 또한 바람직하게는 AFP 의 아미노- 또는 카르복시말단 부분에서 융합 파트너와 연결될 수 있다. 융합 파트너는 예를 들어, 작은 펩티드 서열, 예컨대 하이드록시아파타이트 결합 펩티드, 바람직하게는 SEQ ID NO:4 내지 SEQ ID NO:19 에 개시되어 있는 펩티드 서열을 갖는 것일 수 있다.

SEQ ID NO:4 IDDYTRA

SEQ ID NO:5 HPPLHHA

SEQ ID NO:6 SPSTHWK

SEQ ID NO:7 GSPATAA

SEQ ID NO:8 GKVQAQS

SEQ ID NO:9 YPVTPSI

SEQ ID NO:10 IPTLPSS

SEQ ID NO:11 YQGASEN

SEQ ID NO:12 EHITTSN

SEQ ID NO:13 RILITIP

SEQ ID NO:14 IPITNLR

SEQ ID NO:15 TTSTRHI

SEQ ID NO:16 NERALTL

SEQ ID NO:17 MQTVEVT

SEQ ID NO:18 SWGTQTD

SEQ ID NO:19 TLPASSV

하이드록시아파타이트 결합 펩티드에 연결된 AFP 의 바람직한 구현예는 SEQ NO:4 및 SEQ ID NO:2 의 융합인 SEQ ID NO:20, 및 SEQ ID NO:10 및 SEQ ID NO:2 의 융합인 SEQ ID NO:21 이다.

본 발명의 의미에서 AFP 는 또한 AFP 의 다중 카피 (즉, 멀티머) 가 함께 융합됨을 의미할 수 있는데, 예를 들어 동일한 구조 (즉, 호모머) 또는 상이한 구조 (즉, 헤테로머) 를 갖는 2 개 또는 3 개의 AFP 가 "수퍼 AFP" 를 형성한다. 예를 들어, 어류 유래 AFP 는 곤충 유래 AFP 와 함께 융합되거나 2 개의 동일한 어류 AFP 가 융합될 수 있다.

본 발명의 의미에서 AFP 는 또한 AFP 가 의약품, 비타민 또는 향미제와 같은 비-펩티드성 분자에 연결되는 것을 의미할 수 있다. 이에 의해 비-펩티드성 분자는 AFP 부분을 통해 치아 에나멜을 목표로 할 수 있다. 비-펩티드성 분자의 AFP 에 대한 연결은 예를 들어 AFP 의 아미노산의 측쇄, 예컨대 Ser 또는 Thr 의 OH, 또는 Cys 또는 Met 의 SH, 또는 Asp 또는 Glu 의 COOH, 또는 Lys 또는 Arg 의 NH₂ 와의 반응에 의해 가능하다. 화학적 연결은 "영구적인" 것, 즉 타액에 의해 가수분해되지 않는 것일 수 있거나, 또는 "불안정한" 것, 즉 타액에 의해 절단되기 쉬운 것일 수 있다.

AFP 는 얼음 결정의 형성 및 또한 AFP 의 존재하에서 형성된 얼음 결정을 AFP 가 없는 얼음 결정과 비교했을 때 현미경으로 볼 수 있는 얼음 결정의 형태에 영향을 미친다. 생활성 AFP 가 존재하는 경우, 얼음 결정은 AFP 없이 형성된 결정의 둥글고, 액적 같은 외관에 비해 날카로운 외관을 갖는다. 이는 또한 AFP 의 생물학적 활성을 결정하는데 사용될 수 있다.

도 1 AFP 의 존재 및 부재 하의 얼음 결정 형성 참조. (물은 AFP 가 없는 증류수를 의미함).

AFP 는 펩티드 합성의 공지된 방법, 예를 들어 Merrifield 에 따른 고체상 합성에 의해 화학적으로 제조될 수 있다.

그러나, 조합된 핵산 서열의 유전자 발현이 숙주 생물에서 목적하는 단백질을 생성하는 방식으로, AFP 를 코딩하는 핵산 서열, 특히 DNA 서열 및 (원하는 경우) 하나 이상의 융합 파트너가 조합되는 유전학적 제조 방법이 특히 유용하다.

본원에서 적합한 숙주 생물 (생산자 생물) 은, 원핵생물 (고세균류 포함) 또는 진핵생물, 특히 할로박테리아 및 메타노코치(methanococci)를 포함하는 박테리아, 균류, 곤충 세포, 식물 세포 및 포유류 세포, 특히 바람직하게는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니제르(Aspergillus niger), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 슈도모나스 종(Pseudomonas spec.), 락토바실렌(Lactobacillen), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 트리코데르마 리세이(Trichoderma reesei), SF9 (또는 관련 세포) 등 일 수 있다.

또한, 본 발명은 조절 핵산 서열의 유전학적 제어 하에 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 구조체, 및 또한 상기 발현 구조체 중 적어도 하나를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

특정 코딩 서열의 5' 업스트림 프로모터 및 3' 다운스트림 터미네이터 서열, 및 또한, 적절한 경우, 각각의 경우 상기 코딩 서열에 작동적으로 연결되는 추가의 통상적인 조절 요소를 포함하는 구조체가 바람직하다.

"작동적 연결" 은, 각각의 조절 요소가 코딩 서열의 발현과 관련하여 이의 의도된 용도에 따라 이의 기능을 충족시킬 수 있는 방식으로의, 프로모터, 코딩 서열, 터미네이터, 및 적절한 경우, 추가의 조절 요소의 순차적 배열을 의미한다.

작동적으로 연결될 수 있는 서열의 예는, 표적 서열 및 또한 인핸서(enhancer), 폴리아데닐화 신호 등이다. 추가의 조절 요소는 선택 가능한 마커, 증폭 신호, 복제의 기원 등을 포함한다. 적합한 조절 서열의 예는 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)] 에 기재되어 있다.

이러한 조절 서열 이외에, 이러한 서열의 자연적 조절은 여전히 실제 구조 유전자의 업스트림에 존재할 수 있고, 적절한 경우, 자연적 조절이 스위치 오프되고 유전자의 발현이 증가되도록 유전학적으로 개질된다.

바람직한 핵산 구조체는 유리하게는 또한 프로모터에 기능적으로 연결되고 핵산 서열의 발현을 증가시킬 수 있는 상기 언급된 인핸서 서열 중 하나 이상을 포함한다. 추가의 조절 요소 또는 터미네이터와 같은 부가적인 유리한 서열은 또한 DNA 서열의 3' 말단에 삽입될 수 있다.

