BR112018008209B1 - Métodos para reparo ou inibição ou proteção contra ou prevenção de erosão dentária, promoção da remineralização dentária, e/ou intensificação dos efeitos anticavidade de fluoreto e para produção de um produto para cuidado oral compreendendo proteína anticongelamento, dentifrício, uso de uma proteína anticongelamento, e, composição. - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA REPARO OU INIBIÇÃO OU PROTEÇÃO CONTRA OU PREVENÇÃO DE EROSÃO DENTÁRIA, PROMOÇÃO DA REMINERALIZAÇÃO DENTÁRIA, E/OU INTENSIFICAÇÃO DOS EFEITOS ANTICAVIDADE DE FLUORETO E PARA PRODUÇÃO DE UM PRODUTO PARA CUIDADO ORAL COMPREENDENDO PROTEÍNA ANTICONGELAMENTO, DENTIFRÍCIO, USO DE UMA PROTEÍNA ANTICONGELAMENTO, E, COMPOSIÇÃO. São providas aqui composições para cuidado oral que compreendem Proteínas Anticongelantes (AFPs) úteis em métodos de reparo ou inibição de erosão dentária, promovendo a remineralização dentária e/ou intensificando os efeitos anticavidade de fluoreto.

Description

FUNDAMENTOS

[01] O esmalte dentário é uma camada dura, fina de material calcificado que cobre a coroa dos dentes. O principal componente mineral do esmalte dentário é hidroxiapatita, uma forma cristalina de fosfato de cálcio. A erosão química do esmalte dentário pode surgir a partir da exposição dos dentes a alimentos e bebidas ácidas ou a ácidos estomacais que surgem a partir do refluxo gástrico. A erosão do esmalte dentário pode conduzir à sensibilidade do dente intensificada devido à exposição aumentada dos túbulos da dentina e visibilidade da dentina aumentada conduzindo à aparência de mais dentes amarelos. A película salivar (uma camada fina de glicoproteínas salivares depositada sobre os dentes) é integral na proteção dos dentes contra um desafio erosivo. Como um resultado, as pessoas que experimentam xerostomia são mais suscetíveis aos danos por erosão por ácido.

[02] Métodos existentes desenvolvidos para ajudar a impedir a erosão do esmalte incluem a incorporação de uma fonte de fluoreto livre em composições para cuidado oral. O fluoreto reduz danos ao esmalte, através da formação de fluorapatita, que se dissolve em um pH mais baixo do que a hidroxiapatita e assim é mais resistente aos danos por ácido. Sais estanosos também foram incorporados em formulações dentifrícias para proteger a superfície do esmalte similarmente, pela formação de uma camada mineral mais resistente a ácido. Polímeros também foram descritos para revestir e proteger a superfície de esmalte.

[03] Ácidos também são gerados na cavidade oral quando placa contendo bactérias cariogênicas metabolizam carboidratos. Uma vez que a placa forma uma barreira que controla a cinética de difusão de próton e mineral através do esmalte, os ácidos de placa causam lesões cariosas. A incorporação de íons fluoreto em formulações dentifrícias é o método mais comum para mitigar os efeitos de ácidos de placa. O fluoreto reduz a taxa de desmineralização e intensifica a remineralização. Várias abordagens também foram desenvolvidas para estabilizar sais de fosfato de cálcio ou controlar o pH da placa para intensificar a remineralização.

[04] Embora métodos tenham sido desenvolvidos para mitigar os efeitos de ácidos gerados por bactérias e não-bactérias sobre os dentes, ainda há a necessidade de prover composições de cuidado oral melhoradas que reparam efetivamente o esmalte a partir dos efeitos de erosão de ácido e ácidos de bactérias.

BREVE SUMÁRIO

[05] Verificou-se inesperadamente que as Proteínas Anticongelamento (AFPs) são eficazes no reparo ou mitigação dos efeitos de erosão dentária, promoção da remineralização dentária e intensificação dos efeitos anticavidade de fluoreto.

[06] Por exemplo, em uma forma de realização, AFPs são preparadas para formulação com ingredientes de um carreador oralmente aceitável adequado, por diluição em tampão, por exemplo, um tampão de fosfato tal como tampão de Na2HPO4 (1,5 mM) e CaCl2 (2,5 mM), para prover uma solução tamponada tendo pH aproximadamente neutro ou ligeiramente básico, por exemplo, pH 7 a 8, por exemplo, cerca de pH 7,5, filtragem e centrifugação da solução para obter um filtrado compreendendo a AFP. Um biocida (por exemplo cloreto de cetilpiridínio a 0,1%) e fluoreto pode ser adicionado ao filtrado. A AFP pode então ser combinada com componentes de um carreador oralmente aceitável, por exemplo uma base de pasta de dente ou de colutório, para prover uma composição para cuidado oral para reparar ou mitigar os efeitos de erosão dentária, promover a remineralização dentária, e intensificar os efeitos anticavidade de fluoreto.

[07] Esta descrição refere-se, portanto, a uma composição para cuidado oral (Composição 1 ou 2 ou 3), por exemplo um dentifrício, compreendendo: a) AFP; b) um carreador oralmente aceitável, em que a AFP está presente na composição em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso por peso total da composição. Por exemplo, a descrição provê: 1.1. Composição 1 em que a AFP é uma AFP de inseto.

[08] Composição 1 em que a AFP tem uma sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 2.

[09] Composição 2 em que a AFP é um AFP de planta.

[10] Composição 2 em que a AFP tem uma sequência de polipeptídeo SEQ ID NO:3.

[11] Composição 3 em que a AFP é uma AFP de inseto de peixe.

[12] Composição 3 em que a AFP tem uma sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 1.

[13] 1.7. Qualquer Composição precedente compreendendo fluoreto.

[14] 1.8 Qualquer Composição precedente em que a AFP foi neutralizada a um pH aproximadamente neutro ou ligeiramente básico, por exemplo, pH 7 a 8, por exemplo, usando um tampão de fosfato.

[15] 1.9. Qualquer Composição precedente em que a AFP compreende um biocida, por exemplo, cloreto de cetilpiridínio (CPC) em uma concentração eficaz, por exemplo, 0,1% em peso do filtrado.

[16] 1.10. Qualquer Composição precedente, em que a AFP está presente na composição em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso por peso total da composição, por exemplo, 0,01% em peso a 2% em peso, por exemplo, cerca de 0,02% em peso, cerca de 0,1% em peso, cerca de 0,5% em peso ou cerca de 2% em peso por peso total da composição.

[17] 1.11. Qualquer Composição precedente em que a Composição compreende uma quantidade eficaz de fluoreto.

[18] 1.12. Qualquer Composição precedente que compreende uma quantidade de fluoreto de 100 ppm a 2500 ppm, por exemplo, 250 ppm a 750 ppm, por exemplo, cerca de 500 ppm de fluoreto.

[19] 1.13. Qualquer Composição precedente compreendendo um sal ou óxido de zinco oralmente aceitável, por exemplo, selecionado a partir de óxido de zinco, citrato de zinco, lactato de zinco, fosfato de zinco, acetato de zinco, cloreto de zinco, complexos de zinco com aminoácidos, e misturas de qualquer um dos precedentes, por exemplo, em que a quantidade de zinco é de 0,1% em peso a 3% em peso, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 2% em peso, calculado por peso de íon de zinco.

[20] 1.14. Qualquer Composição precedente compreendendo um sal estanoso oralmente aceitável, por exemplo SnF2 ou SnCl2.

[21] 1.15. Qualquer Composição precedente em que a composição está em uma forma selecionada a partir de um enxaguatório bucal, uma pasta de dente, um gel de dente, um pó de dente, um gel não abrasivo, uma mousse, uma espuma, uma pulverização de boca, e um tablete, por exemplo um dentifrício, por exemplo, uma pasta de dente ou enxaguatório bucal.

[22] 1.16. Qualquer Composição precedente, em que a composição compreende adicionalmente um ou mais agentes selecionados a partir de: abrasivos, agentes de modificação de pH, tensoativos, moduladores de espuma, agentes espessantes, modificadores de viscosidade, umectantes, agentes de controle anticálculo ou de tártaro, edulcorantes, flavorizantes e corantes.

[23] 1.17. Qualquer Composição precedente em que a composição é uma pasta de dente.

[24] 1.18. Qualquer Composição precedente compreendendo um ou mais sais de fosfato solúveis, por exemplo, em que por “sais de fosfato solúveis” é significado por um sal de fosfato oralmente aceitável tendo uma solubilidade em água de pelo menos 1 g/100 ml a 25° C; por exemplo, em que o um ou mais sais de fosfato solúveis são sais de sódio e/ou potássio de pirofosfatos e/ou polifosfatos, por exemplo, tripolifosfatos; por exemplo, em que o um ou mais sais de fosfato solúveis compreendem pirofosfato de tetrasódio (TSPP), tripolifosfato de sódio (STPP) ou uma combinação de TSPP e STPP; por exemplo, onde o um ou mais sais de fosfato solúveis estão presentes em uma quantidade de 1 a 20%, por exemplo, 2 a 8%, por exemplo, cerca de 5%, em peso da composição.