본 발명의 핵산은 구조체 내에 하나 이상의 카피로 존재할 수 있다. 적절한 경우, 구조체 선택에 있어서, 구조체는 영양요구(auxotrophy)를 보완하는 유전자 또는 항생제 내성과 같은 추가의 마커를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 유리한 조절 서열의 예는, 유리하게는 그람-음성 박테리아에 사용되는, cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, 람다-PR 또는 람다-P 프로모터와 같은 프로모터에 존재한다. 유리한 조절 서열의 추가의 예는 그람-양성 프로모터 amy 및 SP02, 효모 또는 균류 프로모터 ADC1, MF알파, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH 에 존재한다. 또한, 조절을 위해 인공 프로모터를 사용할 수도 있다.

숙주 생물에서 발현되게 하기 위하여, 핵산 구조체는 유리하게는 예를 들어 유전자가 숙주에서 최적으로 발현될 수 있게 하는 플라스미드 또는 파지와 같은 벡터 내에 삽입된다. 플라스미드 및 파지 이외에, 벡터는 또한 당업자에게 공지되어 있는 임의의 다른 벡터, 즉 예를 들어 SV40, CMV, 바큘로바이러스 및 아데노바이러스, 트랜스포존, IS 요소, 파스미드, 코스미드, 및 선형 또는 원형 DNA 및 또한 아그로박테리움(Agrobacterium) 시스템과 같은 바이러스를 의미한다.

이러한 벡터는 숙주 생물에서 자율적으로 복제되거나 또는 염색체로 복제될 수 있다. 이러한 벡터는 본 발명의 또 다른 구현예를 구성한다. 적합한 플라스미드의 예는 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III"3-B1, tgt11 또는 pBdCl (대장균 내), pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361 (스트렙토마이세스 내), pUB110, pC194 또는 pBD214 (바실루스 내), pSA77 또는 pAJ667 (코리네박테리움 내), pALS1, pIL2 또는 pBB116 (균류 내), 2알파, pAG-1, YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23 (효모 내) 또는 pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51 (식물 내) 이다. 상기 플라스미드는 가능한 플라스미드의 작은 선택이다. 추가의 플라스미드는 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 예를 들어 도서 [Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)] 에서 찾을 수 있다.

유리하게는, 핵산 구조체는, 존재하는 다른 유전자를 발현시키기 위해, 또한 숙주 생물 및 선택된 유전자 또는 유전자들에 따라 최적의 발현을 위해 선택되는 발현 증가를 위한 3'- 및/또는 5'-말단 조절 서열을 부가적으로 포함한다.

이러한 조절 서열은 유전자 및 단백질 발현이 특이적으로 발현될 수 있게 하기 위한 것이다. 숙주 생물에 따라, 예를 들어, 유전자가 도입 후에만 발현 또는 과발현되거나, 또는 즉시 발현 및/또는 과발현된다는 것을 의미할 수 있다.

이와 관련하여, 조절 서열 또는 인자는 바람직하게는 도입된 유전자의 유전자 발현에 유익한 영향을 미침으로써, 이를 증가시킬 수 있다. 따라서, 조절 요소는 유리하게는 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 강한 전사 신호를 사용함으로써 전사 수준에서 향상될 수 있다. 그러나, 그 외에도, 예를 들어 mRNA 안정성을 개선하여 번역을 향상시킬 수도 있다.

벡터의 또 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 구조체 또는 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터는 또한 유리하게는 선형 DNA 의 형태로 미생물에 도입되고, 이종 또는 상동 재조합에 의해 숙주 생물의 게놈에 통합될 수 있다. 상기 선형 DNA 는 플라스미드와 같은 선형화된 벡터, 또는 단지 본 발명의 핵산 구조체 또는 핵산으로만 이루어질 수 있다.

생물에서 이종 유전자의 최적의 발현을 달성하기 위하여, 생물에서 이용되는 특이적 코돈 사용에 따라 핵산 서열을 개질하는 것이 유리하다. 코돈 사용은 당해 생물의 다른 공지된 유전자의 컴퓨터 분석을 기반으로 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 발현 카세트는 적합한 코딩 뉴클레오티드 서열 및 터미네이터 신호 또는 폴리아데닐화 신호에 적합한 프로모터를 융합시킴으로써 제조된다. 이를 위해, 예를 들어 하기에 기재된 바와 같은 친숙한 재조합 및 클로닝 기술이 사용된다: [T. Maniatis, E.F.Fritsch and J.Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] 및 또한 [T.J.Silhavy, M.L.Berman and L.W.Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)] 및 [Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)].

적합한 숙주 생물에서의 발현을 위해, 재조합 핵산 구조체 또는 유전자 구조체는 유리하게는 유전자가 숙주에서 최적으로 발현될 수 있게 하는 숙주-특이적 벡터 내에 삽입된다. 벡터는 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 예를 들어 "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) 에서 찾을 수 있다.

본 발명의 벡터는 예를 들어 본 발명의 적어도 하나의 벡터로 형질전환되고 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있는 재조합 미생물을 제조하는데 사용될 수 있다. 유리하게는, 상기 기재된 본 발명의 재조합 구조체는 적합한 숙주 시스템 내에 도입되고 여기에서 발현된다. 본원에서 특정 발현 시스템에서 상기 핵산을 발현시키기 위하여, 예를 들어 공침전, 프로토플라스트(protoplast) 융합, 전기천공법, 레트로바이러스 형질주입 등과 같은 당업자에게 공지되어 있는 통상적인 클로닝 및 형질주입 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 적합한 시스템은 예를 들어 [Current Protocols in Molecular Biology, F.Ausubel et al., Eds. Wiley Interscience, New York 1997], 또는 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989] 에 기재되어 있다.

또한, 본 발명에 따라서 상동 재조합 미생물을 제조하는 것도 가능하다. 이를 위하여, 본 발명의 서열을 개질, 예를 들어 기능적으로 분열시키기 위해, 적절한 경우, 적어도 하나의 아미노산 결실, 부가 또는 치환이 도입된 코딩 서열 또는 본 발명의 유전자의 적어도 하나의 섹션을 포함하는 벡터가 제조된다 (녹아웃 (knockout) 벡터). 도입된 서열은, 예를 들어, 또한 관련 미생물로부터의 동족체이거나, 또는 포유류, 효모 또는 곤충 공급원에서 유래될 수 있다. 상동 재조합에 사용되는 벡터는 대안적으로 상동 재조합 동안 내인성 유전자가 돌연변이 되거나, 또는 일부 다른 방식으로 개질되지만 기능성 단백질을 여전히 인코딩하도록 고안될 수 있다 (예를 들어, 업스트림 조절 영역은 내인성 단백질의 발현을 변형하는 방식으로 개질될 수 있음). 본 발명의 유전자의 개질된 섹션은 상동 재조합 벡터에 존재한다. 상동 재조합에 적합한 벡터의 구조는 예를 들어 [Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503] 에 기재되어 있다.

임의의 원핵 또는 진핵 생물은 원칙적으로 본 발명의 핵산 또는 핵산 구조체에 대한 재조합 숙주 생물로 사용하기에 적합하다. 유리하게는, 사용되는 숙주 생물은 박테리아, 균류 또는 효모와 같은 미생물이다. 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아, 바람직하게는 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae), 슈도도모나다세아에(Pseudomonadaceae), 리조비아세아에(Rhizobiaceae), 스트렙토마이세타세아에(Streptomycetaceae) 또는 노카르디아세아에(Nocardiaceae) 과의 박테리아, 특히 바람직하게는 에스테리키아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 노카르디아(Nocardia), 부르크홀데리아(Burkholderia), 살모넬라(Salmonella), 아그로박테리움(Agrobacterium) 또는 로도코쿠스(Rhodococcus) 속의 박테리아가 유리하게 사용된다.

숙주 생물에 따라, 본 발명의 방법에서 사용되는 생물은 당업자에게 공지되어 있는 방식으로 성장 또는 배양된다. 통상적으로, 미생물은 통상적으로 당의 형태로의 탄소 공급원, 통상적으로 유기 질소 공급원의 형태로의 질소 공급원, 예컨대 효모 추출물 또는 염, 예컨대 암모늄 설페이트, 미량 원소, 예컨대 철, 망간, 마그네슘 염, 및, 적절한 경우, 비타민을 포함하는 액체 배지에서, 0 내지 100℃, 바람직하게는 10 내지 60℃ 의 온도에서, 산소로 기체 공급하면서, 성장된다. 영양액의 pH 는 여기서 고정된 값으로 유지될 수 있거나 그렇지 않을 수 있는데, 즉 성장 동안 조절된다. 성장은 배치식, 반배치식 또는 연속식으로 이루어질 수 있다. 영양분은 발효의 시작 시 초기에 도입될 수 있거나, 또는 반연속식 또는 연속식으로 후속적으로 공급될 수 있다. 효소는 실시예에 기재되어 있는 방법을 사용하여 생물로부터 단리될 수 있거나, 또는 미정제 추출물로서 반응에 사용될 수 있다.

발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 기능적, 생물학적 활성 단편을 재조합적으로 제조하는 방법으로서, 폴리펩티드-생산 미생물을 배양하고, 적절한 경우 상기 폴리펩티드의 발현을 유도하고, 이를 배양물로부터 단리하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드는 또한 목적하는 경우 산업적 규모로 생산될 수 있다. 재조합 미생물은 공지되어 있는 방법에 의해 배양 및 발효될 수 있다. 예를 들어, 박테리아는 TB 배지 또는 LB 배지에서 및 20 내지 40℃ 의 온도 및 6 내지 9 의 pH 에서 증식될 수 있다. 적합한 배양 조건은 예를 들어 [T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] 에 상세하게 기재되어 있다.

폴리펩티드가 배양 배지 내로 분비되지 않는 경우, 세포를 파괴하고, 생성물을 공지되어 있는 단백질 단리 방법으로 용해물로부터 단리한다. 세포는 임의로 고주파 초음파, 고압, 예를 들어 프렌치 압력 셀(French pressure cell), 삼투압에 의해, 세제, 용해 효소 또는 유기 용매의 작용에 의해, 균질화기의 사용에 의해, 또는 열거된 방법 중 몇몇의 조합에 의해 파괴될 수 있다.

폴리펩티드는 공지되어 있는 방법, 크로마토그래피 방법, 예컨대 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 예컨대 Q-Sepharose 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피, 및 또한 다른 통상적인 방법, 예컨대 한외여과, 결정화, 염석(salting out), 투석 및 천연 겔 전기영동에 의해 정제될 수 있다. 적합한 방법은 예를 들어 [Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsemthoden [원제: The tools of biochemistry], Verlag Water de Gruyter, Berlin, New York] 또는 [Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin] 에 기재되어 있다.

재조합 단백질을 단리하기 위해, 특정 뉴클레오티드 서열에 의해 cDNA 를 확장하여, 예를 들어 정제를 용이하게 하는 변경된 폴리펩티드 또는 융합 단백질을 인코딩하는 올리고뉴클레오티드 또는 벡터 시스템을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 적합한 개질의 예는 앵커로 작용하는 "태그", 예를 들어 헥사히스티딘 앵커로 공지된 개질물, 또는 항원으로 항체에 의해 인식될 수 있는 에피토프이다 (예를 들어, [Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press] 에 기재되어 있음). 보다 적합한 태그는, 예를 들어, HA, 카모둘린-BD, GST, MBD; 키틴-BD, 스트렙타비딘-BD-Avi 태그, 플래그 태그, T7 등이다. 이러한 앵커는 예를 들어 크로마토그래피 칼럼, 또는 마이크로티터(microtiter) 플레이트 또는 임의의 다른 지지체에 도입될 수 있는 중합체 매트릭스와 같은 고체 지지체에 단백질을 부착하는데 사용될 수 있다. 상응하는 정제 프로토콜은 상업적 친화성 태그 공급업자로부터 수득할 수 있다.

일부 구현예에서, AFP 는 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 3 중량% 의 양으로 조성물에 존재한다. 일부 구현예에서, AFP 는 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 3 중량%, 또는 0.01 중량% 내지 2 중량%, 또는 0.02 중량% 내지 1 중량% 의 양으로 조성물에 존재한다. 다른 구현예에서, AFP 는 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 1 중량%, 또는 0.021 중량% 내지 0.5 중량% 의 양으로 조성물에 존재한다. 추가의 구현예에서, AFP 는 조성물의 총 중량의 0.05 중량% 내지 3 중량%, 또는 0.05 중량% 내지 2 중량%, 또는 0.05 중량% 내지 1 중량% 의 양으로 조성물에 존재한다.

구강에 허용되는 담체 및 임의적 성분

본원에 사용된 표현 "구강에 허용되는 담체" 는 의도된 양 및 농도로 구강 사용에 안전하고 허용되는 물질, 예를 들어 종래의 치약 및 구강청결제에서 발견될 수 있는 물질로부터 만들어진 담체를 의미한다. 상기 물질은 물 또는 보습제, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 자일리톨 등을 함유할 수 있는 기타 용매를 포함한다. 일부 양태에서, 용어 "구강에 허용되는 담체" 는 가수분해된 식물 단백질 및 플루오라이드를 제외한 구강 케어 조성물의 모든 성분을 포함한다. 다른 양태에서, 용어는 AFP, 및/또는 임의의 기타 기능성 성분을 구강에 전달하는 역할을 하는 비활성 또는 불활성 성분을 지칭한다.