[25] 1.19. Qualquer Composição precedente em que o fluoreto é provido por um sal selecionado a partir de fluoreto estanoso, fluoreto de sódio, fluoreto de potássio, monofluorofosfato de sódio, fluorosilicato de sódio, fluorosilicato de amônio, fluoreto de amina (por exemplo, N'- octadeciltrimetilendiamina-N,N,N'-tris(2-etanol)-di-hidrofluoreto), fluoreto de amônio, fluoreto de titânio, hexafluorosulfato, e combinações dos mesmos.

[26] 1.20. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende um umectante, por exemplo, selecionado a partir de glicerina, sorbitol, propileno glicol, polietileno glicol, xilitol, e misturas dos mesmos, por exemplo, compreendendo pelo menos 30%, por exemplo, 40 a 50% de glicerina, por peso da composição.

[27] 1.21. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende um ou mais tensoativos, por exemplo, selecionado a partir de tensoativos aniônicos, catiônicos, zwitteriônicos, e não iônicos, e misturas dos mesmos, por exemplo, em que a base de dentifrício compreende um tensoativo aniônico, por exemplo, um tensoativo selecionado a partir de lauril sulfato de sódio, éter lauril sulfato de sódio, e misturas dos mesmos, por exemplo, em uma quantidade de cerca de 0,3% a cerca de 4,5% em peso, por exemplo, 1 a 2% de lauril sulfato de sódio (SLS) por peso da composição.

[28] 1.22. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende um tensoativo zwitteriônico, por exemplo, um tensoativo de betaína, por exemplo, cocamidopropilbetaína, por exemplo, em uma quantidade de cerca de 0,1% a cerca de 4,5% por peso, por exemplo, 0,5 a 2% de cocamidopropilbetaína por peso da composição.

[29] 1.23. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende uma quantidade de modificador de viscosidade de uma ou mais das gomas de polissacarídeos, por exemplo goma xantana ou carragenano, espessante de sílica e combinações dos mesmos.

[30] 1.24. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende tiras ou fragmentos de goma.

[31] 1.25. Qualquer Composição precedente compreendendo flavorizante, fragrância e/ou corante.

[32] 1.26. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais agentes antibacterianos, por exemplo compreendendo um agente antibacteriano selecionado a partir de éter difenílico halogenado (por exemplo triclosan), extratos herbáceos e óleos essenciais (por exemplo extrato de alecrim, extrato de chá, extrato de magnólia, timol, mentol, eucaliptol, geraniol, carvacrol, citral, hinoquitol, catecol, salicilato de metila, galato de epigalocatequina, epigalocatequina, ácido gálico, extrato de miswak, extrato de espinheiro (sea buckthorn)), antissépticos de bisguanida (por exemplo, clorexidina, alexidina ou octenidina), compostos quaternários de amônio (por exemplo, cloreto de cetilpiridínio (CPC), cloreto de benzalcônio, cloreto de tetradecilpiridínio (TPC), cloreto de N-tetradecil-4-etilpiridínio (TDEPC)), antissépticos fenólicos, hexetidina, octenidina, sanguinarina, povidona iodo, delmopinol, salifluor, íons de metal (por exemplo, sais de zinco, por exemplo, citrato de zinco, sais estanosos, sais de cobre, sais de ferro), sanguinarina, própolis e agentes de oxigenação (por exemplo peróxido de hidrogênio, peroxiborato ou peroxicarbonato de sódio tamponado), ácido ftálico e seus sais, ácido monopertálico e seus sais e ésteres, estearato de ascorbila, oleoil sarcosina, sulfato de alquila, sulfosuccinato de dioctila, salicilanilida, brometo de domifeno, delmopinol, octapinol e outros derivados de piperidino, preparações de nicina, sais de clorito; e misturas de qualquer um dos precedentes; por exemplo, compreendendo triclosan ou cloreto de cetilpiridínio.

[33] 1.27. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende um agente de branqueamento, por exemplo, um selecionado a partir do grupo que consiste em peróxidos, cloritos metálicos, perboratos, percarbonatos, peroxiácidos, hipocloritos e combinações dos mesmos; por exemplo, peróxido de hidrogênio ou uma fonte de peróxido de hidrogênio, por exemplo, peróxido de ureia ou um sal ou complexo de peróxido (por exemplo tal como peroxifosfato, peroxicarbonato, perborato, peroxisilicato, ou sais de persulfato; por exemplo peroxifosfato de cálcio, perborato de sódio, peróxido de carbonato de sódio, peroxifosfato de sódio, e persulfato de potássio).

[34] 1.28. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende um agente que interfere com ou impede ligação bacteriana, por exemplo, solbrol ou quitosana.

[35] 1.29. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende um sal de cálcio solúvel, por exemplo, selecionado a partir de sulfato de cálcio, cloreto de cálcio, nitrato de cálcio, acetato de cálcio, lactato de cálcio, e combinações dos mesmos.

[36] 1.30. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende um sal de potássio fisiologicamente ou oralmente aceitável, por exemplo, nitrato de potássio ou cloreto de potássio, em uma quantidade eficaz para reduzir a sensibilidade dentinal.

[37] 1.31. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende um polímero aniônico, por exemplo, um policarboxilato polimérico aniônico sintético, por exemplo, em que o polímero aniônico é selecionado a partir de 1:4 a 4:1 copolímeros de anidrido maleico ou ácido com um outro monômero etilenicamente insaturado polimerizável; por exemplo, em que o polímero aniônico é um copolímero de éter vinil metílico/anidrido maleico (PVM/MA) tendo um peso molecular médio (M.W.) de cerca de 30.000 a cerca de 1.000.000, por exemplo cerca de 300.000 a cerca de 800.000, por exemplo, em que o polímero aniônico é de cerca de 1 a 5%, por exemplo, cerca de 2%, do peso da composição.

[38] 1.32. Qualquer Composição precedente que é um dentifrício que compreende um refrescante de hálito, fragrância ou flavorizante.

[39] 1.33. Qualquer uma das Composições precedentes, em que o pH da composição é aproximadamente neutro, por exemplo, cerca de pH 7.

[40] 1.34. Qualquer uma das Composições precedentes para uso para reduzir e inibir a erosão por ácido, limpar os dentes, reduzir a biopelícula gerada por bactérias e a placa, reduzir a gengivite, inibir a deterioração do dente e a formação de cavidades, e reduzir a hipersensibilidade dentinal.

[41] 1.35. Qualquer Composição precedente para uso na redução, inibição ou reparo de erosão de esmalte dentário.

[42] 1.36. Qualquer Composição precedente para uso na promoção da remineralização do esmalte dentário.

[43] 1.37. Qualquer Composição precedente para uso na intensificação dos efeitos anticavidade de fluoreto.

[44] Uma nova forma de realização particular da Composição 1 ou 2 é um dentifrício que compreende a) uma AFP; b) opcionalmente uma quantidade eficaz de fluoreto; c) um carreador oralmente aceitável, por exemplo, em que a quantidade de AFP é de 0,01% em peso a 2% em peso e por exemplo, em que o fluoreto está presente em uma quantidade de 100 ppm a 1000 ppm, por exemplo, cerca de 500 ppm.

[45] Em ainda uma outra forma de realização, uma composição para cuidado oral da invenção é uma goma de mascar compreendendo base de goma, flavor, agente edulcorante e AFP. A base de goma está presente de cerca de 4,8% a cerca de 90%, o flavor de cerca de 0,1% a cerca de 10%, o agente edulcorante de cerca de 0,1% a cerca de 95% e o AFP de cerca de 0,01 % a cerca de 0,5%.

[46] Em um aspecto, a descrição provê qualquer uma das Composições 1 ou 2 ou 3, e seguintes para uso no reparo ou inibição ou proteção ou prevenção de erosão dentária, promoção da remineralização, e/ou intensificação dos efeitos anticavidade de fluoreto; por exemplo para uso em qualquer um dos métodos seguintes de acordo com o Método 1, e seguintes.

[47] Em um outro aspecto, a descrição provê um método (Método 1 ou 2 ou 3) de reparo ou inibição de erosão dentária, promoção de remineralização dentária, e/ou intensificação dos efeitos anticavidade de fluoreto que compreende aplicar aos dentes uma composição, por exemplo, qualquer uma da Composição 1 ou 2 ou 3, e seguintes por exemplo uma composição para cuidado oral compreendendo: a) AFP b) um carreador oralmente aceitável, em que a AFP está presente na composição em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso por peso total da composição. Por exemplo, a descrição provê: 1.1. Método 1 em que a AFP é uma AFP de inseto.