본 발명에서 사용하기 위한 구강에 허용되는 담체는 구강세정제 또는 구강청결제, 치약, 치아 젤, 치아 분말, 로젠지, 검, 비드, 식용 스트립, 타블렛 등의 제조에 사용되는 종래의 알려진 담체를 포함한다. 담체는 서로 및 조성물의 다른 성분과의 상용가능성을 위해 선택되어야 한다.

하기 비제한적 실시예가 제공된다. 치약 조성물에서, 담체는 통상적으로 조성물의 주요 중량 분획을 제공하는 물/보습제 시스템이다. 대안적으로, 치약 조성물의 담체 성분은 물, 하나 이상의 보습제, 및 AFP 이외에 기타 기능성 성분을 포함할 수 있다. 구강세정제 또는 구강청결제 제형에서, 담체는 통상적으로 AFP 가 용해 또는 분산되어 있는 물/알코올 액체 혼합물이다. 용해성 로렌지에서, 담체는 통상적으로 구강에서 서서히 용해되는 고체 매트릭스 물질을 포함한다. 츄잉 검에서, 담체는 통상적으로 검 베이스를 포함하는 한편, 식용 스트립에서 담체는 통상적으로 하나 이상의 필름 형성 중합체를 포함한다.

본원에 제공된 구강 케어 조성물은 연마제, pH 조정제, 계면활성제, 발포체 조절제, 증점제, 점도 조절제, 보습제, 항치석제 또는 타르타르 조절제, 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제로부터 선택되는 하나 이상의 부가 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 성분은 또한 담체 물질로서 간주될 수 있다. 비제한적인 예가 하기 제공된다.

한 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어 폴리싱제로서 유용한 하나 이상의 연마제를 포함한다. 임의의 구강에 허용되는 연마제가 사용될 수 있지만, 연마제의 유형, 미세도 (입자 크기) 및 양은 치아 에나멜이 조성물의 통상의 사용 중 과도하게 연마되지 않도록 선택되어야 한다. 적합한 연마제는 비제한적으로 실리카, 예를 들어 실리카겔, 수화 실리카 또는 침강 실리카 형태, 알루미나, 불용성 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 수지성 연마제, 예컨대 우레아-포름알데하이드 축합 생성물 등을 포함한다. 불용성 포스페이트 중에서 연마제로서 유용한 것은 오르토포스페이트, 폴리메타포스페이트 및 피로포스페이트이다. 예시적인 예는 디칼슘 오르토포스페이트 2수화물, 칼슘 피로포스페이트, [베타]-칼슘 피로포스페이트, 트리칼슘 포스페이트, 칼슘 폴리메타포스페이트 및 불용성 소듐 폴리메타포스페이트이다. 하나 이상의 연마제는 본 발명의 구강 케어 조성물에 조성물의 총 중량의 1 중량% 내지 5 중량% 의 양으로 임의로 존재한다. 존재하는 경우, 일반적으로 연마제의 평균 입자 크기는 0.1 내지 30 ㎛, 바람직하게는 5 내지 15 ㎛ 이다.