[48] Método 1 em que a AFP tem uma sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 2.

[49] Método 2 em que a AFP é um AFP de planta.

[50] Método 2 em que a AFP tem uma sequência de polipeptídeo SEQ ID NO:3.

[51] Composição 3 em que a AFP é uma AFP de inseto de peixe.

[52] Composição 3 em que a AFP tem uma sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 1.

[53] 1.7. Qualquer Método precedente em que a AFP compreende fluoreto.

[54] 1.8. Qualquer Método precedente em que a proteína de planta parcialmente hidrolisada foi neutralizada a um pH aproximadamente neutro ou ligeiramente básico, por exemplo, pH 7 a 8, por exemplo, usando um tampão de fosfato.

[55] 1.9. Qualquer Método precedente em que a AFP compreende um biocida, por exemplo, cloreto de cetilpiridínio (CPC) em uma concentração eficaz, por exemplo, 0,1% por peso do filtrado.

[56] 1.10. Qualquer Método precedente em que a AFP está presente na composição em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso por peso total da composição, por exemplo, 0,01% em peso a 2% em peso, por exemplo, cerca de 0,02% em peso, cerca de 0,1% em peso, cerca de 0,5% em peso ou cerca de 2 por cento em peso por peso total da composição.

[57] 1.11. Qualquer Composição precedente em que a Composição compreende uma quantidade eficaz de fluoreto.

[58] 1.12. Qualquer Método precedente em que a quantidade de fluoreto é de 100 ppm a 1000 ppm, por exemplo, cerca de 500 ppm de fluoreto.

[59] 1.13. Qualquer Método precedente em que a composição está em uma forma selecionada a partir de um enxaguatório bucal, uma pasta de dente, um gel de dente, um pó de dente, um gel não abrasivo, uma mousse, uma espuma, uma pulverização de boca, e um tablete.

[60] 1.14. Qualquer Método precedente, em que a composição compreende adicionalmente um ou mais agentes selecionados a partir de: abrasivos, agentes de modificação de pH, tensoativos, moduladores de espuma, agentes espessantes, modificadores de viscosidade, umectantes, agentes de controle anticálculo ou de tártaro, edulcorantes, flavorizantes e corantes.

[61] 1.15. Qualquer Método precedente em que a composição é um dentifrício, por exemplo, uma pasta de dente.

[62] 1.16 Qualquer Método precedente em que a composição é selecionada a partir de qualquer uma das Composições 1 ou 2 ou 3, e seguintes, supra.

[63] 1.17. Qualquer Método precedente que é um método para reduzir, inibir ou reparar a erosão dentária, por exemplo erosão do esmalte, por exemplo, em que a composição é aplicada aos dentes de um paciente tendo sido identificado como tendo erosão dentária ou estando em risco elevado de ter erosão dentária.

[64] 1.18. Qualquer Método precedente que é um método para promover a remineralização dentária, por exemplo, a remineralização do esmalte, por exemplo em que a composição é aplicada aos dentes de um paciente tendo sido identificado como tendo desmineralização.

[65] 1.19. Qualquer Método precedente que é um método para intensificar os efeitos anticavidade de fluoreto, por exemplo em que a composição é aplicada aos dentes de um paciente tendo sido identificado como tendo sinais precoces de deterioração do dente, por exemplo cáries de esmalte precoces, ou como tendo deterioração ativa, ou como estando em risco elevado de deterioração de dente.

[66] 1.20. Método 1.15 em que a composição compreende uma quantidade eficaz de fluoreto e/ou em que o método compreende adicionalmente a administração de um produto para cuidado oral que compreende uma quantidade eficaz de enxaguatório bucal de fluoreto ou pasta de dente compreendendo uma quantidade eficaz de fluoreto.

[67] Em uma outra forma de realização, a descrição provê o uso de uma AFP na fabricação de uma composição para cuidado oral, por exemplo de acordo com qualquer uma das Composições 1 ou 2 ou 3, e seguintes, para reparar ou inibir a erosão dentária, promover a remineralização, e/ou intensificar os efeitos anticavidade de fluoreto, por exemplo em qualquer um dos Métodos 1 ou 2 ou 3, e seguintes.

[68] Em um outro aspecto, a descrição provê um método (Método 4) de fabricação de um produto para cuidado oral, por exemplo um produto para cuidado oral útil para reparo ou inibição de erosão dentária, promoção da remineralização dentária, e/ou intensificação dos efeitos anticavidade de fluoreto, por exemplo, um produto de acordo com qualquer uma das Composições 1 ou 2 ou 3, e seguintes, compreendendo a) neutralizar uma AFP por diluição com uma solução tampão aquosa, por exemplo uma solução tampão de fosfato, para obter uma solução tendo pH aproximadamente neutro ou ligeiramente básico, por exemplo, pH 7 a 8; b) filtrar e centrifugar o produto de solução de a) para obter um filtrado que compreende a AFP; c) adicionar fluoreto (por exemplo, na forma de um sal oralmente aceitável contendo fluoreto, por exemplo fluoreto de sódio ou monofluorofosfato de sódio) e opcionalmente um biocida (por exemplo, cloreto de cetilpiridínio em uma quantidade eficaz, por exemplo 0,01 a 1%, por exemplo cerca de 0,1% por peso do filtrado) para o produto filtrado de b); d) misturar o produto de c) aos componentes de um carreador oralmente aceitável para obter uma composição para cuidado oral compreendendo a AFP em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso por peso total da composição.

[69] Por exemplo, a descrição provê uma composição para cuidado oral que compreende AFP, por exemplo, uma composição de acordo com qualquer uma da Composição 1 ou 2 ou 3, e seguintes, em que a composição para cuidado oral é obtida ou obtenível pelo processo do Método 2, e seguintes.

[70] Áreas adicionais de aplicabilidade da presente invenção tornar- se-ão evidentes a partir da descrição detalhada provida a seguir. Deve ser entendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, enquanto indicando a forma de realização preferida da invenção, são destinados às finalidades de ilustração apenas e não são destinados a limitar o escopo da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[71] A descrição seguinte da(s) forma(s) de realização preferida(s) é meramente exemplar na natureza e não pretende limitar a invenção, sua aplicação, ou usos.

[72] Como usado ao longo, as faixas são usadas como abreviadas para descrever cada uma e todo valor que está dentro da faixa. Qualquer valor dentro da faixa pode ser selecionado como o terminal da faixa. Além disso, todas as referências citadas aqui são aqui incorporadas por referência em suas totalidades. No caso de um conflito em uma definição na presente descrição e aquela de uma referência citada, a presente descrição controla.

[73] A não ser que especificado de outra forma, todas as porcentagens e quantidades expressas aqui e em qualquer lugar no relatório descritivo devem ser entendidas para se referir a porcentagens por peso. As quantidades dadas são baseadas no peso ativo do material.

Proteínas Anticongelamento (AFPs)

[74] Proteínas Anticongelamento (AFPs) são proteínas de organismos tais como certos vertebrados, plantas, fungos e bactérias que permitem a sua sobrevivência em ambientes sub zero. AFPs são também chamadas proteínas de estruturação de gelo. As AFPs se aglutinam a pequenos cristais de gelo para inibir o crescimento e recristalização de gelo que de outra forma seria fatal para os organismos. A característica comum das AFPS é uma histerese térmica, que é uma diferença entre o ponto de fusão e o ponto de congelamento. A adição de AFPS na interface entre gelo sólido e água líquida inibe o crescimento termodinamicamente favorecido do cristal de gelo. O crescimento de gelo é cineticamente inibido pelas AFPs cobrindo as superfícies acessíveis à água de gelo. A histerese térmica é facilmente medida em laboratório com um osmômetro de nanolitros.

[75] Não há sequência de consenso comum das AFPs a partir dos diferentes organismos Crit Rev Biotechnol. 2008; 28: 57-82, Properties, potentials, and prospects of antifreeze proteins, Venketesh S1, Dayananda C.; Journal of Experimental Biology 2015; 218: 1846-1855, Animal ice-binding (antifreeze) proteins and glycolipids: an overview with emphasis on physiological function, John G. Duman.

[76] Úteis para a presente invenção são AFPs de peixe, tal como por exemplo Macrozoarces americanus ou a partir de plantas, tal como Lolium perenne. AFPs preferidas são tais a partir de insetos. Existem dois tipos conhecidos de AFPs de insetos, AFPs de Tenébrio e Dendróides, que são ambas em diferentes famílias de insetos. Elas são similares umas às outras, e consistem em números variados de repetições 12 ou 13-mer de aproximadamente 8,3-12,5 kD. As AFPs especialmente preferidas de insetos são aquelas a partir de Choristoneura fumiferana.