추가의 구현예에서, 본 발명의 구강 케어 조성물은 이산화탄소의 발포(effervescence) 및 방출로 인해, 예를 들어 치아 및 검에 "청결한 느낌" 을 부여하는데 유용한 하나 이상의 바이카보네이트 염을 포함한다. 비제한적으로, 소듐 및 포타슘 바이카보네이트, 암모늄 바이카보네이트 등과 같은 알칼리 금속 바이카보네이트를 포함하는 임의의 구강에 허용되는 바이카보네이트가 사용될 수 있다. 하나 이상의 바이카보네이트 염은 조성물의 1 중량% 내지 10 중량% 의 총량으로 임의로 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 구강 케어 조성물은 적어도 하나의 pH 조정제를 포함한다. 이러한 작용제는 pH 를 낮추는 산성화제, pH 를 높이는 염기성화제 및 목적하는 범위 내에서 pH 를 조절하는 완충제를 포함한다. 예를 들어, 산성화제, 염기성화제 및 완충제로부터 선택되는 하나 이상의 화합물이 2 내지 10 의 pH, 또는 각종 여러 구현예에서 2 내지 8, 3 내지 9, 4 내지 8, 5 내지 7, 6 내지 10, 또는 7 내지 9 의 pH 를 제공하기 위해 포함될 수 있다. 비제한적으로, 하기를 포함하는 임의의 구강에 허용되는 pH 조정제가 사용될 수 있다: 카르복실산, 인산 및 술폰산, 산 염 (예를 들어, 모노소듐 시트레이트, 디소듐 시트레이트, 모노소듐 말레이트), 알칼리 금속 하이드록사이드, 예컨대 소듐 하이드록사이드, 카보네이트, 예컨대 소듐 카보네이트, 바이카보네이트, 보레이트, 실리케이트, 포스페이트 (예를 들어, 모노소듐 포스페이트, 트리소듐 포스페이트, 피로포스페이트 염) 이미다졸 등. 하나 이상의 pH 조정제가 임의로 조성물을 구강에 허용되는 pH 범위로 유지하기에 유효한 총량으로 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 예를 들어 조성물 및 이에 함유되어 있는 성분에 향상된 안정성을 제공하고, 세제 작용(detergent action)을 통해 치아 표면을 세정하는 것을 돕고, 진탕시 (예를 들어, 본 발명의 세치제 조성물을 사용하여 브러싱하는 동안) 발포체를 제공하는 데 유용한 적어도 하나의 계면활성제를 포함한다. 음이온성, 비이온성 또는 양쪽성을 포함하는 임의의 구강에 허용되는 계면활성제가 사용될 수 있다. 적합한 음이온성 계면활성제는 비제한적으로 C_8-20 알킬 설페이트, C_8-20 지방산의 설포네이트화 모노글리세리드, 사르코시네이트, 타우레이트 등의 수용성 염을 포함한다. 적합한 비이온성 계면활성제는, 비제한적으로, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 지방 알코올 에톡실레이트, 알킬페놀 에톡실레이트, 3차 아민 옥사이드, 3차 포스핀 옥사이드, 디알킬 설폭사이드 등을 포함한다. 적합한 양쪽성 계면활성제는, 비제한적으로, 음이온성 기, 예컨대 카복실레이트, 설페이트, 설포네이트, 포스페이트 또는 포스포네이트를 갖는 C_8-20 지방족 2차 및 3차 아민의 유도체를 포함한다. 적합한 예는 코코아미도프로필 베타인이다. 하나 이상의 계면활성제는 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 10 중량%, 예를 들어 0.05 중량% 내지 5 중량% 또는 0.1 중량% 내지 2 중량% 의 총량으로 임의로 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 구강 케어 조성물은 예를 들어 진탕시 조성물에 의해 발생하는 발포체의 양, 두께 또는 안정성을 증가시키는데 유용한 하나 이상의 발포체 조절제를 포함한다. 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 포함하는, 임의의 구강에 허용되는 발포체 조절제가 사용될 수 있다. 하나 이상의 PEG 가 조성물의 총 중량의 0.1 중량% 내지 10 중량% 의 총량으로 임의로 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 구강 케어 조성물은 예를 들어 조성물에 목적하는 컨시스턴시(consistency) 및/또는 입속 느낌(mouth feel)을 부여하는데 유용한 적어도 하나의 증점제를 포함한다. 비제한적으로, 하기를 포함하는 임의의 구강에 허용되는 증점제가 사용될 수 있다: 카르보머 (카르복시비닐 중합체), 카라기난, 셀룰로오스성 중합체, 예컨대 하이드록시에틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 및 이들의 염, 천연 검, 예컨대 카라야, 잔탄, 아라비아 검 및 트라가칸트, 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 콜로이드성 실리카 등. 하나 이상의 증점제가 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 15 중량% 의 총량으로 임의로 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 예를 들어 액체 조성물의 진탕시 성분의 침강 또는 분리를 저해하거나 성분의 재분산을 촉진하는데 유용한 하나 이상의 점도 조절제를 포함한다. 비제한적으로, 미네랄 오일, 바셀린, 점토, 실리카 등을 포함하는 임의의 구강에 허용되는 점도 조절제가 사용될 수 있다. 하나 이상의 점도 조절제가 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 10 중량% 의 총량으로 임의로 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 구강 케어 조성물은 공기에 대한 노출시 치약의 경화를 방지하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 보습제를 포함한다. 비제한적으로, 다가 알코올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 자일리톨 또는 저분자량 PEG 를 포함하는 임의의 구강에 허용되는 보습제가 사용될 수 있다. 대부분의 보습제는 또한 감미제로서 작용한다. 하나 이상의 보습제가 조성물의 총 중량의 1 중량% 내지 50 중량% 의 총량으로 임의로 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 구강 케어 조성물은 조성물의 맛을 향상시키는 하나 이상의 감미제를 포함한다. 비제한적으로, 하기를 포함하는 임의의 구강에 허용되는 천연 또는 인공 감미제가 사용될 수 있다: 덱스트로오스, 수크로오스, 말토오스, 덱스트린, 만노오스, 자일로오스, 리보오스, 프룩토오스, 레불로오스, 갈락토오스, 콘 시럽, 부분 가수분해 전분, 수소첨가 전분 가수분해물, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 이소말트, 아스파탐, 네오탐, 사카린 및 이들의 염, 디펩티드-기반 강한 감미제, 시클라메이트 등. 하나 이상의 감미제가 조성물의 총 중량의 0.005 중량% 내지 5 중량% 의 총량으로 임의로 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 구강 케어 조성물은 조성물의 맛을 향상시키는 하나 이상의 향미제를 포함한다. 비제한적으로, 하기를 포함하는 임의의 구강에 허용되는 천연 또는 합성 향미제가 사용될 수 있다: 바닐린, 세이지, 마조람, 파슬리 오일, 스피어민트 오일, 시나몬 오일, 윈터그린 오일 (메틸살리실레이트), 페퍼민트 오일, 클로브 오일, 베이 오일, 아나이스 오일, 유칼립투스 오일, 시트러스 오일, 과실 오일 및 에센스 등. 향, 및/또는 냉각 또는 보온 효과를 포함하여 입 안에 다른 감각 효과를 제공하는 성분이 또한 향미제에 포함된다. 상기 성분은 예시적으로 멘톨, 멘틸 아세테이트, 멘틸 락테이트, 캄포르, 유칼립투스 오일, 유칼립톨, 유게놀, 카시아, 옥사논, α-이리손, 티몰, 리날로올, 벤즈알데하이드, 신남알데하이드, N-에틸-p-멘탄-3-카르복사민, N,2,3-트리메틸-2-이소프로필부탄아미드, 3-(1-멘톡시)-프로판-1,2-디올, 신남알데하이드 글리세롤 아세탈 (CGA), 멘톤 글리세롤 아세탈 (MGA) 등을 포함한다. 하나 이상의 향미제가 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 5 중량% 의 총량으로 임의로 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 구강 케어 조성물은 적어도 하나의 착색제를 포함한다. 착색제는 다수의 기능을 수행할 수 있다. 이들은 치아 표면에 백색 또는 밝은 색의 코팅을 제공하거나, 조성물에 의해 효과적으로 접촉된 치아 표면 상의 위치를 나타내거나, 및/또는 소비자에 대한 매력을 향상시키기 위해 조성물의 외관을 변형시키는 것을 포함한다. 비제한적으로, 탈크, 마이카, 마그네슘 카보네이트, 칼슘 카보네이트, 마그네슘 실리케이트, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 실리카, 티타늄 디옥사이드, 아연 옥사이드, 철 옥사이드, 페릭 암모늄 페로시아나이드, 망간 바이올렛, 티탄화 마이카, 비스무트 옥시클로라이드 등을 포함하는 임의의 구강에 허용되는 착색제가 사용될 수 있다. 하나 이상의 착색제가 조성물의 총 중량의 0.001 중량% 내지 20 중량% 의 총량으로 임의로 존재한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 구강 케어 조성물은 보존제를 포함한다. 보존제는 파라벤, 포타슘 소르베이트, 벤질 알콜, 페녹시 에탄올, 폴리아미노프로필 바이구아니딘, 카프릴산, 소듐 벤조에이트 및 세틸피리디늄 클로라이드로부터 선택 될 수 있다. 일부 구현예에서, 보존제는 조성물의 총 중량의 약 0.001 내지 약 1 중량% 의 농도로 존재한다.