[77] AFPs especialmente preferidas são aquelas com a seguinte sequência de polipeptídeos: BM 82 (SEQ ID NO: 1), BM 80 (SEQ ID NO: 2), BM 83 (SEQ ID NO: 3).

[78] As formas de realização particularmente preferidas da presente invenção são proteínas tendo as sequências de polipeptídeos representadas na SEQ ID NO: 1, 2, 3. As formas de realização particularmente preferidas são também proteínas que surgem da substituição, inserção ou deleção de pelo menos um, dois, até 10, preferivelmente 5, aminoácidos. Particularmente preferidas são proteínas onde até 1%, até 3%, até 5%, de todos os aminoácidos, a partir das sequências de polipeptídeos representadas na SEQ ID NO: 1, 2, 3, são substituídas ou deletadas e que ainda têm pelo menos 50% preferivelmente pelo menos 80% e mais preferivelmente pelo menos 90% da propriedade biológica das proteínas de partida. A propriedade biológica das proteínas aqui significa a histerese térmica.

[79] As AFPs também podem ser ligadas a um parceiro de fusão, preferivelmente na parte terminal carboxila ou amino da AFP. Um parceiro de fusão pode ser, por exemplo, uma pequena sequência peptídica, tal como um marcador his - de uma sequência 6 a 10 seus resíduos -, que é útil para a purificação da AFP. SEQ ID NO: 1, 2 ou 3, por exemplo, tem nos seus terminais carboxila um marcador his6.

[80] Um parceiro de fusão pode também ser alguns aminoácidos adicionais nos terminais carboxila e ou amino da AFP que são o resultado de novos locais tanto de reconhecimento quanto de criação ou inativação para endonucleases de restrição ao nível do ácido nucleico.

[81] As AFPs também podem ser ligadas a um parceiro de fusão, preferivelmente na parte terminal carboxila ou amino da AFP. Um parceiro de fusão pode ser, por exemplo, uma pequena sequência de peptídeos tal como peptídeos de aglutinação a hidroxiapatita, preferivelmente um que possui uma sequência de peptídeos descrita na SEQ ID NO: 4 a SEQ IDNO: 19 SEQ ID NO: 4 IDDYTRA SEQ ID NO: 5 HPPLHHA SEQ ID NO: 6 SPSTHWK SEQ ID NO: 7 GSPATAA SEQ ID NO: 8 GKVQAQS SEQ ID NO: 9 YPVTPSI SEQ ID NO: 10 IPTLPSS SEQ ID NO: 11 YQGASEN SEQ ID NO: 12 EHITTSN SEQ ID NO: 13 RILITIA SEQ ID NO: 14 IPITNLR SEQ ID NO: 15 TTSTRHI SEQ ID NO: 16 NERALTL SEQ ID NO: 17 MQTVEVT SEQ ID NO: 18 SWGTQTD SEQ ID NO: 19 TLPASSV

[82] As formas de realização preferidas de AFP ligadas a um peptídeo de aglutinação a hidroxiapatita é SEQ ID NO: 20 que é uma fusão da SEQ NO: 4 e SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 21, que é uma fusão da SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 2.

[83] A AFP no sentido desta invenção também pode significar que múltiplas cópias (isto é, multímeros) de uma AFP são fundidas juntas, por exemplo, duas ou três AFP - tendo a estrutura idêntica (isto é, homômeros) ou uma estrutura diferente (isto é, heterômeros) - formam uma “super AFP”, por exemplo, uma AFP de peixe pode ser fundida junto com uma AFP de insetos ou AFP de dois peixes idênticos são fundidas juntas.

[84] A AFP no sentido desta invenção também pode significar que uma AFP está ligada a uma molécula não peptídica, tal como um fármaco farmacêutico, uma vitamina ou um flavortizante. Por isso, uma molécula não peptídica pode ser alvejada para o esmalte dentário através da parte de AFP. A união da molécula não peptídica à AFP é possível, por exemplo, através da reação com as cadeias laterais dos aminoácidos da AFP tais como OH de Ser ou Thr ou SH de Cys ou Met ou COOH de Asp ou Glu ou NH2 de Lys ou Arg. A união química pode ser uma “permanente”, isto é, uma que não seja hidrolisada pela saliva ou pode ser uma “lábil”, isto é, uma que é susceptível a clivagem pela saliva.

[85] As AFPs influenciam na formação de cristais de gelo e também na forma dos cristais de gelo que podem ser observados na microscopia quando cristais de gelo formados na presença de AFP são comparados com cristais de gelo sem AFP. Se a AFP bioativa estiver presente, os cristais de gelo têm uma aparência afiada em comparação com a aparência arredondada, semelhante à gotícula, dos cristais formados sem a AFP. Isso também pode ser usado para determinar a atividade biológica das AFPs.

[86] Ver Fig.1 formação de cristais de gelo na presença e ausência de AFP. (Água significa água destilada sem AFP).

[87] Os AFPs podem ser fabricados quimicamente por métodos conhecidos de síntese de peptídeos, por exemplo, síntese de fase sólida de acordo com Merrifield.

[88] Particularmente úteis, no entanto, são métodos genéticos para a fabricação, nos quais sequências de ácido nucleico, em particular sequências de DNA, as codificações para a AFP e - se desejado - um ou mais parceiros de fusão são combinadas de tal modo que a expressão do gene da sequência de ácido nucleico combinada gera a proteína desejada em um organismo hospedeiro.

[89] Organismos hospedeiros adequados (organismos produtores) aqui podem ser procariontes (incluindo Archaea) ou eucariontes, particularmente bactérias incluindo halobactérias e methanococci, fungos, células de insetos, células de planta e células de mamíferos, particularmente preferivelmente Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., Lactobacillen, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (ou células relacionadas), e outros.

[90] A invenção refere-se ainda a construções de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção sob o controle genético de sequências reguladoras de ácido nucleico, e também vetores compreendendo pelo menos uma das ditas construções de expressão.

[91] É dada preferência a tais construções da invenção compreendendo um promotor 5' a montante da sequência de codificação particular e uma sequência terminadora 3' a jusante, e também, se apropriado, elementos regulatórios habituais adicionais, em cada caso operativamente ligados à dita sequência de codificação.

[92] Uma “ligação operativa” significa a disposição sequencial de promotor, sequência de codificação, terminadora e, se apropriado, elementos regulatórios adicionais de tal modo que cada um dos elementos regulatórios é capaz de cumprir sua função de acordo com seu uso destinado em conexão com a expressão da sequência de codificação.

[93] Exemplos de sequências que podem ser operativamente ligadas são sequências de direcionamento e também intensificadoras, sinais de poliadenilação e similares. Elementos regulatórios adicionais compreendem marcadores selecionáveis, sinais de amplificação, origens de replicação e similares. Exemplos de sequências reguladoras adequadas são descritas em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

[94] Em adição a essas sequências regulatórias, a regulação natural destas sequências pode ainda estar presente a montante dos genes estruturais reais e, se apropriado, foram geneticamente modificados de modo que a regulação natural tenha sido desligada e a expressão dos genes tenha sido aumentada.

[95] Uma construção de ácido nucleico preferida vantajosamente também compreende uma ou mais das sequências intensificadoras já mencionadas que estão funcionalmente ligadas ao promotor e permitem a expressão da sequência de ácido nucleico a ser aumentada. Sequências vantajosas adicionais, tais como elementos regulatórios adicionais ou terminadores, também podem ser inseridas na extremidade 3' das sequências de DNA.

[96] Os ácidos nucleicos da invenção podem estar presentes na construção em uma ou mais cópias. A construção pode compreender ainda marcadores adicionais, tais como resistências antibióticas ou genes que complementam auxotróficos, para selecionar para a construção, se apropriado.

[97] Exemplos de sequências reguladoras que são vantajosas para o método da invenção estão presentes em promotores tais como cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP (rhaPBAD) SP6, lambda-PR ou promotor lambda-P, que são vantajosamente usados em bactérias Gram-negativas. Exemplos adicionais de sequências reguladoras vantajosas estão presentes nos promotores Gram-positivos amy e SP02, nos promotores de levedura ou de fungos ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Também é possível usar promotores artificiais para regulação.

[98] Para ser expresso em um organismo hospedeiro, a construção de ácido nucleico é vantajosamente inserida em um vetor tal como, por exemplo, um plasmídeo ou um fago, que permite que os genes sejam expressos otimamente no hospedeiro. Exceto os plasmídeos e fagos, os vetores também significam quaisquer outros vetores conhecidos pelo trabalhador habilitado, isto é, por exemplo, vírus tais como SV40, CMV, baculovírus e adenovírus, transponsons, elementos IS, fasmídeos, cosmídeos, e DNA linear ou circular e também o sistema de Agrobacterium.