하기 실시예는 본 발명의 조성물 및 이들의 용도를 예시한다. 예시된 조성물은 예시적이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1 - 표면 거칠기

소의 치아를 절단하고, 연마하고, 폴리싱하여, 3 mm x 3 mm x 2 mm 의 대략적인 치수를 갖는 에나멜 블록을 수득하였다. 에나멜의 두께는 대략 1 내지 2 mm 이고, 상아질의 두께는 대략 1 mm 였다. 모든 측정은 에나멜 표면 상에서 실시하였다.

에나멜 블록의 표면 거칠기를 산 에칭 전후에 측정하였다. 표면 거칠기 (Sq) 가 100 - 200 에 도달할 때까지 1% 시트르산 용액 (pH 3.8) 중에 에나멜 블록을 위치시킴으로써 산 에칭을 수행하였다. 이러한 Sq 값을 에칭된 에나멜의 표면 거칠기로 기록하였다 (Sq 는 기본적으로 측정되는 표면의 산술 평균 높이에 대한 평균 제곱근 높이로 ISO 25178 에서 정의되는 표준 측정치이므로, 측정 영역 내의 중심 평면으로부터 프로파일의 모든 절대 거리의 평균에 해당하고, 이 값이 높으면, 표면 상에 더 뚜렷한 최고점(peak) 및 최저점(valley)이 존재하며, 즉 표면이 보다 거칠다는 것을 의미하고, 이 값이 낮으면, 표면이 보다 매끄럽다는 것을 의미함). Na₂HPO₄ 완충액 (1.5 mM) 및 CaCl₂ (2.5 mM) 를 사용하여 AFP 를 최종 농도로 희석하였다. pH 7.5 로 중화시킨 후, 용액을 여과하고, 원심분리하였다. 그 후, 60 분 동안 5.5 μM 또는 55 μM 의 농도 (블록 당 2 ml 용액) 에서 처리된 AFP 포함하는 용액으로 산-에칭된 에나멜 블록을 인큐베이션하였다.

60 분의 인큐베이션 기간 후, 에나멜 블록을 인공 타액 (AS) 용액 (0.4g NaCl, 0.4g KCl, 0.8g CaCl₂, 0.69g NaH₂PO₄, 1g 우레아, 1 리터 증류수; pH 7 (1 M NaOH 를 사용하여 조정됨)) 중에서 22 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 에나멜 블록을 AFP 로 2 차 처리하고, 인공 타액과 22 시간 동안 다시 인큐베이션하였다. 그 후, 블록을 탈이온수 (DI water) 로 헹구고, 표면 거칠기를 측정하기 전에 공기 건조시켰다. 0.5% PBS 로 처리한 에나멜 블록을 실험의 음성 대조군으로 사용하였다. 표 1 에 결과를 예시하였다. % 회복 (% repair) 는 (처리하지 않은) 산-에칭된 에나멜의 표면 거칠기에 대한 단백질 처리에 의해 달성된 표면 거칠기 (Sq) 의 % 감소를 나타낸다.

표 1 - 표면 거칠기 분석 결과

도 2 거칠기 분석을 사용한 저농도 및 고농도에서의 BM80 의 회복 효능 참조

표 1 에 나타낸 바와 같이, AFP SEQ ID NO2 는 5.5 또는 55 μM 의 농도에서 산-에칭된 에나멜 블록의 표면 거칠기를 감소시키는 데 효과적이었다.

실시예 2 - 나노인덴테이션(Nanoindentation)

에나멜 블록을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조하였다. 15 분 동안 1% 시트르산 용액 (pH 3.8) 중에 에나멜 블록을 위치시킴으로써 산-에칭을 수행하였다. 500 nm 깊이에서의 나노경도(nanohardeness) 및 영률(Young's modulus)을 에칭 전후에 측정하였다. 에칭된 에나멜 블록을 30 분 동안 20 μM 의 농도에서 AFP SEQ ID NO: 20 의 용액 (2 ml 용액/블록) 과 인큐베이션한 후, 실시예 1 에 기재된 바와 같은 AS 용액과 22 내지 24 시간 동안 인큐베이션하였다. AFP 및 AS 인큐베이션 단계를 2 회 더 반복한 후, 에나멜 블록을 탈이온수로 헹구고, 공기 건조시켰다. 처리된 에나멜 블록의 나노경도 및 영률을 500 nm 깊이에서 측정하여, AFP 의 에나멜 회복 효과를 평가하였다. 500 ppm 플루오라이드의 용액을 실험의 양성 대조군으로 사용하였다. 표 2 및 3 에 결과를 예시하였다.

표 2 - AFP 의 회복 효능 - 나노경도

표 3 - 가수분해된 밀 단백질의 회복 효능 - 영률

도 3 나노인덴테이션을 사용한 AFP 의 회복 효능 (나노경도) 참조

도 4 나노인덴테이션을 사용한 AFP 의 회복 효능 (영률 사용) 참조

표 2 및 3 에 나타낸 바와 같이, AFP 는 산-침식된 에나멜을 회복하는데 효과적이었다.

실시예 3 - 마이크로경도(Microhardness)

에나멜 블록을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 제조하였다. 마이크로경도를 Knoop Diamond Indenter 및 50 g 하중을 갖는 Micromet 6020 Micro-hardness Tester (Buehler, Lake Bluff, IL, USA) 를 사용하여 측정하였다. 적어도 300 의 누프 경도(Knoop hardness) (KH) 를 갖는 블록을 선택하였다. 블록을 30% 인산에 15 초 동안 침지시켜 에칭하였다. 블록의 좌측 및 우측에서 KH 를 측정하였다. 이어서, 블록의 우측을 테이프로 덮은 후, 블록을 AFP 의 20 mg/ml 용액 (각각 실시예 1 에 기재된 바와 같이 중화됨) 으로 30 분 동안 2 회 처리한다. (블록의 우측에 있는 테이프는 이 쪽이 단백질 용액에 노출되는 것을 방지하고 내부 통제(internal control)로서의 역할을 함). 블록을 2 회의 처리 사이에 및 2 차 처리 후에, 탈이온수로 @ 5 분, 500 PRM 에서 2 회 세정하였다. 이어서, 테이프를 제거하고, 블록을 AS 용액 (0.2 mM MgCl₂, 1 mm CaCl₂.H₂O, 20 mM HEPES 완충액, 4 mM KH₂PO₄, 16 mM KCl, 4.5 mM NH₄Cl, 300 ppm NaF, 0.05 wt.% NaN₃, pH 7 (1 M NaOH 로 조정됨)) 에서 7 일 동안 인큐베이션하였다. 에나멜 블록을 탈이온수로 헹구고, 헹군 블록을 공기 건조시킨후, 마이크로경도를 다시 측정하였다. % 로서의 다시 수득한 표면 마이크로경도 (SMHL, 재미네랄화%(Remin%)) 를 하기와 같이 계산하였다: ((마이크로경도_회복됨 - 마이크로경도_에칭됨) / (마이크로경도_{손상되 지 않음} - 마이크로경도_에칭됨))*100. 표 4 에 마이크로경도 분석의 결과를 예시하였다.