[99] Estes vetores podem se replicar de forma autônoma no organismo hospedeiro ou ser replicados cromossomicamente. Estes vetores constituem uma outra forma de realização da invenção. Exemplos de plasmídeos adequados são pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19,2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III”3-B1, tgt11 ou pBdCl em E coli, pIJ101, pIJ364, pIJ702 ou pIJ361 em Streptomyces, pUB110, pC194 ou pBD214 em Bacillus, pSA77 ou pAJ667 em Corynebacterium, pALS1, pIL2 ou pBB116 em fungos, 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 ou pEMBLYe23 em leveduras ou pLGV23, pGHIac+, pBIN19, pAK2004 ou pDH51 em plantas. Os ditos plasmídeos são uma pequena seleção dos plasmídeos possíveis. Plasmídeos adicionais são bem conhecidos do trabalhador habilitado e podem ser encontrados, por exemplo, no livro Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904 018).

[100] Vantajosamente, a construção de ácido nucleico adicionalmente compreende, para a finalidade de expressar os outros genes presentes, também sequências reguladoras terminais 3'- e/ou 5'- para aumentar a expressão que são selecionadas para expressão ótima dependendo do organismo hospedeiro e gene ou genes selecionados.

[101] Estas sequências reguladoras destinam-se a permitir que os genes e a expressão de proteína sejam expressos especificamente. Dependendo do organismo hospedeiro, isto pode significar, por exemplo, que o gene é expresso ou super expresso apenas após indução ou que ele é expresso e/ou super expresso imediatamente.

[102] Neste contexto, as sequências ou fatores regulatórios podem, preferivelmente, ter uma influência benéfica sobre, e desse modo aumentar, a expressão de gene dos genes introduzidos. Assim, os elementos regulatórios podem ser vantajosamente intensificados no nível transcricional pelo uso de sinais de transcrição fortes tais como promotores e/ou intensificadores. Além disso, no entanto, é também possível intensificar a tradução ao melhorar a estabilidade do mRNA, por exemplo.

[103] Em uma outra forma de realização do vetor, o vetor compreendendo a construção de ácido nucleico da invenção ou o ácido nucleico da invenção pode também ser vantajosamente introduzido na forma de um DNA linear nos microrganismos e integrado no genoma do organismo hospedeiro por meio de recombinação heteróloga ou homóloga. O dito DNA linear pode consistir em um vetor linearizado tal como um plasmídeo, ou apenas da construção de ácido nucleico ou do ácido nucleico da invenção.

[104] A fim de se alcançar a expressão ótima de genes heterólogos em organismos, é vantajoso modificar as sequências de ácido nucleico de acordo com o uso de códon específico empregado no organismo. O uso de códon pode ser prontamente determinado com base nas análises de computador de outros genes conhecidos do organismo em questão.

[105] Um cassete de expressão da invenção é preparado por fusão de um promotor adequado a uma sequência de nucleotídeos de codificação adequada e um sinal terminador ou sinal de poliadenilação. Para esta finalidade, o uso é feito de técnicas de recombinação e de clonagem familiares como são descritas, por exemplo, em T. Maniatis, E.F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) e também em T.J. Silhavy, M.L. Berman e L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience (1987).

[106] Para expressão em um organismo hospedeiro adequado, a construção de ácido nucleico recombinante ou construção de gene é vantajosamente inserida em um vetor específico hospedeiro que permite que os genes sejam expressos otimamente no hospedeiro. Os vetores são bem conhecidos do trabalhador habilitado e podem ser encontrados, por exemplo, em “Cloning Vectors” (Pouwels P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).

[107] Os vetores da invenção podem ser usados para preparar microrganismos recombinantes que são transformados, por exemplo, com pelo menos um vetor da invenção e podem ser usados para produzir os polipeptídeos da invenção. Vantajosamente, as construções recombinantes descritas acima da invenção são introduzidas em e expressas em um sistema hospedeiro adequado. Preferência é dada aqui ao uso de métodos de clonagem e transfecção comuns conhecidos pelo trabalhador habilitado, tais como, por exemplo, co-precipitação, fusão de protoplastos, eletroporação, transfecção retroviral e similares, a fim de expressar os ditos ácidos nucleicos no sistema de expressão particular. Sistemas adequados são descritos, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Eds. Wiley Interscience, New York 1997, ou Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

[108] Também é possível, de acordo com a invenção, preparar microrganismos homologamente recombinados. Para esta finalidade, um vetor é preparado, que compreende pelo menos uma seção de um gene da invenção ou de uma sequência de codificação, na qual, se apropriado, pelo menos uma deleção, adição ou substituição de aminoácido foi introduzida a fim de modificar, por exemplo, interromper funcionalmente, a sequência da invenção (vetor de nocaute). A sequência introduzida pode, por exemplo, também ser um homólogo a partir de um microrganismo relacionado ou ser derivado a partir de uma fonte de mamífero, de levedura ou de inseto. O vetor usado para recombinação homóloga pode alternativamente ser projetado de tal modo que o gene endógeno sofra mutação ou seja modificado de algum outro modo durante a recombinação homóloga, mas ainda codifica a proteína funcional (por exemplo, a região regulatória a montante pode ter sido modificada de um modo que modifica a expressão da proteína endógena). A seção modificada do gene da invenção está no vetor de recombinação homóloga. A construção de vetores adequados para recombinação homóloga está descrita, por exemplo, em Thomas, K.R. e Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503.

[109] Quaisquer organismos procarióticos ou eucarióticos são em princípio adequados para serem usados como organismos hospedeiros recombinantes para o ácido nucleico da invenção ou para a construção de ácido nucleico. Os organismos hospedeiros usados vantajosamente são microrganismos tais como bactérias, fungos ou leveduras. Bactérias Gram- positivas ou Gram-negativas, preferivelmente bactérias das famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae ou Nocardiaceae, particularmente preferivelmente bactérias dos gêneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium ou Rhodococcus, são vantajosamente usados.

[110] Dependendo do organismo hospedeiro, os organismos usados no método da invenção são crescidas ou cultivadas de uma maneira conhecida pelo trabalhador habilitado. Microrganismos são usualmente crescidos em um meio líquido compreendendo uma fonte de carbono usualmente na forma de açúcares, uma fonte de nitrogênio usualmente na forma de fontes de nitrogênio orgânico tais como extrato de levedura ou sais tais como sulfato de amônio, elementos em traço tais como ferro, manganês, sais de magnésio e, se apropriado, vitaminas, em temperaturas entre 0 e 100°C, preferivelmente entre 10 e 60°C, enquanto sendo gaseificada com oxigênio. O pH do líquido nutriente pode ou não pode ser mantido aqui em um valor fixo, isto é, regulado durante o crescimento. O crescimento pode ocorrer em batelada, semi-batelada ou continuamente. Os nutrientes podem ser introduzidos inicialmente no início da fermentação ou ser subsequentemente alimentados de forma semicontínua ou contínua. As enzimas podem ser isoladas a partir dos organismos usando o método descrito nos exemplos ou ser usadas para a reação como um extrato bruto.

[111] A invenção refere-se adicionalmente a métodos de produção recombinante de polipeptídeos da invenção ou fragmentos biologicamente ativos, funcionais dos mesmos, cujos métodos compreendem cultivar um microrganismo produtor de polipeptídeo, se apropriado, induzir a expressão dos ditos polipeptídeos e isolar os mesmos a partir da cultura. Deste modo, os polipeptídeos também podem ser produzidos em uma escala industrial, se desejado. O microrganismo recombinante pode ser cultivado e fermentado por métodos conhecidos. Por exemplo, bactérias podem ser propagadas em meio TB ou meio LB e a uma temperatura de 20 a 40°C e um pH de 6 a 9. Condições de cultura adequadas são descritas em detalhe em, por exemplo, T. Maniatis, E.F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

[112] Se os polipeptídeos não são secretados no meio de cultura, as células são então rompidas e o produto é isolado a partir do lisado por métodos conhecidos de isolamento de proteínas. As células podem opcionalmente ser rompidas por ultrassom de alta frequência, por alta pressão, por exemplo em uma célula de pressão francesa, por osmólise, pela ação de detergentes, enzimas líticas ou solventes orgânicos, pelo uso de homogeneizadores ou por uma combinação de vários dos métodos listados.

[113] Os polipeptídeos podem ser purificados por meio de métodos cromatográficos conhecidos tais como cromatografia de peneira molecular (filtração em gel), tal como cromatografia de Q-Sefarose, cromatografia de troca de íons e cromatografia hidrofóbica, e também por meio de outros métodos habituais tais como ultrafiltração, cristalização, salinização, diálise e eletroforese em gel nativo. Métodos adequados são descritos, por exemplo, em Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden [título original: The tools of biochemistry], Verlag Water de Gruyter, Berlim, New York ou em Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlim.

[114] Pode ser vantajoso, para o propósito de isolar a proteína recombinante, utilizar sistemas de vetor ou oligonucleotídeos que estendam o cDNA por sequências nucleotídicas particulares e, assim, codificar polipeptídeos alterados ou proteínas de fusão que facilitem a purificação, por exemplo. Exemplos de tais modificações adequadas são marcadores que atuam como âncoras, por exemplo a modificação conhecida como âncora de hexa-histidina ou epítopos que podem ser reconhecidos por anticorpos como antígenos (descritos, por exemplo, em Harlow, E. and Lane, D., 1988 Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Outros marcadores adequados são, por exemplo, HA, calmodulina-BD, GST, MBD; quitina-BD, marcador estreptavidina-BD-Avi, marcador Flag, T7, etc. Estas âncoras podem ser utilizadas para afixar as proteínas a um suporte sólido, tal como, por exemplo, uma matriz polimérica que pode ter sido introduzida em uma coluna cromatográfica por exemplo, ou a uma placa de microtitulação ou qualquer outro suporte. Os protocolos de purificação correspondentes podem ser obtidos a partir dos fornecedores de marcadores de afinidade comercial.

[115] Em algumas formas de realização, a AFP está presente na composição em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso por peso total da composição. Em algumas formas de realização, a AFP está presente na composição em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso, ou de 0,01% em peso a 2% em peso, ou de 0,02% em peso a 1% em peso por peso total da composição. Em outras formas de realização, a AFP está presente na composição em uma quantidade de 0,01% em peso a 1% em peso, ou de 0,021% em peso a 0,5% em peso por peso total da composição. Em formas de realização adicionais, a AFP está presente na composição em uma quantidade de 0,3% em peso a 3% em peso, ou de 0,05% em peso a 2% em peso, ou de 0,05% em peso a 1% em peso a 2% em peso por peso total da composição.

Carreador oralmente aceitável e ingredientes opcionais

[116] A expressão “carreador oralmente aceitável”, como usada aqui denota um carreador feito a partir de materiais que são seguros e aceitáveis para uso oral nas quantidades e concentrações destinadas, por exemplo materiais como seriam encontrados em pastas de dente e colutórios convencionais. Tais materiais incluem água ou outros solventes que podem conter um umectante tal como glicerina, sorbitol, xilitol e similares. Em alguns aspectos, o termo “carreador oralmente aceitável” engloba todos os componentes da composição para cuidado oral exceto a proteína vegetal hidrolisada e o fluoreto. Em outros aspectos, o termo refere-se a ingredientes inertes ou inativos que servem para entregar a AFP, e/ou quaisquer outros ingredientes funcionais, para a cavidade oral.

[117] Carreadores oralmente aceitáveis para uso na invenção incluem carreadores convencionais e conhecidos usados na produção de enxaguatórios bucais ou colutórios, pastas de dente, géis de dente, pós de dente, pastilhas, gomas, contas, tiras comestíveis, tabletes e similares. Os carreadores devem ser selecionados para compatibilidade um com o outro e com outros ingredientes da composição.

[118] Os seguintes exemplos não limitantes são providos. Em uma composição de pasta de dente, o carreador é tipicamente um sistema água/umectante que provê uma fração principal por peso da composição. Alternativamente, o componente carreador de uma composição de pasta de dente pode compreender água, um ou mais umectantes, e outros componentes funcionais diferentes da AFP. Em uma formulação de um enxaguatório bucal ou de um colutório, o carreador é tipicamente uma mistura líquida de água/álcool na qual a AFP está dissolvida ou dispersa. Em uma pastilha dissolvível, o carreador tipicamente compreende um material de matriz sólida que se dissolve lentamente na cavidade oral. Em gomas de mascar, o carreador tipicamente compreende uma base de goma, enquanto em uma tira comestível, o carreador tipicamente compreende um ou mais polímeros formadores de película. As composições para cuidado oral providas aqui podem compreender adicionalmente um ou mais ingredientes adicionais selecionados a partir de abrasivos, agentes de modificação de pH, tensoativos, moduladores de espuma, agentes espessantes, modificadores de viscosidade, umectantes, agentes de controle anticálculo ou de tártaro, edulcorantes, flavorizantes, corantes e conservantes. Estes ingredientes também podem ser considerados como materiais carreadores. Exemplos não limitantes são providos abaixo.

[119] Em uma forma de realização, uma composição da invenção compreende pelo menos um abrasivo, útil, por exemplo, como um agente de polimento. Qualquer abrasivo oralmente aceitável pode ser usado, mas o tipo, finura (tamanho de partícula) e a quantidade de abrasivo devem ser selecionados de modo que o esmalte do dente não seja excessivamente friccionado durante o uso normal da composição. Abrasivos adequados incluem, sem limitação, sílica, por exemplo na forma de sílica gel, sílica hidratada ou sílica precipitada, alumina, fosfatos insolúveis, carbonato de cálcio, abrasivos resinosos tais como produtos de condensação de ureia- formaldeído e similares. Entre os fosfatos insolúveis úteis como abrasivos são ortofosfatos, polimetafosfatos e pirofosfatos. Exemplos ilustrativos são ortofosfato de dicálcio di-hidratado, pirofosfato de cálcio, pirofosfato de [beta]-cálcio, fosfato tricálcico, polimetafosfato de cálcio e polimetafosfato de sódio insolúvel. Um ou mais abrasivos estão opcionalmente presentes nas composições para cuidado oral da presente invenção em uma quantidade de 1% em peso a 5% em peso por peso total da composição. O tamanho de partícula médio de um abrasivo, se presente, é geralmente de 0,1 a 30 μm e preferivelmente de 5 a 15 μm.

[120] Em uma forma de realização adicional, uma composição para cuidado oral da invenção compreende pelo menos um sal de bicarbonato, útil, por exemplo, para transmitir uma “sensação limpa” aos dentes e gengivas devido a efervescência e liberação de dióxido de carbono. Qualquer bicarbonato oralmente aceitável pode ser usado, incluindo, sem limitação, bicarbonatos de metal alcalino tais como bicarbonatos de sódio e potássio, bicarbonato de amônio e similares. Um ou mais sais de bicarbonato estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de 1% em peso a 10% em peso da composição.

[121] Em uma forma de realização ainda adicional, uma composição para cuidado oral da invenção compreende pelo menos um agente de modificação de pH. Tais agentes incluem agentes acidificantes para abaixar o pH, agentes basificantes para elevar o pH e agentes de tamponamento para controlar o pH dentro de uma faixa desejada. Por exemplo, um ou mais compostos selecionados a partir de agentes acidificantes, basificantes e de tamponamento podem ser incluídos para prover um pH de 2 a 10, ou em várias formas de realização ilustrativas um pH de 2 a 8, 3 a 9, 4 a 8, 5 a 7, 6 a 10, ou 7 a 9. Qualquer agente de modificação de pH oralmente aceitável pode ser usado, incluindo, sem limitação, ácido carboxílico, ácido fosfórico e ácido sulfônico, sais de ácido (por exemplo, citrato de monossódio, citrato de dissódio, malato de monossódio), hidróxidos de metal alcalino, tais como hidróxido de sódio, carbonatos, tais como carbonato de sódio, bicarbonatos, boratos, silicatos, fosfatos (por exemplo, fosfato de monossódio, fosfato de trissódio, sais de pirofosfato), imidazol e similares. Um ou mais agentes de modificação de pH estão opcionalmente presentes em uma quantidade total eficaz para manter a composição em uma faixa de pH oralmente aceitável.

[122] Em uma forma de realização ainda adicional, uma composição da invenção compreende pelo menos um tensoativo, útil, por exemplo, para prover estabilidade intensificada à composição e aos componentes ali contidos, para ajudar na limpeza de uma superfície dentária através da ação de detergente, e para prover espuma sob agitação (por exemplo, durante a escovação com uma composição dentifrícia da invenção). Qualquer tensoativo oralmente aceitável, incluindo aqueles que são aniônicos, não iônicos ou anfotéricos, pode ser usado. Tensoativos aniônicos adequados incluem, sem limitação, sais solúveis em água de sulfatos de alquila C8-20, monoglicerídeos sulfonados de ácidos graxos C8-20, sarcosinatos, tauratos e similares. Os tensoativos não iônicos adequados incluem, sem limitação, poloxâmeros, ésteres de polioxietileno sorbitano, etoxilatos de álcool graxo, etoxilatos de alquilfenol, amina terciária, óxidos, óxidos de fosfina terciária, sulfóxidos de dialquila e similares. Tensoativos anfotéricos adequados, sem limitação, derivados de aminas secundárias e terciárias alifáticas C8-20 tendo um grupo aniônico tal como carboxilato, sulfato, sulfonato, fosfato ou fosfonato. Um exemplo adequado é cocoamidopropilbetaína. Um ou mais tensoativos estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de 0,01% em peso a 10% em peso, por exemplo, de 0,05% em peso a 5% em peso ou de 0,1% em peso a 2% em peso por peso total da composição.