표 4 - 마이크로경도 분석의 결과

도 5 마이크로경도를 사용한 AFP 의 회복 효능 참조

표 4 로부터, 모든 AFP 가 산-에칭된 에나멜 블록의 에나멜 표면을 재미네랄화하는데 효과적이라는 것을 알 수 있었다. 모든 마이크로경도 시험에서, 인공 타액에 침지되었을 뿐 아니라 인공 타액으로부터의 일부 회복된 우측/내부 통제 쪽에서의 재미네랄화 백분율은 데이터가 AFP 의 차별적인 효과를 나타내도록 결과로부터 제외되었다는 것을 유의한다.

본 발명의 특정 구현예가 예시 및 기재되어 있지만, 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> BASF SE <120> Oral Care Products and Methods comprising AFPs <130> 0000078606 <150> 62246163 <151> 26 October 2015 <160> 21 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 178 <212> PRT <213> Zoarces americanus <400> 1 Met Ala Glu Gln Ser Asp Lys Asp Val Lys Tyr Tyr Thr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Ile Gln Lys His Lys Asp Ser Lys Ser Thr Trp Val Ile Leu His His 20 25 30 Lys Val Tyr Asp Leu Thr Lys Phe Leu Glu Glu His Pro Gly Gly Glu 35 40 45 Glu Val Leu Gly Glu Gln Ala Gly Gly Asp Ala Thr Glu Asn Phe Glu 50 55 60 Asp Val Gly His Ser Thr Asp Ala Arg Glu Leu Ser Lys Thr Tyr Ile 65 70 75 80 Ile Gly Glu Leu His Pro Asp Asp Arg Ser Lys Ile Ala Lys Pro Ser 85 90 95 Glu Thr Leu Asp Asp Asp Asp Lys His Met Asn Gln Ala Ser Val Val 100 105 110 Ala Asn Gln Leu Ile Pro Ile Asn Thr Ala Leu Thr Leu Val Met Met 115 120 125 Arg Ser Glu Val Val Thr Pro Val Gly Ile Pro Ala Glu Asp Ile Pro 130 135 140 Arg Leu Val Ser Met Gln Val Asn Arg Ala Val Pro Leu Gly Thr Thr 145 150 155 160 Leu Met Pro Asp Met Val Lys Gly Tyr Pro Pro Ala His His His His 165 170 175 His His <210> 2 <211> 97 <212> PRT <213> Choristoneura fumiferana <400> 2 Met Asp Gly Ser Cys Thr Asn Thr Asn Ser Gln Leu Ser Ala Asn Ser 1 5 10 15 Lys Cys Glu Lys Ser Thr Leu Thr Asn Cys Tyr Val Asp Lys Ser Glu 20 25 30 Val Tyr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Ser Arg Phe Asp Gly Val Thr Ile 35 40 45 Thr Thr Ser Thr Ser Thr Gly Ser Arg Ile Ser Gly Pro Gly Cys Lys 50 55 60 Ile Ser Thr Cys Ile Ile Thr Gly Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala Ala 65 70 75 80 Cys Lys Ile Ser Gly Cys Thr Phe Ser Ala Asn His His His His His 85 90 95 His <210> 3 <211> 317 <212> PRT <213> Lolium perenne <400> 3 Met Thr Thr Gln Ser Pro Leu Asn Ser Phe Tyr Ala Thr Gly Thr Ala 1 5 10 15 Gln Ala Val Ser Glu Pro Ile Asp Val Glu Ser His Leu Gly Ser Ile 20 25 30 Thr Pro Ala Ala Gly Ala Gln Gly Ser Asp Asp Ile Gly Tyr Ala Ile 35 40 45 Val Trp Ile Lys Asp Gln Val Asn Asp Val Lys Leu Lys Val Thr Leu 50 55 60 Arg Asn Ala Glu Gln Leu Lys Pro Tyr Phe Lys Tyr Leu Gln Ile Gln 65 70 75 80 Ile Thr Ser Gly Tyr Glu Thr Asn Ser Thr Ala Leu Gly Asn Phe Ser 85 90 95 Glu Thr Lys Ala Val Ile Ser Leu Asp Asn Pro Ser Ala Val Ile Val 100 105 110 Leu Asp Lys Glu Asp Ile Ala Val Leu Tyr Pro Asp Lys Thr Gly Tyr 115 120 125 Thr Asn Thr Ser Ile Trp Val Pro Gly Glu Pro Asp Lys Ile Ile Val 130 135 140 Tyr Asn Glu Thr Lys Pro Val Ala Ile Leu Asn Phe Lys Ala Phe Tyr 145 150 155 160 Glu Ala Lys Glu Gly Met Leu Phe Asp Ser Leu Pro Val Ile Phe Asn 165 170 175 Phe Gln Val Leu Gln Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Pro Gly Gly 180 185 190 Met Asp Glu Gln Pro Asn Thr Ile Ser Gly Ser Asn Asn Thr Val Arg 195 200 205 Ser Gly Ser Lys Asn Val Leu Ala Gly Asn Asp Asn Thr Val Ile Ser 210 215 220 Gly Asp Asn Asn Ser Val Ser Gly Ser Asn Asn Thr Val Val Ser Gly 225 230 235 240 Asn Asp Asn Thr Val Thr Gly Ser Asn His Val Val Ser Gly Thr Asn 245 250 255 His Ile Val Thr Asp Asn Asn Asn Asn Val Ser Gly Asn Asp Asn Asn 260 265 270 Val Ser Gly Ser Phe His Thr Val Ser Gly Gly His Asn Thr Val Ser 275 280 285 Gly Ser Asn Asn Thr Val Ser Gly Ser Asn His Val Val Ser Gly Ser 290 295 300 Asn Lys Val Val Thr Asp Ala His His His His His His 305 310 315 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 4 Ile Asp Asp Tyr Thr Arg Ala 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 5 His Pro Pro Leu His His Ala 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 6 Ser Pro Ser Thr His Trp Lys 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 7 Gly Ser His Ala Thr Ala Ala 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 8 Gly Lys Val Gln Ala Gln Ser 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 9 Tyr Pro Val Thr Ser 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 10 Ile Pro Thr Leu Pro Ser Ser 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 11 Tyr Gln Gly Ala Ser Glu Asn 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 12 Glu His Ile Thr Thr Ser Asn 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 13 Arg Ile Leu Ile Thr Ile Pro 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 14 Ile Pro Ile Thr Asn Leu Arg 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 15 Thr Thr Ser Thr Arg His Ile 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 16 Asn Glu Arg Ala Leu Thr Leu 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 17 Met Gln Thr Val Glu Val Thr 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 18 Ser Trp Gly Thr Gln Thr Asp 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 19 Thr Leu Pro Ala Ser Ser Val 1 5 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 20 Met Ile Asp Asp Tyr Thr Arg Ala Gly Gly Gly Asp Gly Ser Cys Thr 1 5 10 15 Asn Thr Asn Ser Gln Leu Ser Ala Asn Ser Lys Cys Glu Lys Ser Thr 20 25 30 Leu Thr Asn Cys Tyr Val Asp Lys Ser Glu Val Tyr Gly Thr Thr Cys 35 40 45 Thr Gly Ser Arg Phe Asp Gly Val Thr Ile Thr Thr Ser Thr Ser Thr 50 55 60 Gly Ser Arg Ile Ser Gly Pro Gly Cys Lys Ile Ser Thr Cys Ile Ile 65 70 75 80 Thr Gly Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala Ala Cys Lys Ile Ser Gly Cys 85 90 95 Thr Phe Ser Ala Asn His His His His His His 100 105 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> synthetic peptide <400> 21 Met Ile Pro Thr Leu Pro Ser Ser Gly Gly Gly Asp Gly Ser Cys Thr 1 5 10 15 Asn Thr Asn Ser Gln Leu Ser Ala Asn Ser Lys Cys Glu Lys Ser Thr 20 25 30 Leu Thr Asn Cys Tyr Val Asp Lys Ser Glu Val Tyr Gly Thr Thr Cys 35 40 45 Thr Gly Ser Arg Phe Asp Gly Val Thr Ile Thr Thr Ser Thr Ser Thr 50 55 60 Gly Ser Arg Ile Ser Gly Pro Gly Cys Lys Ile Ser Thr Cys Ile Ile 65 70 75 80 Thr Gly Gly Val Pro Ala Pro Ser Ala Ala Cys Lys Ile Ser Gly Cys 85 90 95 Thr Phe Ser Ala Asn His His His His His His 100 105