[123] Em uma forma de realização ainda adicional, uma composição para cuidado oral da invenção compreende pelo menos um modulador de espuma, útil, por exemplo, para aumentar a quantidade, a espessura ou a estabilidade da espuma gerada pela composição sob agitação. Qualquer modulador de espuma oralmente aceitável pode ser usado incluindo, sem limitação, polietileno glicóis (PEGs). Um ou mais PEGs estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de 0,1% em peso a 10% em peso por peso total da composição.

[124] Em uma forma de realização ainda adicional, uma composição para cuidado oral da invenção compreende pelo menos um agente espessante, por exemplo, para transmitir uma consistência e/ou sensação de boca desejadas à composição. Qualquer agente espessante oralmente aceitável pode ser usado incluindo, sem limitação, carbômeros (polímeros de carboxivinila), carragenanos, polímeros celulósicos tais como hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose (CMC) e sais dos mesmos, gomas naturais tais como caraia, xantana, goma arábica e tragacanto, silicato de alumínio e magnésio coloidal, sílica coloidal e similares. Um ou mais agentes espessantes estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de 0,01% em peso a 15% em peso por peso total da composição.

[125] Em uma forma de realização ainda adicional, uma composição da invenção compreende pelo menos um modificador de viscosidade, útil, por exemplo, para inibir a sedimentação ou a separação dos ingredientes ou para promover a redispersão dos ingredientes sob agitação de uma composição líquida. Qualquer modificador de viscosidade oralmente aceitável pode ser usado incluindo, sem limitação, óleo mineral, petrolato, argilas, sílica e similares. Um ou mais modificadores de viscosidade estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de 0,01% em peso a 10% em peso por peso total da composição. Em uma forma de realização ainda adicional, uma composição para cuidado oral da invenção compreende pelo menos um umectante que pode ser usado para impedir o endurecimento de uma pasta de dente quando da exposição ao ar. Qualquer umectante oralmente aceitável pode ser usado, incluindo, sem limitação, álcoois poli-hídricos tais como glicerina, sorbitol, xilitol ou PEGs de baixo peso molecular. A maioria dos umectantes também funciona como edulcorantes. Um ou mais umectantes estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de 1% em peso a 50% em peso por peso total da composição.

[126] Em uma forma de realização ainda adicional, uma composição para cuidado oral da invenção compreende pelo menos um edulcorante que intensifica o gosto da composição. Qualquer edulcorante natural ou artificial oralmente aceitável pode ser usado incluindo, sem limitação, dextrose, sacarose, maltose, dextrina, manose, xilose, ribose, frutose, levulose, galactose, xarope de milho, amido parcialmente hidrolisado, hidrolisado de amido hidrogenado, sorbitol, manitol, xilitol, maltitol, isomalte, aspartame, neotame, sacarina e sais dos mesmos, edulcorantes intensos com base em dipeptídeos, ciclamatos e similares. Um ou mais edulcorantes estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de 0,005% em peso a 5% em peso por peso total da composição.

[127] Em uma forma de realização ainda adicional, uma composição para cuidado oral da invenção compreende pelo menos um flavorizante que intensifica o gosto da composição. Qualquer flavorizante natural ou sintético oralmente aceitável pode ser usado incluindo, sem limitação, vanilina, salva, manjerona, óleo de salsa, óleo de hortelã, óleo de canela, óleo de gaultéria (metilsalicilato), óleo de hortelã pimenta, óleo de cravo, óleo de pimenta racemosa, óleo de anis, óleo de eucalipto, óleos cítricos, óleos e essências de frutas, e similares. Também englobados dentro de flavorizantes são ingredientes que provêm fragrância e/ou outros efeitos sensoriais na boca, incluindo efeitos de resfriamento ou de aquecimento. Tais ingredientes incluem ilustrativamente mentol, acetato de mentila, lactato de mentila, cânfora, óleo de eucalipto, eucaliptol, eugenol, cássia, oxanona, α-irisona, timol, linalol, benzaldeído, cinamaldeído, N-etil-p-mentan-3-carboxamina, N,2,3-trimetil-2-isopropilbutanamida, 3-(1-mentóxi)-propano-1,2-diol, cinamaldeído glicerol acetal (CGA), mentona glicerol acetal (MGA) e similares. Um ou mais flavorizantes estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de 0,01% em peso a 5% em peso por peso total da composição.

[128] Em uma forma de realização ainda adicional, uma composição para cuidado oral da invenção compreende pelo menos um corante. Um corante pode servir para um número de funções. Estes incluem prover um revestimento branco ou colorido claro sobre uma superfície dentária, indicar localizações sobre uma superfície dentária que foram efetivamente contatadas pela composição, e/ou modificar a aparência da composição para intensificar a atratividade ao consumidor. Qualquer corante oralmente aceitável pode ser usado incluindo, sem limitação, talco, mica, carbonato de magnésio, carbonato de cálcio, silicato de magnésio, silicato de alumínio e magnésio, sílica, dióxido de titânio, óxido de zinco, óxido de ferro, ferrocianeto de amônio férrico, violeta de manganês, mica titanizada, oxicloreto de bismuto e similares. Um ou mais corantes estão opcionalmente presentes em uma quantidade total de 0,001% em peso a 20% em peso por peso total da composição.

[129] Em uma forma de realização ainda adicional, uma composição para cuidado oral da invenção compreende um conservante. O conservante pode ser selecionado a partir de parabenos, sorbato de potássio, álcool benzílico, fenoxietanol, poliaminopropril biguanida, ácido caprílico, benzoato de sódio e cloreto de cetilpiridínio. Em algumas formas de realização, o conservante está presente em uma concentração de cerca de 0,001 a cerca de 1% em peso, por peso total da composição.

[130] Os seguintes exemplos ilustram composições da invenção e seus usos. As composições exemplificadas são ilustrativas e não limitam o escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Rugosidade da Superfície

[131] Os dentes de bovino são cortados, moídos e polidos para obter- se blocos de esmalte tendo dimensões aproximadas de 3 mm x 3 mm x 2 mm. A espessura do esmalte é de aproximadamente 1 a 2mm e a espessura da dentina é de aproximadamente 1mm. Todas as medições são tomadas na superfície do esmalte.

[132] A rugosidade da Superfície dos blocos de esmalte é medida antes e depois do ataque com ácido. O ataque com ácido é alcançado colocando os blocos de esmalte em solução de ácido cítrico a 1% (pH 3,8) até que a rugosidade da superfície (Sq) atinja 100 - 200. Este valor Sq é registrado como a rugosidade da superfície do esmalte atacado. (Sq é uma medida padrão definida na ISO 25178 basicamente como a altura quadrada média da raiz em relação à altura média aritmética da superfície a ser medida, esta então corresponde à média de todas as distâncias absolutas do perfil a partir do plano central dentro da área de medição, de modo que se for maior, significa que há picos e vales mais pronunciados na superfície, ou seja, a superfície é mais rugosa e, se for mais baixa, a superfície é mais lisa.) A AFP é diluída até a concentração final utilizando um tampão de Na2HPO4 (1,5 mM) e CaCl2 (2,5 mM). Depois de neutralizar para um pH 7,5, a solução é filtrada e centrifugada. Blocos de esmalte que sofrem ataque ácido são subsequentemente incubados com uma solução compreendendo a AFP tratada a uma concentração de 5,5 μM ou 55 μM (2 ml de solução por bloco) durante 60 minutos.

[133] Após o período de incubação de 60 minutos, os blocos de esmalte são incubados em solução de saliva artificial (0,4g de NaCl, 0,4g de KCl, 0,8g de CaCl2, 0,69g de NaH2PO4, 1g de ureia, 1 litro de água destilada; pH 7 (ajustado usando 1M NaOH)) por 22 horas. Os blocos de esmalte são então tratados uma segunda vez com AFP e incubados novamente com saliva artificial por 22 horas. Os blocos são então rinsados com água deionizada (DI) e secos ao ar antes de medir a rugosidade de superfície deles. Blocos de esmalte tratados com PBS a 0,5% são usados como controle negativo para o experimento. Os resultados são ilustrados na Tabela 1. A % de reparo representa a % de redução na rugosidade da superfície (Sq) alcançada pelo tratamento de proteína, relativa à rugosidade da superfície do esmalte que sofre com ataque ácido (sem tratamento). Tabela 1 - Resultados do ensaio de rugosidade da superfície

[134] Ver Fig. 2 Eficácia de reparação do BM80 em baixas e altas concentrações utilizando ensaio de rugosidade

[135] Como indicado na Tabela 1, a SEQ ID NO2 de AFP é eficaz na redução da rugosidade de superfície de blocos de esmalte que sofre ataque ácido a uma concentração de 5,5 res. 55 μM.