Claims (15)

1. a. AFP;
   b. 구강에 허용되는 담체
   (여기서, AFP 는 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 3 중량% 의 양으로 조성물에 존재함)
   를 포함하는 구강 케어 조성물을 치아에 적용하는 것을 포함하는, 치아 부식 회복 또는 저해 또는 보호 또는 예방, 치아 재미네랄화(remineralization) 촉진, 및/또는 플루오라이드의 충치예방 효과 향상 방법.
2. 제 1 항에 있어서, AFP 가 SEQ ID NO: 2 에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 2 에 나타낸 폴리펩티드 서열로부터 출발하여, 모든 아미노산의 5% 이하의 치환, 삽입 또는 결실로부터 발생하고, 출발 단백질 (SEQ ID NO: 2) 의 생물학적 특성의 적어도 50% 를 여전히 갖는 폴리펩티드 서열을 갖는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, AFP 가 SEQ ID NO: 1 에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 1 에 나타낸 폴리펩티드 서열로부터 출발하여, 모든 아미노산의 5% 이하의 치환, 삽입 또는 결실로부터 발생하고, 출발 단백질 (SEQ ID NO: 1) 의 생물학적 특성의 적어도 50% 를 여전히 갖는 폴리펩티드 서열을 갖는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, AFP 가 SEQ ID NO: 3 에 나타낸 폴리펩티드 서열, 또는 SEQ ID NO: 3 에 나타낸 폴리펩티드 서열로부터 출발하여, 모든 아미노산의 5% 이하의 치환, 삽입 또는 결실로부터 발생하고, 출발 단백질 (SEQ ID NO: 3) 의 생물학적 특성의 적어도 50% 를 여전히 갖는 폴리펩티드 서열을 갖는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, AFP 가 SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 로부터 형성된 군으로부터 선택된 하이드록시아파타이트 결합 펩티드에 커플링된 방법.
6. 제 1 항에 있어서, AFP 가 AFP 의 호모머 또는 헤테로머이고 SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 로부터 형성된 군으로부터 선택된 하이드록시아파타이트 결합 펩티드에 커플링된 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 구강 케어 조성물이 유효량의 플루오라이드를 추가로 포함하는 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, AFP 가 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 3 중량% 의 양으로 조성물에 존재하는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 세치제(dentifrice)인 방법.
10. 하기를 포함하는 세치제:
    a. 대략 중성 또는 약염기성 pH 로 중화된 AFP;
    b. 유효량의 플루오라이드, 및
    c. 구강에 허용되는 담체.
11. 치아 에나멜 부식 회복 또는 저해, 치아 에나멜의 재미네랄화 촉진, 및/또는 플루오라이드의 충치예방 효과 향상에 사용하기 위한,
    a. AFP;
    b. 임의로 유효량의 플루오라이드;
    c. 구강에 허용되는 담체
    (여기서, AFP 는 조성물의 총 중량의 0.01 중량% 내지 3 중량% 의 양으로 조성물에 존재함)
    를 포함하는 구강 케어 조성물.
12. 치아 부식 회복 또는 저해, 치아 재미네랄화 촉진, 및/또는 플루오라이드의 충치예방 효과 향상을 위한 구강 케어 조성물의 제조에서의 AFP 의 용도.
13. a. AFP 용액을 수성 완충 용액으로 희석함으로써 중화하여, 대략 중성 또는 약염기성 pH 를 갖는 용액을 수득하는 단계;
    b. a) 의 용액 생성물을 여과 및 원심분리하여 AFP 를 포함하는 여과물을 수득하는 단계;
    c. 플루오라이드 및 임의로 살생물제를 b) 의 여과 생성물에 첨가하는 단계;
    d. c) 의 생성물을 구강에 허용되는 담체의 성분에 혼화하는 단계
    를 포함하는, AFP 를 포함하는 구강 케어 제품의 제조 방법.
14. 구강 케어 조성물이 제 13 항에 따른 제조 방법으로 수득되거나 또는 수득가능한, AFP 를 포함하는 구강 케어 조성물.
15. 하기를 포함하는 츄잉 검 조성물:
    a. 검 베이스,
    b. 향미제,
    c. 감미제, 및
    츄잉 검 조성물의 약 0.01 중량% 내지 약 0.5 중량% 의 AFP.

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