Exemplo 2 - Nanoindentação

[136] Blocos de esmalte são preparados como descrito no Exemplo 1. O ataque ácido é alcançado colocando os blocos de esmalte em solução de ácido cítrico a 1% (pH 3,8) durante 15 minutos. A nanodureza e o módulo de Young a 500nm de profundidade são medidos antes e depois do ataque. Os blocos de esmalte atacados são incubados com uma solução da SEQ ID NO: 20 de AFPs, a uma concentração de 20 μM durante 30 minutos (2 ml de solução/bloco), seguido por uma incubação com solução AS como descrita no Exemplo 1, durante 22 a 24 horas. As etapas de incubação de AFP e AS são repetidas mais duas vezes, após isso os blocos de esmalte são rinsados com água DI e secos ao ar. A nanodureza e o módulo de Young dos blocos de esmalte tratados são medidos a 500nm de profundidade para avaliar os efeitos de reparo do esmalte da AFP. Uma solução de 500 ppm de fluoreto é usada como um controle positivo para o experimento. Os resultados estão ilustrados nas Tabelas 2 e 3. Tabela 2 - Eficácia de reparo de AFP – nanodureza

Tabela 3 - Eficácia de reparação de proteína de trigo hidrolisada - Módulo de Young

Ver Fig. 3 Eficácia de reparação (nanodureza) de AFP usando nanoindentação. Ver Fig. 4 Eficácia de reparação (usando o módulo de Young) de AFP usando nanoindentação.

[137] Como pode ser visto nas Tabelas 2 e 3, a AFP é eficaz na reparação de esmalte corroído pelo ácido.

Exemplo 3 - Microdureza

[138] Os blocos de esmalte são preparados como descrito no Exemplo 1. A microdureza é medida usando um Testador de Microdureza Micromet 6020 com um Indentador de Diamente Knoope uma carga de 25 50 g (Buehler, Lake Bluff, IL, EUA). Blocos com dureza Knoop (KH) de pelo menos 300 são selecionados. Os blocos são atacados por imersão em ácido fosfórico a 30% por 15 segundos. O KH nos lados esquerdo e direito dos blocos é medido. Subsequentemente, o lado direito dos blocos é coberto com fita antes de tratar os blocos com 20 mg/ml de solução de AFP, cada um neutralizado como descrito no exemplo 1, durante dois períodos de 30 minutos. (A fita no lado direito dos blocos previne a exposição deste lado à solução de proteína e serve como um controle interno). Os blocos são lavados duas vezes com água DI @ 5 minutos, 500 PRM entre os dois tratamentos e após o segundo tratamento. Subsequentemente, a fita é removida e os blocos são incubados em solução AS (0,2 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2H2O, 20 mM de tampão HEPES, 4 mM de KH2PO4, 16 mM de KC1, 4,5 mM de NH4Cl, 300 ppm de NaF, 0,05% em peso de NaN3, em pH 7 (ajustado com 1M de NaOH)) durante 7 dias. Depois de rinsar os blocos de esmalte com água deionizada e secar ao ar os blocos rinsados, a microdureza é medida novamente. A recuperação da microdureza da superfície (SMHL, % de Remin) como uma porcentagem é calculada como ((Microdurezareparada - Microdurezaatacada) / (Microdurezasom - Microdurezaatacada))*100. Os resultados do ensaio de microdureza estão ilustrados na Tabela 4. Tabela 4 - Resultados de ensaio de microdureza

Ver Fig. 5 Eficácia de reparação de AFP usando microdureza.

[139] Pode ser visto a partir da Tabela 4 que todas as AFPs são eficazes na remineralização da superfície do esmalte de blocos de esmalte que sofre ataque ácido. Note que para todos os testes de microdureza, a porcentagem de remineralização do lado de controle direito/interno que foi imersa em sálvia artificial e teve algum reparo de sálvia artificial, é subtraída dos resultados, de modo que os dados apresentem o efeito diferencial da AFP. [140] Embora formas de realização particulares da invenção tenham sido ilustradas e descritas, será óbvio para aqueles versados na técnica que várias mudanças e modificações podem ser feitas sem se afastar do escopo da invenção como definido nas reivindicações anexas.

Claims (14)

1. Método para reparo ou inibição ou proteção contra ou prevenção de erosão dentária, promoção da remineralização dentária, e/ou intensificação dos efeitos anticavidade de fluoreto, caracterizadopelo fato de que compreende aplicar aos dentes uma composição para cuidado oral compreendendo a) uma proteína anticongelamento (AFP); b) um carreador oralmente aceitável, em que a AFP possui a sequência de polipeptídeo como definida na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, ou uma sequência de polipeptídeo que surgem a partir da substituição, inserção ou deleção de até 5% de todos os aminoácidos, começando pelas das sequências de polipeptídeos como definidas na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 e que ainda tem pelo menos 50% da propriedade biológica da proteína de partida, e em que a AFP está presente na composição em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso por peso total da composição.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a AFP é acoplada a um peptídeo de aglutinação a hidroxiapatita que é selecionado do grupo formado a partir das SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, e 19.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a AFP é um homômero ou heterômero de AFPs e acoplado a um peptídeo de aglutinação a hidroxiapatita que é selecionado do grupo formado a partir das SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, e 19.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a composição para cuidado oral compreende adicionalmente uma quantidade eficaz de fluoreto.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição é um dentifrício.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a AFP tem a sequência de polipeptídeo retratada na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:3, ou uma sequência de polipeptídeos que surgem a partir da substituição, inserção ou deleção de até 3% de todos os aminoácidos, começando pelas sequências de polipeptídeos retratadas na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:3, e que ainda tem pelo menos 80% da propriedade biológica da proteína de partida, e em que a AFP está presente na composição em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso por peso total da composição.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a AFP tem a sequência de polipeptídeo retratada na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:3, ou uma sequência de polipeptídeos que surgem a partir da substituição, inserção ou deleção de até 1% de todos os aminoácidos, começando pelas sequências de polipeptídeos retratadas na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:3, e que ainda tem pelo menos 90% da propriedade biológica da proteína de partida, e em que a AFP está presente na composição em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso por peso total da composição.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a AFP tem a sequência de polipeptídeo retratada na SEQ ID NO: 1, ou em que a AFP tem a sequência de polipeptídeo retratada na SEQ ID NO: 2 ou em que a AFP tem a sequência de polipeptídeo retratada na SEQ ID NO:3.

9. Dentifrício, caracterizado pelo fato de que compreende a) proteína anticongelamento (AFP), que foi neutralizada a um pH aproximadamente neutro ou ligeiramente básico, em uma quantidade de 0,01% em peso a 2% em peso por peso total da composição; b) fluoreto, em uma quantidade de 100 ppm a 1000 ppm, e c) um carreador oralmente aceitável.

10. Composição para cuidado oral, caracterizadapelo fato de que compreende: a) proteína anticongelamento (AFP), em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso por peso total da composição; b) opcionalmente fluoreto, em uma quantidade de 100 ppm a 1000 ppm; c) um carreador oralmente aceitável, para uso no reparo ou inibição da erosão do esmalte dentário, promoção da remineralização do esmalte dentário, e/ou intensificação dos efeitos anticavidade de fluoreto.

11. Uso de uma Proteína Anticongelamento (AFP), caracterizadopelo fato de ser na fabricação de uma composição para cuidado oral para reparo ou inibição de erosão dentária, promoção da remineralização dentária, e/ou intensificação dos efeitos anticavidade de fluoreto.

12. Método para produção de um produto para cuidado oral compreendendo Proteína Anticongelamento (AFP), como definido na reivindicação 9 ou 10, caracterizadopelo fato de que compreende a) neutralizar uma solução de AFP por diluição com uma solução tampão aquosa para obter uma solução tendo pH aproximadamente neutro ou ligeiramente básico; b) filtrar e centrifugar o produto de solução de a) para obter um filtrado compreendendo AFP; c) adicionar fluoreto e opcionalmente um biocida ao produto filtrado de b); d) misturar o produto de c) aos componentes de um carreador oralmente aceitável.

13. Composição para cuidado oral, caracterizadapelo fato de que compreende proteína anticongelamento (AFP) em uma quantidade de 0,01% em peso a 3% em peso por peso total da composição, em que a composição para cuidado oral é obtida ou obtenível pelo método como definido na reivindicação 12.

14. Composição de goma de mascar, caracterizadapelo fato de que compreende a) base de goma, em uma quantidade de 4,8% a 90% em peso; b) flavor, em uma quantidade de 0,1% a 10% em peso; c) agente edulcorante, em uma quantidade de 0,1% a 95% em peso; e d) 0,01% a 0,5% de proteína anticongelamento (AFP) em peso da composição de goma de mascar.

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